JPS63269986A - 遺伝子調節単位および、クローニング・発現系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ＤＮＡ配列■： ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＣＴＣＡＴＴ　ＡＴＣＡＣＡ　ＡＡＡ
　ＴＧＧ　ＧＡＡ　ＴＴＧ　ＴＴＡ　ＴＴＴＣＡＡ　Ｃ
ＧＣＴＴＧ　ＧＣＧ　ＧＴＡ　ＴＣＴ　ＴＣＴ　ＴＡＴ
　ＴＡＧ　ＧＡＧ　ＡＡＡ　ＡＧＡＡＡＡ　ＣＧＡ　Ａ
ＧＣＧＴＣＡＧＣＴＴＡ　ＴＴＴ　ＣＧＡ　ＴＴＡ　Ｃ
ＧＡ　ＴＴＧ　ＧＴＡＴＴＧ　ＴＧＣＴＣＡ　ＴＣＡ　
ＴＴＴ　ＴＡＧ　ＧＴＧ　ＧＣＧ　ＴＡＴ　ＴＣＣＴＣ
Ｇ　ＧＡＡＴＧＧ　ＣＴＡ　ＡＡＡ　ＧＴＴ　ＡＡＣＧ
ＴＴ　ＴＡＣＧＴＡ　ＡＡＡ　ＧＴＴ　ＡＡＴ　ＧＡＴ
ＡＧＴ　ＡＴＧ　ＴＡＴ　ＧＡＡ　ＴＡＡ　ＡＴＧ　Ａ
ＡＡ　ＡＣＡ　ＣＴＡ　ＧＧＡ　ＧＧＡ　ＴＴＴＡＴ　
Ｔ により特徴付けられる少くとも一つのプロモーター領域
を含む遺伝子調節単位の提供に関する。

本発明は、更に、ＤＮＡ配列■： ＴＴＴ　ＴＴＡ　　ＡＴＣＧＡＴ　　ＧＴＡ　　ＧＡＡ
　　ＡＡＡ　　ＡＧＡ　　ＧＡＣＡＴＧ　　ＣＣＡ　　
ＡＡＡＡＧＣＧＣＣＡＴＧ　ＴＣＴ　ＣＴＴ　ＴＴＴ　
ＴＣＴ　ＡＴＡ　ＣＣＴ　ＡＡＧ　ＣＧＡ　ＡＴＧＡＣ
Ａ　ＣＣＣＣＣＣＴＴＴ　ＣＧＧ　ＧＧＴ　ＴＧＧ　Ｔ
ＧＧ　ＣＡＴ　ＴＣＧ　ＣＣＴ　ＡＧＧＴＡＡ　ＡＡＧ
　ＣＴＴ により表わされるターミネータ−領域の提供に関する。

本発明は、更に、タンパク調製に用いるためのクローニ
ングおよび発現ベクター、およびかかるベクターにより
形質転換された宿主生物に関する。

本発明は、更に、形質転換可能で好ましくは微生物の宿
主生物、前記において特定され好ましくは巨大菌（Ｂａ
ｃｉｆｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）の菌種起源の調
節単位、および同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）または異
種の（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）構造遺伝子を含む細
菌クローニング・発現系に関する。本発明によるＤＮＡ
配列■のターミネータ−領域に代えて、適切な場合には
、他の有効なターミネータ−領域またはＤＮＡ配列を用
いることもできる。

最後に、本発明は、前記クローニングむよび発現系を用
いて同種または異種タンパクを調製するための遺伝子工
学的方法に関する。

組換えＤＮＡ技術の導入により、適切な操作、例えば遺
伝子増幅により考えられる、宿主生物に同種タンパクま
たは異種タンパクを過剰生産させる機会を提供するタン
パク取得方法が生物工学に利用可能となっている。大腸
菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）はこの目的のための宿主生物として
極めてしばしば用いられ、またそれらはある程度異種の
転写および翻訳信号を受容するのみならず、それら自体
で容易に調節され得る強力なプロモーターを有するため
、外来遺伝子であっても、場合によっては十分な転化率
をもって、発現することができる。他の微生物（例えば
ＤＥ−Ｏ３３１５２００１に記載されるようなα−アミ
ラーゼ取得のための枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ）など）を大腸菌と同程度に使えるまでには
到っていない。その理由としては、特に、これらの生物
、例えば枯草菌の場合には、形質転換細胞中での使用ベ
クターが、例えば欠失、リアレンジなどによって、構造
的に不安定となることがしばしばみられる点が挙げられ
る。更に、大腸菌とは対照的に、バチルス系の菌種は、
本質的に、種に特有の特異的な認識および調節配列しか
有していない、すなわち外米遺伝子は全く発現できない
かまたはほんのわずかしか発現できない。更に調節可能
な強力なプロモーターおよび調節単位はバチルスの場合
、わずかしか知られていない。

一方、遺伝子工学に応用する上ではグラム陽性細菌の使
用は有利でもあり、従って望ましいことである。すなわ
ち、バチルス系菌種、例えば枯草菌や巨大菌などは、多
くの大腸菌株とは対照的に、病原性がない。更に、糞便
のインジケーターとされている大腸菌細菌とは対照的に
、それらは、厳しい衛生規制を受ける場所、例えば食品
セクターまたは飲料水セクターなどにおいても問題なく
用いることができる。更に、バチルス系菌種についての
発酵技術および生産物範囲はよく知られている。分子生
物学の見地からは、それらはタンパクを可溶な形態で分
泌するという点でダラム陰性細菌よりも有利である。

従って、それらは分泌ベクターの構築に特に適している
。

このように、更に実用的かつ生産的で、好ましくは非大
腸菌の系を開発し、遺伝子工学のますます高まる経済的
重要性を考慮し、そしてますます多岐化する価値ある物
質、特にタンパクを様々な用途分野に利用可能にするこ
とが何故必要かについては多くの理由があるのである。

従って、本発明の目的は、強力な調節単位および安定な
ベクターを有し、そして内生むよび外生タンパクを高収
率および良品質で合成できる新しいクローニング・発現
系を提供することにある。

この目的は、以下詳述する如くすることにより達成され
る。

驚くべきことに、７アージ・ベクター、好ましくはλ−
ＥＭＢＬ３、で巨大菌のジーン・バンクを作り、そして
、酵素グルコース・デヒドロゲナーゼをコードするＤＮ
Ａ領域を順次縮小することにより、そして中間宿主、好
ましくは大腸菌、の形質転換により、（構造遺伝子のほ
かに）ＤＮＡ配列Ｉおよび■に相当するプロモーターお
よびターミネータ−領域を含むＤＮＡ配列が得られるこ
とが見出された。それを適当なベクターに挿入しそして
好ましくは微生物の宿主生物例えばバチルス属の宿主生
物中でクローニングすると、それらの調節下にある様々
な構造遺伝子が驚くほど高い収率かつ優れた品質で発現
する。

「それらの調節下にある・・・構造遺伝子・・・」とは
本発明においては、調節単位と構造遺伝子とが直接接続
されているか、あるいは、非コーディングまたは他の目
的のコードであるＤＮＡセクションが調節単位と構造遺
伝子の間に挿入されていてもよいことを意味するものと
して定義される。

出発生物種として用いられる微生物は、適切な遺伝情報
を有する菌種巨大菌およびその突然変異体または変異体
である。このタイプの菌株は知られており、そしてこの
目的に対して権限のある寄託機関に寄託されている（例
えばＤＳＩＪ３２１、　ＤＳＭ３２２、ＤＳＭ３３３ま
たはＤＳＩＪ３３７）。

本発明によるＤＮＡ配列Ｉおよび■で形質転換できる適
切な宿主生物は主として微生物であるが、植物、動物ま
たは人間の細胞も適している。

しかしながら、細菌、例えば大腸菌またはバチル・ス属
菌種、特に巨大菌、を用いるのが好ましい。

適切な構造遺伝子は、同種遺伝子、すなわち宿主が天然
に含んでいるもの、および外来遺伝子の両方である。従
って、グルコース・デヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｉ）およ
び（■）（この説明については下記参照）およびクロラ
ムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を
本発明による調節単位の調節下に置き発現させることが
できる。しかしながら、原則的に、他の遺伝子、例えば
ムタロターゼ遺伝子、α−アミラーゼ遺伝子、β−グル
コシダーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、およ
びトランスアミナーゼ、リパーゼまたはプロテアーゼ遺
伝子を発現させることもできる。

本発明による調節単位、特にプロモーターの、同種宿主
中での効率は相当なものである。すなわち例えば、菌種
巨大菌が宿主の場合、発現さレルグルコース・デヒドロ
ゲナーゼ（Ｉ）の活性は、２０〜６５単位／＋＋＋ｆ２
（培養液）、好ましくは３５〜５０単位／ｍＱである。

