KR20020093081A

KR20020093081A - 신규한(알)-2-히드록시-3-페닐프로피온산(디-페닐유산)탈수소효소 및 이 것을 코드하는 유전자

Info

Publication number: KR20020093081A
Application number: KR1020027014361A
Authority: KR
Inventors: 고이찌 미야모토; 나오미 수미다; 나오끼 미도; 다께시 무라까미; 라이너 조허; 호르스트 클라인카우프
Original assignee: 메이지 세이카 가부시키가이샤
Priority date: 2000-04-26
Filing date: 2001-04-26
Publication date: 2002-12-12
Also published as: US6916641B2; NO20025126L; NO330796B1; EP1291417B1; KR100808307B1; AU5260801A; NO20025126D0; CA2407059A1; JP4679785B2; CA2407059C; AU2001252608B2; NZ522584A; DE60126767D1; ATE354650T1; US20030186410A1; WO2001081563A1; CN1437651A; CN1254536C; EP1291417A4; DE60126767T2

Abstract

본 발명의 목적은 D-페닐유산 탈수소효소를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 D-페닐유산 탈수소효소를 코드하는 유전자를 제공하는 것이다. 본 발명에 의한 D-페닐유산 탈수소효소는 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 치환, 결실, 부가, 및 삽입으로부터 선택되는 1 이상의 개변을 갖고, D-페닐유산 탈수소효소활성을 갖는 서열번호 2의 아미노산서열의 개변 아미노산서열로 이루어지는 단백질이다. 본 발명에 의한 D-페닐유산 탈수소효소유전자는 D-페닐유산 탈수소효소를 코드하는 누클레오티드서열, 예를 들면 서열번호 1의 누클레오티드서열로 이루어진다.

Description

신규한(알)-2-히드록시-3-페닐프로피온산(디-페닐유산)탈수소효소 및 이 것을 코드하는 유전자{NOVEL(R)-2-HYDROXY-3-PHENYLPROPIONATE(D-PHENYLLACTATE) DEHYDROGENASE AND GENE ENCODING THE SAME}

D-페닐유산은, 아고노마이세탈레스(Agonomycetales)에 속하는 사상균 PF1022균주(Mycelia sterilia, FERM BP-2671)에 의해서 생산되는 PF1022물질[시클로(D-락틸 -L-N-메틸로이실-D-3-페닐락틸-L-N-메틸로이실-D-락틸-L-N-메틸로이실-D-3-페닐락틸-L-N-메틸로이실)](Sasaki, T. et al., J. Antibiotics, 45,692(1992)의 전구물질이다. 최근, PF1022물질을 직접 생산하는 효소 및 이 효소를 코드하는 유전자가 밝혀졌다(WO01/18179A1). 또한, PF1022물질 생산균의 액체배양기간 중에, 외부로부터 페닐유산유도체를 첨가하면, 첨가한 페닐유산유도체를 혼입한 새로운 PF1022물질이 생산되는 것이 알려져 있다(WO97/20945호). 이 경우에 있어서, 첨가하는 전구체는, (R)-2-히드록시유도체인 것이 바람직하다.

미생물이 생산하는 어떤 종의 효소는, 광학적으로 활성인 화합물, 예를 들면 D-유산(Taguchi, H. et al., J. Biol. Chem., 266, P. 12588(1991))을 특이적으로 생산하는 것이 알려져 있다. 또한, 어떤 종의 효소 또는 유용한 효소를 생산하는 미생물을 이용해서 산업상 유용한 화합물, 예를 들면 (R)-2-히드록시-4-페닐부티르산 등을 제조하는 방법은 다수 보고되어 있다(일본국 특허 제2750017호, 동 제2752754호, 동 제2774341호, 동 제2873236호, 일본국 특허공고 1994-61271호, 일본국 특허공개 1994-197774호, 일본국 특허공개 제1998-75797호). 효소를 사용한 반응은, 화학합성에 비하면, 목적하는 화합물을 더욱 더 선택적으로 그리고 능률적으로 제조할 수 있는 것이 특징이지만, 반면에, 효소가 갖는 기질특이성이 엄밀하기 때문에, 목적하는 화합물에 특이적으로 작용하는 효소의 탐색이 필요하다. 이제까지 미생물유래의 D-페닐유산에 특이적인 탈수소효소가 보고된 예는 없다.

본 발명은 광학적으로 활성인 2-히드록시산유도체, 예를 들면 (R)-2-히드록시-3-페닐프로피온산(이하, 「D-페닐유산」으로 약칭한다) 또는 그의 유도체를 제조하기 위한 신규한 D-페닐유산 탈수소효소(이하, 「D-PLDH」로 약칭한다) 및 이 효소를 코드하는 유전자에 관한 것이다.

도 1은 플라스미드 pDPLDH-1의 제작방법을 나타낸 도이다.

본 발명자들은, 페닐피루빈산을 특이적으로 환원하여, D-페닐유산을 생산하는 효소, 즉 D-페닐유산 탈수소효소(D-PLDH) 및 이 효소를 코드하는 유전자를 단리하는 것에 성공했다. 또한, 본 발명자들은 이 유전자를 대장균에서 대량으로 발현시키는 것에 성공했다.

본 발명은 D-페닐유산 탈수소효소를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은, 또한, D-페닐유산 탈수소효소를 코드하는 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은, 또한, D-페닐유산 탈수소효소를 발현시키기 위한 재조합 벡터 및형질전환체 및 D-페닐유산 탈수소효소의 제조법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은, 또한, PF1022물질 및 그의 유도체의 대량생산계 및 그의 제조법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에 의한 D-페닐유산 탈수소효소는, 하기에서 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산서열로 이루어지는 단백질이다.

(a) 서열번호 2의 아미노산서열, 및

(b) 치환, 결실, 부가, 및 삽입에서 선택되는 1 이상의 개변을 갖고, 또한 D-페닐유산 탈수소효소활성을 갖는 서열번호 2의 아미노산서열의 개변 아미노산서열.

본 발명에 의한 D-페닐유산 탈수소효소 유전자는, D-페닐유산 탈수소효소를 코드하는 누클레오티드서열로부터 이루어지는 것이다.

본 발명에 의한 D-페닐유산 탈수소효소 유전자는, 또한, 하기에서 이루어지는 군에서 선택되는 누클레오티드서열로부터 이루어진다.

(c) 서열번호 1의 DNA서열,

(d) 서열번호 1의 DNA서열과 적어도 70%의 상동성을 갖고, 또한 D-페닐유산 탈수소효소활성을 갖는 단백질을 코드하는 누클레오티드서열,

(e) 치환, 결실, 부가, 및 삽입에서 선택되는 1이상의 개변을 갖고, 또한 D-페닐유산 탈수소효소활성을 갖는 단백질을 코드하는 서열번호 1의 DNA서열의 개변 DNA서열, 및

(f) 스트린전트한 조건(stringent conditions)하에서 서열번호 1의 DNA서열과 하이브리다이즈하고, 또한 D-페닐유산 탈수소효소활성을 갖는 단백질을 코드하는 누클레오티드서열.

