JP2001505403A - エステラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 種々の生物Staphylothermus、Pyrodictium、Archaeoglobus、Aquifex、MllTL、Thermococcus、Teredinibacter、およびSulfolobus由来のエステラーゼ酵素を開示する。これらの酵素は、天然または組換え宿主細胞から産生され、医薬品工業、農業、および他の工業で利用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 エステラーゼ 本発明は、新しく同定されたポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドによりコ ードされるポリペプチド、該ポリヌクレオチドおよび該ポリペプチドの使用、な らびに該ポリヌクレオチドおよび該ポリペプチドの製造および単離に関する。よ り詳細には、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、エステラーゼと して同定されたものと推定される。エステラーゼは、エステル基の有機酸および アルコールへの加水分解を触媒する酵素である。 多くのエステラーゼが周知であり、細菌、酵母、ならびに他の高等動物および 植物など、多種多様な生物中に見出されている。エステラーゼの代表例は、脂質 の加水分解、アシドリシス（エステル化された脂肪酸の遊離脂肪酸への変換）反 応、エステル交換反応（トリグリセリド間の脂肪酸の交換）およびエステル合成 に使用されるリパーゼである。リパーゼの主な工業用途としては、洗濯物の汚れ に含まれる脂肪質を、容易に除去可能な親水性物質に分解するためにリパーゼが 利用される洗剤業界；チーズの製造に、チーズの熟成および着香に、パン製品用 の老化防止剤として、更に、マーガリン、および天然バター香味料を含む他のス プレッドの製造にリパーゼが使用される食品および飲料業界；ならびに消化助剤 としてリパーゼが使用される医薬品業界が挙げられる。 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、その酵素活性から、エステ ラーゼとして同定されている。 本発明の一つの態様によれば、新規な酵素、ならびに該酵素の活性断片、類似 体、および誘導体が提供される。 本発明のもう１つの態様によれば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、およびゲノムＤＮＡ を含む、本発明の酵素ならびに該酵素の活性類似体および断片をコードする単離 された核酸分子が提供される。 本発明のもう１つの態様によれば、ATCC寄託番号 に含まれるＤＮＡによ り発現される成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供される。 本発明の更に別の態様によれば、前記酵素の発現を促進する条件下で、本発明 の核酸配列を含有する組換え原核および／または真核宿主細胞を培養する工程、 およびそれに続いて前記酵素を回収する工程を含む組換え技術により、このよう なポリペプチドを製造する方法が提供される。 本発明の更に別の態様によれば、このような酵素、またはこのような酵素をコ ードするポリヌクレオチドを、エステル基の分解により有機酸およびアルコール を生成するために利用する方法が提供される。本発明のエステラーゼは、高温お よび有機溶剤中において安定であり、従って、医薬品工業、農業、およびその他 の化学工業で使用される光学的に純粋なキラル化合物の製造に使用するための優 れた物質である。 本発明の更に別の態様によれば、本発明の核酸配列にハイブリダイズするのに 十分な長さをもつ核酸分子を含む核酸プローブも提供される。 本発明の更に別の態様によれば、科学研究に関連したin vitroの目的のために 、例えば、ヌクレオチド配列の所定の領域すなわち保存配列領域により、他の生 物由来の類似の酵素をコードする可能性のある類似の配列を同定するためのプロ ーブを作製するために、このような酵素またはこのような酵素をコードするポリ ヌクレオチドを利用する方法が提供される。 本発明のこれらのおよび他の態様は、当業者にとって、本明細書中の教示から 自明であろう。 以下の図面は、本発明の実施態様を説明するものであり、請求の範囲に包含さ れる本発明の範囲を制限するものではない。 図１は、本発明のStaphylothermus marinus F1-12LCの全長ＤＮＡ（配列番号2 3）および対応する推定アミノ酸配列（配列番号33）を示したものである。本発 明のすべての配列について、378自動ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystem s，Inc.）を使用して配列決定を行った。 図２は、Pyrodictium TAG11-17LCの全長ＤＮＡ（配列番号24）および対応する 推定アミノ酸配列（配列番号34）を示したものである。 図３は、Archaeoglobus venificus SNP6-24LCの全長ＤＮＡ（配列番号25）お よび対応する推定アミノ酸配列（配列番号35）を示したものである。 図４は、Aquifex pyrophilus-28LCの全長ＤＮＡ（配列番号26）および対応す る推定アミノ酸配列（配列番号36）を示したものである。 図５は、M11TL-29Lの全長ＤＮＡ（配列番号27）および対応する推定アミノ酸 配列（配列番号37）を示したものである。 図６は、Thermococcus CL-2-30LCの全長ＤＮＡ（配列番号28）および対応する 推定アミノ酸配列（配列番号38）を示したものである。 図７は、Aquifex VF5-34LCの全長ＤＮＡ（配列番号29）および対応する推定ア ミノ酸配列（配列番号39）を示したものである。 図８は、Teredinibacter-42Lの全長ＤＮＡ（配列番号30）および対応する推定 アミノ酸配列（配列番号40）を示したものである。 図９は、Archaeoglobus fulgidus VC16-16MCの全長ＤＮＡ（配列番号31）およ び対応する推定アミノ酸配列（配列番号41）を示したものである。 図10は、Sulfolobus solfataricus P1-8LCの全長ＤＮＡ（配列番号32）および 対応する推定アミノ酸配列（配列番号42)を示したものである。 図11は、本発明のLA11.1エステラーゼes2の全長ＤＮＡ（配列番号23）および 対応する推定アミノ酸配列（配列番号33）を示したものである。 図12は、クジラMatサンプル11.801エステラーゼes9の全長ＤＮＡ（配列番号24 ）および対応する推定アミノ酸配列（配列番号34）を示したものである。 図13は、Mらlosphaera Prunae Ron 12/2エステラーゼ23mclの全長ＤＮＡ（配 列番号25）および対応する推定アミノ酸配列（配列番号35）を示したものである 。 図14は、Thermotoga neapolitana 5068エステラーゼ56mc4の全長ＤＮＡ（配列 番号26）および対応する推定アミノ酸配列（配列番号36）を示したものである。 図15は、Melittangium lichenicolaエステラーゼ77mc1の全長ＤＮＡ（配列番 号27）および対応する推定アミノ酸配列（配列番号37）を示したものである。 図16は、クジラMatサンプル11.801エステラーゼes2の全長ＤＮＡ（配列番号28 ）および対応する推定アミノ酸配列（配列番号38）を示したものである。 図17は、クジラMatサンプルAD3059エステラーゼes4の全長ＤＮＡ（配列番 号29）および対応する推定アミノ酸配列（配列番号39）を示したものである。 図18は、Microscilla furvescensエステラーゼ53sc2の全長ＤＮＡ（配列番号3 0）および対応する推定アミノ酸配列（配列番号40）を示したものである。 図19は、Thermotoga maritima MSB8エステラーゼ6sc1の全長ＤＮＡ（配列番号 31）および対応する推定アミノ酸配列（配列番号41）を示したものである。 図20は、Polyangium brachysporumエステラーゼ78mc1の全長ＤＮＡ（配列番号 32）および対応する推定アミノ酸配列（配列番号42）を示したものである。 