同一条件下、本発明によるプロモーターの調節下にある
グルコース・デヒドロゲナーゼ（ｎ）の発現は１０〜３
５、好ましくは１５〜２５、単位／ｉｆｆであるが、い
ずれの遺伝子についても、本発明のプロモーターを用い
ないときはわずか０．０５〜０．２単位／　ｒｍ　Ｑ　
（培養液）に過ぎない。クロラムフェニコール・アセチ
ルトランスフェラーゼ（本発明のプロモーターの調節下
にある）についての対応する数値は５００〜１５００、
好ましくは６００〜１３００ミリ単位／ｒｓＱ　（培養
液）である。この結果、例えば、本発明のプロモーター
配列工の調節下にあるＣＡＴ遺伝子を有する巨大菌株は
、形質転換されていない菌株よりも適宜の抗生物質に対
する抵抗性が約３０〜５０倍高い。本発明の調節単位に
よりもたらされる高レベルの発現は、今日まで、極めて
強力な大腸菌プロモーター例えば既知のＡＰＬプロモー
ターを用いることにより大腸菌においてでしか達せられ
なかった。比較のため、例えばλＰＬプロモーターを用
いずに大腸菌で得られるグルコース・デヒドロゲナーゼ
Ｉの発現は平均で０．１〜０．２単位／ｍＱ（培養液）
であり、これに対しλＰＬプロモーターを用いた場合は
平均で４０〜５０単位／ｍＱ（培養液）である。従って
、本発明の巨大菌プロモーターのバチルス宿主、好まし
くは巨大菌における効率（約３５〜５０単位／ｍＱ（培
養液））は、λＰＬプロモーターの大腸菌におけるそれ
と全面的に比較し得るものである。すなわち、このよう
にして、バチルスにおける強力なプロモーターおよび効
果的な調節単位を提供することも可能である。更に、本
発明により調製される酵素は良好な安定性を示し、また
、障害となる物質（例えばＮＡＤＨオキシダーゼ類、プ
ロテアーゼ類など）を非実質的な量でしか含まない透明
無色の粗抽出液から容易に得ることができる。

従って、本発明は、少くとも一つのＤＮＡ配列配列相当
するプロモーター領域、および、適切な場合には、ＤＮ
Ａ配列配列相当するターミネータ−領域を含む調節単位
に関する。

特定の構造遺伝子を含む本発明の調節単位は、既知の方
法で適当なベクターに挿入できまたバチルス宿主に形質
転換できる。原則的に、適したベクターは、外来遺伝子
の挿入により不安定化されることなく、また例えば欠失
、リアレンジなどによりそれら自体で宿主生物中で不安
定化を生じることのないすべてのものである。バチルス
宿主におけるベクターＤＮＡの形質転換率は、適切に形
質転換されたクローンを効率的に得るために、なるべく
高い方がよい。高形質転換率は、しばしば、ベクターの
コピー数が高い（増幅）の印でもある。本発明によるベ
クター、好ましくはｐＳＡ６７７（ＤＳＭ４０５５Ｐ）
、ｐＳＡＧ２（０３Ｍ４０５４Ｐ）およびｐｓＡｃ４（
ＤｓＭ４０５３Ｐ）、はこれらの要件を極めて十分に満
たす。すなわち、例えば巨大菌の場合の形質転換率はＤ
ＮＡの使用量および使用プラ゛スミドにもよるが、１０
’−１０’／μｇＣＤＮＡ）である。これらの高形質転
換率は、これまで巨大菌においては達し得られなかった
ものであり（Ｂｒｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　
Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６７／２゜６２３〜６
３０）　、従って本発明の重要な一面を現わしている。

更に、使用されるベクターは、バチルス宿主中で淘汰圧
なしに多世代にわたり安定したままである。本発明によ
るベクターは好ましくはシャトルベクターである、すな
わちそれらは、バチルスおよび好ましくは大腸菌の両方
に対して複製開始部位を含んでいる。本発明による意味
は、バチルスの複製開始部位が異なる給源からのもので
あるシャトルベクターも包含する。これによって確立さ
れた大腸菌技術を中間のクローニングに用いることがで
きる。このタイプのシャトルベクターは既知であり、ま
た文献に記載されている〔例えばｐＨＶ２３およびｐＨ
ｖ３３　（Ｍｉｃｈｅｌ　　ｅｔ　　ａｌ、、１９８０
．Ｇｅｎｅ　　１２．１４７〜１５４）またはｐＪＫ３
０２　（Ｋｒｅｆｔ、　　ＨｕｇｈｅＳ＋　　１９８２
．　　Ｃｕｒｒ。

Ｔｏｐｉｃｓ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ、９６．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ））。更
に本発明によれば自己複製しない、すなわち染色体、ま
たはその他のＤＮＡ複製開始部位を含む複製ＤＮＡ領域
に一体化されるまでは複製し得ないベクター、例えばク
リプテイック（ｃｒｙｐｔｉｃ）・プラスミド、を用い
ることもできる。

従って、本発明は次のプラスミドにも関する： ０　プラスミドＩ）ＳＡ６７７　（受託番号ＤＳＭ４０
５５Ｐ）。

これはＤＮＡ配列配列上び酵素グルコース・デヒドロゲ
ナーゼ（Ｉ）をコードするＤＮＡ配列を含有する。

０　プラスミドｐＳＡＧ２　（受託番号ＤＳＭ４０５４
Ｐ）。

これはＤＮＡ配列配列上び酵素グルコース・デヒドロゲ
ナーゼ（Ｉ［）をコードするＤＮＡ配列を含有する。お
よび、 ０　プラスミドｐＳＡＣ４（受託番号ＤＳＭ４０５３Ｐ
）。

これはＤＮＡ配列配列上び酵素クロラムフェニコール・
アセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列を
含む。

本発明は更に次の宿主生物に関する： ０　宿主生物Ｍ１２９６／ｐＳＡ６７７　（受託番号Ｄ
ＳＭ４０５０）。

これはプラスミドｐＳＡ６７７で形質転換された菌株巨
大菌Ｍ１２９６（０３Ｍ３１９）から得られる。

０　宿主生物　Ｍ１２９６／ｐＳＡＧ２　（受託番号　
ＤＳＭ４０４８）。

これはプラスミドｐＳＡＧ２で形質転換された菌株巨大
菌Ｍ１２９６（０３Ｍ３１９）から得られる。

０　宿主生物Ｍ１２９６／ｐＳＡＣ４（受託番号　ＤＳ
Ｍ４０４９）。

これはプラスミドｐＳＡＣ４で形質転換された菌株巨大
菌Ｍ１２９６（０３Ｍ３１９）から得られる。

本発明は更に、形質転換可能なバチルス属の微生物宿主
生物好ましくは巨大菌、および自己複製し宿主菌体中で
安定でありそしてプロモーターおよび適切な場合には巨
大菌からのターミネータ−１および複製および発現され
るべき構造遺伝子、好ましくはグルコース・デヒドロゲ
ナーゼ（Ｉ）遺伝子、グルコース・デヒドロゲナ−１１
’（ｎ）遺伝子またはクロラムフェニコール・アセチル
トランスフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドを含む、タ
ンパク取得用細菌クローニングおよび発現系に関する。

最後に、本発明は、前述のクローニングおよび発現系を
栄養溶液中で培養し発現により生じたタンパクを単離す
ることを特徴とするタンパクの調製方法に関する。

本発明は好ましくは以下に記載するとおりに行われる。

まず第一に、巨大菌菌体から染色体ＤＮＡを単離し精製
する（実施例３参照）。巨大菌菌体の培養は実施例２に
詳細に説明されている。このようにして単離された染色
体ＤＮＡをこの目的に適した周知慣用の制限エンドヌク
レアーゼを用いて自体既知の方法で部分加水分解する。

制限酵素５ａｕ３Ａをこの目的に用いるのが好ましい。

この加水分解は、主として９〜２２キロベース（ｋｂ）
、好ましくは１４ｋｂ以上、の長さの断片が得られるよ
うに調節するのが好ましい。シーンバンク作製に用いら
れるファージ・ベクターは好ましくはこの目的によく用
いられる既知のλ−ＥＭＢＬ３である（Ｆｒｉｓｃｈａ
ｕｆｆ　ｅｔ　ａｌ、＋　　１９８３＋　　Ｊ。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１７０．８２７〜８４２）。それ
らファージは好ましくはＡｒｂｅｒ　ａｔ　ａｌｚ　（
１９８３，Ｌａｍｂｄａ　ＩＩ　。

４３３−４６６、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏ、ｒｋ）の方法により調製され、
そしてファージＤＮＡは実施例４に詳記されるごとくに
調製されそして既知の方法により、慣用の制限エンドヌ
クレアーゼ、好ましくはＢａｍＨＩｑ　を用いて切断さ
れる。

得られたＤＮＡ断片の各々の大きさをゲル電気泳動によ
り測定する。

ファージＤＮＡの切断部位に嵌合するバチルス・ゲノム
のＤＮＡ断片を今度は商業的に入手し得る連結酵素、好
ましくはＴ４　　ＤＮＡリガーゼ、を用いて自体既知の
方法で挿入する（Ｗｅ　１ｓｓｅｔ　ａｌ、、　１９６
８．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２４３．４５４
３−４５５５）。このようにして得られた様々な組換え
ファージ分子を、それらを複製できる宿主生物、好まし
くは大腸菌、特に大腸菌ＮＭ５３９（ＡＴＣＣ３５６３
９Ｘ大腸菌の培養については実施例１参照）に形質導入
し、そして自体既知の方法によりクローン化する（Ａｒ
ｂｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８３．前掲書）。プラス
ミドによる細菌細胞の形質転換は、好ましくは既知の塩
化カルシウム法によって行われる（Ｃｏｈｅｎ　ｅｔ　
ａｌｚ　１９７２．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、６９．２１１０〜２１
１４）。