본 발명에 의한 재조합 벡터는, 본 발명에 의한 D-페닐유산 탈수소효소 유전자로 이루어진다.

본 발명에 의한 형질전환체는, 본 발명에 의한 재조합 벡터로 이루어지는 숙주이다.

본 발명에 의한 D-페닐유산 탈수소효소의 제조법은, 본 발명에 의한 형질전환체를 배양하고, 배양물로부터 D-페닐유산 탈수소효소를 채취하는 공정으로 이루어지는 것이다.

본 발명에 의한 PF1022물질의 생산계는, 본 발명에 의한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 PF1022물질 생산균이다.

본 발명에 의한 PF1022물질의 제조법은, 본 발명에 의한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 PF1022물질 생산균을 배양하고, 배양물로부터 PF1022물질을 채취하는 공정으로 이루어지는 것이다.

미생물의 기탁

실시예 1-1에 기재된 PF1022균주는, 1989년 1월 24일에 통상산업성 공업기술원 미생물공업기술연구소(일본국 이바라키껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반 1고 주오다이6)에 기탁되었다. 기탁번호는 FERM BP-2671이다.

실시예 3-3에 기재된 플라스미드 pDPLDH-1로 형질전환된 대장균(DH5α)은, 2000년 4월 12일에 독립행정법인 산업기술총합연구소 특허생물기탁센타에 기탁되었다. 기탁번호는 FERM BP-7545이다.

유전자 및 단백질

본 발명에 의하면 D-페닐유산 탈수소효소 및 그의 유전자가 제공된다.

본 발명에 의한 효소는, 2-옥소-3-페닐프로피온산(이하 「페닐피루빈산」으로 약칭한다)에 작용해서 이 것을 환원하여, (R)-2-히드록시-3-페닐프로피온산으로 변환한다. 기질인 페닐피루빈산을 미리 수식해 놓음으로써 D-페닐유산의 유도체 또는 유사물질을 제조할 수 있다.

D-페닐유산의 유도체로서는, 예를 들면, P-아미노페닐유산, P-니트로페닐유산, P-히드록시페닐유산을 들 수가 있다. 이 경우, D-페닐유산 유도체의 합성기질로서는, 예를 들면, P-아미노페닐피루빈산, P-니트로페닐피루빈산, P-히드록시페닐피루빈산을 사용할 수 있다.

D-페닐유산의 유사물질로서는, 예를 들면, 항고혈압제의 원료로서 사용되는 (R)-2-히드록시-4-페닐부티르산을 들 수가 있다. 이 경우, D-페닐유산 유사물질의 합성기질로서는, 예를 들면, 2-옥소-4-페닐부티르산을 사용할 수 있다.

서열 (b)에 있어서, 개변의 수는, 예를 들면, 1~수개, 더욱 구체적으로서는 1~6개일 수 있다.

서열 (e)에 있어서, 개변의 수는, 예를 들면, 1~수십개일 수 있다.

서열 (b) 및 서열 (e)에 있어서, 개변이 복수개 존재하는 경우, 도입된 개변의 종류는 동일하거나 상이해도 좋다.

서열 (d)에 있어서, 서열번호 1의 DNA서열과의 상동성은, 바람직하기는 적어도 80%, 더욱 바람직하기는 적어도 90%, 가장 바람직하기는 적어도 95%일 수 있다.

서열 (f)에 있어서, 「스트린전트한 조건」이라 함은, 하이브리다이제이션 후의 멤브레인(membrane)의 세정조작을, 고온하에서, 낮은 염농도의 용액 중에서 행하는 것을 의미하고, 예를 들면 0.2 X SSC (1 X SSC: 15mM 구연산3나트륨, 150mM 염화나트륨), 0.1% SDS용액 중에서 60℃에서 15분간 세정하는 조건을 의미한다.

서열 (b)에 관해서, 「D-페닐유산 탈수소효소활성을 갖는다」아니다 여부는, 예를 들면, D-페닐유산 탈수소효소의 기질(예를 들면, 페닐피루빈산)과 환원형 보효소인 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 인산(NADPH)을 준비하고, 피시험 단백질을 작용시켜, 효소반응에 의해서 생기는 물리화학적 변화, 예를 들면 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 인산의 흡광도 변화 및/또는 생성물인 D-페닐유산의 양적변화를 측정함으로써 평가할 수 있다(실시예 3 참조).

서열 (d),(e), 및 (f)에 관해서, 「D-페닐유산 탈수소효소활성을 갖는 단백질을 코드한다」아니다 여부는, 예를 들면, 피시험 누클레오티드서열을 숙주에서 발현시키고, 얻어진 단백질을 D-페닐유산 탈수소효소의 기질(예를 들면, 페닐피루빈산)과 환원형 보효소인 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티 인산(NADPH)과 작용시키고, 효소반응에 의해서 생기는 물리화학적 변화, 예를 들면, 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 인산의 흡광도 변화 및/또는 생성물인 D-페닐유산의 양적변화를측정함으로써 평가할 수 있다(실시예 3 참조).

본 발명에 의한 효소의 아미노산서열이 부여되면, 이 것을 코드하는 누클레오티드서열은 용이하게 결정되어, 서열번호 2에 기재되는 아미노산서열을 코드하는 여러가지의 누클레오티드서열을 선택할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의한 효소를 코드하는 누클레오티드서열이라함은, 서열번호 1에 기재된 DNA서열의 일부 또는 전부에 더하여, 동일 아미노산을 코드하는 DNA 서열에 있어서 축중관계에 있는 코돈을 DNA서열로서 갖는 서열을 의미하는 것이고, 또한 이들에 대응하는 RNA서열도 포함된다.

본 발명에 의한 효소 및 유전자의 기원은 특히 한정되는 것은 아니고, 본 발명에 의한 효소를 생산할 수 있는 미생물이면 어떤 미생물도 사용할 수 있지만, 바람직하기는 PF1022물질생산균(Mycelia sterilia, FERM BP-2671)이다.

본 발명에 의한 효소의 N말단 아미노산서열은, 예를 들면, SDS-폴리아크릴아미드 전기영동법으로 효소를 영동하고, 얻어진 효소 밴드를 전기적으로 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF)막 등으로 이동시킨 후에, 프로테인 시퀀서(protein sequencer)로 분석하여 결정할 수 있다.

본 발명에 의한 효소의 내부 아미노산서열은, 예를 들면, 효소를 단백질분해효소 등으로 부분 소화한 후에, 상기 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동 이후의 조작 및 역상 크로마토그라피에 의한 분리조작을 실시함으로써 결정할 수 있다.

본 발명에 의한 유전자는, 예를 들면, 다음과 같이 해서 얻을 수 있다.

PF1022물질생산균으로부터 게놈DNA를 추출하고, 적당한 제한효소로 절단한후, 파지 벡터(phage vector)를 사용해서, PF1022물질생산균의 게놈DNA로 이루어지는 라이브러리(library)를 제작한다. 또는, PF1022물질생산균으로부터 전RNA를 추출하고, 프라이머로서 올리고dT를 사용하는 역전사효소반응으로 mRNA에 대응하는 cDNA를 조제한 후, 파지 벡터를 사용해서 PF1022물질생산균의 cDNA로 이루어지는 라이브러리를 제작한다.

