JPH11313683A - 新規キシロシダーゼ遺伝子、ベクター、それを用いた形質転換体及びその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規なキシロシダーゼ及びその製造法の提
供。 【解決手段】 アスペルギルス・オリゼからキシロシダ
ーゼ遺伝子を取り出し、その DNA配列を決定し、これを
アスペルギルス属菌株に移入して形質転換体を作成す
る。この形質転換体を用いてキシロシダーゼを産生す
る。該キシロシダーゼを用いてキシロオリゴ糖からキシ
ロースを工業的有利に製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アスペルギルス・
オリゼ(Aspergillus oryzae) から得られた新規キシロ
シダーゼ遺伝子、これを含むベクター、そのベクターを
アスペルギルス属菌に移入した形質転換体およびその利
用に関する。アスペルギルス・オリゼのキシロシダーゼ
はキシロースを生成する、産業上重要な酵素であり、本
発明によって得られた形質転換体はキシロシダーゼを著
量に生産し、これらの酵素を用いる産業界に大いに貢献
するものである。

【０００２】

【従来の技術】キシロシダーゼは、β-1,4結合したキシ
ロオリゴ糖に作用して、キシロースを生成する加水分解
酵素である。従来、キシロースの製造は、植物原料を塩
酸分解することにより得られる場合が多いが、精製操作
が煩雑であり、さらに廃液処理等の問題がある。また、
キシロシダーゼを用いてキシロースを酵素分解により得
る方法もあるが、キシロシダーゼの生産が充分に行なわ
れず、この方法で工業的に多量のキシロースを製造する
ことは困難であった。また、従来、一般に微生物を変異
させてその産生する酵素活性を高めたり生産量を多くし
たりすることは行なわれている。このような菌株の育種
法は主に、紫外線や変異誘発剤によって得られる変異株
から選択する方法に限られている。しかし、これらの育
種方法は、安定な変異株を単離するのが困難である。ま
た、キシロシダーゼのみが高生産にならず、本来あった
形質が欠失あるいは変更されてしまうなどの欠点を有し
ている。その結果現在までに本来あった形質を実質的に
有し、キシロシダーゼの生産性のみが上昇した実用菌株
の育種は成功していない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
キシロシダーゼ生産における問題点を解決することを目
的としてなされたものである。すなわち、本発明は微生
物の形質を実質的に欠失あるいは変更することなくキシ
ロシダーゼのみを著量生産する微生物を開発し、そこか
らキシロシダーゼを得ることを課題としてなされたもの
である。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な課題を達成するために各方面から検討した結果、目的
とする微生物を創製するためには、古典的な変異法によ
るよりもキシロシダーゼの遺伝子を単離し、これを直接
使用して遺伝子操作によりキシロシダーゼ産生菌株を得
ることが最も好ましいという観点にたった。特に、黄麹
菌の１種であるアスペルギルス・オリゼ由来のキシロシ
ダーゼ遺伝子の構造については、全く未知であり、ま
た、該遺伝子の単離すらされていないのが実状である。
この観点にたち、キシロシダーゼ生産菌として知られて
いるアスペルギルス・オリゼのキシロシダーゼ遺伝子に
着目した。そして研究、検討を重ねた結果、同菌由来の
染色体 DNAライブラリーを作成し、目的とするキシロシ
ダーゼをコードする遺伝子をクローニングすることに成
功した。そして更に、これらクローン化することに成功
したキシロシダーゼをコードする遺伝子を有する染色体
DNA断片およびｃDNA についてこれらをアスペルギルス
属菌 (例えばアスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス
・カワチ等) といった宿主ベクター系に移入することに
成功し、得られた形質転換体においてもこれらの遺伝子
が発現することも確認した。更にまた同菌のmRNAから合
成したｃDNA よりキシロシダーゼ遺伝子をコードする遺
伝子をRACE法を用いてクローニングすることに成功し
た。

【０００５】すなわち、本発明者らは、アスペルギルス
・オリゼのキシロシダーゼ遺伝子に着目し、アスペルギ
ルス・オリゼのゲノムDNA の制限酵素断片よりキシロシ
ダーゼをコードするDNA 断片をクローン化し、これをア
スペルギルス・カワチの宿主ベクター系に移入する形質
転換体を得ることに成功した。ここで得られたキシロシ
ダーゼ高生産アスペルギルス属菌の組換え体の一例は、
Aspergillus kawachii XYL1 として工業技術院生命工
学工業技術研究所に寄託されている (受託番号FERM P-1
6721)。

【０００６】本発明は、これらの知見に基づいてなされ
たものである。すなわち、本発明は、次のキシロシダー
ゼ遺伝子、これを含むベクター、このベクターをアスペ
ルギルス属菌に移入した形質転換体及びこの形質転換体
を用いてキシロシダーゼを生産する方法に関する。 (1) 配列表配列番号１または配列番号２の塩基配列を含
み、キシロシダーゼ遺伝子のプロモーター及び／又はタ
ンパク質をコードする領域を含む DNA。なお、配列表配
列番号１は、塩基配列の１〜314 がプロモーター領域で
あり、315〜2708がタンパクコード領域であり、2709〜2
711(TAG) がストップコドンであり、2712〜5021がター
ミネーター領域である。また、配列表配列番号２には、
2395〜2397にストップコドン(tag) がある。 (2) 配列表配列番号２の塩基配列で示されるアスペルギ
ルス・オリゼのキシロシダーゼのcDNA配列。 (3) 配列表配列番号３のアミノ酸配列をコードするキシ
ロシダーゼ。 (4) キシロシダーゼ遺伝子のDNAを連結したアスペルギ
ルス属菌由来のベクター。 (5) このベクターをアスペルギルス属菌に移入すること
によって得られる、高キシロシダーゼ生産能を有する形
質転換体。 (6) この形質転換体を用いることによってキシロシダー
ゼを効率的に著量に製造する方法。 なお、本発明の DNA及びキシロシダーゼは、配列表に示
される DNA配列あるいはアミノ酸配列ばかりではなく、
これらの配列と相同性を有し、同様の性質を示すものも
包含される。