「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメン トを意味し、コード領域の前および後の領域（リーダー領域およびテーラー領域 ）ならびに個々のコードセグメント（エキソン）の間の介在配列（イントロン） が含まれる。 ＲＮＡポリメラーゼが２つのコード配列を転写して単一のｍＲＮＡを形成し、 次いで、このｍＲＮＡが、両方のコード配列から誘導されるアミノ酸を有する単 一のポリペプチドに翻訳される場合、コード配列は、他のコード配列と「動作可 能に連結」されているとされる。発現される配列が最終的に所望のタンパク質を 産生するように機能するかぎり、コード配列は互いに隣接している必要はない。 「組換え」酵素とは、組換えＤＮＡ技術により産生された酵素、すなわち、所 望の酵素をコードする外来ＤＮＡ構築物により形質転換された細胞から産生され た酵素を意味する。「合成」酵素とは、化学合成により調製された酵素である。 特定の酵素のＤＮＡ「コード配列」または特定の酵素を「コードするヌクレオ チド配列」とは、適切な調節配列の制御下に置かれたときに、転写および翻訳が 行われて酵素を形成するＤＮＡ配列である。 本発明の態様によれば、図1〜10の推定アミノ酸配列を有する成熟酵素をコー ドする単離された核酸（ポリヌクレオチド）（配列番号23〜32）が提供される。 本発明のもう１つの態様によれば、本発明の酵素をコードする単離されたポリ ヌクレオチドが提供される。寄託物は、本発明の酵素をコードするＤＮＡを含む ゲノムクローンの混合物である。個々のＤＮＡを含む各ゲノムクローンは、pBlu escriptベクター（カリフォルニア州La JollaのStratagene）中に挿入されてい る。この寄託物は、1995年12月13日にAmerican Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，USAに寄託され、ATCC寄託 番号 が付与された。 こうした寄託は、特許手続きのための微生物の寄託の国際承認に関するブダペ スト条約に基づいて行われた。これらの株は、特許の発行に伴い、取消不能であ り、制約や条件なしに一般に分譲されるであろう。こうした寄託は、単に当業者 の便宜を図るために行われるものであり、35 U.S.C．§112の下で寄託が必要で あることを容認するものではない。寄託物中に含まれるポリヌクレオチドの配列 、ならびに該配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書 中の配列に関する記載に抵触した場合の規制に使用される。寄託物の製造、使用 、または販売を行うにはライセンスが必要となることもあるが、本特許では、こ うしたライセンスの付与は行わない。 本発明のポリヌクレオチドは、以下の生物から誘導されたゲノム遺伝子ライブ ラリーから独自に回収された。 Staphylothermus marinus F1は、イタリアのVulcanoで単離された好熱性硫黄 古細菌(archaea)である。85℃（T_max=98℃）、pH6.5において、最適な増殖をす る。 Pyrodictium TAG11は、Middle Atlantic Ridgeで単離された好熱性硫黄古細菌 である。103℃（T_max=110℃）、pH6.5において、最適な増殖をする。 Archaeoglobus venificus SNP6は、Middle Atlantic Ridgeで単離されたもの で、75℃（T_max=92℃）、pH6.9において、最適な増殖をする。 Aquifex pyrophilus KO1 5aは、アイスランド北部のKolbeinsey Ridgeで単離 された。この海洋生物は、グラム陰性、棹状、偏性化学合成無機独立栄養の爆鳴 気細菌である。85℃（T_max=95℃）、pH6.8において、最適な増殖をする。 M11TLは、YellowstoneのDiamond Pool(以前のJim's Black Pool)から単離され たDesulfurococcusの新種である。この生物は、85℃〜88℃、低塩培地中、pH7.0 の最適条件下で、様々な有機物質（硫黄は必要でない）の発酵により従属栄養的 に増殖し、ブドウ状集合体を形成する。 Thermococcus CL-2は、Juan de Fuca RidgeのNorth Cleft Segmentにおいて、 「ブラックスモーカー」の硫化物構造体上に生存するsevered alvinellid 虫から単離された。この海洋古細菌は、多態性球菌を生成し、88℃で最適な増殖 をする。 Aquifex VF5は、イタリアのVulcanoの海辺で単離された。この海洋生物は、グ ラム陰性、棹状、偏性化学合成無機独立栄養の爆鳴気細菌である。85℃（T_max=9 5℃）、pH6.8において、最適な増殖をする。 Teredinibacter（純粋）は、フナクイムシBankia gouldiの内部共生生物であ る。この生物は、真っ直ぐまたは僅かに湾曲した５μm〜10μm桿体を有し、静止 期になると螺旋細胞を形成する。この生物は、Science（1983）22:1401-1403に 記載された。30℃、pH8.0において、最適増殖をする。 Archaeoglobus fulgidus VC16は、イタリアのVulcanoで単離された。この生物 は、85℃（T_max=92℃）、pH7.0において、最適な増殖をする。 Sulfolobus solfataricus P1は、85℃（T_max=87℃）、pH2.0において、最適な 増殖をする。 従って、ポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドによりコードされる酵素 は、それらが単離された生物により特定され、これ以降ではしばしば次のように 記される：F1/12LC（図１ならびに配列番号23および33）、TAG11/17LC（図２な らびに配列番号24および34）、SNP6/24LC（図３ならびに配列番号25および35） 、AqP/28LC（図４ならびに配列番号26および36）、M11TL/29L（図５ならびに配 列番号27および37）、CL-2/30LC（図６ならびに配列番号28および38）、VF5/34L C（図７ならびに配列番号29および39）、Trb/42L（図８ならびに配列番号30およ び40）、VC16/16MC（図９ならびに配列番号31および41）、およびP1/8LC（図10 ならびに配列番号32および42）。 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、表１に示されているように 、ヌクレオチドおよびタンパク質のレベルで、既知の遺伝子および該遺伝子によ りコードされるタンパク質と、同一性を示す。 表１中の同定されたすべてのクローンは、エステラーゼ活性を有するポリペプ チドをコードする。 本発明はまた、本発明の酵素をコードする単離された核酸分子の他に、実質的 に類似の配列をも提供する。単離された核酸配列は、(i)以下に記載の条件下で 、配列番号23〜32のポリヌクレオチドにハイブリダイズできる場合、または(ii) 配列番号23〜32のポリヌクレオチドと縮重したＤＮＡ配列をコードする場合、実 質的に類似しているとされる。縮重ＤＮＡ配列は、配列番号33〜42のアミノ酸配 列をコードするが、ヌクレオチドコード配列中に変異が存在する。本明細書中で 使用する場合、実質的に類似とは、本発明の配列と類似した同一性を有する配列 を意味する。実質的に同一であるヌクレオチド配列は、ハイブリダイゼーション によって、または配列比較によって、同定することができる。実質的に同一であ る酵素配列は、次の方法：すなわち、タンパク質分解消化、ゲル電気泳動、およ び／またはマイクロシークエンシング、のうちの１つ以上によって同定すること ができる。 本発明の酵素をコードする核酸分子を単離する１つの方法は、当該技術分野で 認定されている手順により天然のまたは人工的にデザインされたプローブを用い て遺伝子ライブラリーから釣り上げるものである（例えば、Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel F.M．ら．（編）Green Publishing Company As soc．and John Wiley Interscience，New York，1989，1992を参照されたい）。 配列番号23〜32のポリヌクレオチドまたはそれらの断片（少なくとも12個の隣接 ヌクレオチドを含む）が特に有用なプローブであることは、当業者には認識され る。