D-PLDH의 N말단 아미노산서열 및 내부 아미노산서열을 기초해서, 적당한 프라이머를 합성하고, 이 프라이머와 주형으로서 PF1022물질생산균 유래의 게놈DNA 또는 cDNA를 사용하여 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 행하여, D-PLDH 유전자의 DNA단편을 증폭한다. 이 DNA단편을 프로브로서 사용하여, 게놈라이브러리 또는 cDNA라이브러리의 스크리닝을 행한다. 이와 같이 해서 D-PLDH 유전자의 전영역 또는 발현에 필요한 영역을 단리할 수 있다. 이들의 DNA단편의 염기서열을 결정한 후, 번역개시코돈의 상류 및 번역종결코돈의 하류에, PCR 등의 방법에 의해 적당한 제한효소 절단부위를 도입하여, D-PLDH유전자만을 함유하는 유전자단편을 얻을 수 있다.

재조합 벡터

본 발명에 의하면, D-페닐유산 탈수소효소를 코드하는 누클레오티드서열로 이루어지는 재조합 벡터가 제공된다.

본 발명에 의한 재조합 벡터의 구축의 과정 및 방법은, 유전자공학의 분야에서 관용되고 있는 것을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서 사용할 수 있는 벡터로서는, 숙주염색체 DNA에 병합되는것이나, 자기복제가능한 자율적복제서열을 갖는 벡터를 숙주세포 내에서 플라스미드상태로 존재시키는 것을 들 수가 있고, 예를 들면, pUC벡터(pUC18 또는 pUC118등), pBluescript벡터(pBluescriptⅡ KS+등), 및 pBR322 등의 플라스미드를 들 수가 있다. 숙주세포 내에 존재하는 유전자의 카피수는 1카피 상이어도 좋다.

본 발명에 의한 재조합 벡터는, 예를 들면, D-페닐유산 탈수소효소를 코드하는 누클레오티드서열의 상류에 프로모터를, 또한 하류에 터미네이터(terminator)를 각각 작동가능하게 연결하고, 경우에 따라서는, 유전자마커 및/또는 다른 제어서열을 작동가능하게 연결함으로써 제작할 수 있다.

본 발명에 의한 유전자에 프로모터 및 터미네이터의 연결, 및 발현 유니트의 벡터로의 삽입은, 공지의 방법에 따라서 행할 수 있다.

본 발명에 사용하는 프로모터 및 터미네이터는 특히 한정되지 않고, 예를 들면 3-포스포글리세린산 키나제, 글루타르알데히드-3-인산 데히드로게나제 등의 당분해 효소(glycolysis enzymes) 유전자의 제어서열, 트립토판 신타제 등의 아미노산합성계 효소유전자의 제어서열, 아밀라제, 프로테아제, 리파제, 셀룰라제 등의 가수분해효소유전자의 제어서열, 질산환원효소, 오로티딘-5'-인산탈수소효소, 알콜탈수소효소 등의 산화환원효소유전자의 제어서열, 및 WO01/18219 A1에 기재된Abp1등의 PF1022물질생산균 중에서 고발현하는 PF1022물질생산균 유래의 유전자의 제어서열을 들 수가 있다.

본 발명에 의한 유전자를 다른 단백질의 번역영역을 코드하는 외래유전자와 연결시켜서 융합단백질로서 발현시켜도 좋다.

유전자마커의 도입은, 예를 들면, 제어서열에 PCR법에 의해 적당한 제한효소 절단부위를 도입하고, 이 것을 플라스미드 벡터에 삽입한 후, 약제내성유전자 및/또는 영양요구성 상보유전자 등의 선택 마커유전자를 연결함으로써 행할 수 있다.

선택마커는 형질전환체의 선택방법에 따라서 적당히 선택할 수 있지만, 예를 들면, 약제내성 유전자나 영양요구성을 상보하는 유전자를 사용할 수 있다. 약제내성 유전자로서는, 데스토마이신, 베노밀, 올리고마이신, 하이그로마이신, G418, 플레오마이신, 포스피노트리신(phosphinothricin), 암피실린, 가나마이신 등의 약제에 내성을 주는 유전자를 들 수가 있다. 영양요구성을 상보하는 유전자로서는argB,pyr4,trpC,TRP1,niaD,LEU2,URA3등의 유전자를 들 수가 있다.

형질전환체 및 D-페닐유산 탈수소효소의 제조

본 발명에 의하면 상기 벡터에 의해 형질전환된 숙주가 제공된다.

본 발명에 있어서 사용할 수 있는 숙주는 특별히 한정되지 않으며, 유전자 재조합의 숙주로서 사용될 수 있는 미생물이면 어느 것이라도 사용될 수 있다. 사용할 수 있는 숙주의 예로서는, 임의의 세균류 또는 진균류의 미생물을 들 수가 있고, 바람직하기는 대장균, 유산균, 방선균, 효모, 사상균이고, 더욱 바람직하기는 PF1022물질을 생산하는 사상균이고, 특히 바람직하기는 PF1022균주(Mycelia sterilia, FERM BP-2671) 또는 그의 변이주이다.

숙주로의 유전자발현용의 재조합 벡터의 도입은, 통상의 방법에 따라서 행할 수 있다. 도입법으로서는, 예를 들면, 일렉트로포레이션(electroporation)법, 폴리에틸렌글리콜법, 아글로박테륨법(aglobacterium methods), 리튬법 또는 염화칼슘법 등을 들 수가 있고, 숙주세포에 있어서 능률적인 방법이 선택된다. PF1022물질 생산균을 숙주로서 사용하는 경우, 바람직하기는 폴리에틸렌글리콜법이다.

형질전환체의 배양은 통상의 방법에 따라서, 배지, 배양조건 등을 적당히 선택해서 행할 수 있다. 배지로서는, 통상의 성분들을 사용할 수 있다. 예를 들면, 탄소원으로서는, 글루코스, 수크로스, 물엿, 덱스트린, 전분, 글리세롤, 당밀, 동식물유 등을 사용할 수 있다. 또한, 질소원으로서는, 대두분, 소맥배아, 파마 메디아(pharma media), 콘스팁 리커, 면실박, 육엑스, 폴리펩톤, 맥아 엑스, 이스트엑스, 황산암모늄, 질산나트륨, 요소 등의 유기 또는 무기 질소화합물을 사용할 수 있다. 기타 필요에 따라서, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 코발트, 염소, 인산, 황산 및 기타 이온을 생성할 수 있는 무기염류, 예를 들면, 염화칼륨, 탄산칼슘, 인산수소2칼륨, 황산마그네슘, 인산1칼륨, 황산아연, 황산망간, 황산구리를 첨가하는 것도 유효하다. 또한, 필요에 따라서, 티아민(티아민염산염 등) 등의 각종 비타민, 글루타민산(글루타민산나트륨 등), 아스파라긴(DL-아스파라긴 등) 등의 아미노산, 누클레오티드 등의 핵산류, 항생물질 등의 선택약제를 첨가할 수도 있다. 또한, 균의 발육을 돕고, 본 발명에 의한 효소의 생산을 촉진하는 유기 및 무기물을 적당히 첨가할 수 있다.