【０００７】

【発明の実施の形態】次に、本発明を詳細に説明する
が、本発明に用いた染色体DNA 、mRNAおよびキシロシダ
ーゼ酵素の供与体はアスペルギルス・オリゼであり、例
えばアスペルギルス・オリゼHL15株である。

【０００８】本発明のキシロシダーゼのゲノム遺伝子
は、以下のように調製する。 1) 染色体 DNAの調製 黄麹菌、例えばアスペルギルス・オリゼHL15株をＹＰＤ
培地 (２％グルコース、２％ポリペプトン、１％酵母エ
キス（pH6.0)) で培養し、得られる菌体を集菌し、この
菌体を公知の方法 (Iimura, Agric. Biol. Chem., 51,
323-328(1987))に準じてフェノールで抽出し、精製して
染色体DNAを得る。 2) プローブの合成 アスペルギルス・オリゼHL15株の生産するキシロシダー
ゼをリシルエンドペプチダーゼにより分解し (綱沢ら、
蛋白質 核酸 酵素、31, 629, 1986)、２つのペプチド
フラグメントを得、それぞれについてアミノ酸配列をプ
ロテインシークエンサー（アプライドバイオシステム社
製、491 型）により決定する。得られたそれぞれのアミ
ノ酸配列に対応する DNAを合成し、これを後述のプラー
クハイブリダイゼーションのプローブとして使用する。

【０００９】3) 染色体 DNAのライブラリーの調製 上記方法により得られた染色体 DNAを、制限酵素Sau3AI
（TaKaRa酒造社製）によって部分分解し、9-23kbの DNA
断片を得、このDNA断片をファージベクター（lDASH II,
STRATAGENE社製）に導入する。この組み換え体ファー
ジを、in vitroパッケージング後、宿主の大腸菌XL1-Bl
ue (Ｐ2)株 (STRATAGENE社製) を公知の方法 (モレキュ
ラー・クローニング、ｐ2.82-2.107、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー(1982)) により形質転換
して染色体 DNAのライブラリーを得る。 4) クローンの調製 この染色体 DNAのライブラリーを上記のプローブを用い
てプラークハイブリダイゼーション法 (モレキュラー・
クローニング（Molecular Cloning) p2.108-2.113 、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(1982))
によりスクリーニングし、ポジティブプラークを得、こ
のポジティブプラークから目的のファージ DNAを得る。
このファージ DNAをBamHI, PstI 等の制限酵素により消
化し、得られるDNA 断片をpUC119（TaKaRa酒造社製）等
のプラスミドベクターに導入して組み換え体 DNAを得、
この組み換え体 DNAで宿主（大腸菌 JM109株等）を形質
転換して目的のクローンを得る。 5) 塩基配列の解析 キシロシダーゼ遺伝子の塩基配列の決定は、キロシーケ
ンス法、サイクルシーケンス法等の公知の方法により行
なう。

【００１０】6) 形質転換用ベクターの構築および形質
転換 上記で得られた DNA断片をアスペルギルス属菌、例えば
アスペルギルス・オリゼあるいはアスペルギルス・カワ
チのベクターとして例えば、sC遺伝子(Biosci.Biotech.
Biochem., 61(8),1367-1369) 、amdS遺伝子等をマーカ
ーに持つプラスミド pUAMD3 (Journal of Fermentation
and Bioengineering, Vol. 74, No. 6,389-391(199
2))に挿入し、得られた DNAをアスペルギルス属菌に移
入し形質転換体を得る。形質転換方法としては、公知の
方法、例えばAgric. Biol. Chem., Vol.51, 323-328(19
87) に記載された方法あるいはこれに準じた方法がとら
れる。この方法によって形質転換体を得る。アスペルギ
ルス属菌としてはアスペルギルス・カワチ、アスペルギ
ルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ等が用いられ
る。このうちアスペルギルス・カワチはプロテアーゼの
生産量が低いため、過剰発現されたタンパク（酵素）は
分解を受け難く、目的とする外来タンパクの生産が増大
されるので望ましい。 7) キシロシダーゼｃDNA の調製 アスペルギルス・オリゼのキシロシダーゼ遺伝子をアス
ペルギルス・カワチに移入し、キシロシダーゼ活性が上
昇した株を得た。この形質転換アスペルギルス・カワチ
をフスマ抽出物培地にて培養し、得られた菌体より Ana
l. Biochem. 162,156〜159(1987) に記載された方法に
よりmRNAを抽出し、Gene, Vol. 25, 263-269(1983)の記
載の方法にてcDNAを合成し、RACE法により目的のキシロ
シダーゼcDNAを単離する。このcDNAの塩基配列を決定し
たところ、配列表配列番号２の配列を有しており、ゲノ
ムより単離したキシロシダーゼ遺伝子にはイントロンは
存在していない。 8) 形質転換体によるキシロシダーゼの生産 キシロシダーゼ遺伝子を移入したアスペルギルス・カワ
チを、キシランを唯一の炭素源として培養したところ、
親株よりも高いキシロシダーゼ生産能を有していた。ま
た、キシロシダーゼ遺伝子を移入したアスペルギルス・
オリゼも親株より高いキシロシダーゼ生産能を有してい
た。なお、このアスペルギルス・カワチおよびアスペル
ギルス・オリゼともに、生育速度、タンパク生産量の点
でキシロシダーゼ遺伝子移入前のアスペルギルス・カワ
チおよびアスペルギルス・オリゼと顕著な差は認められ
ず、アスペルギルス・カワチおよびアスペルギルス・オ
リゼの形質を実質的に欠失あるいは変更するものではな
かった。