このようにして作製された巨大菌シーンバンクからバチ
ルス属系菌種に存在するＮＡＤ／ＮＡＤＰ−依存性酵素
グルコース・デヒドロゲナーゼ（Ｅ、Ｃ，１，１，１，
４７）　（以下グルコースＤＨと記す）の遺伝情報を含
むファージ・クローンが同定される。これは、グルコー
スＤＨの触媒作用を受けＮＡＤ）Ｉ、形成を伴うβ−グ
ルコースのグルコノラクトンへの転化を利用した特異的
フィルター・アッセイを用いて、新たに形成されたファ
ージ・クローンの溶解液（リゼイト）中の酵素活性を検
出することにより行われる。ＮＡＤＨ、形成はグルコー
スＤ）Ｉの産生（陽性反応）に依存するが、これは濾紙
に適用された７ア一ジ検体（プラーク）に蛍光信号が現
れることにより検出される（実施例５参照）。以後の諸
工程においても用いられるこれらのアッセイに基づいて
、最終的に再現性のある陽性反応を示すファージ・クロ
ーンを同定することができる。組換え７アージＤＮＡ内
のグルコースＤＨＤＮＡを濃縮するために、後の手順に
おいてサブクローニングを好ましくはプラスミドで行う
。このためには、組換えファージＤＮＡを今度は、常法
により制限エンドヌクレアーゼ、好ましくは５ａｕ３Ｃ
を用いて部分加水分解し、それによって約４〜９ｋｂの
サイズの断片を生成させる。原則として、出発プラスミ
ドとしては、前示すイズのＤＮＡ断片を取り込んでも不
安定にならないあらゆるプラスミドを用いることができ
る。この目的に特に適しているのはＩ）ＢＲ３２２（Ｂ
ｏｌｉｖａｒ　ｅｔ　ａｌ、、　　１９７７゜Ｇｅｎｅ
　２．９５〜１１３）であり、これを好ましくは制限エ
ンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで消化する。前記ファージ
ＤＮＡ断片を今度は自体既知の方法により（Ｗｅｉｓｓ
　ａｔ　ａｌ　、上記引用文献）切断済みのプラスミド
ベクターに連結する。その連結生成物を用いて、形質転
換に適しそして認定された寄託機関から入手し得る任意
の所望の宿主生物、好ましくは大腸菌、を常法により形
質転換する。

このようにして得られたコロニーをグルコースＤＨ酵素
アッセイにかける（実施例５参照）。基礎的なプラスミ
ドの一つは１０．２ｋｂの大きさを持ちそしてｐＪＨ１
０７と称される。制限分析を行うために、プラスミドを
制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ　、　Ｓａｔ　Ｉ　
５Ｓｐｈ　Ｉ、ＨｉｎｄｍおよびＣ１ａ　Ｉにより自体
既知の方法で完全加水分解し、そしてＤＮＡ断片を自体
既知の方法でアガロースゲル電気泳動により分画する。

グルコースＤＨ配列を含む断片の大きさは５　、８００
ｂｐであることが分る。

第１図は本発明によるプラスミドｐＪＨ１０７の制限地
図を示す。

組換えプラスミド上で遺伝子を更に局在下させるための
手順としては以下に概略の示される既知の方法を用いる
のが好ましい： ０　（好ましくは）ｓｐｈ　ＩによりｐＪＨ１０７を消
化する。

ｏ　　ｐＪＨ１０７をｐＢＲ３２２に取り込み、任意の
所望の宿主、好ましくは大腸菌を形質転換する。この結
果、プラスミド・ベクターｐＪＨ１０８が得ら　−れる
。後者は約３０００ｂｐの大きさのパラセンジャーＤＮ
Ａ断片を含む（第２図参照）。制限分析にはエンドヌク
レアーゼＳｐｈ　Ｉ　、　Ｃ１ａ　Ｉ、ＥｃｏＲＩおよ
びＨｉｎｄ　ｍを用いるのが好ましい。

ｏ　　ｐＪＨ１０８を好ましくは旧ｎｄｌＩ［で消化す
る。

０　プラスミド・ベクターｐＢＲ３２２に取り込みそし
て宿主、好ましくは大腸菌ＲＲＩ、を形質転換しクロー
ン化する。本発明による組換えプラスミド・ベクター：
　ｐＪＨｌｌｌ（第３図）。

プラスミド・ベクターｐＪＨ１１１はこの段階で、制限
分析により示されるように、５　、５００ｂｐの大きさ
の残余プラスミドのほかには１ｌｏｏｂｐの大きさのＤ
ＮＡ断片を含むだけである。対応する大腸菌クローンは
グルコースＤＨ酵素活性を有する。

ＤＮＡの大きさを更に小さくすると酵素活性が完全に失
われる。その調節単位を含むグルコース・デヒドロゲナ
ーゼ遺伝子は前記１１００ｂｐ断片上に位置している。

（例えばＭａｘａｍおよびＧ１１ｂｅｒｔ、　　Ｍｅｔ
ｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、（１９８０）　６５，４９９
〜５８０、の方法による）この１ｌｏｏｂｐ断片のヌク
レオチド配列決定により、プロモーター領域の本発明に
よるＤＮＡ配列Ｉ。

ターミネータ−領域の本発明によるＤＮＡ配列■、およ
び酵素グルコースＤＨをコードする構造遺伝子のＤＮＡ
配列が得られる（第４図参照）。

驚くべきことに、第４図からのＤＮＡ配列、およびそれ
より導かれ精製酵素のタンパク配列により確認されたア
ミノ酸配列（第５図参照）は、商業的に入手し得るグル
コースＤＨの既知配列（Ｊａｎｙ　ａｔ　ａｌ、、　１
９８４．　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　１６５．６〜１９参
照）とほぼ２０％異なっている。それは以上および以下
においてグルコースＤＨ（Ｉ）と称される。

同じくバチルスに存在する既知のグルコースＤＨ（本明
細書中ではグルコースＤＨ（ＩＩ）と称される）の同定
は、巨大菌からのフィルター結合ＤＮＡを遺伝子の放射
性標識１１２６ｂｐ　ＨｉｎｄｌＩｆ断片とハイブリダ
イゼーションすることにより行われる。

このためには、染色体ＤＮＡを自体既知の方法により、
好ましくは制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ■を用いて
、加水分解し、ＤＮＡ鎖長標準と共に１％アガロースゲ
ルに適用しそしてニトロセルロースに移す。鎖長標準と
してはＥｃｏＲＩにより加水分解された５ＰＰＩ　　Ｄ
ＮＡのみならず、ｐＪＨ１０８（Ｓａｌ　Ｉ　−Ｓｐｈ
　Ｉにより加水分解）およびｐＪＨｌｌｌ（ＨｉｎｄＩ
［［により加水分解）の混合物も用いられ、それによっ
てオートラジオグラフィー後にハイブリダイズする断片
の大きさを測定することが可能となる。ハイブリダイゼ
ーション技術、放射性標識およびオートラジオグラフィ
は従来技術（例えばＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、
　１９７５．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７２．１１８４−１１
８８；　Ｃａ５ｅｙおよびＤａｖｉｄｓｏｎ、　１９７
７、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　４，１５３
９−１５３２　；　ＨａｎａｈａｎおよびＭｅｓｅｌｓ
ｏｎ、　１９８０．　Ｇｅｎｅ　１０゜６３−６７；　
Ｒｉｇｂｙ　ｅｔ　ａｌ、、　　１９７７、　　Ｊ、　
　Ｍｏ１．　　Ｂｉｏｌ。

１１３、２３７〜２５１）であるか、または当業者によ
りそれより簡単に演鐸され得る。そのオートラジオグラ
フから使用遺伝子プローブに相当する強い１１００ｂｐ
バンドのみならず、より弱いバンドを２１００および５
０００ｂｐに確認することができる。このことは巨大菌
が一種よりも多いグルコース・デヒドロゲナーゼを含ん
でいることを示している。

１３００〜５０００ｂｐの断片に相当するもう一つのグ
ルコースＤＨのクローニングを原則として、１１００ｂ
ｐ断片について既に詳記したとおりに行う。使用ベクタ
ーは好ましくは大腸菌プラスミドｐＵｃ１８（出典：　
Ｖｉｅｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　　１９８２．　Ｇｅｎｅ
　１９．２５９）である。最後に、２１００ｂｐ　ＤＮ
Ａ　断片を含み、大腸菌でグルコースＤＨを発現する新
規プラスミドｐＪＨ２１１（第６図参照）が得られる（
同じく遺伝子プローブとハイブリダイズする５０００ｂ
ｐ断片はこの方法によっては得ることができない）。第
二のグルコースＤＨ遺伝子のＤＮＡおよびタンパク配列
を自体既知の方法で、または前記１１００ｂｐ断片と同
様にして確定する。この配列はグルコースＤＨについて
知られているものと完全に符合する。

本発明による二つのＤＮＡ配列Ｉおよび■は、結果の示
すとおり、プラスミドｐＪＨ１１１の１１００ｂｐ断片
にのみ含まれていた。大腸菌では、いずれのグルコース
ＤＨ遺伝子もそれらの調節単位の調節下に、比較的低度
にしかグルコースＤＨを発現しない（約０．１単位／ｍ
Ｑ（培養液））。グルコースＤＨまたはその構造遺伝子
をバチルス、好ましくは巨大菌で、発現させるには、プ
ラスミドｐＪＨ１１１およびｐＪＨ２１１、特に本発明
による調節単位を含むプラスミドｐＪＨ１１１を再構築
する必要がある。