배양법으로서는, 호기적 조건에서의 진탕배양법, 통기교반배양법 또는 심부호기배양법에 의해 행할 수 있지만, 특히, 심부호기배양법이 가장 적합하다. 숙주에 따라서는 혐기배양법에 의해 배양할 수 있다.

배지의 pH는, 예를 들면 pH6~pH8 정도이다. 배양은, 호기적 조건에서의 진탕배양법, 통기교반배양법에 의해 행할 수 있다. 배양에 적덩한 온도는, 15~60℃이지만, 바람직하기는 20~40℃ 부근에서 생육한다. 배양시간은, 예를 들면, 6~240시간, 바람직하기는 8~168시간 정도이다.

배양 중의 D-페닐유산 탈수소효소의 양이 최고로 되었을 때에 배양을 정지하고, 배양물로부터 D-페닐유산 탈수소효소를 단리·정제 한다.

본 발명에 효소의 배양물로부터의 단리·정제는, 배양한 미생물균체를 분쇄하여, 얻어진 무세포추출액을 통상의 정제방법을 사용해서 행할 수 있다. 예를 들면, 배양물을 원심분리 또는 여과함으로써 회수한 균체를, 물리적 분쇄법, 예를 들면, 초음파처리, 해사, 또는 유발(mortar)·유봉(pestle)을 사용한 분쇄, 또는 볼밀, 프렌치 프레스(French press), 동결분쇄기, 블렌더(blender) 또는 믹서 등에 의해서 분쇄하고, 원심분리에 의해서 부스러기를 제거해서 무세포추출액을 얻는다. 원심분리 또는 여과에 의해서 배양물로부터 회수한 균체를 즉시로 분쇄하지 않는 경우는, 동결 또는 동결건조에 의해 보존할 수 있고, 필요한 때에 분쇄할 수 있다. 다음에, 무세포 추출액을 황산암모늄분획법, 이온교환 크로마토그라피법, 어피니티크로마토그라피법, 흡착 크로마토그라피법, 겔여과법 등의 통상의 정제방법을 단독으로 또는 조합함으로써, 활성을 갖는 효소를 얻을 수 있다.

본 발명에 의하면, D-페닐유산 탈수소효소의 대량생산계가 제공된다. D-페닐유산 탈수소효소의 대량 생산계로서 사용할 수 있는 숙주로서는, 대장균, 유산균, 방선균, 효모, 사상균을 들 수가 있다.

본 발명에 의한 효소는 페닐피루빈산을 D-페닐유산으로 변환한다. 한편,PF1022물질은 4분자의 L-로이신, 2분자의 D-유산, 및 2분자의 D-페닐유산으로부터 환상 뎁시펩티드합성효소에 의해 합성된다. 따라서, D-페닐유산은 PF1022물질 합성시의 원료물질에 상당한다. 따라서, D-페닐유산을 PF1022물질 생산균에 있어서 대량으로 발현시키는 것이 가능하면, PF1022물질을 대량으로 생산시키는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명에 의하면, 본 발명에 의한 효소가 발현하도록 형질전환된 것을 특징으로 하는 PF1022물질의 대량 생산계가 제공된다. PF1022물질은 동물용의 구충약으로서 유용하다(Sasaki, T. et al., J. Antibiotics., 45,692(1992)).

PF1022물질의 대량 생산계로서 사용할 수 있는 PF1022물질 생산균은, PF1022물질을 생산하는 사상균이 바람직하며, 가장 바람직하기는 PF1022물질생산균 (Mycelia sterilia, FERM BP-2671)이다.

PF1022물질생산균은, 본 발명에 의한 효소유전자 이외의 유전자에 의해 더욱 형질전환될 수 있다. 예를 들면, PF1022물질의 합성기획에 있어서 작용하는 효소유전자를, 경우에 따라서는, 강력한 프로모터와 함께 도입함으로써 PF1022물질의 생산을 향상시킬 수 있다. 이와 같은 유전자로서는 환상 뎁시펩티드합성효소(WO 01/18179 A1)를 들 수가 있다.

또한, 본 발명에 의한 효소가 작용하는 기질, 즉, 페닐피루빈산, 그의 유도체, 및 유사물질을 합성하지 않는 숙주에 있어서는, 부족한 기질, 기질의 유도체, 또는 기질의 유사물질을 첨가해서 배양함으로써, 또는 부족한 기질, 기질의 유도체, 또는 기질의 유사물질을 코드하는 유전자로 숙주를 형질전환함으로써, D-페닐유산 및 그의 유도체 및 유사물질을 생산시키는 것이 가능하다. 이와 같은 효소유전자로서는 코리스미산으로부터 P-아미노페닐피루빈산으로의 생합성경로에 관여하는 유전자를 들 수가 있다(WO01/23542 A1).

코리스미산으로부터 P-아미노페닐피루빈산으로의 생합성 경로에 관여하는 유전자가 도입된 숙주에 있어서는, P-아미노페닐피루빈산이 합성되어, 본 발명에 의한 효소가 P-아미노페닐피루빈산을 P-아미노페닐유산으로 변환한다. 그 결과, 변환된 P-아미노페닐유산이 PF1022물질 생산의 원료로 되어, 벤젠고리의 파라위치가 아미노기에 의해 수식된 PF1022물질 유도체, 즉 [시클로(D-락틸-L-N-메틸로이실-D-3-(4-아미노페닐)락틸-L-N-메틸로이실-D-락틸-L-N-메틸로이실-D-3-페닐락틸-L-N-메틸로이실)]이 합성된다. 아미노기와 같은 관능기에 의해 수식된 PF1022물질 유도체는 더욱 고활성인 PF1022물질 유도체를 합성하기 위한 원료로서 유용하다.

형질전환에 사용되는 재조합 벡터로서는, PF1022물질 생산균에서 기능하는 제어서열(프로모터, 터미네이터 등)을 본 발명에 의한 효소유전자에 작동가능하게 연결한 발현 벡터가 바람직하고, 가장 바람직하기는 PF1022균주(Mycelia sterilia, FERM BP-2671)에서 기능하는 제어서열을 본 발명에 의한 효소유전자에 작동가능하게 연결한 발현벡터이다. 발현을 증강하기 위한 강력한 프로모터로서는 Abp1 프로모터(WO 01/18219A1)을 들 수가 있다.

