JP2007209359A - エステラーゼ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 種々の生物Staphylothermus、Pyrodictium、Archaeoglobus、Aquifex、M11TL、Thermococcus、Teredinibacter、およびSulfolobus等由来のエステラーゼ酵素を開示する。これらの酵素は、天然または組換え宿主細胞から産生され、医薬品工業、農業、および他の工業で利用することができる。
【選択図】 なし
Description
細菌発現およびエステラーゼの精製
本発明の酵素をコードする配列番号33〜42のDNAは、最初に、本明細書中に記載のプライマーを使用したPCR法により、このようなDNAを含有するpBluescriptから増幅した。次に、増幅させた配列を、プライマー配列の下に記した各PQEベクター中に挿入し、本明細書中に記載のプロトコルに従って酵素の発現を行った。各遺伝子に対する5'および3'プライマー配列は次の通りである。
実施例2
堆積したゲノムクローンからの所定のクローンの単離
目的の遺伝子に対応する2つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、堆積した物質から得られた遺伝子を増幅する。目的の遺伝子のDNA 0.1μgを用いて、反応混合物25μl中でポリメラーゼ連鎖反応を行う。反応混合物は、1.5〜5mM MgCl2、0.01% (w/v) ゼラチン、それぞれ20μMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP、25pmolの各プライマー、および1.25ユニットのTaqポリメラーゼである。Perkin-Elmer Cetus 9600サーマルサイクラーを用いて、30サイクルのPCR(94℃において1分間の変性;55℃において1分間のアニーリング;72℃において1分間の伸長)を行う。増幅産物を、アガロースゲル電気泳動により分析し、所定の分子量を有するDNAバンドを切出して精製する。DNA産物のサブクローニングおよび配列決定を行うことにより、PCR産物が目的の遺伝子であることを確認する。
実施例3
発現遺伝子バンクの作製
Hay and Short, Strategies, 5:16, 1992の方法に従って、M11TL、Thermococcus GU5L5、およびTeredinibacterの生物由来のランダムインサートを有するpBluescriptプラスミドを含むコロニーを得た。
実施例4
リパーゼ/エステラーゼ活性についてのスクリーニング
得られたコロニーを滅菌された楊枝で採取し、これを用いて96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに個々に接種した。ウェルには、100μg/mLアンピシリン、80μg/mLメチシリン、および10% v/v グリセロールを含有する250μlのLB培地(LB Amp/Meth,グリセロール)が入っていた。37℃において振盪せずに一晩、細胞を増殖させた。こうして「供給源遺伝子バンク」の作製を行った。従って、供給源遺伝子バンクの各ウェルには、独自のDNAインサートを有するpBluescriptがそれぞれ含まれたE. coli細胞のストック培養株が入っていた。
実施例5
活性クローンの単離および精製
活性を有する個々のクローンを単離するために、供給源遺伝子バンクプレートを解凍し、それぞれのウェルを使用してLB Amp/Methを含有する新しいプレートに個々に接種した。上述したように、37℃でプレートをインキュベートして細胞を増殖させ、Biomekを使用して50μlの600μM基質ストック溶液を添加し、蛍光を測定した。供給源プレートから活性ウェルを同定したら、この活性ウェルからの細胞を、LB/Amp/Methを含む寒天上に線条接種し、37℃で一晩増殖させて単一コロニーを得た。滅菌した楊枝を用いて8つの単一コロニーを採取し、これを用いて96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに個々に接種した。ウェルには、250μLのLB Amp/Methが含まれていた。細胞は、振盪せずに37℃で一晩増殖させた。それぞれのウェルから200μLのアリコートを取出し、上述したように適切な長鎖または短鎖基質を用いてアッセイを行った。最も活性なクローンを同定し、残りの50μLの培養物を用いてLB/Amp/Methを含む寒天プレートに線条接種した。上述したように、8つの単一コロニーを採取し、増殖させ、更に、アッセイを行った。最も活性なクローンを用いてLB/Amp/Methの培養物3mLに接種し、一晩増殖させた。培養物からプラスミドDNAを単離し、これを配列決定に利用した。
Claims (20)
- (a)配列番号33〜42で示されたアミノ酸配列を含む酵素をコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも70%の同一性を有するポリヌクレオチド、
(b)(a)のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド、および
(c)(a)または(b)のポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続塩基を含むポリヌクレオチド、
からなる群より選ばれたメンバーを含む、単離されたポリヌクレオチド。 - 前記ポリヌクレオチドがDNAである請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドがRNAである請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号33のアミノ酸1〜414を含む酵素をコードする請求項2に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号34のアミノ酸1〜373を含む酵素をコードする請求項2に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号35のアミノ酸1〜453を含む酵素をコードする請求項2に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号36のアミノ酸1〜343を含む酵素をコードする請求項2に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号37のアミノ酸1〜398を含む酵素をコードする請求項2に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号38のアミノ酸1〜592を含む酵素をコードする請求項2に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号39のアミノ酸1〜354を含む酵素をコードする請求項2に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号40のアミノ酸1〜303を含む酵素をコードする請求項2に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号41のアミノ酸1〜311を含む酵素をコードする請求項2に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号42のアミノ酸1〜305を含む酵素をコードする請求項2に記載のポリヌクレオチド。
- (a)ATCC受託番号 に含まれるDNAにより発現される酵素をコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも70%の同一性を有するポリヌクレオチド、
(b)(a)のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド、ならびに
(c)(a)および(b)のポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続塩基を含むポリヌクレオチド、
からなる群より選ばれたメンバーを含む、単離されたポリヌクレオチド。 - 請求項2に記載のDNAを含む、ベクター。
- 請求項15に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 前記DNAによりコードされるポリペプチドを請求項16に記載の宿主細胞から発現する工程を含む、ポリペプチドの製造方法。
- 細胞が請求項15に記載のベクター中に含まれるDNAによりコードされるポリペプチドを発現するように、前記ベクターを用いて前記細胞を形質転換またはトランスフェクトする工程を含む、細胞の製造方法。
- 配列番号33〜42で示されたアミノ酸配列と少なくとも70%同じであるアミノ酸配列を含有する酵素からなる群より選ばれたメンバーを含む酵素。
- αケト酸の存在下で、アミノ酸を、配列番号33〜42で示されたアミノ酸配列を有する酵素からなる群より選ばれた酵素に接触させる工程を含む、アミノ酸からαケト酸へアミノ基を転移させる方法。
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