この目的のための他の特に有用なプローブは、配列番号1〜22の配列のハイ ブリダイズ可能な断片（すなわち、少なくとも12個の隣接ヌクレオチドを含む） である。 本明細書中に開示された特定の核酸配列にハイブリダイズする核酸配列に関し て、低ストリンジェント、中ストリンジェント、更にはストリンジェントの条件 下において、ハイブリダイゼーションを行ってもよい。例えば、オリゴヌクレオ チドのハイブリダイゼーションの場合、最初に、固定化変性核酸を含有したポリ マー膜を、0.9M NaCl、50mM NaH₂PO₄，pH7.0、5.0mM Na₂EDTA、0.5%SDS、10Xデ ンハルト溶液、および0.5mg/mL ポリリボアデニル酸を含有する溶液中において 45℃で30分間プレハイブリダイズする。次に、約２×10⁷cpm（比活性4〜9×10⁸c pm/μg)の³²Ｐ末端標識オリゴヌクレオチドプローブを、溶液に添加する。12時 間〜16時間のインキュベーションの後、0.5％SDSを含有する1X SET（150mM NaCl 、20mMトリス塩酸塩，pH7.8、1mM Na₂EDTA）中において室温で30分間 膜を洗浄し、続いて、オリゴヌクレオチドプローブに対するTm=10℃において新 しい1X SET中で30分間洗浄する。次に、膜をオートラジオグラフィー用フィルム に曝露し、ハイブリダイゼーションシグナルの検出を行う。 ストリンジェント条件とは、少なくとも90％の同一性、好ましくは少なくとも 95％の同一性、最も好ましくは少なくとも97％の同一性が存在する場合にのみ、 ハイブリダイゼーションが起こることを意味する。Sambrookら.，Molecular Clo ning，A Laboratory Manual，第２版，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)を 参照されたい。該文献の全内容は、引用により本明細書中に含まれるものとする 。 本明細書中で使用する場合、互いに適切に並置したとき、例えば、BLASTNによ り並置したとき、最初のＤＮＡ（ＲＮＡ）配列の塩基と、もう１つのＤＮＡ（Ｒ ＮＡ）配列の塩基との間に、少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％または 90％の同一性が存在するならば、最初の配列は、もう１つの配列と、少なくとも 70％、好ましくは少なくとも80％同じである。 本発明は、基準のポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドにも関するが、 ただし、その差異はサイレントなもので、例えば、こうした差異によって、ポリ ヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列は変化しないものとする。本発明 はまた、基準のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに対して、ア ミノ酸の置換、付加、欠失、融合、および切断を引き起こすヌクレオチドの変化 に関する。本発明の好ましい態様において、これらのポリペプチドは、基準のポ リヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと同じ生物学的作用を保持する 。 本発明のポリヌクレオチドは、表１に列挙された生物に由来するゲノム遺伝子 ライブラリーから回収された。遺伝子ライブラリーは、λ ZAP IIクローニング ベクター（Stratagene Cloning Systems）中で作製した。これらのライブラリー に対して大量切出を行って、pBluescriptファージミド中でライブラリーを作製 した。ライブラリーの作製および切出は、以下で説明するプロトコル／方法に従 って実施した。 本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡの形態であってもよいが、 ただし、該ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる 。 ＤＮＡは、二本鎖であっても一本鎖であってもよく、一本鎖の場合、コード鎖ま たは非コード（アンチセンス）鎖であってもよい。成熟酵素をコードするコード 配列は、図1〜10に示されているコード配列（配列番号23〜32)と同じであっても よいし、または、遺伝子コードの重複もしくは縮重の結果として、図1〜10のＤ ＮＡ（配列番号23〜32）と同じ成熟酵素をコードする異なるコード配列であって もよい。 図1〜10の成熟酵素（配列番号33〜42）をコードするポリヌクレオチドとして は、成熟酵素に対するコード配列のみ；成熟酵素に対するコード配列、およびリ ーダー配列またはプロタンパク質配列などの他のコード配列；成熟酵素に対する コード配列（および、場合に応じて他のコード配列）、ならびにイントロンまた は成熟酵素に対するコード配列の5'端および／または3'端の非コード配列などの 非コード配列、が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 従って、「酵素（タンパク質）をコードするポリヌクレオチド」という用語に は、酵素に対するコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびに他のコード 配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチド、が包含される。 本発明は更に、図1〜10の推定アミノ酸配列（配列番号33〜42）を有する酵素 の断片、類似体、および誘導体をコードする、上述のポリヌクレオチドの変異体 に関する。該ポリヌクレオチドの変異体は、該ポリヌクレオチドの天然に存在す る対立変異体であってもよいし、該ポリヌクレオチドの天然に存在しない変異体 であってもよい。 従って、本発明は、図1〜10（配列番号23〜32）に示されているものと同じ成 熟酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびに図1〜10（配列番号23〜32）の 酵素の断片、誘導体、または類似体をコードする、該ポリヌクレオチドの変異体 を含む。こうしたヌクレオチドの変異体には、欠失変異体、置換変異体、および 付加もしくは挿入変異体が含まれる。 上述したように、ポリヌクレオチドは、図1〜10に示されたコード配列（配列 番号23〜32）の天然に存在する対立変異体であるコード配列を有することができ る。当該技術分野で周知のように、対立変異体は、１つ以上のヌクレオチドの置 換、欠失、または付加を有するものであってもよいがコードされる酵素の機能 を実質的に変えない他の形態のポリヌクレオチド配列である。 本発明の全長遺伝子の断片をｃＤＮＡまたはゲノムのライブラリーに対するハ イブリダイゼーションプローブとして使用し、全長ＤＮＡの単離、または該遺伝 子と高い配列類似性を有するかもしくは類似の生物学的活性を有する他のＤＮＡ の単離を行ってもよい。このタイプのプローブは、好ましくは少なくとも10個、 好ましくは少なくとも15個、更に好ましくは少なくとも30個の塩基を含有し、例 えば、少なくとも50個もしくはそれ以上の塩基を含んでいてもよい。また、プロ ーブを使用して、全長転写物に対応するＤＮＡクローンの同定、ならびに調節お よびプロモーター領域、エキソン、およびイントロンを有する完全遺伝子を含む １つまたは複数のゲノムクローンの同定、を行ってもよい。スクリーンの例では 、既知のＤＮＡ配列を使用して遺伝子のコード領域を単離することにより、オリ ゴヌクレオチドプローブの合成が行われる。本発明の遺伝子の配列と相補的な配 列を有する標識化オリゴヌクレオチドを使用して、ゲノムＤＮＡのライブラリー をスクリーニングし、プローブがライブラリーのどのメンバーとハイブリダイズ するかを決定する。 また、プローブの同定を容易にするために、分析により検出可能な試薬で、こ うしたプローブを標識化することができ、しかも標識化することが好ましいと考 えられる。有用な試薬としては、放射能、蛍光色素、または検出可能な産物の形 成を触媒することができる酵素が挙げられるが、これらに限定されるものではな い。この場合、プローブは、ＤＮＡの相補的コピーを他の供給源から単離するう えで、またはこうした供給源をスクリーニングして関連する配列を得るうえで有 用である。 