これは、いずれのプラスミドも大腸菌に対する複製開始
点しか含まず、それ故にバチルスでは複製できないため
である。後者を可能とするためにバチルスおよび別の宿
主、好ましくけ大腸菌の両方に対する複製開始点を含む
ベクターが用いられる。これに関連して、本発明におい
てはバチルスｏｒｉが枯草菌、セレウス菌（Ｂａｃｉ−
１１ｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ）、巨大菌またはその他のバチ
ルス属菌種またはその他のグラム陽性生物のどれを起源
としようともそれは重要なことではない。

本発明によるプラスミドｐＳＡ６７７（ＤＳＭ４０５５
Ｐ）の調製にはシャトルベクターｐＪＫ３０２（Ｋｒｅ
ｆｔ、　Ｈｎｇｈｅｓ。

上記引用文献）を用いるのが好ましい。アンピシリンお
よびテトラサイクリンに対する抵抗性をコードする遺伝
子セグメントと大腸菌およびセレウス菌のｏｒｉのほか
に、ｐＳＡ６７７はＤＮＡ配列配列相当するプロモータ
ー領域とグルコースＤＨ遺伝子（Ｉ）のＤＮＡ配列を含
んでいる（第４図参照）。

このプラスミドの構築は第７図および実施例６に詳述さ
れている。

ｐＳＡ６７７を巨大菌に形質転換後、多数のテトラサイ
クリン抵抗性およびグルコースＤｉ（−陽性クローンが
得られる。グルコースＤＨ（Ｉ）の検出および酵素活性
の計算は好ましくは実施例５において説明される方法に
より行われる。それによって前述の高発現率が達成され
る。

バチルス、好ましくは巨大菌、においてもグルコースＤ
Ｈ（Ｉｆ）遺伝子の発現をもたらすことができるように
するには、セレウス菌ｏｒｉおよびテトラサイクリン抵
抗性を有する既知のプラスミドベクターｐＢｃ１６−１
（Ｂｅｒｎｈａｒｄ　ｅｔ　ａｔ、、　１９７８゜Ｊ、
　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　１３３．８９７−９０３）
をプラスミドｐＪＨ２１１中にクローン化し、そしてそ
れにより得られる新規シャトルベクターｐＢＣＧＤ２を
バチルス、好ましくは巨大菌中に形質転換する。ｐＢｃ
１６−１に代えて、例えば巨大菌ｏｒｉを有する相当す
るＤＮＡ断片を用いることもできる。ｐＢＣＧＤ２の制
限地図を第８図に示す。グルコースＤＨ（ＩＩ）遺伝子
は発現が著しく低くこの点でグルコースＤＨ（Ｉ）遺伝
子と対照的である。すなわちその発現は野生株よりも実
質的に高いとはいえない程のものに過ぎない（前記参照
）。その理由は、プラスミドｐＪＨ２１１は本発明によ
る調節単位、特にグラスミドｐＪＨ１１１中の１１２６
ｂｐ断片のＤＮＡ配列配列相当する強力なプロモーター
、を含んでいないからであると考えられる。その根拠と
なる事実として、グルコースＤＨ（ＩＦ）遺伝子を本発
明によるプロモーターの調節下におくと極めて高い酵素
活性が再び得られる。これは例えば本発明によるＤＮＡ
配列配列相ＪＨｌｌｌまたはｐＳＡ６７７の１１２６ｂ
ｐ断片から適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて切り
出し、そしてそれを直接構造遺伝子（この場合にはグル
コースＤＨ（ｎ））に連結することにより達成すること
ができる。もう一つの手順（この方法が好ましい手順で
ある）は自体既知の方法により本発明によるプラスミド
ｐＳＡ６７７から利用可能な制限エンドヌクレアーゼに
相当する大きさの断片、好ましくは１８０ｂｐの大きさ
のＸｂａＩ断片、を欠失させることより成る（第３図参
照）。この欠失によって多くのアミノ酸が影響されるの
で機能し得るグルコースＤＨ（ＩＩ）タンパクを産生ず
ることは不可能である。それによって得られる新規プラ
スミドｐＳＡＸ　（第９図参照）を含む形質転換体はグ
ルコースＤＨＣＩ）について陰性反応を示す。ｐＳＡＸ
を今度は既知の方法によりＡｃｃ　Ｉを用いて部分的に
切断開環し、そしてグルコースＤＨ（ＩＦ）遺伝子を含
む適宜の断片を常法によりその切断部位にクローン化す
る。それによって得られる新規プラスミドｐＳＡＧ２の
構成は第９図および実施例７に詳述されている。

このように、本発明によるグルコースＤＨ（Ｉ）遺伝子
のプロモーターは巨大菌宿主中で同種グルコースＤＨ（
Ｉ［）遺伝子を強力に発現させる（活性については前記
参照）。

クロラムフェニコールφアセチルトランスフェラーゼ（
ＣＡＴ）遺伝子は、異種遺伝子の一例として働き得る。

この酵素は抗生物質クロラムフェニコールのアセチル化
、従って不活化、を触媒する。このタイプの抵抗性マー
カーが強力なプロモーターの下流に置かれれば、形質転
換体は高濃度のその抗生物質に対して抵抗性となるので
容易に選択できるはずである。本発明においては、ＣＡ
Ｔ遺伝子は１）ＮＡ配列Ｉに相当する強力なプロモータ
ーの調節下に置かれる。これは、好ましくは、ＣＡＴ遺
伝子をグルコースＤＨＩ構造遺伝子の開始点のすぐのと
ころに挿入することにより行われる。このようにすると
後者はもはや発現できなくなる。しかしながら、適切な
制限エンドヌクレアーゼを入手できる場合には、ＣＡＴ
遺伝子、または一般的に外来遺伝子、を本発明によるプ
ロモーターのすぐ下流におき、そしてそれ以上の発現を
適宜の手段例えば停止コドンを取り込むことにより抑え
るか、あるいはグルコースＤＨ（Ｉ）構造遺伝子を完全
に除去しそして得られるプラスミドを適宜補充（ｆｉｌ
ｌ　ｉｎ）するか、またはグルコースＤＨ（Ｉ）遺伝子
を別の方法で不活化させることも考えられる。

この新しい構築物は、好ましくは、いわゆるＣＡＴ遺伝
子のＢａｍ１（ＩカルツーシーＬ　（ｃａｒｔｏｕｃｈ
ｅ）を含む既知のプラスミドｐＣＭ４　（Ｃ１ｏｓｅお
よびＲｏｄｒｉｇｕｅｚ、　１９８２．　Ｇｅｎｅ　２
０．３０５〜３１６）を用いて作られる（第１０図参照
）。ＣＡＴ遺伝子および本発明によるＤＮＡ配列■のプ
ロモーター領域ヲ含む本発明の新規プラスミドｐＳＡＣ
４の構築は第１１図および実施例８に詳述されている。

例えばｐＳＡＣ４が巨大菌中に形質転換されると、それ
は受容菌である巨大菌に、５０〜１００μｇ／ｍＩ２の
クロラムフェニコールに対する抵抗性を付与する。

これに対し、形質転換されていない菌株は約２μｇ／ｍ
Ｑというわずかな濃度中でももはや増殖しない。すなわ
ち、異種クロラムフェニコール・アセチルトランスフェ
ラーゼ遺伝子で形質転換されたバチルス属菌株はもとの
致死量の３０〜５０倍の対クロラムフェニコール抵抗性
を獲得している。この好ましい方法によって巨大菌中で
産生されるクロラムフェニコール・アセチルトランスフ
ェラーゼは大腸菌中で産生されるものよりも１３アミノ
酸だけ長い（グルコースＤＨ（Ｉ）遺伝子のリポソーム
から進行する融合タンパクの形成）。このようにして巨
大菌中で産生されたクロラムフェニコール・アセチルト
ランスフェラーゼの酵素活性は、５００〜１５００、好
ましくは６００〜１３００、ミリ単位／ｍα（培養液）
である。

酵素活性は好ましくは既知の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏ
ｆＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　（１９８０）、　Ｖｏｌ、１
８．７４２〜７４３頁）を用いて分光光度測定法により
測定される。この好ましい方法により形質転換されたバ
チルス属宿主生物はもはやグルコースＤＨ活性を示さな
い。

本発明によれば、ＤＮＡ配列配列相当するプロモーター
領域および場合により、全体のｒｅｇｕ−１ａｔｉｏｎ
のために重要なりＮＡ配列■に相当するターミネータ−
領域は、グルコースＤＨ（Ｉ／Ｉ［）遺伝子およびＣＡ
Ｔ遺伝子ばかりでなく、他の同種もしくは異種の遺伝子
、例えば各実施例にみられる如き遺伝子を好ましくは、
バチルス属宿主、特に巨大菌において好収量で発現する
ことが可能である。