【００１１】以下、本発明を実地例を挙げて更に具体的
に説明する。なお、本発明はここに示される方法に限定
されるものではない。

【実施例１】(1) アルペルギルス・オリゼ染色体 DNAの
調製 アスペルギルス・オリゼの染色体 DNA抽出は、以下の方
法により行った。まず、アスペルギルス・オリゼHL15株
の分生子をスラントより白金耳を用いてかきとり、これ
を 500ml容の三角フラスコに 150mlのＹＰＤ培地 (２％
グルコース、２％ポリペプトン、１％酵母エキス(pH6.
0))を入れたものに接種し、30℃で一昼夜培養した。こ
の培養液をナイロンフィルター濾過により集菌し、得ら
れた菌体を液体窒素中で粉砕した後、５mMトリスバッフ
ァー、0.5%ラウリル硫酸ナトリウム、50mM EDTA (pH8.
0) に懸濁した。この懸濁液に等量のTE飽和フェノール
（100mM トリス- 塩酸、10mM EDTA 、pH8.0 で平衡化し
たもの）を加え、染色体DNA を抽出した。抽出後の溶液
に、1/100 量のRNaseA（10mg/ml)を加え、37℃、30分間
反応させた後、1/10量の3M酢酸ナトリウム(pH5.2) およ
び 2.5倍量のエタノールを加えた。この溶液を20℃で１
時間放置後、遠心分離し、得られた沈殿を70％エタノー
ルで洗浄して乾燥後、TEバッファー（10mMトリスー塩
酸、1mM EDTA、pH8.0)に溶解した。

【００１２】(2) プローブの合成 アスペルギルス・オリゼHL15株のキシロシダーゼをＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一なバン
ドが得られるまで精製した。このキシロシダーゼをリシ
ルエンドペプチダーゼにより分解し、得られたペプチド
のアミノ酸配列をプロテインシーケンサー（アプライド
バイオシステム社製、491 型）により決定した。この配
列の中にGlu-Tyr-Asp-Leu-Ile-Ile-Phe-Ala-Gly-Gly か
らなるアミノ酸配列とAla-Gly-Tyr-Asp-Ile-Glu-Asn-Tr
p-Asp-Asn からなるアミノ酸配列が存在し、これらアミ
ノ酸配列に対応するDNA 塩基配列から、次の配列を有す
る29残基の合成 DNAプローブ（XYLD-1、XYLD-2、いずれ
も４種類のミックスプローブ）を作成した。 このXYLD-1、XYLD-2はそれぞれキシロシダーゼ遺伝子の
クローニング用のプローブとして用いるため各々10pmol
e のオリゴヌクレオチドの5'末端を（γ-³²P)ＡＴＰ
（アマシャム社製）およびＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ（TaKaRa社製）を用いて放射性標識を行った。

【００１３】(3) 染色体 DNAのライブラリーの作成とス
クリーニング 制限酵素Sau3AIで部分消化したアスペルギルス・オリゼ
HL15株の染色体DNA 、9-23kbをλ DASH II（STRATAGENE
社製）に組み換え、アスペルギルス・オリゼHL15株の染
色体ライブラリーを構築した。得られたライブラリーを
大腸菌XL1-BlueMRA(P2)株（STRATAGENE社製）に導入し
(モレキュラー・クローニング、ｐ2.82-2.107、コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(1982)の方法
による)、形質転換体約 100,000個を得た。これら形質
転換体約 100,000個から、前記の DNA混合配列XYLD-1を
プローブとして、プラークハイブリダイゼーション法
(モレキュラー・クローニング、p 2.108-2.113 、コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(1982)) に
よりポジティブプラークを12株得た。

【００１４】このポジティブプラークから、モレキュラ
ー・クローニング、ｐ73-81、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー(1982)記載の方法に従って、組
み換え体ファージ DNAを単離した。単離したファージ D
NAを制限酵素 BamHI, EcoRI,PstI, SalI (TaKaRa 社製)
で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後、XYLD-2
をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行
った。その結果、制限酵素PstIで生じてくる、約5kb の
DNA断片を得た。この DNA断片をプラスミドベクターpU
C119に組み換え、大腸菌JM109 に導入し、pXYL1 と命名
した。この菌株は、Escherichia coli XYL1 と表示さ
れ、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されてい
る (受託番号 FERM P-16720)。

【００１５】(4) アスペルギルス・オリゼのキシロシダ
ーゼを多量に分泌するアスペルギルス・カワチの形質転
換体の作製 前記(3) に記載のキシロシダーゼ遺伝子を含む5.0 kbp
PstI断片を、アスペルギルス・カワチの形質転換ベクタ
ーであるpUAMD3のPstIサイトに連結し、図１に示すpUAM
D-XYL1を作製した。前記(3) に記載のキシロシダーゼ遺
伝子はキシロシダーゼの構造遺伝子領域、プロモーター
領域、ターミネーター領域を含んでいると予想されたの
で、次のようにpUAMD-XYL1のアスペルギルス・カワチへ
の移入を行った。アスペルギルス・カワチをYPD 培地
(２％グルコース、２％ポリペプトン、１％酵母エキ
ス）で30℃、16時間振盪培養した後、得られた菌糸を無
菌水で洗浄した。この菌糸を細胞壁溶解酵素（50mMリン
酸緩衝液 pH6.0、５％ NaCl 、0.5 mg/ml ノボザイム 2
34) に懸濁し、30℃、２時間振盪することによりプロト
プラスト化を図った。

【００１６】得られたプロトプラストをガラスフィルタ
ーでろ過することにより残存する菌糸を除去した。次に
このプロトプラスト 1.0×10⁸ 個を５％ NaCl および 1
0mMCaCl₂ を含む50mM Tris-HCl(pH7.5) 100μl に懸濁
し、これにプラスミドpUAMD-XYL1を加え室温に５分間放
置した後、等量のＰＥＧ溶液（70％ポリエチレングリコ
ール4000、50mM Tris-HCl(pH7.5)、10 mM CaCl₂を含
む）を添加し室温似て10分間放置した。得られたプロト
プラストをamdS培地 (0.2% NaNO₃、0.1 ％ K₂HPO₄、0.
05％ MgSO₄・H₂O 、0.05％KCl 、0.001 ％ FeSO₄、2 ％
寒天、 pH5.5、1Mショ糖、10mMアセトアミド、15mM CsC
l 、1.5 ％寒天) の平板上に塗布し、その上に軟寒天am
dS培地(0.5％寒天）を重層し、30℃で培養した。プラス
ミド pUAMD-XYL1 はアセトアミド分解酵素を含んでお
り、形質転換体はamdS培地上で良好に生育することがで
きた。得られた形質転換体をフスマ抽出物液体培地にお
いて30℃で72時間培養して得られた培養菌体を用いてキ
シロシダーゼ活性を測定した。その結果を表１に示し
た。