本発明は更に、上述の配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドに関するが 、ただし、配列間に少なくとも70％、好ましくは少なくとも90％、更に好ましく は少なくとも95％の同一性が存在するものとする。本発明は、特に、ストリンジ ェント条件下で、上述のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチ ドに関する。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェント条件」という用語 は、配列間に少なくとも95％、好ましくは少なくとも97％の同一性が存在する場 合にハイブリダイゼーションが起こることを意味する。好ましい実施態様におい て、 上述のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図1〜10の ＤＮＡ（配列番号23〜32）によりコードされる成熟酵素と同じ生物学的な機能ま たは活性を実質的に保持する酵素をコードする。 この他、本発明のポリヌクレオチドの任意の部分とハイブリダイズし、かつ上 述したように該ポリヌクレオチドに対する同一性を有し、かつ活性を保持しても 保持しなくてもよい、少なくとも15個の塩基、好ましくは少なくとも30個の塩基 、より好ましくは少なくとも50個の塩基を、ポリヌクレオチドがもっていてもよ い。例えば、このようなポリヌクレオチドを、配列番号23〜32のポリヌクレオチ ドに対するプローブとして利用し、例えば、ポリヌクレオチドの回収を行ったり 、または診断用プローブとしてもしくはPCRプライマーとして利用してもよい。 従って、本発明は、配列番号33〜42の酵素をコードするポリヌクレオチドに対 して少なくとも70％の同一性、好ましくは少なくとも90％の同一性、より好まし くは少なくとも95％の同一性を有するポリヌクレオチド、およびそれらの断片を 指向するが、ただし、該断片は、少なくとも15個の塩基、好ましくは少なくとも 30個の塩基、最も好ましくは少なくとも50個の塩基を有し、かつ該断片は、スト リンジェント条件下で、本発明のポリヌクレオチドの任意の部分に対して少なく とも90％の同一性、好ましくは約95％の同一性、最も好ましくは少なくとも97％ の同一性を有するものとする。 本発明は更に、図1〜10（配列番号23〜32）の推定アミノ酸配列を有する酵素 、ならびに該酵素の断片、類似体、および誘導体に関する。 図1〜10の酵素（配列番号33〜42）を参照する場合、「断片」、「誘導体」、 および「類似体」という用語は、該酵素と本質的に同じ生物学的機能または活性 を保持する酵素を意味する。従って、類似体には、プロタンパク質部分の開裂に より活性化されて活性な成熟酵素を生成するプロタンパク質が含まれる。 本発明の酵素は、組換え酵素、天然酵素、または合成酵素であってもよいが、 好ましくは組換え酵素である。 図1〜10の酵素（配列番号33〜42）の断片、誘導体、または類似体は、(i)１つ 以上のアミノ酸残基が保存もしくは非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミ ノ酸残基）で置換され、かつこうした置換アミノ酸残基が遺伝子コードによりコ ードされるアミノ酸残基であってもなくてもよいもの、あるいは(ii)１つ以上の アミノ酸残基が置換基を含むもの、あるいは(iii)成熟酵素が、他の化合物、例 えば、酵素の半減期を増大させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）、 と融合されたもの、あるいは(iv)リーダーもしくは分泌配列、または成熟酵素の 精製に利用される配列、またはプロタンパク質配列などの更なるアミノ酸が成熟 酵素に融合されたもの、であってもよい。このような断片、誘導体、および類似 体は、本明細書中の教示から、当業者の範囲内にあるとみなされる。 本発明の酵素およびポリヌクレオチドは、好ましくは、単離された形態で提供 され、しかも、好ましくは、精製されて均質である。 「単離された」という用語は、もとの環境（例えば、天然に存在するものであ れば、自然環境）から物質が取出されたことを意味する。例えば、生存動物中に 存在する天然のポリヌクレオチドまたは酵素は単離されたものではないが、自然 系中の共存物質の一部分またはすべてから分離された同じポリヌクレオチドまた は酵素は単離されたものである。こうしたポリヌクレオチドはベクターの一部分 であってもよく、および／またはこうしたポリヌクレオチドまたは酵素は組成物 の一部分であってもよく、この場合、こうしたポリヌクレオチドまたは酵素が自 然環境の一部分ではないという点で単離されたものである。 本発明の酵素には、配列番号33〜42の酵素（特に、成熟酵素）、および配列番 号33〜42の酵素に対して少なくとも70％の類似性（好ましくは、少なくとも70% の同一性）を有する酵素、より好ましくは、配列番号33〜42の酵素に対して少な くとも90％の類似性（より好ましくは、少なくとも90％の同一性）を有する酵素 、更により好ましくは、配列番号33〜42の酵素に対して少なくとも95％の類似性 （更により好ましくは、少なくとも95％の同一性）を有する酵素が含まれ、その 他に、こうした酵素の一部分が含まれるが、ただし、こうした酵素の一部分は、 一般に、少なくとも30個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも50個のアミノ酸 を含有する。 当該技術分野で周知の通り、２つの酵素の「類似性」は、第１の酵素のアミノ 酸配列および保存アミノ酸配列と、第２の酵素の配列とを比較することによって 、 決定される。 変異体、すなわち、「断片」、「類似体」、または「誘導体」のポリペプチド と、基準のポリペプチドとは、アミノ酸配列に関して、１つ以上の置換、付加、 欠失、融合、および切断が任意の組合せで存在していてもよいという点で、異な っていてもよい。 好ましい変異体としては、保存アミノ酸が置換されているという点で基準物質 と異なる物質が挙げられる。こうした置換では、ポリペプチド中の所定のアミノ 酸が、類似の特性を有する他のアミノ酸と置き換わる。保存的置換の典型的な例 としては、脂肪族アミノ酸Ala、Val、Leu、およびIleの間の相互の交換；ヒドロ キシ残基SerおよびThrの入換え、酸性残基AspおよびGluの交換、アミド残基Asn およびGlnの置換、塩基性残基LysおよびArgの交換、ならびに芳香族残基Pheおよ びTyrの交換が挙げられる。 とりわけ好ましい変異体は、その出発物質である基準のポリペプチドと同じ生 物学的機能および活性を保持するものである。 本発明の酵素の断片または一部分を利用して、対応する全長酵素をペプチド合 成によって生成させてもよく、従って、全長酵素を生成させるための中間体とし て断片を利用してもよい。本発明のポリヌクレオチドの断片または一部分を使用 して、本発明の全長ポリヌクレオチドを合成してもよい。 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクター を用いて遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術による本発明の酵素の産 生に関する。 宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであってもよ い本発明のベクターを用いて遺伝子操作される（形質導入、形質転換またはトラ ンスフェクトされる）。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファ ージなどの形態であってもよい。操作された宿主細胞は、プロモーターの活性化 、形質転換体の選択、または本発明の遺伝子の増幅に適するように改良された従 来の栄養培地中で培養できる。温度、pHなどの培養条件は、発現用に選択された 宿主細胞に対して既に使用した条件であり、当業者には自明であろう。 本発明のポリヌクレオチドを利用して、組換え技術による酵素の産生を行って もよい。この場合、例えば、ポリヌクレオチドは、酵素を発現するための様々な 発現ベクターのうちの任意の１つに含有させてもよい。こうしたベクターには、 染色体、非染色体、および合成のＤＮＡ配列が含まれるが、具体的には、SV40の 誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド ；プラスミドおよびファージＤＮＡ、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏 痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスなどのウイルスのＤＮＡの組合せから誘導され たベクターが挙げられる。