次の省略形を鮮明中、および実施例および図面中に用い
るが、そこでは詳細には説明されていない： Ａ　　　　アデニン Ａｓｙｇ　　　　５７８ｎｍにおける吸収Ａｓｙａ−Ｕ
　　　５７８ｎｍにおける吸収一単位Ａｐ　　　　　ア
ンピシリン抵抗性 ＡＰＳ　　　　アンモニウムペルオキソジサル７エート
ｂ　　塩基 Ｂｉｓ　　　　Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’−メチレンビスア
クリルアミドｂｐ　　　　　塩基対 ＢＳＡ　　　　ウシ血清アルブミン Ｃシトシン ＣＡＴクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラ
ーゼ遺伝子 Ｄａ　　　　　ダルトン（ｇ／ｍｏｆｆ）ＤＮＡ　　　
　デオキシリポ核酸 ＤＴＴ　　　　ジチオトレイトール ＥＤＴＡ　　　　エチレンジアミン四酢酸Ｅ、ｃｏｌｉ
　　　大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｇ
　　　　　グアニン ｇａｌｋ　　　　ガラクトキナーゼ ｋ　　　　　ＸＩＯ’ Ｑ　　　　　リットル ＮＡＤ　　　　ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチ
ドＮＡＤＰ　　　　ニコチンアミドーアデニンジヌクレ
オチドホス７エート ０Ｄ　　　　　光学密度 ＰＥＧ　　　　ポリエチレングリコールｒｐｍ　　　　
回転７分 ５秒 ＳＤＳ　　　　　ドデシル硫酸ナトリウムＴ　　　　チ
ミン Ｔ４　　　　　バクテリオファージＴ４Ｔｃ”　　　　
テトラサイクリン抵抗性ＴＥＭＥＤ　　　Ｎ、Ｎ、Ｎ’
、Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンＴｒｉｓ　　　
　）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタンｔＲＮＡ　
　　　転移リボ核酸 Ｕ　　　　酵素活性の単位 本発明の個々の切り口を示す図を以下説明する： 第１図ニブラスミド・ベクターｐＪＨ１０７の制限地図
。明瞭に指定できる制限切断部位が 示されている。バラセンジャＤＮＡの大きさは約５８０
０ｂｐである。プラスミドｐＪＨＩＱ７はＢａｍＨＩ−
消化プラスミドｐＢＲ３２２と染色体ＤＮＡおよびλ−
ＥＭＢＬ−３ファージＤＮＡの５ａｕ３Ａ−加水分解構
築物から構築される。

第２図ニブラスミド・ベクターｐＪＨ１０８の制限地図
。明瞭に指定できる切断部位のみが 示されている。パラセンジャＤＮＡの大きさは、約３０
００ｂｐである。プラスミドｐＪＨ１０８はｐＪＨ１０
７の断片（Ｓｐｈ　Ｉにより加水分解）およびｐＢＲ３
２２から構築される。

第３図ニブラスミドｐＪＨ１１１のＬ１２６ｂｐ断片の
制限地図。就中、プロモーターの−３５および一１０領
域、およびリポソーム結合部位および開始および停止コ
ドンが示さ れている。更に、本テキストにおいで ある役割を有する切断部位のみが示さ れている。

第４図：巨大菌からのグルコース・デヒドロゲナーゼ遺
伝子のＤＮＡ配列。

第５図：　ｐＪＨｌｌｌの発現産生物のアミノ酸配列。

第６図：　ｐＪＨ２１１の制限地図。制限分析に用いら
れる切断部位のみが示される。プラス ミドｐＪＨ２１１はｐＵｃ１８とＨ４ｎｄＩｆｆ−加水
分解染色体ＤＮＡから構築される。

第７図：シャトルベクターｐＪＫ３０２とプラスミドｐ
ＪＨ１ｌｌからのハイブリッド・プラスミドｐＳＡ６７
７の構築（テキスト参照）。ｐＳＡ６７７はグルコース
ＤＨ（Ｉ　）遺伝子およびＤＮＡ配列配列台み、従って
大腸菌およびバチルス属のいずれにおいても複製 できる。

第８図：シャトルベクターｐＢＣＯＤ２の制限地図。

シラスミドはｐＪＨ２１１およびｐＢｃ１６−１から構
築される（テキスト参照）。ｐＢＣＧＤ２はグルコース
ＤＨ（１）；’ロモーター領域を有しないグルコースＤ
Ｈ（ｎ）遺伝子を含む。

第９図：　ｐＪＨ２１１とｐｓＡｘからのハイブリッド
プラスミドｐＳＡＧ２の構築。ｐｓＡｘは短縮されたｐ
ＳＡ６７７から作られ、またもはや機能し得ない欠陥グ
ルコースＤＨ（１）構造遺伝子を含むがＤＮＡ配列配列
台当するプロモーター領域を含む。ｐＪＨ２１１はグル
コースＤＨ（ｎ）構造遺伝子を含む。ｐＳＡＧ２はグル
コースＤＨ（Ｉ［）遺伝子が前記プロモーター領域の調
節下にあるシャト ルベクターである。

第１０図ニア０ラムフエニコール・アセチルトランスフ
ェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子のＢａｍＨＩカルツーシュ。

特に、構造遺伝子の停 止コドン（ＴＡＡ）、開始コドン（ＡＴＧ）、および大
腸菌リポソーム結合部位（ＳＤＩ／５Ｄ２）が示されて
いる。

第１１図：　ｐＳＡ６７７とｐＣＭ４からのプラスミド
ｐＳＡＣ４の構築。ｐＳＡ６７７はグルコースＤＨ（Ｉ
）遺伝子子ＤＮＡ配列■に相当するプロモーター領域を
含み、またｐｃｌＪ４はＢａｍＨＩカルツーシュ中にＣ
ＡＴ遺伝子を含んでいる。ｐＳＡＣ４において、ＣＡＴ
遺伝子はＤＮＡ配列Ｉに相当するプロモーター領域の 調節下にある。グルコースＤＨ（Ｉ）構造遺伝子は挿入
により不活化されるため 発現しない。

以下に実施例を挙げて本発明を詳述する。温度は全体を
通して００単位である。

実施例１　大腸菌の培養 ａ）　　ｍｇ量のプラスミドを調製するために、大腸菌
をＩＱスケールで完全（ＬＢ）または最小（Ｍ９）培地
で培養する。このためにｌＱの培地に５ｍＱの定常期予
備培養液を接種し、そして３７゜で連続的に振盪しなが
ら、約１８時間後に定常増殖期に達するまで培養を行う
。

ｂ）グルコース・デヒドロゲナーゼを過剰発現させるた
めに、２００ｍｆｆのＬＢ培地に２８°で増殖させた一
夜培養液２ｍＱを接種する。次にその細菌懸濁液を０−
５Ａｓｙｓ−Ｕの光学密度に達するまで２８°および１
６０ｒｐｍで培養する。次にその培養容器を４２°で更
に１６時間インキュベートする。

ＬＢ培地： カゼイン（酵素的に加水分解したもの）　　　　　１０
　９酵母エキス　　　　　　　　　　５　。

ＮａＣＱ　　　　　　　　　　　　　　５　　。

寒天（固体寒天）１５゜ （軟寒天）　　　　　　　　　　　　　　　７．５９二
回蒸留水　　　　　　　ａｄ　１０００顧ｐＨは１．Ｏ
Ｎ　ＮａＯＨを用いて７．４に調節する。

抗生物質を次の濃度で添加する： アンピシリン：　　　　　　　　　　　　　　５０　ｕ
ｇ／ｒｔｒＱ　”テトラサイクリン＝２０μｇ／Ｉｌｌ
α改変Ｍ９培地： Ｍ９塩（１０倍濃縮液）　　　　　　　　　　　　　　
１０　　ｍ（１２０％グルコース溶液　　　　　　　　
　　　　　　５　　ｍＱ１１４　Ｍｇ５ｏ、　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　ｌ　　蛯１０％カゼ
イン加水分解物　　　　　　　　　　　５　蛯チアミン
溶液（２ｍｇ／ＩＩｆｆ）　　　　　　　　　　　　０
．１ｍＱ二回蒸留水　　　　　　　ａｄ　１０００蛯Ｍ
９塩（１０倍濃縮液）： ＮａＪＰＯ，Ｘ　２Ｈ２０７５ｇ／Ｑ ＫＨ２ＰＯ４３０ｇ／ｆｆ ＮＨ，ＣＱ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　１０９／ＱＮａＣ１２５ｆｉ／Ｑ 実施例２　巨大菌細胞の培養 染色体ＤＮＡを調製するために、巨大菌をＩＯＱスケー
ルで完全（ＬＢ）培地で培養する。このために、１０ｆ
ｆの滅菌培地に２００１１１（２の定常期予備培養液を
接種し、２８°で撹拌（４００ｒｐｍ）および通気（４
００１２空気／時間）しながら、後期対数増殖期に達す
るまで培養を行う。

ＬＢ培地： カゼイン（酵素的に加水分解したもの）　　　　　１０
　９酵母エキス　　　　　　　　　　５ｇ ＮａＣＱ　　　　　　　　　　　　　　５　９寒天（固
体寒天）　　　　　　’　　　　　　　　　１５　　ｇ
（軟寒天）　　　　　　　　　　　　　　　７．５９二
回蒸留水　　　　　　　ａｄ　１０００　ｍ（１ｐＨは
１．ＯＮ　ＮａＯＨを用いて７．４に調節する。