【００１７】

【表１】 上記のようにプラスミドpUAMD-XYL1でアスペルギルス・
カワチを形質転換し、得られた形質転換体は、Aspergil
lus kawachii XYL1 として工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託した (受託番号 FERM P-16721)。

【００１８】

【実施例２】キシロシダーゼを多量に分泌するアスペル
ギルス・オリゼの形質転換体の作製 前記実施例１と同様の方法でアスペルギルス・オリゼ中
にプラスミドpUAMD-XYL1を移入して、プラスミドpUAMD-
XYL1の移入されたアスペルギルス・オリゼを作製した。
得られた形質転換体を用いて麹を作製し、キシロシダー
ゼ活性を測定した。その結果を表２に示した。

【００１９】

【表２】

【００２０】

【実施例３】 塩基配列の解析 実施例１(3) で得られた組み換え体プラスミドpXYL1 を
用い、キロシークエンス用欠失キット（TaKaRa社製）を
用いて、ヘニコフ（Henikoff）の方法 (Gene)、28,p351
-359(1984))に従い、組み換え体プラスミドDNA 、pXYL1
遺伝子に種々の欠失が導入されたプラスミド DNAを作
製し、前項と同様に大腸菌 JM109株（TaKaRa社製）に形
質転換した。この様にして得られた大腸菌よりプラスミ
ド DNAを調製し、サイクルシーケンス（Innis, Proc. N
atl. Acad. Sci. USA. 85, p 9436-9440, 1988）を行っ
た。塩基配列の決定には、アプライドバイオシステム社
製、373A-18 型および 310型を使用した。その結果、配
列表配列番号3 に示すキシロシダーゼ遺伝子のコーディ
ング領域のＤＮＡ配列を得た。この全塩基配列は2394bp
であり、Met で始まる 798個のアミノ酸からなるペプチ
ドをコードする。

【００２１】

【発明の効果】本発明によってはじめてアスペルギルス
・オリゼ由来のキシロシダーゼ遺伝子のクローン化に成
功し、そのヌクレオチド配列が解明された。また本発明
においては、クローニングされた上記遺伝子をベクター
に挿入して宿主の形質転換を行うことにも成功した。上
述したことから明らかな如く、本発明によれば、本発明
キシロシダーゼ構造遺伝子の組み込まれた組み換え体DN
Aを含む微生物等を培養することにより、極めて短期間
のうちに、キシロシダーゼを効率よく多量に得ることが
できる。本酵素は、耐塩性および耐熱性を有しており、
食塩を含む溶液中でも十分活性を示す。また、上記遺伝
子は、蛋白質工学用試料として用いることができるの
で、本発明は、産業上極めて有用なものである。また、
キシロースは工業的にも多く使用されているが、その製
造方法はほとんど化学的分解法に頼っている。キシロシ
ダーゼを用いた酵素法によるキシロース生産を行うこと
により、さらに利用範囲を広げることができる。