이하에, 실시예에 의해 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. D-PLDH의 단리·정제

1. 균체의 조제

PF1022물질 생산균(Mycelia sterilia, FERM BP-2671)에 대해서 UV조사 또는 NTG처리에 의해 돌연변이를 유발하고, PF1022물질의 생산성을 향상시킨 PF1022물질 생산균 432-26주를 종배지[1% 이스트엑스, 1% 맥아엑스, 2% 폴리펩톤, 2.5% 글루코스, 0.1% 인산수소2칼륨, 0.05% 황산마그네슘(pH7.0)](WO 01/18179A1) 50㎖를 넣은 적당한 용기에서 접종하고, 26℃에서 3일간 진탕배양하여 일차 종배양했다. 이 배양액을 WO 97/20945호에 기재된 배지 500㎖를 넣은 적당한 용기에서 접종하고, 26℃에서 로타리 세이커(rotary shaker)를 사용해서 3일간 배양하여 이차 종배양했다. 이 배양액을, 같은 배지 500㎖를 넣은 적당한 용기에서 접종하고, 26℃에서 로타리 세이커를 사용해서 4일~6일간 배양했다. 배양 종료 후의 배양액을, 시판용 나일론제 클로드(cloth) 및 부크너 펀넬(Buchner funnel)을 사용해서 흡인여과하고, 동시에 탈이온수로 균체를 세정했다. 얻어진 균체 케이크를 즉시로 -80℃에서 동결시키고, 동결건조기에서 이틀밤 건조시켰다. 이와 같이 해서 조제한 동결건조균체는, 밀폐용기에 넣어서 -80℃에서 보존할 수 있었다.

2. D-PLDH의 추출 및 정제

0.1M 페닐피루빈산 2㎕, 0.1M NADPH 2㎕, 완충액A(10mM 트리스염산, 10mM DTT, pH8) 및 임의의 양의 효소액시료를 첨가하여 전체 용적을 100㎕로 만들고, 26℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 가열처리에 의해 반응을 정지시킨 후, 반응액을 HPLC[칼럼:L-컬럼 ODS 4.6φX 150㎜ (일본화학품검사협회), 이동상:0.1M 황산나트륨:아세토니트릴(3.9:1) 아이소크라틱(isocratic), 유속:1㎖/분, 40℃, UV검출: 210nm]로 분석하고, 페닐유산의 생산량을 기초해서 이 효소의 활성으로 했다. 또한, 효소반응생성물의 광학활성을 분석하기 위하여, 따로 HPLC[칼럼:CHIRALPAK WH 0.46φX 25㎝ (Daicel Chemical Industries, Ltd.), 이동상:25mM 황산구리수용액, 유속:1㎖/분, 온도:40℃, UV검출:210nm]를 사용했다.

이하의 조작은 모두 4℃에서 실시했다. 실시예 1의 1에서 얻어진 동결건조균체 약 70g을 볼밀(포트 외경:210φ㎜, 볼직경:35φ㎜, 東京硝子器械)를 사용해서 하룻밤 동안 분쇄했다. 미세분말로 된 균체에 추출완충액(50mM 트리스염산, 10mMDTT, 50mM 염화칼륨, pH8) 1.5ℓ를 첨가하고, 충분히 현탁시켰다. 균체현탁액을 자석 교반기를 사용해서 약 1시간 동안 서서히 교반했다. 이어서, 균체현탁액을 고속냉각원심기 SCR20B (로타(rotor) No. RPR 9. 日立工機)를 사용하여 8000rpm으로 30분간 원심분리해서 상징액 약 1.2ℓ를 회수했다. 회수한 상징액을, 담체로서 Red Sepharose CL6B(Amersham Pharmacia)가 충전되어 있는 칼럼(26φX 300㎜)에 통과시켰다. 비흡착획분이 완전히 없어질 때까지 완충액A로 칼럼을 세정한 후, 1M 염화칼륨을 함유하는 완충액A로 용출한 단백질을 분획했다. 활성획분을 모으고, 담체로서 Superdex 200(Amersham Pharmacia)이 충전되어 있는 칼럼(26φX 950㎜)을 사용해서 겔 크로마토그라피를 실시했다. 활성획분을, 즉시로 Mono Q 10/10(Amersham Pharmacia)에 제공했다. 완충액A로 칼럼을 세정한 후, 흡착해 있는 단백질을 0~0.3M 염화칼륨 경사(gradient)를 사용하여 용출했다. 활성획분을 모으고, 완충액A로 10배로 희석하여, AMP아가로스(Amersham Pharmacia)가 충전해 있는 칼럼(16φX 100㎜)에 제공했다. 비흡착획분을 회수하고, 즉시로 히드록시아파타이트(hydroxyapatite)가 충전되어 있는 칼럼(5φX 50㎜)에 제공했다. 비흡착획분을 회수하고, 다시 Mono Q 10/10에 흡착시켰다. 단백질을 0~0.2M 염화칼륨 경사를 사용하여 용출시켰다. 폴리아크릴아미드 전기영동에서 활성획분은 분자량 약 38kDa를 갖는 거의 단일 단백질을 함유하는 것으로 나타냈다.

3. D-PLDH의 내부 부분 아미노산서열의 결정

실시예 1의 2에서 얻어진 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동으로 농축·단리하고, PVDF막에 전기적으로 이동시켰다. PVDF막 위로 이동한 단백질을 쿠마시 브릴리안트 블루(Coomassie Brilliant Blue)로 염색하여 그의 존재와 위치를 확인했다. 단백질이 존재하는 위치의 PVDF막의 단편을 오려내어, 프로테인 시퀀서(protein sequencer)로 N말단 아미노산서열을 분석하려고 시도했지만, 실패했다.

실시에 1의 2에서 얻어진 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 농축·단리하고, 쿠마시 브릴리안트 블루로 겔을 염색했다. 목적으로 하는 단백질을 함유하는 겔의 단편을 잘라 내었다. 이 겔을 작은 시험관 중에서 탈색액(0.2M 중탄산암모늄, 50% 아세토니트릴, pH8.0) 200㎕로 반복해서 세정하여 쿠마시 브릴리안트 블루를 겔로부터 세척한 후, 겔을 감압하에서 건조시켰다. 반 건조시킨 겔에, 완충액B (0.2M 중탄산암모늄, 0.02% Tween 20, pH8.0) 5㎕를 첨가하고, 이어서 1/100몰 용적의 트립신을 첨가했다. 10분 정도 방치해서 효소를 겔 중에 분산시킨 후, 또한 완충액B 200㎕를 첨가하고, 37℃에서 48시간 동안, 이 단백질을 효소로 소화했다. 효소반응을 트리플루오로아세트산으로 정지시키고, 반응액을 회수했다. 겔을 세정액(0.1% 트리플루오로아세트산, 60% 아세토니트릴) 200㎕로 충분히 세정하고, 세정액은 먼저 회수한 반응액과 혼합했다. 세정을 또한 2회 반복하여 트립신소화물을 회수했다. 회수한 트립신소화물을 감압하에서 건조시킨 후에, 증류수 60㎕를 첨가하여 트립신으로 소화시킨 펩티드 단편 시료를 만들었다. 이 시료를 Model 172μ조제용 HPLC 시스템(Perkin-Elmer Applied Biosystem)을 사용해서 크로마토그라피(칼럼:C18, 0.21φX 220㎜, 0.1% 트리플루오로아세트산, 5% 아세토니트릴~0.085% 트리플루오로아세트산, 35% 아세토니트릴 경사)를 행하여 분획했다. 얻어진 펩티드 단편 피크 중 2개의 펩티드 단편에 대해서 아미노산서열을 분석하여 다음과 같은 서열을 결정했다.