しかしながら、宿主中で複製可能かつ生存可能である かぎり、任意の他のベクターを使用してもよい。 様々な手順により、適切なＤＮＡ配列をベクター中に挿入することができる。 一般的には、ＤＮＡ配列は、当該技術分野で周知の手順により、適切な制限エン ドヌクレアーゼ部位に挿入される。このような手順およびその他の手順は、当業 者の範囲内にあるとみなされる。 発現ベクター中のＤＮＡ配列は、適切な発現調節配列（プロモーター）に動作 可能に連結され、ｍＲＮＡ合成を指図する。こうしたプロモーターの代表例とし ては、LTRまたはSV40プロモーター、E．coli．lacまたはtrp、ファージλP_Lプロ モーター、および原核細胞もしくは真核細胞またはそれらのウイルス中で遺伝子 の発現を調節することが知られている他のプロモーターが挙げられる。発現ベク ターにはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーター も含まれる。ベクターには更に、発現を増幅するための適切な配列も含んでもよ い。 この他、発現ベクターには、好ましくは、真核細胞培養株に対するジヒドロ葉 酸レダクターゼ耐性もしくはネオマイシン耐性またはE．coli中におけるテトラ サイクリン耐性もしくはアンピシリン耐性などの、形質転換された宿主細胞選択 用の表現型特性を提供するための１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子が含まれ る。 上述の適切なＤＮＡ配列および適切なプロモーターまたは調節配列を含有する ベクターを利用して、宿主がタンパク質を発現できるように宿主の形質転換を行 ってもよい。 適切な宿主の代表的な例としては、E．coli、Streptomyces、Bacillus subti lisなどの細菌細胞；酵母などの菌類細胞；Drosophila S2、Spodoptera Sf9など の昆虫細胞；CHO、COS、Bowesメラノーマなどの動物細胞；アデノウイルス；植 物細胞などが挙げられる。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の 範囲内にあるとみなされる。 より詳細には、本発明はまた、先に概説した配列を１つ以上含有した組換え構 築物を含む。構築物には、本発明の配列が順方向または逆方向に挿入された、プ ラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターが含まれる。本発明の好ましい 態様において、構築物には更に、例えば、配列に動作可能に連結されたプロモー ターなどの調節配列が含まれる。多数の好適なベクターおよびプロモーターが当 業者には周知であり、市販品もある。次のベクターが具体例として挙げられる。 細菌：pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBluescript II KS、ptrc99a、pKK223-3 、pDR540、pRIT2T（Pharmacia）；真核生物：pXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、 pBPV、pMSG、pSVL、SV40(Pharmacia)。しかしながら、宿主中で複製可能かつ生 存可能であるかぎり、任意の他のプラスミドまたはベクターを使用してもよい。 プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベク ターまたは選択可能なマーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の 遺伝子から選択することができる。２つの適切なベクターは、pKK232-8およびｐ CM7である。細菌プロモーターとしては、特に、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP_R 、P_L、およびtrpが挙げられる。真核プロモーターとしては、極初期CMV、HSVチ ミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウ スメタロチオネイン-Iが挙げられる。適切なベクターおよびプロモーターの選択 は、当該技術分野において十分に通常の技術レベル内にある。 更なる実施態様において、本発明は、上述の構築物を含有する宿主細胞に関す る。宿主細胞は、哺乳類細胞などの高等真核細胞、もしくは酵母細胞などの下等 真核細胞であってもよく、または宿主細胞は、細菌細胞などの原核細胞であって もよい。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション 、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーショ ンによって行うことができる（Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Met hods in Molecular Biology，(1986))）。 宿主細胞中の構築物を従来と同様に使用して、組換え配列によりコードされた 遺伝子産物を生成することができる。この他、本発明の酵素は、従来のペプチド 合成機により合成することができる。 成熟タンパク質は、哺乳類細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で適切なプロ モーターの制御下で発現することができる。また、細胞が関与しない翻訳系を利 用し、本発明のＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡを用いてこうしたタンパク質 を産生することもできる。原核宿主および真核宿主と併用される適切なクローニ ングベクターおよび発現ベクターについては、Sambrookら.，Melecular Cloning :A Laboratory Manual，第２版，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)に記載され ているが、その開示内容は、引用により本明細書中に含まれるものとする。 本発明の酵素をコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、ベクター中へ のエンハンサー配列の挿入により増大される。エンハンサーは、プロモーターに 作用して転写を増大させる通常約10bp〜300bpのシス作用性ＤＮＡエレメントで ある。具体的には、複製起点bp100〜270の後期サイド上のSV40エンハンサー、サ イトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期サイド上の ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。 一般的には、組換え発現ベクターには、複製起点と、宿主細胞の形質転換を可 能にする選択可能なマーカー、例えば、E．coliおよびＳ．cerevisiae TRP1遺伝 子のアンピシリン耐性遺伝子と、下流構造配列の転写を指図するための、高発現 された遺伝子から誘導されるプロモーターとが含まれるであろう。このようなプ ロモーターは、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)、α因子、酸性ホスファタ ーゼ、熱ショックタンパク質などの解糖酵素をコードするオペロンから誘導する ことができる。異種構造配列は、翻訳開始および停止配列ならびに好ましくは翻 訳された酵素の分泌を指図できるリーダー配列と共に、適切な相の中に組み立て られる。場合に応じて、異種配列は、所望の特性を付与する、例えば、発現され た組換え産物を安定化するまたはその精製を単純化する、N末端認識ペプチドを 含む融合酵素をコードすることができる。 細菌に使用するための有用な発現ベクターの構築は、所望のタンパク質をコー ドする構造ＤＮＡ配列を好適な翻訳開始および停止シグナルと一緒に、機能的プ ロモーターを有する動作可能なリーディング相中に挿入することによって行われ る。