【００２２】 配列表 配列番号：１ 配列の長さ：５０２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： Genomic DNA 起源生物名: Aspelgillus oryzae 配列： CTGCAGAACC TGCAATTCAG CCTGAATGGA TTGGGTGGTT CAGCATATAT CGGAAATCCC 60 CGCGTCGGAG GAGGTGATCG GCTGCGGGAC TTTCTCGATT CGGGACTTCA TCTGTGGGGG 120 TGAAGTCAAA ATGTTGGAGA TGCTGCGGCA ATGCCGACTT TTTATCCAGA GATAGATGAC 180 GTACACAGCT CAAGGAACGC AGCTAACTCC CTTGCCATGC AGAATGCAAT TGCCCATTGC 240 TATAAATCCG AGCCCACTGC CAGGGTACCA GACGAAAAGA CAGCTCCAGC ACTGGACCAC 300 CGACAATTGC CATTATGCCT GGTGCAGCGT CCATCGTCGC CGTCCTGGCG GCCTTGTTGC 360 CGACCGCTCT TGGTCAAGCA AACCAAAGCT ACGTCGACTA CAACAGCGAA GCGAACCCAG 420 ACCTCTTCTC TGAATGTCTG GAGACCGGTG GTACCTCATT CCCAGACTGC GAAAGCGGTC 480 CCTTGAGCAA GACTCTGGTC TGCGATACTT CGGCAAAACC CCATGATCGA GCTGCTGCCC 540 TCGTCTCCCT CCTGACCTTC GAGGAGCTGG TGAACAACAC CGCCAACACC GGCCATGGTG 600 CCCCTAGAAT CGGCCTGCCC GCGTATCAGG TGTGGAATGA AGCTCTCCAC GGTGTCGCCC 660 ATGCCGATTT CAGCGATGCC GGTGACTTCA GCTGGTCCAC GTCCTTCCCG CAGCCGATCT 720 CGACAATGGC TGCCCTCAAC CGCACCCTAA TTCACCAGAT CGCCACCATC ATCTCCACGC 780 AAGGCCGTGC CTTCATGAAC GCTGGCCGCT ACGGACTCGA CGTCTACTCT CCCAACATCA 840 ATACCTTCCG CCACCCAGTT TGGGGCCGCG GCCAGGAAAC CCCAGGCGAA GACGCCTACT 900 GCCTCGCCTC CACCTACGCA TACGAATACA TCACCGGCAT CCAGGGCGGC GTCGACGCCA 960 ACCCTCTCAA ACTCATCGCA ACAGCGAAGC ACTACGCCGG CTACGATATC GAGAACTGGG 1020 ACAACCACTC CCGGCTCGGT AACGACATGC AAATCACCCA ACAAGACCTG GCCGAATACT 1080 ACACCCCCCA ATTCCTCGTC GCCTCGCGAG ACGCCAAAGT CCACAGCGTG ATGTGCTCCT 1140 ACAACGCCGT CAACGGCGTC CCCAGCTGCT CCAACTCCTT CTTCCTGCAA ACCCTCCTCC 1200 GCGACACCTT CGACTTCGTC GAAGACGGCT ACGTCTCCGG CGACTGCGGC GCAGTCTACA 1260 ACGTCTTCAA CCCGCACGGC TACGCCACCA ACGAATCATC CGCCGCCGCA GACTCCATCC 1320 GCGCAGGAAC CGACATCGAC TGCGGCGTCT CCTACCCACG CCACTTCCAA GAATCCTTCC 1380 ACGACCAGGA AGTCTCCCGA CAAGACCTCG AACGCGGCGT CATCCGTCTC TACGCCAGCC 1440 TCATCCGCGC AGGCTACTTC GACGGCAAAA CCAGTCCATA CCGCAACATA ACCTGGTCCG 1500 ACGTGGTGTC CACCAACGCC CAAAACCTCT CCTACGAAGC CGCCGCCCAA AGCATCGTCC 1560 TGCTCAAAAA CGACGGCATC CTCCCCCTTA CCTCCACCAG TTCCTCCACA AAAACCATCG 1620 CCCTAATCGG CCCCTGGGCA AACGCAACCA CCCAAATGCT AGGCAACTAC TACGGCCCAG 1680 CCCCCTACCT AATCAGCCCG CTGCAAGCCT TCCAAGACTC AGAATACAAA ATCACCTACA 1740 CCATCGGCAC AAACACAACC ACCGACCCGG ACTCCACCTC CCAATCCACC GCCCTCACCA 1800 CCGCCAAAGA AGCAGACCTA ATCATCTTCG CCGGCGGCAT CGACAACACC CTCGAAACCG 1860 AAGCCCAAGA CCGCAGCAAC ATAACCTGGC CCTCCAACCA ACTCTCCCTA ATAACCAAGC 1920 TCGCGGACCT AGGCAAACCC CTCATCGTCC TCCAAATGGG CGGCGGGCAG GTCGACTCCT 1980 CCGCCCTGAA GAACAACAAG AACGTCAACG CCTTGATTTG GGGCGGATAC CCGGGTCAGT 2040 CGGGTGGACA GGCCCTGGCC GATATCATCA CGGGGAAACG GGCCCCCGCG GCTCGGCTAG 2100 TTACGACGCA GTATCCGGCT GAGTACGCCG AGGTGTTCCC GGCTATTGAT ATGAATCTGA 2160 GACCGAATGG GTCGAATCCA GGACAAACTT ATATGTGGTA TACCGGGACG CCGGTTTATG 2220 AGTTTGGACA TGGGCTGTTT TATACTAATT TCACTGCTTC TGCTTCTGCG GGTAGTGGGA 2280 CTAAGAATCG GACGTCGTTT AATATCGATG AGGTTCTGGG ACGCCCGCAT CCTGGGTATA 2340 AGCTGGTGGA GCAGATGCCG TTGTTGAATT TTACGGTCGA CGTGAAGAAT ACTGGAGACA 2400 GGGTGTCGGA TTATACTGCC ATGGCGTTTG TGAATACGAC TGCTGGGCCG GCGCCGCATC 2460 CTAATAAGTG GCTGGTTGGG TTTGATCGGT TGAGTGCTGT CGAGCCTGGG TCGGCGAAGA 2520 CTATGGTTAT TCCGGTGACG GTGGATAGTC TGGCTCGGAC TGATGAGGAG GGGAATCGGG 2580 TGTTGTATCC TGGACGGTAT GAAGTGGCGT TGAATAATGA GAGGGAGGTG GTTTTGGGAT 2640 TTACGCTCAC GGGGGAGAAG GCTGTGCTTT TCAAGTGGCC TAAGGAGGAG CAGTTGATTG 2700 CGCCGCAGTA GATTGGGATA GTTCTATTTT GATGTAATGA TGTGGTTTGC TAGAAAGATA 2760 TGAAGAGAGA GTACTGCTTA TGATAGATTC ATTCTATATG CAATTTCATG GTGATTCAAA 2820 CGTGACTGTG TAGGAATGGT GTAAACCAAG ACATGCTAGT TCCTCCGTCA ACGATCTCAT 2880 CAGCATCGTT GTTCTATTTT ACGGTAACTG TGCTTCACGA AGTAGAAGGC TTTGTCTCAA 2940 TCATCTGAAC AAGCTCATCA TACTCGCCCG TATTGCGCAA CATATCCCAG AAGATGCCTT 3000 CTTTCTTGAC AAGGTTGGCG GGCGTATCGT TCCTATTGTG TCCGTTAGTA TCAGCACAAT 3060 ACTACAAATC ACTCAGTTTG ATTAATAGAT CGAGGAAGGA ACATACTCAA TAATCTCCCC 3120 ATCGGCCATA ACAAGCACCC GATCATAGTC CATAATGGTC CTCAGCCGAT GCGCGATAGC 3180 GATAATAGTG CAATCAGGGA ACATCTCCCT CAGGACACGC TGCATATGCA TATCCGTCTC 3240 ATGGTCAACG GATGCCGTCG CCTCGTCCAG CAGCACGACC TTTGACCGTC GACACATGGC 3300 CCGGGCGAGA CTGAGCACCT GACGCTGGCC CTGGCTGAAG TTCTCGCCGT TAGCCGCCAC 3360 AGGCGTATCC AGGGCGAGAG GACGGGCCGT TTTGGCGGGA TGGGCGTGGT CTGCCTGGTC 3420 GCTGCCGTCA GGACATGGAT GGAGGTGCAG GCTGCCAGGG CGGAGGCAAG TTCTGTTTCG 3480 CTGGACTCGC CGAATGGGTC GAGGTTCGAG TGGACGTCCC CCGAAAAAAG GACTGGTTCT 3540 TGCGGGATCA AGGTTACGCT GGTGCGAAGT CGGTTGAGGA GGATCTTGGT GATGTCGACT 3600 CCATCGATGG TTATCTGACC AGAGGCGATG TTCACAAATC GTAATAACGA TAGTCCAAGG 3660 GTGCTTTTGC CACTTCCTGT TCGACCGACG AGGCCAATGC GCTCCCCTGG ATTCGCGACG 3720 AAAGACACAT TGCGTAGGAC GTCGGGGCCG TCTTCCTGGT ATCGCGCGGT GACGTTATGA 3780 AACTCGACAC GGCCGGATGT AGGCCAGCTG GCTGGGACGA CTGAGGATTT TGCGTGGTCT 3840 TCACTCAGGT GTTCCTCAGG TTCGATATCT GCGTATTCAC GCACCCGTTG GAAACAGTTC 3900 AGCTCGACTT CCAGCTCGTT CATTGTCCGC ACAAGGTTCA GGATATTCTG GCTGAGACCG 3960 ATGGCATTGG TCAATGAGAA ACCAACCAGC CCGGCTGGTC CAGACCAAAA GTAGGCCACG 4020 CAGCCGGCCG CGGCTGCAAC AGATGCGGCA CAGAGATCCG ATCGGACGGA TATCCAACGG 4080 TTGCAGTTAT ACTGTGTTTC CGCGGAGCGA GCATGAACAG CTAGTTTCTC GGCGAGGAGC 4140 CTCTGGAACA CGAGATCCAT ATCCTTGCGG GCACGAATCA CGCACAGGCC AGACAGAGAA 4200 TCGGTAAAAT GTGAAAACAC TGGAGAGTAG TTGATGGATG TCAGCCGCTT GATGGAGACC 4260 TGAGTGCGAG TGTACATCTC TCCGATGATG AACCCAACCG TGCATATAAC AGCTGCCGGA 4320 AGAGCAAATA TAGGCATAAT AGAGGCAACA CTGGCAATGC GAAGCAAGAA CCGCAACCCG 4380 TTCTCAATGG ACATCCGCAG CCAGTCTATC AGAACTGTGT CTAGCGACCG TGTGTCATTT 4440 CCAAACCGGT TAATCAATCG TCCGATTGGA TTCTGGTCGA ACCAGGAAAT GGGGGCAGAT 4500 AGAACCGCTG TCACCAATCG CCTGTGCATC TTTTTTGCAG CTGACCAGCT CCCGTACTGA 4560 TAGAGGAGAT TACCACTTAG CTGTAGCAAC AGGAAGAGGA TGATTGATGC GGCGTAGACC 4620 CCTAAATAGT AAAGGGAATT TGCATTCTCG TACTCCTCGT AGGCACGCAT CCAAATAGAA 4680 AGCCAGTAGG TGATCGCAAA GTAAGCAAGT TGCACTGCGA TAGTCACAGC CATTGCTAGA 4740 AGCGCGTAGC AAGGCCCGCC GAATAAGAGG ATGTATTGTA AGGCTTGAGA AAATGGTTAG 4800 GCGTGCTTTG AGAAGTTTAC GGGGTGTAAC ATACCTAAAG TGCGCGGCAC ACGGCCAGTA 4860 GCTGATGTTT CCTTTGCTAT GCGCGATACC TGTGGACTTT GTTGCTCATG TGCAGGGGCA 4920 ATGGTGGTTG TAGGCTCTGA AGGAACATCA AGGGGTTCTT CTACTATCAG GGGGTTACAC 4980 TAAGGATAAC GAATCCGTGT CTGTTGCAGG GTGTACTGCG A 5021