実施例３　ベクターＤＮＡの単離 ａ）　ファージＤＮＡの単離 超遠心分離により精製された７アージの懸濁液を２０ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ、　０．５％ＳＤＳに調整し、そして５０
μｇ／ｒｔｒ（ｌのブロテイナーゼＫを添加後、５０’
で１時間インキュベートする。次にそれ全等容のフェノ
ールで数回抽出し、そしてクロロホルム／イソアミルア
ルコール（２４：１）テ数回抽出する。ＤＮＡを既知の
方法でエタノールで沈殿させ、そして５．０００ｒｐｍ
で１０分間遠心分離することにより沈降させる。次にそ
れを７０％エタノールで洗浄し、乾燥しそして緩衝液中
にとる。

ｂ）プラスミドの小規模（ミニ）調製 多数のプラスミドの分析を可能とするためにＢｉｒｎｂ
ｏｉｍ（ＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙ、１９７９　
：　Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、７．１５１３）の迅速溶菌法を用い
る。

−夜培養液の菌体懸濁液サンプルｌ　、　５ｒｎＱを１
５．００Ｏｒｐｍで１分間遠心分離することにより沈降
させる。１００μａの溶液Ａ（下記参照）を添加後、そ
の混合物を２０″で５分間インキュベートする。

次に２００μαの溶液Ｂ（下記参照）を添加し、そして
容器を水中に入れる。更に５分後、溶液Ｃ（下記参照）
を添加し、そしてそれらサンプルを染色体ＤＮＡ、　Ｒ
ＮＡおよびタンパクの不溶性コンプレックスが折出する
まで（２〜５分）水中に放置する。遠心分離（１５分間
）後プラスミド含有上清を新しい１．５ｍ（２容プラス
チツク製エツペンドルフ管に移す。

ＤＮＡを一２０°で１０分間エタノールを用いて沈殿さ
せ、そして１５分間遠心分離して沈降させる。次にそれ
を７０％エタノールで２回洗浄しそして（デシケータ−
内で）乾燥する。

４０μＱのＴＥ緩衝液（下記参照）にとった後、それは
形質転換または制限分析に直接使用できる。

Ｂｉｒｎｂｏｉｍ溶液Ａ　：　　　　　　Ｂｉｒｎｂｏ
ｉｍ溶液Ｂ：２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１２、ｐＨ８−
００，２Ｍ　ＮａＯＨ５０ｍＭグルコース　　　　　　
１％ＳＤＳ１０ｍＭ　ＥＤＴＡ Ｂｉｒｎｂｏｉｍ溶液Ｃ：　　　　　　ＴＥ緩衝液：３
Ｍ　Ｎａ０Ａｃ／ＨＯＡｃ、　ｐＨ４，８１０ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ塩基１ｍＭ　ＨＣＱ ｐＨ：　ｓ、。

Ｃ）プラスミドの単離調製 洗剤による限局プロトプラスト溶解によりｍｇ量のプラ
スミドを調製する（Ｈａｒｄｉｅｓｅｔ　ａｌ、、　１
９７９．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５４．５
５２７〜５５３４）。

実施例１で得られた細菌の懸濁液を５　、０００ｒｐｍ
および４°で２０分間遠心分離する。沈降物を１５ｒ！
ＩＱのスクロース溶液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆｆ
、　ｐＨ８，０゜中２５％スクロース）にとる。３ｍＱ
の０．５ＭＥＤＴＡおよび３ｍＱのリソチーム溶液（５
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ、ｐＨ８，０、中２０　ｒｔ
ｒ　ｙ　／　ｍ　Ｑリソチーム）を添加シ、そしてその
混合物を次いで３０〜４０分間水中でインキュベートす
る。次に１０％ポリエチレングリコールモノラウリルエ
ーテル／ｌＯ％デオキシコレートの２　：　ｌ　（Ｖ／
Ｖ）混合物を２ｍＱ添加する。菌体消化液を４０．ＯＯ
Ｏｒｐｍおよび４°で遠心分離（３０分間）することに
より清澄化する。清澄上清を傾瀉し、ｌ１００ｕ／ｒａ
Ｑ　ＲＮａｓｅ　Ａを添加し、そしてその混合物を４５
分間水中でインキュベートする。ＤＮＡを沈殿させるた
めに、そのＲＮａｓｅ−処理上溝を１７２容の１．５Ｍ
　′ＮａＣＱ中３０％ＰＥ０６　、０００と混合し、そ
して更に３０分間水中に放置する。遠心分離を４°で２
０分間、８．０００ｒｐｍで行う。沈殿を５ｍｆｆのＴ
Ｅ緩衝液にとり、５０μｇ／ｌＱプロテイナーゼＫを添
加し、そしてその混合物を３７°で６０分間インキュベ
ートする。次にそれをＴＥ飽和フェノールで数回、そし
てクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）で
数回抽出する。

ＤＮＡをエタノールで沈澱し、洗浄し、そして乾燥する
。沈降物を１〜２ｍＱのＴＥ緩衝液に溶解し、そしてプ
ラスミド収率を２６０ｎｍで分光光度測定法により測定
する。

実施例４ニゲルコースＤＨ産生巨大菌からの染色体ＤＮ
Ａの調製 完全培地中で増殖させた定常期培養液１００＋＋＋Ｑか
らの細菌菌体を５．ＯＯＯｒｐｍ、　４°で１０分間沈
降させる。次に沈降物を１０＋ｘＱの溶菌緩衝液（５０
ｍＭＮａｃＱ、　　５０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　　３０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣＣｐＨ７，９）にとり、４０ｍｇのリ
ソチームを添加し、そしてその混合物を３７°で４５分
間インキュベートする。その懸濁液をＳＤＳ濃度が１％
となるよう調整し、５ｍｇのプロテイナーゼＫ　（Ｅ、
Ｍｅｒｃｋ社（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）製）と混合し、そ
してその混合物を更に３０分間３７゜に放置する。次に
それをＴＥ飽和フェノールで数回、そしてクロロホルム
／イソアミルアルコール（２４：　１）で数回抽出する
。常法により核酸を沈殿させ、洗浄しそして乾燥する。

なおも存在するＲＮＡを加水分解するために、沈降物を
５ｍ１２のＴＥ緩衝液中に注意深く再懸濁し、１０μｇ
　／　＋１１　ＱのＲＮａｓｅを添加し、そしてその混
合物を３７°で３０分間インキュベートする。

次にその溶液をＳＤＳ濃度が１％、ブロテイナーゼに濃
度が５０μｇ／ｍＱとなるように調節し、そして３７°
で更に３０分間処理する。次に、それを前述の如くフェ
ノール、およびクロロホルム／イソアミルアルコールで
抽出し、モしてＴＥ緩衝液に対して透析する。この方法
による染色体ＤＮＡ収量は２〜４ｍｇである。

実施例５ニゲルコースＤＨの酵素アッセイこのアッセイ
のために、非蛍光性クロマトグラフイ紙に９２ｍ１２の
インジケーター溶液を一様に噴霧し、次いで２０°で乾
燥する。

インジケーター溶液： ６０．５罰の燐酸ナトリウム緩衝液（０−１２Ｍ　；　
ｐＨ７，６）３０ｍＱのＤ−グルコース溶液（１０％ｗ
／ｖ）１．５ｍＱのＮＡＤ＋溶液（７０ｍｇ／　ｍｌ２
）酵素アッセイを行う前に調製されたクロマトグラフィ
紙を栄養培地プレート（直径約８０ａ１）の正しいサイ
ズに合わせて切断する。

ファージ溶菌液に対するアッセイを行うために、容易に
肉視できるプラーク（６００〜８００／プレート）の形
成直後に、プレートをインキュベーターから取り出す。

まずペトリ皿をラベルし、そして同様にマークされたア
ッセイ・フィルターを置いてきちっとカバーする。２分
後にそれらを取り出し、熱空気流中で乾燥し、次いで波
長３６６ｎｍの光の下で検査する。活性グルコースＤＨ
がアッセイ・フィルター上に移っていれば、その場合に
はこれらの場所でＮＡＤ＋は蛍光により明確に検出され
得るＮＡＤＨに還元することができる。次にフィルター
・ラベルを用いて栄養培地プレート上の陽性７アージ・
クローンを同定し単離する。

細菌クローンに対するアッセイを行うために、菌体を同
じ方法で２個の栄養培地プレートに移す（１００〜２０
０コロニー／プレート）。それらプレートのうちの一つ
を基準プレート（「マスタープレート」）とし、他を酵
素アッセイに用いる。

これは、細菌をアルミ箔に移し、そして約５μＱの消化
溶液を各コロニーにピペットで注ぐことにより行われる
。菌体をモイスチャー・チェンバー（ｍｏｉｓｔｕｒｅ
　ｃｈａｍｂｅｒ）内で２０°で３０分間インキュベー
トし溶菌させる。次いで前述の如く、アッセイ・フィル
ターを載せ、乾燥し、そして酵素反応の位置を同定する
。基準プレート上での対応する陽性細菌は以後のズラス
ミド単離に用いることができる（実施例３参照）。

消化溶液： １００ｍＭ　　　　燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６，５
２０ｍ１Ｊ　　　　ＥＤＴＡ ５ｍｇ／　ｍＱ　　リソチーム 活性は分光光度計で２５°で測定する。

アッセイ溶液： １２０ｍＭ　　　　燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，６
１００ｍＭ　　　　グルコース ２ｍＭ　　　　ＮＡＤ” 酵素活性（Ｕ／ｍ１２）は１分間あたり転化される基質
！（μモル）として報告される。