ベクターには、確実にベクターを維持するために、更に、必要な場合には、 宿主内で増幅を行うために、１つ以上の選択可能な表現型マーカーおよび複製起 点が含まれるであろう。形質転換を行うための好適な原核宿主としては、E．col i、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、ならびにシュードモナス属、 ストレプトミセス属、およびスタフィロコッカス属に属する種々の種が挙げられ るが、これ以外の選択肢も利用できる。 代表的な例として、細菌に使用するための有用な発現ベクターには、選択可能 なマーカーと、周知のクローニングベクターpBR322(ATCC 37017)の遺伝エレメン トを含む市販のプラスミドから誘導された細菌性複製起点とが含まれるが、これ らに限定されるものではない。このような市販のベクターとしては、例えば、pK K223-3（スウェーデンUppsalaのPharmacia Fine Chemicals）およびGEM1（米国 ウィスコンシン州MadisonのPromega Biotec）が挙げられる。これらのpBR322「 バックボーン」セクションは、適切なプロモーターおよび発現される構造配列と 結合される。 好適な宿主株の形質転換および適切な細胞密度までの宿主株の増殖を行ってか ら、選択されたプロモーターを適切な手段により誘発し（例えば、温度変化によ る誘発または化学的な誘発）、その後で更に細胞を培養する。 細胞は、典型的には、遠心分離により回収され、物理的または化学的手段によ り分断され、得られた粗抽出物は、更なる精製のために保持される。 タンパク質の発現に利用される微生物細胞は、凍結融解反復、音波処理、機械 的分断、または細胞溶解剤の使用など、任意の従来法により分断できるが、この ような方法は、当業者には周知である。 組換えタンパク質を発現するために、種々の哺乳類細胞培養系を利用すること もできる。呻乳類発現系としては、例えば、Gluzman，Cell，23:175(1981)に記 載されているサル腎臓線維芽細胞のCOS-7系統、ならびに例えば、C127、3T3、CH O、HeLa、BHK細胞系統などの、適合ベクターを発現することのできる他の細胞系 統が挙げられる。哺乳類発現ベクターには、複製起点と、好適なプロモーターお よびエンハンサーと、更には、任意の必要なリボソーム結合部位と、ポリア デニル化部位と、スプライス供与部位および受容部位と、転写停止配列と、５' 末端非転写配列とが含まれるであろう。SV40スプライスから誘導されたＤＮＡ配 列およびポリアデニル化部位を、必要な非転写遺伝子エレメントを提供するため に使用してもよい。 組換え細胞培養物からの酵素の回収および精製は、硫酸アンモニウムまたはエ タノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホス ホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィ ニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レ クチンクロマトグラフィーなどの方法によって行われる。必要な場合には、成熟 タンパク質の配座を完成させるために、タンパク質の再折畳み工程を使用するこ とができる。最後に、最終精製工程のために高速液体クロマトグラフィー（HPLC ）を利用することができる。 本発明の酵素は、自然精製産物もしくは化学合成法による生成物であってもよ いし、または組換え技術により原核または真核宿主から産生させてもよい（例え ば、細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳類の細胞を培養することにより） 。組換え産生手順で利用される宿主にもよるが、本発明の酵素は、グリコシル化 されていても、されていなくてもよい。本発明の酵素はまた、初期メチオニンア ミノ酸残基を含有してもしなくてもよい。 エステラーゼは、脂肪の代謝における中心的な酵素のグループであり、微生物 から哺乳動物まで、すべての生物に存在する。加水分解反応では、エステル基が 加水分解されて有機酸とアルコールになる。 エステラーゼは、ジカルボン酸ジエステルとジオールのジアセテートとの鏡像 異性を識別する。1995年12月7日出願で発明の名称が「コンビナトリアル酵素開 発」である同一譲受人の同時係属仮出願第60/008,316号に記載の方法を使用して 、エステラーゼの鏡像異性特異性を変えることが可能である。更に、熱安定性エ ステラーゼは、高温および有機溶剤中において優れた安定性を有すると考えられ る。従って、ロバスト性のある触媒が必要となる苛酷な製造法に使用するうえで より好適である。 本発明の用途のように、エステラーゼの科学工業用途は多数存在するが、例え ば次のような用途が挙げられる。 1）エステラーゼは、乳業において、スイス型チーズなどのチーズ用の熟成開 始剤として有用である。 2）エステラーゼは、パルプおよび製紙工業において、セルロースパルプから のリグニンの除去、芳香族酸とリグニンとの間およびリグニンとヘミセルロース との間のエステル結合の開裂によるリグニンの可溶化、更に、生物学的パルプ化 およびパルプの生物学的漂白においてキシラナーゼおよび他のキシラン分解酵素 と併用するときの細胞壁構造の分断に有用である。 3）エステラーゼは、糖誘導体などの炭水化物誘導体の合成に有用である。 4）エステラーゼは、キシラナーゼおよびセルロースと併用する場合、様々な 化学薬品および燃料を製造するためにリグノセルロース廃棄物を発酵性の糖に転 化するうえで有用である。 5）エステラーゼは、植物細胞壁構造、特に、細胞壁マトリックス中でのリグ ニンと炭水化物ポリマーとの共有結合の性質、に関する研究において、研究用試 薬として有用である。 6）エステラーゼはまた、植物の耐病性および有機物質の分解過程に関する機 構の研究において、研究用試薬として有用である。 7）エステラーゼは、消化性の良い動物用飼料、特に、反芻動物用の飼料、を 製造するために育成された植物の選択に有用である。 本発明の配列に対応する酵素に対して生成させた抗体は、動物に酵素を直接注 入することにより、または動物、好ましくはヒト以外の動物、に酵素を投与する ことにより、得ることができる。この場合、こうして得られた抗体は、酵素自体 に結合するであろう。このようにして、酵素の断片だけをコードする配列でさえ も、天然酵素全体に結合する抗体を発生させるために使用することができる。こ のような抗体は、次に、この酵素を発現する細胞から酵素を単離するために使用 することができる。 モノクロナール抗体の調製のために、無限継代固定細胞系の培養により産生し た抗体を提供する任意の技法が使用できる。具体的には、ハイブリドーマ法（Ko hler and Milstein，Nature，256:495-497，1975）、トリオーマ法、ヒトB細 胞ハイブリドーマ法（Kozborら．，Immunology Today 4:72，1983）、およびヒ トモノクロナール抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ法（Coleら.，Monocl onal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R．Liss，Inc.，pp．77-96,1985） が挙げられる。 一本鎖抗体の産生用として報告された技法（米国特許第4,946,778号）を適用 して、本発明の免疫原性酵素産物に対する一本鎖抗体を産生することができる。 また、トランスジェニックマウスを使用して、本発明の免疫原性産物に対するヒ ト化抗体を発現することもできる。 本発明の酵素に対して生成させた抗体は、他の生物およびサンプルから得られ た類似の酵素に対するスクリーニングに使用してもよい。このようなスクリーニ ング技術は当該技術分野で周知であり、例えば、こうしたスクリーニングアッセ イの１つが、Sambrookら.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第２版)， Cold Spring Harbor Laboratory，Section 12.21-12.28(1989)に記載されている が、この全内容は、引用により本明細書中に含まれるものとする。 以下の実施例を参照して本発明を更に説明するが、本発明は、こうした実施例 に限定されるものではないことを理解すべきである。部または量はいずれも、他 に記載のない限り、重量ユニットである。 