펩티드 단편1: ANVAGFVTTSEPK (서열번호 3)

펩티드 단편2: AGDWVTK (서열번호 4)

실시예 2. D-PLDH의 cDNA의 단리

1. cDNA의 단리 및 cDNA 라이브러리의 제작

PF1022물질 생산균(Mycelia sterilia, FERM BP-2671)에 대하여 UV조사 또는 NTG처리에 의해 돌연변이를 유발하고, PF1022물질의 생산성을 향상시킨 PF1022물질 생산균 432-26주를, 종배지 [1% 이스트엑스, 1% 맥아엑스, 2% 폴리펩톤, 2.5% 글루코스, 0.1% 인산수소2칼륨, 0.05% 황산마그네슘(pH7.0)](WO 01/18179A1) 10㎖를 넣은 시험관에서 접종하고, 26℃에서 3일간 진탕배양했다. 종배양액을, WO 97/20945호에 기재되어 있는 배지 50㎖를 넣고 적당한 용기에서 접종하고, 26℃에서 로타리 세이커를 사용해서 6일간 배양한 후, 원심분리에 의해 균체를 회수했다. 얻어진 균체를 액체 질소로 동결시킨 후, 유발 및 유봉을 사용해서 분쇄했다. 분쇄한 균체로부터 ISOGEN(Nippon Gene)에 의해, 첨부된 조작방법에 따라 전RNA를 단리했다. 또한, 전RNA로부터 mRNA Purification Kit(Amersham Pharmacia)에 의해, 첨부된 조작방법에 따라 mRNA를 정제했다.

이와 같이 해서 얻어진 mRNA로부터, Time Saver cDNA Synthesis Kit(Amersham Pharmacia)에 의해, 첨부된 조작방법에 따라서 cDNA를 합성했다. 이 cDNA를 파지 벡터의 Lambda ZAP Ⅱ(Stratagene Co.)에 삽입했다. 이와 같이 해서 제작한 재조합 파지 벡터에 대해서, Gigapack Ⅲ Gold Packaging Extract(Stratagene Co.)에 의해, 첨부된 조작방법에 따라서 인 비트로 팩케이징(in vitropackaging)을 행했다. 그 후, 이 재조합 파지를 대장균 XL1-Blue MRF'균주로 감염시키고, 플레이트에서 배양하여 플라크(plaques)를 형성시켰다. 이와 같이 해서 제작한 cDNA 라이브러리는, 6.8 X 10⁵플라크 형성 단위이였다. 또한, 이 cDNA 라이브러리를 Lambda ZAPⅡ에 첨부한 조작방법에 따라 증폭했다. 이 증폭한 cDNA라이브러리 중의 재조합 파지를 대장균 XL1-Blue MRF'균주로 감염시키고, 플레이트에서 배양하여 플라크를 형성시켰다.

2. D-PLDH 유전자의 부분 DNA 단편의 단리

실시예 1의 3에서 얻어진 펩티드단편1 및 2의 서열로부터, 이하의 2종류의 프라이머를 합성했다.

프라이머1:5'-GTIGTIACRAAICCNGCNAC-3' (서열번호 5)

프라이머2:5'-GCIGGIGAYTGGGTNAC-3' (서열번호 6)

이들의 프라이머를 사용하고, WO 01/18179A1에 기재된 방법에 의하여, 주형으로서 PF1022물질생산균(FERM BP-2671)으로부터 단리시킨 게놈DNA를 사용하여 PCR를 행했다. PCR는, 100㎕의 반응액 중에서 게놈DNA 80ng을 주형으로 하고, 2.5유니트의 ExTaq DNA 폴리머라제(寶酒造社), 첨부의 완충액 및 dNTP혼합액, 또한 각각 최종농도 0.5uM이 되도록 2종류의 프라이머를 각각 첨가하여, 이하의 조건으로 반응을 행했다: 94℃ 5분간[94℃ 1분간, 58℃ 1분간, 72℃ 30초간]X40회, 72℃ 7분간, 4℃ 보존. 반응액을 2% 아가로스 겔 전기영동으로 분석한 결과, 약 550bp의 DNA단편이 증폭했다. 이 DNA 단편을 시판용 Sephaglas BandPrep Kit(Amersham Pharmacia)를 사용해서 아가로스 겔로부터 회수했다. 회수한 DNA단편과 pT7Blue T-Vector(Novagen, Inc.)를 DNA Ligation Kit ver.2(寶酒造社)를 사용하여, 첨부된 조작방법에 따라서 연결시켰다.

이와 같이 해서 클로닝한 DNA단편의 염기서열의 결정은 DNA Sequencing Kit dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction(Perkin-Elmer) 및 BI PRISM 310 Genetic Analyzer(Perkin-Elmer)를 사용해서, 첨부된 조작방법에 따라 행했다. 그 결과, 단리한 DNA단편의 염기서열은, D-α-케토산 특이적 탈수소효소유전자와 상동성을 나타내어, 목적으로 하는 D-PLDH의 유전자의 일부인 것이 강하게 시사되었다.

3. D-PLDH의 cDNA전역(全域)의 클로닝

실시예 2의 2에서 얻어진 DNA단편의 염기서열정보를 기초하여 새롭게 이하의 2종류의 프라이머를 합성했다.

프라이머3:5'-AAGGGATCCCAGCAGAGCACGATGAA-3' (서열번호 7)

프라이머4:5'-GCAGGCTCGGCTGTAGTTATCAAA-3' (서열번호 8)

실시예 2의 2에서 얻어진 DNA단편을 주형으로 하고, 프라이머 3 및 프라이머 4를 사용한 PCR에 의해 증폭한 PCR생성물을, cDNA라이브러리의 스크리닝에 프로브로 사용했다. PCR는, 100㎕의 반응액 중에서, 실시예 2의 2에서 얻어진 DNA단편이 삽입되어 있는 pT7 Blue 플라스미드 벡터 500ng을 주형으로 하고, 2.5유니트의 ExTaq DNA 폴리머라제(寶酒造社), 첨부의 완충액 및 dNTP혼합액, 또한 각각 최종농도 0.5uM이 되도록 2종류의 프라이머를 각각 첨가하고, 이하의 조건에서 반응을 행했다. 94℃ 5분간[94℃ 1분간, 60℃ 1분간, 72℃ 30초간]X40회, 72℃ 7분간, 4℃ 보존. 반응액을 2% 아가로스 겔 전기영동에 제공하여, 약 530bp의 DNA단편의 존재를 획인하고, 이 DNA 단편을 Sephaglas BandPrep Kit(Amersham Pharmacia)를 사용해서 아가로스 겔로부터 회수했다. 회수한 DNA단편을, ECL Direct DNA/RNA 레이블링 검출시스템(Amersham Pharmacia)을 사용하여, 첨부된 조작방법에 따라서 표지를 붙여 하이브리다이제이션에 사용하는 핵산 프로브로 사용했다.