実施例６：グルコースＤＨ（Ｉ）遺伝子とプロモーター
ＤＮＡ配列Ｉを含むプラスミドｐＳＡ６７７の構築 出発プラスミドはシャトルベクターｐＪＫ３０２および
本発明のプラスミドベクターｐＪＨ１１１である。

ｐＪＫ３０２はｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒ　ａｔ　
ａｌ、＋　　１９７７、　Ｇｅｎｅ２、９５〜１１３）
およびｐＢｃ１６−１（Ｂｅｒｎｈａｒｄ　ｅｔ　ａｔ
、。

１９７８上記引用文献）から構築することができる。

その構築法は、ＫｒｅｆむおよびＨｕｇｈｅｓ（１９８
２）、上呂引用文献に詳述している。ｐＪＨｌｌｌの構
築法はテキストから明らかである。プラスミドｐＪＫ３
０２からＣ１ａＩおよびＢａｍＨＩ切断部位間の約０．
３ｋｂの大きさのＤＮＡ断片を適当な制限エンドヌクレ
アーゼを用いて既知の方法により切り取る。好ましくは
同じ制限エンドヌクレアーゼを用いて本発明のプラスミ
ドｐＪＨ１ｌｌから約１．４ｋｂ断片を切り取る。この
断片は、就中、グルコースＤＨ（Ｉ）構造遺伝子と本発
明によるＤＮＡ配列配列相当する強力プロモーターを含
む。この断片を自体既知の方法により、関連の断片を予
め標準的な方法例えば電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕ
ｔｉｏｎ）などにより制限混合物から単離した後残余ｐ
ＪＫ３０２プラスミド中にクローン化する。連結は好ま
しくは商業的に入手し得るＴ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｗｅ
ｉｓｓ　ｅｔ　ａｌ、。

１９６８、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、　　２４３
．　４５４３〜４５５５）を用いて行われる。新たに形
成されたプラスミドｐＳＡ６７７は８．ｌｋｂの大きさ
であり、そして大腸菌およびバチルス属に対する複製開
始点、テトラサイクリンおよびアンピシリンに対する抵
抗性マーカーのほか、本発明によるプロモーター配列工
および新規グルコースＤＩ（ｒ　）遺伝子を有する（第
４図および第５図参照）。中間クローニングのために、
任意の所望の大腸菌菌体、例えば大腸菌ＳＦ８　（出典
：５ｔｒｕｈｌ　ａｔ　ａｔ、、　　１９７６＋ＰＮＡ
Ｓ　ＵＳＡ、　７３．１４７４〜１４７５）を自体既知
の方法により、例えば塩化カルシウム法（例えばＣｏｈ
ｅｎａｔ　ａｔ、、　１９７２＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪＳＡ６９、２１１０
〜２１１４）によりｐＳＡ６７７で形質転換し、そして
得られたクローンのグルコースＤＨ活性を実施例５に記
載のアッセイを用いて調べる。同種宿主、例えば巨大菌
、中での形質転換はＶｏｒｏ−ｂｊｅｖａ　ｅｔ　ａｌ
、、　１９８０　（ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　
Ｌｅｔｔ。

７、２６１〜２６３）の方法であって下記のパラメータ
ーに関し改良された方法により行う：ａ）　リソチーム
濃度を約０−５ｍｇ／ｍＱとする。

ｂ）抗生物質を含まない培地中で４〜５時間プロトプラ
スト再生を行う。

Ｃ）形質転換体をテトラサイタリン（約１２．５μ９／
＋ｘＱ）により選別する。

実施例７：グルコースＤＨ（ＩＩ）遺伝子およびプロモ
ーターＤＮＡ配列Ｉを含むプラスミ ドｐＳＡＧ２の構築 まず、約１８０ｂｐの大きさのＸｂａ　Ｉ断片を自体既
知の方法により、制限および引き続く連結によりプラス
ミドｐＳＡ６７７から欠失させる。新たに形成されたプ
ラスミドをｐＳＡＸと称する。関連の形質転換体はもは
やグルコースＤＩ（を産生できない。

プラスミドベクターｐＢｃ１６−１を今度は自体既知の
方法により、実施例６と同様にして、グルコースＤＨ（
ＩＩ）構造遺伝子を含むプラスミドｐＪＨ２１１（グル
コースＤＩ（１）プロモーターは含まない）中にクロー
ン化する。この結果、新規シャトルベクターｐＢＣＧＤ
２が得られる（第８図参照）。

ｐＢＣＯＤ２を今度は、好ましくは制限エンドヌクレア
ーゼＢｃｌＩを用いて切断開環し、そして得られるグル
コースＤＨ（Ｉｔ）構造遺伝子およびリポソーム結合部
位を有するＤＮＡ断片を自体既知の方法でｐＳＡＸの対
応するＡｃｃ　Ｉ切断部位中にクローン化する。尤の場
合制限は、好ましくは、グルコースＤＨ（ＩＩ　）プロ
モーター配列がＢｃｌＩ断片の外に位置するように行わ
れる。次に制限切断部位を既知の方法によりＤＮＡポリ
メラーゼエのクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）断片および適当
なデオキシヌクレオチドを用いて充填する。この場合も
、適当な断片の単離、およびそれらの連結および再環化
には標準的方法が用いられる。本発明による新規ベクタ
ーｐＳＡＧ２は本発明によるＤＮＡ配列配列相当するプ
ロモーター領域の調節下にあるグルコースＤＨ（ＩＩ）
の完全構造遺伝子を含む。この場合も大腸菌菌体が中間
クローニングに用いられ、例えば、大腸菌ＳＦ８　（、
実施例６参照）、を常法によりプラスミドｐＳＡＧ２で
形質転換する。バチルス属菌体の形質転換については実
施例６を参照のこと。

実施例８：クロラムフェニコール・アセチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子とプロモー ターＤＮＡ配列Ｉを含むプラスミド ｐＳＡＣ４の構築 出発プラスミドはプロモーター領域からのＤＮＡ配列配
列上びグルコースＤＨ（Ｉ　）構造遺伝子を含む本発明
によるプラスミドｐＳＡ６７７、および既知の商業的に
入手し得るプラスミド　ｐＣＭ４（Ｃ１ｏｓｅおよびＲ
ｏｄｒｉｇｕａｚ、上記引用文献）である。後者はＣＡ
Ｔ遺伝子のＢａｍＨＩカルツーシュを含む。ｐＳＡ６７
７を自体既知の方法によりＡｃｃ　Ｉで部分加水分解し
、そしてｐＣＭ４は好ましくはＢａｍ）ｌＩで制限する
。制限切断部位を常法によりＤＮＡポリメラーゼエのク
レノー断片および適切なデオキシヌクレオチドを用いて
充填し、そしてそれら断片を標準的方法、例えば電気溶
出により単離する。連結は好ましくはＴ４　ＤＮＡリガ
ーゼを用いて行われる（実施例６参照）。本発明による
新規プラスミドｐＳＡＣ４は従って、就中、ＤＮＡ配列
配列上当するプロモーター領域、ＣＡＴ遺伝子、および
挿入不活化のためにもはや発現され得ないグルコースＤ
Ｈ（Ｉ）遺伝子を含む。それはまたバチルス属および大
腸菌ｏｒｉをテトラサイタリンおよびアンピシリンに対
する抵抗性マーカーと共に含んでいる。大腸菌およびバ
チルス属菌体のｐＳＡＣ４による形質転換は、好ましく
は、実施例６と同様に行われる。

実施例９：巨大菌Ｍ１２９６／　ｐＳＡ６７７（０５Ｍ
４０５０）におけるグルコースＤＨ（Ｉ）の発現 グルコース・デヒドロゲナーゼを発現させるために、１
０１２の栄養溶液（下記参照）に２００＋１１２の２８
°で増殖させた一夜培養液を接種し、そして撹拌（４０
０ｒｐｍ）および通気（４００Ｑ空気／時間）を施しな
がら２８°で２４時間培養を行う。

１８時間増殖させた後、２時間毎にサンプルを採取する
： 玉１・ ｏｏＣｏ　　　　Ｃｏ　　　　豐 ロ　　　ｃｏ　　　　ｃｏ　　　　ｃ。

遠心分離により集菌し、そして菌体内酵素を超音波破砕
により放出する。活性は分光光度計で２５６で測定する
。

アッセイ溶液： １２０　ｍＭ　　　燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，６
１００ｍＭ　　　グルコース ２ｍＭ　　　ＮＡＤ” 酵素活性（０７ｍ６）は、１分間当たり転化される基質
量（μモル単位）として記載される。

栄養溶液： グルタミン酸ナトリウム　　　　５．０ｇコーンスチー
プ　　　　　　　　５．０ｇ（ＮＨ＜）ＪＰＯ＜　　　
　　　　　　　　２−０　９Ｍｇ５０．　　　　　　　
　　　　　０．１　　ｇＦｅＳｏ、　　　　　　　　　
　　　　０．０２９ＣａＣ（２１０，０２９ ＮａＮＯ３０，１９ ホスフ工−ト緩衝液１／３０Ｍ　　　ｐＨ６，８８７％
グリセロール　　　　　　１０．０　　ｙスクロース（
別個に滅菌）　　　　　１０．０　９水道水　　　　　
ａｄｌＯ（２