以下の実施例の理解に役立つように、頻繁に現れる特定の方法および／または 用語について説明する。 「プラスミド」は、大文字および／または数字の前および／または後にある小 文字「p」によって表されている。本明細書中の最初のプラスミドは、市販品と して制約なく一般に入手可能であるか、または報告された手順に従って、入手可 能なプラスミドから構築することができる。更に、記載したものと同等なプラス ミドは、当該技術分野で周知であり、当業者には自明であろう。 ＤＮＡの「消化」とは、ＤＮＡ中の特定の配列にのみ作用する制限酵素による ＤＮＡの触媒切断を意味する。本実施例に使用される種々の制限酵素は、市販さ れており、それらの反応条件、コファクター、および他の要件は、当業者に周知 のものを使用した。分析のために、典型的には、１μgのプラスミドまたはＤＮ Ａ断片を、約20μlの緩衝溶液中の約２ユニットの酵素と併用する。プラスミド 構築用にＤＮＡ断片を単離する目的で、典型的には、５μg〜50μgのＤＮＡを、 より大きい容積中の20ユニット〜250ユニットの酵素を用いて消化する。特定の 制限酵素に対する適切な緩衝液および基質の量は、製造業者の規定による。通常 、37℃において約１時間のインキュベーション時間を使用するが、供給業者の指 示に従って変えてもよい。消化の後、ポリアクリルアミドゲル上で反応物を直接 電気泳動にかけて所望の断片を単離する。 切断断片のサイズ分離は、Goeddelら.，Nucleic Acids Res.，8:4057(1980)に 記載の８パーセントポリアクリルアミドゲルを使用して行った。 「オリゴヌクレオチド」とは、化学的に合成可能な一本鎖ポリデオキシヌクレ オチドまたは二本鎖の相補的ポリデオキシヌクレオチドを意味する。このような 合成オリゴヌクレオチドは５'ホスフェートをもたず、従って、キナーゼの存在 下でATPと共にホスフェートを付加しないかぎり、他のオリゴヌクレオチドに連 結しないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱ホスホリル化されていない断 片に連結するであろう。 「連結反応」とは、２つの二本鎖核酸断片間のホスホジエステル結合の形成過 程を意味する（Maniatis，T.，ら，Id.，P.146）。他に記載のない限り、連結反 応は、既知の緩衝液および条件を使用し、連結されるほぼ等モル量のＤＮＡ断片 0.5μgあたり10ユニットのT4ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて行っても よい。 他に記載のない限り、形質転換は、Sambrookら.，Molecular Cloning:A Labor atory Manual（第２版），Cold Spring Harbor Press(1989)の記載に従って行っ た。 実施例１ 細菌発現およびエステラーゼの精製 本発明の酵素をコードする配列番号33〜42のＤＮＡは、最初に、本明細書中に 記載のプライマーを使用したPCR法により、このようなＤＮＡを含有するpBluesc riptから増幅した。次に、増幅させた配列を、プライマー配列の下に記した各PQ Eベクター中に挿入し、本明細書中に記載のプロトコルに従って酵素の発 現を行った。各遺伝子に対する５'および３'プライマー配列は次の通りである。 指定の制限酵素部位は、各遺伝子に対して指定された細菌発現ベクター上の制 限酵素部位に対応する（カリフォルニア州ChatsworthのQiagen，Inc.）。pQE ベクターは、抗生物質抵抗性(Amp^r)、細菌複製起点(ori)、IPTG調節性プロモー ターオペレーター(P/O)、リボソーム結合部位(RBS)、6-Higタグ、および制限酵 素部位をコードする。 pQEベクターは、指定の制限酵素を用いて消化した。増幅された配列は、それ ぞれのpQEベクター中に連結し、更に、RBSをコードする配列を用いてフレーム中 に挿入した。次に、連結混合物を用いて、エレクトロポレーションによりE.coli 菌株M15/pREP4(Qiagen，Inc.)の形質転換を行った。M15/pREP4には、lacIリプレ ッサーを発現し、更に、カナマイシン耐性(Kan^r)を付与するプラスミドpREP4の 複数のコピーが含まれる。LBプレート上での増殖能力により形質転換体を同定し 、アンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを単 離し、制限分析により確認した。所望の構築物を含有するコロニーを、Amp(100 μg/ml)およびKan(25μg/ml)で補充されたLB培地中で液体培養により一晩(O/N) 増殖させた。O/N培養物を使用し、1:100〜1:250の比で多量の培養物を接種した 。600光学密度(O.D.⁶⁰⁰)が0.4〜0.6になるまで細胞を増殖させた。次に、IPTG( 「イソプロピル-B-D-チオガラクトピラノシド」)を添加して、その最終濃度を1m Mとした。IPTGは、lacIリプレッサーを不活性化することにより、P/Oの清澄化を 誘発し、遺伝子発現を増大させる。更に３時間〜４時間、細胞を増殖させた。次 に、遠心分離により細胞を回収した。 上記のプライマー配列を利用して、上述したハイブリダイゼーション法により 、堆積した物質から標的遺伝子を単離してもよい。 実施例２ 堆積したゲノムクローンからの所定のクローンの単離 目的の遺伝子に対応する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、堆 積した物質から得られた遺伝子を増幅する。目的の遺伝子のＤＮＡ0.1μgを用い て、反応混合物25μl中でポリメラーゼ連鎖反応を行う。反応混合物は、1.5〜5m M MgCl₂、0.01%（w/v）ゼラチン、それぞれ20μMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP、25 pmolの各プライマー、および1.25ユニットのTaqポリメラーゼである。Perkin-El mer Cetus 9600サーマルサイクラーを用いて、30サイクルのPCR（9 4℃において１分間の変性；55℃において１分間のアニーリング；72℃において １分間の伸長）を行う。増幅産物を、アガロースゲル電気泳動により分析し、所 定の分子量を有するＤＮＡバンドを切出して精製する。ＤＮＡ産物のサブクロー ニングおよび配列決定を行うことにより、PCR産物が目的の遺伝子であることを 確認する。実施例３ 発現遺伝子バンクの作製 Hay and Short，Strategies，5:16，1992の方法に従って、M11TL、Thermococc us GU5L5、およびTeredinibacterの生物由来のランダムインサートを有するpBlu escriptプラスミドを含むコロニーを得た。 実施例４ リパーゼ／エステラーゼ活性についてのスクリーニング 得られたコロニーを滅菌された楊枝で採取し、これを用いて96ウェルマイクロ タイタープレートの各ウェルに個々に接種した。ウェルには、100μg/mLアンピ シリン、80μg/mLメチシリン、および10%v/vグリセロールを含有する250μlのLB 培地（LB Amp/Meth,グリセロール）が入っていた。37℃において振盪せずに一晩 、細胞を増殖させた。こうして「供給源遺伝子バンク」の作製を行った。従って 、供給源遺伝子バンクの各ウェルには、独自のＤＮＡインサートを有するpBlues criptがそれぞれ含まれたE．coli細胞のストック培養株が入っていた。 供給源遺伝子バンクのプレートを使用し、各ウェルに200μLのLB Amp/Meth,グ リセロールの入った単一プレート（「集合(condenced)プレート」）に、複数の 接種を行った。この工程は、Beckman BiomekのHigh Density Replicating Tool( HDRT)を使用し、1%漂白剤、水、イソプロパノール、各接種間での空気乾燥滅菌 サイクルを利用して行った。従って、集合プレートの各ウェルには、供給源ライ ブラリープレートのそれぞれから得られた10種〜12種の異なるpBluescriptが入 っていた。37℃で16時間かけて集合プレートを増殖させ、次に、これ を用いて、各ウェルに250μLのLB Amp/Meth(グリセロールなし)の入った２つの 白色96ウェルPolyfiltronicsマイクロタイター娘プレートに接種した。もとの集 合プレートは、-80℃で保存した。この２つの集合娘プレートを、37℃で18時間 インキュベートした。 