실시예 2의 1에서 제작한, 플라크가 형성된 플레이트 위에, 블로팅 멤브레인(blotting membrane) Hibond N+(Amersham Pharmacia)을 놓고, 플라크를 카피했다. 이 멤브레인을 마까베의 방법(Kazuhiro Makabe, Visual Experimental Note Series, Biotechnology Experiments Illustrated 4, in Cell Technology Supp., 125-133, 1997, published by Shujunsha)에 따라서 처리하여 DNA를 멤브레인에 고정화시켰다. 이 때, 멤브레인의 세정에는 5 X SSC를 사용했다. ECLDirect DNA/RNA 레이블링 검출 시스템(Amersham Pharmacia)를 사용하여, 첨부된 조작방법에 따라서 표지된 핵산 프로브 및 멤브레인에 고정화되어 있는 파지DNA를 하이브리다이즈시키고, 이어서 표지된 핵산 프로브가 하이브리다이즈된 플라크를 검출했다. 이와 같이 해서, 프로브에 상동한 영역의 5'상류 및 3'하류를 함유하는 양성 파지를 선택했다.

양성 파지를, Lambda ZAPⅡ(Stratagene Co.)에 첨부한 조작방법에 따라서 처리하여, D-PLDH의 cDNA유전자가 삽입되어 있는 플라스미드를 조제했다.

4. 염기서열의 결정

이와 같이 해서 단리된 D-PLDH의 cDNA유전자가 삽입되어 있는 플라스미드를 주형으로 하고, 플라스미드 유래의 서열인, 프라이머5:5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' (서열번호 9) 및/또는 프라이머6:5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3' (서열번호 10)을 프라이머로서 사용하여 시퀀싱을 행했다. 시퀀싱은 DNA Sequencing Kit dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Perkin Elmer) 및 ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Perkin Elmer)을 사용해서, 첨부된 조작방법에 따라 실시했다. 얻어진 결과로부터, 염기서열이 알려져 있지 않은 부분에 대해서는, 염기서열해독이 종료한 부분에서 새롭게 프라이머를 설계하고, 또한 시퀀싱을 반복했다. 이 것에 의해, 플라스미드에 삽입된 D-PLDH의 1509bp cDNA유전자의 염기서열을 결정했다.

이 서열은 해석한 결과, 1011bp로 이루어지는 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF)이 존재하는 것으로 나타냈다. 이 ORF로부터 예측되는 단백질은 336아미노산잔기를 갖고, 분자량이 36.5kDa를 가지며, D-유산 탈수소효소 등과의 상동성을 나타냈다. 가장 높은 상동성을 나타낸 단백질은 글리세레이트 데히드로게나제이고, 그의 상동성은 37% 이였다. 이와 같이하여 단리한 본 발명의 D-PLDH 유전자의 ORF의 염기서열을 서열표의 서열번호 1에 나타냈고, 아미노산서열을 서열번호 2에 각각 나타냈다.

실시예 3. D-PLDH 유전자의 대량발현에 의한 D-PLDH의 대량조제

1. 유전자 발현용 D-PLDH 유전자의 조제

실시예 2의 3에서 조제한 플라스미드를 주형으로 하고, 양단에HindⅢ 부위를 도입한 D-PLDH 유전자를 증폭시키기 위하여, 5'말단에HindⅢ 부위를, 또한 그의 바로 뒤에 스톱 코돈을, 또한 그의 바로 뒤에 리보좀 결합부위를 부가한 프라이머7:5'-AAGCTTGTAAGGAGATATACATGGCCCAAGCACAACCA-3' (서열번호 11), 및 5' 말단에HindⅢ 부위만을 부가한 프라이머 8:5'-ATGCAAGCTTTAGTGAACCCTATACTTGG-3' (서열번호 12)를 사용해서 PCR를 행했다. PCR은, 20㎕의 반응액 중에 80ng의 플라스미드 DNA를 주형으로 하고, 1 유니트의 TaKaRa LA-Taq DNA 폴리머라제(寶酒造社), 첨부의 완충액, dNTP혼합물, 25mM 염화마그네슘, 및 100pM의 프라이머를 사용하여, 이하의 조건에서 반응을 행했다. 94℃ 1분간, [98℃ 15초간, 68℃ 3분간]X30회, 72℃ 10분간. 반응액을 1% 아가로스 겔 전기영동에 제공하여, 약 1000bp의 DNA단편을 확인하고, 이 것을 Sephaglas Band Prep Kit(Amersham Pharmacia)를 사용해서 아가로스 겔로부터 회수했다. 회수한 PCR생성물 및 pTBlue T-Vector(Novagen, Inc.)를 DNA Ligation Kit ver.2(寶酒造社)를 사용하여, 첨부된 조작방법에 따라서연결시켰다. D-PLDH와 연결한 플라스미드를 대장균 DH 5α에 도입하여 증폭하고, Concert Rapid Plasmid Purification Systems(Gibco BRL Products)을 사용하여 플라스미드 DNA를 회수했다.

이와 같이 해서 증폭한 D-PLDH의 유전자서열은, 실시예 2의 4에서 사용한 D-PLDH 유전자 유래의 프라이머와 pT7플라스미드 벡터의 염기서열 유래의 프라이머를 사용해서 확인했다. 시퀀싱은 DNA Sequencing Kit BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction(Perkin Elmer) 및 ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Perkin Elmer)를 사용해서, 첨부된 조작방법에 따라 실시했다. 서열 확인 후, 약 12㎍의 D-PLDH 유전자를 연결한 pT7 플라스미드 벡터를 함유하는 24㎕의 DNA 용액과 3㎕의HindⅢ(東洋紡) 및 3㎕의 첨부의 완충용액을 충분히 혼합하고, 37℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 다음에, 반응액을 1% 아가로스 겔 전기영동에 제공하여, 약 1000bp의 DNA단편을 확인하고, 이 단편을 Sephaglas Band Prep Kit(Amersham Pharmacia)를 사용해서 아가로스 겔로부터 회수하여, 발현용 D-PLDH 유전자를 얻었다.

2. 유전자 발현용의 벡터의 구축

시판용 pUC119(寶酒造社) 약 2.5㎍을 함유하는 용액을,HindⅢ(東洋紡社) 및 첨부된 완충액과 함께 37℃에서 18시간 동안 반응시킨 후, DNA를 페놀로 추출해서 회수했다. 이 DNA에 알카리포스타제 C75(寶酒造社) 3㎍, 첨부의 완충액 3㎕ 및 멸균수 24㎕를 첨가하고, 이어서 이 혼합물을 50℃에서 30분간 반응시켜서 말단의 인산을 제거했다. 인산을 제거한 DNA를 페놀로 추출해서 회수하고, TE완충액(10mM트리스 염산, 1mM EDTA, pH8) 3㎕에 용해했다.

실시예 3의 1에서 조제한 발현용 D-PLDH 유전자 5㎕ 및HindⅢ으로 소화하여 말단을 탈인산화한 pUC119 벡터 0.5㎕를 DNA Ligation Kit ver.2(寶酒造社)를 사용하고, 첨부의 조작방법에 따라서 연결시켜서, 플라스미드 pDPLDH-1을 제작했다(도 1).