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミド・ベクターｐＪＨＩ０７の制限地図
である。 第２図はプラスミド・ベクターｐＪＨ１０８の制限地図
である。 第３図はプラスミドｐＪＨ１１１の１１２６ｂｐ断片の
制限地図である。 第４図は巨大筒からのグルコース・デヒドロゲナーゼ遺
伝子のＤＮＡ配列である。 第５図はｐＪＨｌｌｌの発現産生物のアミノ酸配列であ
る。 第６図はｐＪｕ２１１の制限地図である。 第７図はシャトルベクターｐＪＫ３０２とプラスミドｐ
ＪＨ１１１からのハイブリッド・プラスミドｐＳＡ６７
７の構築を示す図である。 第８図はシャトルベクターｐＢＣＧＤ２の制限地図であ
る。 第９図はｐＪＨ２１１とｐＳＡＸからのハイブリッド・
プラスミドｐＳＡＧ２の構築を示す図である。 第１０図はクロラムフェニコール・アセチルトランスフ
ェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子のＢａｍＨＩカルツーシュで
ある。 第１１図はｐＳＡ６７７とｐＣＭ４からのプラスミドｐ
ＳＡＣ４の構築を示す図である。 特許出願人　　メルク・パテント・ゲゼルシャフト・ミ
ツト・ベシュレンクテル・ハフラングＦＩＧ、４ ＡＴＧ−ＴＡＴ−ＡＣＡ−ＧＡＴ−ＴＴＡ−ＡＡＡ−Ｇ
ＡＴ−ＡＡＡ−ＧＴＡ−ＧＴＴ−ＧＴＡ−ＡＴＴ−ＡＣ
Ａ−ＧＧＴ−ＧＧＡ−ＴＣＡ−ＡＣＡ−ＧＧＴ−ＴＴＡ
−ＧＧＡ−ＣＧＣ−ＧＧＡ−ＡＴＧ−ＧＣＴ−ＧＴＴ−
ＣＧＴ−ＴＴＣ−ＧＧＴ−ＣＡＡ−ＧＡＡ−ＧＡＡ−Ｇ
ＣＡ−ＡＡＡ−ＧＴＴ−ＧＴＴ−ＡＴＴ−ＡＡＣ−ＴＡ
Ｔ−ＴＡＣ−ＡＡＣ−ＡＡＴ−ＧＡＡ−ＧＡＡ−ＧＡＡ
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ＧＡＡ−ＧＴＡ−ＧＡＡ−ＧＡＡ−ＧＣＡ−ＧＧＣ−Ｇ
ＧＡ−ＣＡＡ−ＧＣＡ−ＡＴＣ−ＡＴＣ−ＧＴＴ−ＣＡ
Ａ−ＧＧＣ−ＧＡＴ−ＧＴＡ−ＡＣＡ−ＡＡＡ−ＧＡＡ
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ＧＴ−ＧＣＡ−ＴＴＣ−ＴＴＡ−ＧＧＡ−ＡＧＣ−ＣＧ
Ｔ−ＧＡＡ−ＧＣＡ−ＡＴＴ−ＡＡＡ−ＴＡＣ−ＴＴＣ
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ＴＡ−ＴＴＴ−ＧＣＡ−ＧＡＴ−ＧＧＣ−ＧＧＴ−ＡＴ
Ｇ−ＡＣＧ−ＡＡＡ−ＴＡＣ−ＣＣＴ−ＴＣＴ−ＴＴＣ
−ＣＡＡ−ＧＣＡ−ＧＧＡ−ＡＧＡ−ＧＧＣ−ＴＡＡ−
ＴＡＧＦｌ（３，５ Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａ
ｓｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｔｈ
ｒ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　１　ｙ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇ　１ｙ
−Ｌｅｕ−Ｇ　］］ｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａ　
１ａ−Ｖａ　ｌ　−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌ　ｙ−Ｇ　Ｉ
ｎ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　１ｕ−Ａ　１ａ−Ｌｙｓ−Ｖａ　１
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Ａ　ｓ　ｎ−Ａｓ　ｎ−Ｇ　１　ｕ−Ｇ　１　ｕ−Ｇ　
１　ｕ−Ａ　１ａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａ　１　ａ−Ｌｙ
ｓ−Ｌｙｓ−Ｇ　］ｕ−Ｖａ　１−Ｇ　１ｕ−Ｇ　１ｕ
−Ａ　］ａ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ａ　ｌａ
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Ｇ　１ｕ−Ａｓｐ−Ｖａ　１−Ｖａ　ｌ　−Ａｓｎ−Ｌ
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Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａ　１−Ｍｅｔ−１１ｅ−Ａｓｎ−
Ａｓｎ−Ａ　１ａ−Ｇｌ　ｙ−Ｖａ　１−Ｇｌ　ｕ−Ａ
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Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｓ　ｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇ　１　
ｙ−Ａ　１　ａ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌｙ−５ｅｒ−
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ｒ−Ｐｈｅ−Ｖａ　１−Ｇ　１ｕ−Ａｓ　ｎ−Ａｓｐ−
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Ｇ　ｌｙ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｔｈ　ｒ
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Ｇ１　ｙ−Ｔｙｒ−Ａ　１ａ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌ　
ｙ−Ｉ　ｌｅ−Ａｒｇ−Ｖａ　１−Ａｓ　ｎ−Ａｓ　ｎ
−１１ｅ−Ｇｌ　ｙ−Ｐｒｏ−Ｇ　１　ｙ−Ａｌ　ａ−
Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ａｓ　ｎ−
Ａ　１　ａ−Ｇ　１ｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ａ　１　ａ−
Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌ　ｕ−Ｇ　１　ｎ−Ａｒｇ−Ａ　
１ａ−Ａｓ　ｐ−Ｖａ　］−Ｇ　ｌｕ−５ｅｒ−Ｍｅ　
ｔ−Ｉ　１　ｅ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉ
　１　ｅ−Ｇ　１　ｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇ　１ｕ−Ｇ
　１ｕ−Ｖａ　１−Ａ　１ａ−Ａ　１ａ−Ｖａ　１−Ａ
　１ａ−Ａ　１　ａ　−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａ　１　ａ−
Ｓｅ　ｒ−Ｓｅｒ−Ｇ　１　ｎ−Ａ　１ａ−Ｓｅｒ−Ｔ
ｙｒ−Ｖａ　１−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−へ５ｐ−Ｇｌｙ−ＧリーＭｅｔ
−Ｔｈｒ−Ｌ３／Ｓ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｐｈｅ
−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＧｌｙＦＩＧ、６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）少くとも一つのプロモーターおよび一つのターミネ
   ーター領域を含み、そしてそのプロモーター領域を含む
   領域がＤＮＡ配列 I ： 【遺伝子配列があります】 により示されることを特徴とする遺伝子調節単位。 ２）ターミネーター領域を含む領域がＤＮＡ配列II： 【遺伝子配列があります】 により示される請求項１記載の遺伝子調節単位。 ３）巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ
   ）を起源とする請求項１および／または２記載のプロモ
   ーターおよび／またはターミネーター配列。 ４）請求項１記載のＤＮＡ配列 I および酵素グルコー
   ス・デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ配列を含む、
   ｐＳＡ６７７と称され受託番号ＤＳＭ４０５５Ｐを有す
   るプラスミド。 ５）請求項１記載のＤＮＡ配列 I および酵素グルコー
   ス・デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ配列を含む、
   ｐＳＡＧ２と称され受託番号ＤＳＭ４０５４Ｐを有する
   プラスミド。 ６）請求項１記載のＤＮＡ配列 I および酵素クロラム
   フエニコール・アセチルトランスフエラーゼをコードす
   るＤＮＡ配列を含むｐＳＡＣ４と称され受託番号ＤＳＭ
   ４０５３Ｐを有するプラスミド。 ７）プラスミドｐＳＡ６７７で形質転換された巨大菌Ｍ
   １２９６（ＤＳＭ３１９）株から得られるＭ１２９６／
   ｐＳＡ６７７と称され受託番号ＤＳＭ４０５０を有する
   宿主生物。 ８）プラスミドｐＳＡＧ２で形質転換された巨大菌Ｍ１
   ２９６（ＤＳＭ３１９）株から得られるＭ１２９６／ｐ
   ＳＡＧ２と称され受託番号ＤＳＭ４０４８を有する宿主
   生物。 ９）プラスミドｐＳＡＣ４で形質転換された巨大菌Ｍ１
   ２９６（ＤＳＭ３１９）株から得られるＭ１２９６／ｐ
   ＳＡＣ４と称され受託番号ＤＳＭ４０４９を有する宿主
   生物。 １０）ａ）バチルス属の形質転換可能な微生物宿主生物
   、および ｂ）宿主菌体中で自己複製を受けかつ安定であって、巨
   大菌からのターミネーターおよびプロモーター、および
   その複製および発現されるべき構造遺伝子 を含むタンパク取得用細菌クローニング・発現系。 １１）宿主生物が巨大菌である請求項１０記載の系。 １２）特定の構造遺伝子が酵素グルコース・デヒドロゲ
   ナーゼ I 、グルコース・デヒドロゲナーゼIIおよびク
   ロラムフエニコール・アセチルトランスフエラーゼをコ
   ードする請求項 １０または１１記載の系。 １３）請求項１２記載の系を栄養溶液中で培養しそして
   発現により産生されたタンパクを単離することを特徴と
   するタンパクの調製方法。