短鎖エステラーゼ「600μM基質ストック溶液」を、次のように調製した。以下 の各化合物25mgを適切な容量のDMSOに溶解し、25.2mM溶液とした。使用した化合 物は、4-メチルウンベリフェリルプロピオネート、4-メチルウンベリフェリルブ チレート、および4-メチルウンベリフェリルヘプタノエートであった。各DMSO溶 液250マイクロリットルを、0.6%のTriton X-100および1mLあたり0.6mgのドデシ ルマルトシド(Anatrace)を含有した50mM，pH7.5のHepes緩衝液約9mLに添加した 。上記のHepes緩衝液で容積を10.5mLとし、僅かに濁りのある懸濁液を作製した 。 長鎖「600μM基質ストック溶液」を、次のように調製した。上述したように、 以下の各化合物25mgをDMSOに溶解し、25.2mM溶液とした。使用した化合物は、4- メチルウンベリフェリルエライデート、4-メチルウンベリフェリルパルミテート 、４−メチルウンベリフェリルオレエートおよび4-メチルウンベリフェリルステ アレートであった。いずれも、溶解させるために70℃浴中で加温する必要があっ た。上述したように、各DMSO溶液250マイクロリットルをHepes緩衝液に添加し、 10.5mLまで希釈した。７つのウンベリフェロンはすべて、Sigma Chemical Co.か ら入手した。 長鎖エステラーゼまたは短鎖エステラーゼ「600μM基質ストック溶液」50μL を、Biomekを使用して、白色集合プレートの各ウェルに添加し、約100μMの基質 最終濃度とした。基質の添加直後に、プレート読み取り蛍光光度計を用いて、蛍 光値を記録した（励起＝326nm、発光＝450nm）。長鎖基質の場合は70℃において 60分間、短鎖基質の場合は室温で30分間、プレートをインキュベートした。再び 、蛍光値を記録した。最初および最後の蛍光値を比較し、活性クローンが存在す るかどうかを決定した。 実施例５ 活性クローンの単離および精製 活性を有する個々のクローンを単離するために、供給源遺伝子バンクプレート を解凍し、それぞれのウェルを使用してLB Amp/Methを含有する新しいプレート に個々に接種した。上述したように、37℃でプレートをインキュベートして細胞 を増殖させ、Biomekを使用して50μlの600μM基質ストック溶液を添加し、蛍光 を測定した。供給源プレートから活性ウェルを同定したら、この活性ウェルから の細胞を、LB/Amp/Methを含む寒天上に線条接種し、37℃で一晩増殖させて単一 コロニーを得た。滅菌した楊枝を用いて８つの単一コロニーを採取し、これを用 いて96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに個々に接種した。ウェルには 、250μLのLB Amp/Methが含まれていた。細胞は、振盪せずに37℃で一晩増殖さ せた。それぞれのウェルから200μLのアリコートを取出し、上述したように適切 な長鎖または短鎖基質を用いてアッセイを行った。最も活性なクローンを同定し 、残りの50μLの培養物を用いてLB/Amp/Methを含む寒天プレートに線条接種した 。上述したように、８つの単一コロニーを採取し、増殖させ、更に、アッセイを 行った。最も活性なクローンを用いてLB/Amp/Methの培養物3mLに接種し、一晩増 殖させた。培養物からプラスミドＤＮＡを単離し、これを配列決定に利用した。 上記の教示に照らして、本発明の多くの改良および変更が可能であり、従って 、添付の請求の範囲内で、特に説明を行ったもの以外にも、本発明を実施しても よい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 レイド，ジョン アメリカ合衆国 19010 ペンシルバニア 州 ブリン マウア，モントゴメリー ア ベニュー 922 アパートメント ジェイ ２ (72)発明者 メイフィア，アンソニー，エム. アメリカ合衆国 19810 デラウェア州 ウィルミントン，シダー ツリー ドライ ブ 2505―３ エイ (72)発明者 リンク，スチーブン アメリカ合衆国 19803 デラウェア州 ウィルミントン，ギブソン アベニュー 108 (72)発明者 スワンソン，ロナルド，ブイ. アメリカ合衆国 19063 ペンシルバニア 州 メディア，レモン ストリート 309 アパートメント エイ (72)発明者 ワーレン，パトリック，ブイ. アメリカ合衆国 19163 ペンシルバニア 州 フィラデルフィア，シェフィールド アベニュー 35507 (72)発明者 コスモッカ，アンナ アメリカ合衆国 19015 ペンシルバニア 州 ブルックヘイブン，ハリソン ロード 244 (72)発明者 カレン，ウォールター アメリカ合衆国 92117 カリフォルニア 州 サン ディエゴ，ティカムセー ウェ イ 4379

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（a）配列番号33〜42で示されたアミノ酸配列を含む酵素をコードするポ リヌクレオチドに対して少なくとも70%の同一性を有するポリヌクレオチド、 （b）(a)のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド、および （c）(a)または(b)のポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続塩基を含むポ リヌクレオチド、 からなる群より選ばれたメンバーを含む、単離されたポリヌクレオチド。 ２．前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項１に記載のポリヌクレオチド 。 ３．前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項１に記載のポリヌクレオチド 。 ４．配列番号33のアミノ酸1〜414を含む酵素をコードする請求項２に記載のポ リヌクレオチド。 ５．配列番号34のアミノ酸1〜373を含む酵素をコードする請求項２に記載のポ リヌクレオチド。 ６．配列番号35のアミノ酸1〜453を含む酵素をコードする請求項２に記載のポ リヌクレオチド。 ７．配列番号36のアミノ酸1〜343を含む酵素をコードする請求項２に記載のポ リヌクレオチド。 ８．配列番号37のアミノ酸1〜398を含む酵素をコードする請求項２に記載のポ リヌクレオチド。 ９．配列番号38のアミノ酸1〜592を含む酵素をコードする請求項２に記載のポ リヌクレオチド。 １０．配列番号39のアミノ酸1〜354を含む酵素をコードする請求項２に記載の ポリヌクレオチド。 １１．配列番号40のアミノ酸1〜303を含む酵素をコードする請求項２に記載の ポリヌクレオチド。 １２．配列番号41のアミノ酸1〜311を含む酵素をコードする請求項２に記載の ポリヌクレオチド。 １３．配列番号42のアミノ酸1〜305を含む酵素をコードする請求項２に記載の ポリヌクレオチド。 １４．（a）ATCC受託番号 に含まれるＤＮＡにより発現される酵素をコ ードするポリヌクレオチドに対して少なくとも70％の同一性を有するポリヌクレ オチド、 （b）(a)のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド、ならびに （c）(a)および(b)のポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続塩基を含むポ リヌクレオチド、 からなる群より選ばれたメンバーを含む、単離されたポリヌクレオチド。 １５．請求項２に記載のＤＮＡを含む、ベクター。 １６．請求項１５に記載のベクターを含む、宿主細胞。 １７．前記ＤＮＡによりコードされるポリペプチドを請求項１６に記載の宿主 細胞から発現する工程を含む、ポリペプチドの製造方法。 １８．細胞が請求項１５に記載のベクター中に含まれるＤＮＡによりコードさ れるポリペプチドを発現するように、前記ベクターを用いて前記細胞を形質転換 またはトランスフェクトする工程を含む、細胞の製造方法。 １９．配列番号33〜42で示されたアミノ酸配列と少なくとも70％同じであるア ミノ酸配列を含有する酵素からなる群より選ばれたメンバーを含む酵素。 ２０．αケト酸の存在下で、アミノ酸を、配列番号33〜42で示されたアミノ酸 配列を有する酵素からなる群より選ばれた酵素に接触させる工程を含む、アミノ 酸からαケト酸へアミノ基を転移させる方法。