【００２３】 配列番号：２ 配列の長さ：２３９７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列： ATGCCTGGTG CAGCGTCCAT CGTCGCCGTC CTGGCGGCCT TGTTGCCGAC CGCTCTTGGT 60 CAAGCAAACC AAAGCTACGT CGACTACAAC AGCGAAGCGA ACCCAGACCT CTTCTCTGAA 120 TGTCTGGAGA CCGGTGGTAC CTCATTCCCA GACTGCGAAA GCGGTCCCTT GAGCAAGACT 180 CTGGTCTGCG ATACTTCGGC AAAACCCCAT GATCGAGCTG CTGCCCTCGT CTCCCTCCTG 240 ACCTTCGAGG AGCTGGTGAA CAACACCGCC AACACCGGCC ATGGTGCCCC TAGAATCGGC 300 CTGCCCGCGT ATCAGGTGTG GAATGAAGCT CTCCACGGTG TCGCCCATGC CGATTTCAGC 360 GATGCCGGTG ACTTCAGCTG GTCCACGTCC TTCCCGCAGC CGATCTCGAC AATGGCTGCC 420 CTCAACCGCA CCCTAATTCA CCAGATCGCC ACCATCATCT CCACGCAAGG CCGTGCCTTC 480 ATGAACGCTG GCCGCTACGG ACTCGACGTC TACTCTCCCA ACATCAATAC CTTCCGCCAC 540 CCAGTTTGGG GCCGCGGCCA GGAAACCCCA GGCGAAGACG CCTACTGCCT CGCCTCCACC 600 TACGCATACG AATACATCAC CGGCATCCAG GGCGGCGTCG ACGCCAACCC TCTCAAACTC 660 ATCGCAACAG CGAAGCACTA CGCCGGCTAC GATATCGAGA ACTGGGACAA CCACTCCCGG 720 CTCGGTAACG ACATGCAAAT CACCCAACAA GACCTGGCCG AATACTACAC CCCCCAATTC 780 CTCGTCGCCT CGCGAGACGC CAAAGTCCAC AGCGTGATGT GCTCCTACAA CGCCGTCAAC 840 GGCGTCCCCA GCTGCTCCAA CTCCTTCTTC CTGCAAACCC TCCTCCGCGA CACCTTCGAC 900 TTCGTCGAAG ACGGCTACGT CTCCGGCGAC TGCGGCGCAG TCTACAACGT CTTCAACCCG 960 CACGGCTACG CCACCAACGA ATCATCCGCC GCCGCAGACT CCATCCGCGC AGGAACCGAC 1020 ATCGACTGCG GCGTCTCCTA CCCACGCCAC TTCCAAGAAT CCTTCCACGA CCAGGAAGTC 1080 TCCCGACAAG ACCTCGAACG CGGCGTCATC CGTCTCTACG CCAGCCTCAT CCGCGCAGGC 1140 TACTTCGACG GCAAAACCAG TCCATACCGC AACATAACCT GGTCCGACGT GGTGTCCACC 1200 AACGCCCAAA ACCTCTCCTA CGAAGCCGCC GCCCAAAGCA TCGTCCTGCT CAAAAACGAC 1260 GGCATCCTCC CCCTTACCTC CACCAGTTCC TCCACAAAAA CCATCGCCCT AATCGGCCCC 1320 TGGGCAAACG CAACCACCCA AATGCTAGGC AACTACTACG GCCCAGCCCC CTACCTAATC 1380 AGCCCGCTGC AAGCCTTCCA AGACTCAGAA TACAAAATCA CCTACACCAT CGGCACAAAC 1440 ACAACCACCG ACCCGGACTC CACCTCCCAA TCCACCGCCC TCACCACCGC CAAAGAAGCA 1500 GACCTAATCA TCTTCGCCGG CGGCATCGAC AACACCCTCG AAACCGAAGC CCAAGACCGC 1560 AGCAACATAA CCTGGCCCTC CAACCAACTC TCCCTAATAA CCAAGCTCGC GGACCTAGGC 1620 AAACCCCTCA TCGTCCTCCA AATGGGCGGC GGGCAGGTCG ACTCCTCCGC CCTGAAGAAC 1680 AACAAGAACG TCAACGCCTT GATTTGGGGC GGATACCCGG GTCAGTCGGG TGGACAGGCC 1740 CTGGCCGATA TCATCACGGG GAAACGGGCC CCCGCGGCTC GGCTAGTTAC GACGCAGTAT 1800 CCGGCTGAGT ACGCCGAGGT GTTCCCGGCT ATTGATATGA ATCTGAGACC GAATGGGTCG 1860 AATCCAGGAC AAACTTATAT GTGGTATACC GGGACGCCGG TTTATGAGTT TGGACATGGG 1920 CTGTTTTATA CTAATTTCAC TGCTTCTGCT TCTGCGGGTA GTGGGACTAA GAATCGGACG 1980 TCGTTTAATA TCGATGAGGT TCTGGGACGC CCGCATCCTG GGTATAAGCT GGTGGAGCAG 2040 ATGCCGTTGT TGAATTTTAC GGTCGACGTG AAGAATACTG GAGACAGGGT GTCGGATTAT 2100 ACTGCCATGG CGTTTGTGAA TACGACTGCT GGGCCGGCGC CGCATCCTAA TAAGTGGCTG 2160 GTTGGGTTTG ATCGGTTGAG TGCTGTCGAG CCTGGGTCGG CGAAGACTAT GGTTATTCCG 2220 GTGACGGTGG ATAGTCTGGC TCGGACTGAT GAGGAGGGGA ATCGGGTGTT GTATCCTGGA 2280 CGGTATGAAG TGGCGTTGAA TAATGAGAGG GAGGTGGTTT TGGGATTTAC GCTCACGGGG 2340 GAGAAGGCTG TGCTTTTCAA GTGGCCTAAG GAGGAGCAGT TGATTGCGCC GCAGtag 2397