3. 대장균에서의 D-PLDH의 발현

pDPLDH-1을 첨부의 조작방법에 따라서 도입한 대장균 DH5α(東洋紡)을, 암피실린 50㎍/㎖를 함유하는 LB한천배지에 도포했다. 37℃에서 18시간 동안 정치배양한 후, 생육한 대장균 DH5α를 암피실린 50㎍/㎖를 함유하는 LB배지 2㎖에 접종하고, 37℃에서 18시간 동안 진탕배양해서 종배양으로 했다. 종배양액의 일부를 각각 동일한 배지 2㎖를 넣은 시험관 10개에 접종하고, 37℃에서 진탕배양을 개시하여, 5시간 후에 IPTG를 최종농도 1mM가 되도록 첨가하고, 2시간 동안 더욱 배양했다. 배양 종료 후, 원심분리로 균체를 회수하고, 실시예 1의 2에 기재된 완충액A로 세정한 후에, 완충액A 2.5㎖에 현탁시켰다. 이 균체 현탁액을, 빙냉하에 초음파세포분쇄기로 처리하고, 원심분리로 균체 찌꺼기를 제거하여 얻어진 상징액을 조효소액으로 했다. 대조에는, D-PLDH 유전자를 함유하지 않은 pUC119로 형질전환된 대장균 DH5α를 사용햇다. 96웰 마이크로타이터 플레이트에 250uM NADPH 및 250uM 페닐피루빈산을 함유하는 완충액A 150㎕를 분배하고, 거기에 조효소액 50㎕를 첨가하고, 피페팅(pipetting)조작에 의해 즉시 혼합시키고, 26℃에서의 340nm의 흡광도변화를 측정했다. 측정에는 흡광도 마이크로어쎄이 리더(Absorption MicroassayReader) BioLumin 960(Molecular Dynamics사)을 사용하여, 반응개시 후로부터 경시적으로 흡광도의 감소를 추적했다. 이 때, 1분간에 1umol의 NADPH가 산화되는 효소량을 1유니트로 했다. 이 결과를 하기 표 1에 조효소액의 효소활성으로서 나타냈다.

표 1 조효소액 중의 탈수소효소활성

조효소액을 조제한 균주	pUC119보유주	pDPLDH-1보유주
효소활성	7.30 X 10^-3	1.01 X 10^-1

수치는 「unit/㎖ 조효소액」으로 환산한 값을 나타냈다.

이와 같이, pDPLDH-1에 의해 형질전환된 대장균 DH5α는, D-PLDH활성이, pUC119로 형질전환된 대장균 DH5α와 비교해서 약 13배 높은 것으로 나타났다. 또한, 생산물을 광학분할칼럼으로 분석한 결과, D-PLDH 유전자 보유주의 생산물이 D-페닐유산인 것을 확인했다. 본 발명에 의한 유전자가 D-PLDH 유전자인 것이 확인되었다.

또한, 얻어진 조효소액을, Mono Q 10/10을 사용하여 실시예 1의 2에 기재한 조건에 따라서 조정제하여, 부분정제 효소액을 조제했다. 이 부분정제 조효소액을 사용하여 96웰 마이크로타이터 플레이트 위에서, 기질인 페닐피루빈산의 농도를 변화시켜, 효소활성을 측정했다. 또한, 반응기질을 페닐피루빈산으로부터 피루빈산으로 대체했을 때의 효소활성도 측정했다. 페닐피루빈산의 반응속도를 100으로 했을 때의 측정결과를 하기 표에 나타냈다.

표 2 반응기질에 의한 상대효소활성

반응기질	페닐피루빈산	피루빈산
페닐피루빈산을 100으로 했을 때의 상대반응속도	100	10

이와 같이, 본 발명에 의한 효소는 공지의 유산 탈수소효소 등(일본국 특허 제2750017호, Taguchi, H. et al., J. Biol. Chem., 266, p. 12588(1991))과는 명확하게 성질이 다른 것이 나타났으며, 아미노산서열 및 효소학적성질의 어느 점으로부터 신규 효소인 것이 판명되었다.

Claims

하기 서열을 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산서열로 이루어지는 단백질:

(a) 서열번호 2의 아미노산서열, 및

(b) 치환, 결실, 부가, 및 삽입으로부터 선택되는 1이상의 개변을 갖고, 또한 D-페닐유산 탈수소효소 활성을 갖는 서열번호 2의 아미노산서열의 개변 아미노산서열.
제 1항에 기재된 단백질을 코드하는 폴리누클레오티드.
제 2항에 있어서, 서열번호 1의 DNA서열로 이루어지는 폴리누클레오티드.
하기 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리누클레오티드:

(c) 서열번호 1의 DNA서열,

(d) 서열번호 1의 DNA서열과 적어도 70%의 상동성을 갖고, 또한 D-페닐유산 탈수소효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 누클레오티드서열,

(e) 치환, 결실, 부가, 및 삽입으로부터 선택되는 1이상의 개변을 갖고, 또한 D-페닐유산 탈수소효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 서열번호 1의 DNA서열의 개변 DNA서열, 및

(f) 스트린전트한 조건하에서 서열번호 1의 DNA서열과 하이브리다이즈 하고, 또한, D-페닐유산 탈수소효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 누클레오티드서열.
제 4항에 있어서, (d)가 서열번호 1의 DNA서열과 적어도 80%의 상동성을 갖는 누클레오티드서열인 폴리누클레오티드.
제 4항에 있어서, (d)가 서열번호 1의 DNA서열과 적어도 90%의 상동성을 갖는 누클레오티드서열인 폴리누클레오티드.
제 2항 내지 제 6항 중 어느 하나의 항에 기재된 폴리누클레오티드로 이루어지는 재조합 벡터.
제 7항에 기재된 재조합 벡터로 이루어지는 숙주.
제 8항에 있어서, D-페닐유산 탈수소효소를 발현하고 있는 숙주.
제 8항 또는 제 9항에 있어서, PF1022물질 생산균인 숙주.
제 8항 내지 제 10항 중 어느 하나의 항에 기재된 숙주를 배양하고, 배양물로부터 D-페닐유산 탈수소효소를 채취하는 공정으로 이루어지는 D-페닐유산 탈수소효소의 제조법.
페닐피루빈산, 그의 유도체, 또는 그의 유사물질을, 제 1항에 기재된 단백질, 또는 제 8항 내지 제 10항에 기재된 숙주, 그의 추출물, 그의 배양물, 또는 그의 배양물에서 정제된 효소와 반응시키고, 이어서 D-페닐유산, 그의 유도체, 또는 그의 유사물질을 채취하는 공정으로 이루어지는 D-페닐유산, 그의 유도체, 또는 그의 유사물질의 제조법.
제 10항에 기재된 숙주를 배양하고, 배양물로부터 PF1022물질 또는 그의 유도체를 채취하는 공정으로 이루어지는 PF1022물질 또는 그의 유도체의 제조법.