【００２４】 配列番号：３ 配列の長さ：７９８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Pro Gly Ala Ala Ser Ile Val Ala Val Leu Ala Ala Leu Leu 5 10 15 Pro Thr Ala Leu Gly Gln Ala Asn Gln Ser Tyr Val Asp Tyr Asn 20 25 30 Ser Glu Ala Asn Pro Asp Leu Phe Ser Glu Cys Leu Glu Thr Gly 35 40 45 Gly Thr Ser Phe Pro Asp Cys Glu Ser Gly Pro Leu Ser Lys Thr 50 55 60 Leu Val Cys Asp Thr Ser Ala Lys Pro His Asp Arg Ala Ala Ala 65 70 75 Leu Val Ser Leu Leu Thr Phe Glu Glu Leu Val Asn Asn Thr Ala 80 85 90 Asn Thr Gly His Gly Ala Pro Arg Ile Gly Leu Pro Ala Tyr Gln 95 100 105 Val Trp Asn Glu Ala Leu His Gly Val Ala His Ala Asp Phe Ser 110 115 120 Asp Ala Gly Asp Phe Ser Typ Ser Thr Ser Phe Pro Gln Pro Ile 125 130 135 Ser Thr Met Ala Ala Leu Asn Arg Thr Leu Ile His Gln Ile Ala 140 145 150 Thr Ile Ile Ser Thr Gln Gly Arg Ala Phe Met Asn Ala Gly Arg 155 160 165 Tyr Gly Leu Asp Val Tyr Ser Pro Asn Ile Asn Thr Phe Arg His 170 175 180 Pro Val Trp Gly Arg Gly Gln Glu Thr Pro Gly Glu Asp Ala Tyr 185 190 195 Cys Leu Ala Ser Thr Tyr Ala Tyr Glu Tyr Ile Thr Gly Ile Gln 200 205 210 Gly Gly Val Asp Ala Asn Pro Leu Lys Leu Ile Ala Thr Ala Lys 215 220 225 His Tyr Ala Gly Tyr Asp Ile Glu Asn Trp Asp Asn His Ser Arg 230 235 240 Leu Gly Asn Asp Met Gln Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Glu Tyr 245 250 255 Tyr Thr Pro Gln Phe Leu Val Ala Ser Arg Asp Ala Lys Val His 260 265 270 Ser Val Met Cys Ser Tyr Asn Ala Val Asn Gly Val Pro Ser Cys 275 280 285 Ser Asn Ser Phe Phe Leu Gln Thr Leu Leu Arg Asp Thr Phe Asp 290 295 300 Phe Val Glu Asp Gly Tyr Val Ser Gly Asp Cys Gly Ala Val Tyr 305 310 315 Asn Val Phe Asn Pro His Gly Tyr Ala Thr Asn Glu Ser Ser Ala 320 325 330 Ala Ala Asp Ser Ile Arg Ala Gly Thr Asp Ile Asp Cys Gly Val 335 340 345 Ser Tyr Pro Arg His Phe Gln Glu Ser Phe His Asp Gln Glu Val 350 355 360 Ser Arg Gln Asp Leu Glu Arg Gly Val Ile Arg Leu Tyr Ala Ser 365 370 375 Leu Ile Arg Ala Gly Tyr Phe Asp Gly Lys Thr Ser Pro Tyr Arg 380 385 390 Asn Ile Thr Trp Ser Asp Val Val Ser Thr Asn Ala Gln Asn Leu 395 400 405 Ser Tyr Glu Ala Ala Ala Gln Ser Ile Val Leu Leu Lys Asn Asp 410 415 420 Gly Ile Leu Pro Leu Thr Ser Thr Ser Ser Ser Thr Lys Thr Ile 425 430 435 Ala Leu Ile Gly Pro Trp Ala Asn Ala Thr Thr Gln Met Leu Gly 440 445 450 Asn Tyr Tyr Gly Pro Ala Pro Tyr Leu Ile Ser Pro Leu Gln Ala 455 460 465 Phe Gln Asp Ser Glu Tyr Lys Ile Thr Tyr Thr Ile Gly Thr Asn 470 475 480 Thr Thr Thr Asp Pro Asp Ser Thr Ser Gln Ser Thr Ala Leu Thr 485 490 495 Thr Ala Lys Glu Ala Asp Leu Ile Ile Phe Ala Gly Gly Ile Asp 500 505 510 Asn Thr Leu Glu Thr Glu Ala Gln Asp Arg Ser Asn Ile Thr Trp 515 520 525 Pro Ser Asn Gln Leu Ser Leu Ile Thr Lys Leu Ala Asp Leu Gly 530 535 540 Lys Pro Leu Ile Val Leu Gln Met Gly Gly Gly Gln Val Asp Ser 545 550 555 Ser Ala Leu Lys Asn Asn Lys Asn Val Asn Ala Leu Ile Trp Gly 560 565 570 Gly Tyr Pro Gly Gln Ser Gly Gly Gln Ala Leu Ala Asp Ile Ile 575 580 585 Thr Gly Lys Arg Ala Pro Ala Ala Arg Leu Val Thr Thr Gln Tyr 590 595 600 Pro Ala Glu Tyr Ala Glu Val Phe Pro Ala Ile Asp Met Asn Leu 605 610 615 Arg Pro Asn Gly Ser Asn Pro Gly Gln Thr Tyr Met Trp Tyr Thr 620 625 630 Gly Thr Pro Val Tyr Glu Phe Gly His Gly Leu Phe Tyr Thr Asn 635 640 645 Phe Thr Ala Ser Ala Ser Ala Gly Ser Gly Thr Lys Asn Arg Thr 650 655 660 Ser Phe Asn Ile Asp Glu Val Leu Gly Arg Pro His Pro Gly Tyr 665 670 675 Lys Leu Val Glu Gln Met Pro Leu Leu Asn Phe Thr Val Asp Val 680 685 690 Lys Asn Thr Gly Asp Arg Val Ser Asp Tyr Thr Ala Met Ala Phe 695 700 705 Val Asn Thr Thr Ala Gly Pro Ala Pro His Pro Asn Lys Trp Leu 710 715 720 Val Gly Phe Asp Arg Leu Ser Ala Val Glu Pro Gly Ser Ala Lys 725 730 735 Thr Met Val Ile Pro Val Thr Val Asp Ser Leu Ala Arg Thr Asp 740 745 750 Glu Glu Gly Asn Arg Val Leu Tyr Pro Gly Arg Tyr Glu Val Ala 755 760 765 Leu Asn Asn Glu Arg Glu Val Val Leu Gly Phe Thr Leu Thr Gly 770 775 780 Glu Lys Ala Val Leu Phe Lys Trp Pro Lys Glu Glu Gln Leu Ile 785 790 795 Ala Pro Gln 798

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のプラスミドpUAMD-XYL1の制限酵素地図
を図示したものである。

【符号の説明】 XYL1P はキシロシダーゼプロモーターを示す。XYL1はキ
シロシダーゼコード領域を示す。XYL1T はキシロシダー
ゼターミネーターを示す。amdSはアセトアミダーゼ遺伝
子を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:66） (72)発明者 伊藤 清 広島県東広島市鏡山３−７−１ 国税庁醸 造研究所所内

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表配列番号１の塩基配列を含み、キ
   シロシダーゼ遺伝子のプロモーター及び／又はタンパク
   質をコードする領域を含む DNA。
2. 【請求項２】 アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus
   oryzae) から単離されたキシロシダーゼ遺伝子である請
   求項１記載の DNA。
3. 【請求項３】 配列表配列番号２の塩基配列を含み、キ
   シロシダーゼ遺伝子のタンパク質をコードする領域を含
   むcDNA。
4. 【請求項４】 配列表配列番号３のアミノ酸配列をコー
   ドするキシロシダーゼ。
5. 【請求項５】 アスペルギルス属(Aspergillus) 菌由来
   の請求項１〜３のいずれかに記載の DNAを含んだベクタ
   ー。
6. 【請求項６】 アスペルギルス属菌がアスペルギルス・
   カワチ(Aspergilluskawachii) である請求項５記載のベ
   クター。
7. 【請求項７】 プラスミドpUAMD-XYL1である請求項６記
   載のベクター。
8. 【請求項８】 請求項５〜７のいずれかに記載のベクタ
   ーをアスペルギルス属(Aspergillus）菌に移入すること
   によって得られる、キシロシダーゼ酵素生産能を上昇せ
   しめた形質転換体。
9. 【請求項９】 アスペルギルス属菌がアスペルギルス・
   カワチ(Aspergilluskawachii) である請求項８記載の形
   質転換体。
10. 【請求項１０】 FREM P-16721である請求項９記載の形
    質転換体。
11. 【請求項１１】 請求項８〜１０のいずれかに記載の形
    質転換体を培養し、培養物中のキシロシダーゼを産生せ
    しめ、これを採取することを特徴とするキシロシダーゼ
    製造法。