JPH11155570A - 酵素の基質特異性の改変法 - Google Patents
酵素の基質特異性の改変法Info
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- JPH11155570A JPH11155570A JP10280003A JP28000398A JPH11155570A JP H11155570 A JPH11155570 A JP H11155570A JP 10280003 A JP10280003 A JP 10280003A JP 28000398 A JP28000398 A JP 28000398A JP H11155570 A JPH11155570 A JP H11155570A
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- microorganism
- red
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/003—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions
- C12P41/005—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions by esterification of carboxylic acid groups in the enantiomers or the inverse reaction
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 酵素の基質特異性の改変法の提供。
【解決手段】 酵素の基質特異性を改変するために、次
の工程： ａ）大腸菌株ＸＬ１レッド中に又は機能誘導体中に、該
酵素をコードする遺伝子のコピーを有するＤＮＡを導入
し、 ｂ）形質転換した大腸菌株ＸＬ１レッド又はその機能誘
導体をインキュベートして酵素遺伝子中に突然変異を誘
発し、 ｃ）菌株ＸＬ１レッド又はその機能誘導体から突然変異
したＤＮＡを、阻害する酵素活性を有しない微生物に転
移し、 ｄ）酵素活性を検出するために、該酵素の未改変の基質
特異性を認識することを可能とする、少なくとも１種の
酵素基質を含有し、かつその他の指示物質を含有するか
又は含有しない、少なくとも１つの選択培地上で、又は
培地中でこの微生物をインキュベートし、 ｅ）基質特異性の改変を示す微生物を選択する、を実施
する。
の工程： ａ）大腸菌株ＸＬ１レッド中に又は機能誘導体中に、該
酵素をコードする遺伝子のコピーを有するＤＮＡを導入
し、 ｂ）形質転換した大腸菌株ＸＬ１レッド又はその機能誘
導体をインキュベートして酵素遺伝子中に突然変異を誘
発し、 ｃ）菌株ＸＬ１レッド又はその機能誘導体から突然変異
したＤＮＡを、阻害する酵素活性を有しない微生物に転
移し、 ｄ）酵素活性を検出するために、該酵素の未改変の基質
特異性を認識することを可能とする、少なくとも１種の
酵素基質を含有し、かつその他の指示物質を含有するか
又は含有しない、少なくとも１つの選択培地上で、又は
培地中でこの微生物をインキュベートし、 ｅ）基質特異性の改変を示す微生物を選択する、を実施
する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は酵素の基質特異性の
改変法に関する。
改変法に関する。
【０００２】
【従来の技術】合成化学は実地においてしばしば、化合
物を製造するための容易でかつ簡単な合成工程をたどる
ことができないという問題に直面する、それというのも
この工程が、例えば合成された分子が分解される可能性
があるために、必要とされる保護基の除去がもはや可能
でない化合物に導くことがあるためである。この問題を
解決するために、合成化学はしばしばより複雑でかつ時
間を消費する合成工程をたどらなければならない。
物を製造するための容易でかつ簡単な合成工程をたどる
ことができないという問題に直面する、それというのも
この工程が、例えば合成された分子が分解される可能性
があるために、必要とされる保護基の除去がもはや可能
でない化合物に導くことがあるためである。この問題を
解決するために、合成化学はしばしばより複雑でかつ時
間を消費する合成工程をたどらなければならない。
【０００３】酵素は化学結合を、緩和な条件下に切断す
る。従って、酵素をしばしばこの種の合成問題を解決す
るために使用することができる。すなわち、保護基を、
例えば緩和な条件下に、他の結合を破壊することなく、
かつこうして分子を破壊することなく、酵素により除去
することができる。こうして酵素は所望の物質を実験室
で容易にかつ迅速に獲得することを可能にする。しかし
ながら、酵素活性及び／又は安定性はしばしば酵素の産
業上の使用のために不十分であり、こうして化学的合成
法は多数の合成工程を必要とするのではあるが、それに
もかかわらず化学的合成はより費用が安く、かつ従って
産業的に実施される。
る。従って、酵素をしばしばこの種の合成問題を解決す
るために使用することができる。すなわち、保護基を、
例えば緩和な条件下に、他の結合を破壊することなく、
かつこうして分子を破壊することなく、酵素により除去
することができる。こうして酵素は所望の物質を実験室
で容易にかつ迅速に獲得することを可能にする。しかし
ながら、酵素活性及び／又は安定性はしばしば酵素の産
業上の使用のために不十分であり、こうして化学的合成
法は多数の合成工程を必要とするのではあるが、それに
もかかわらず化学的合成はより費用が安く、かつ従って
産業的に実施される。
【０００４】これが、多くの研究が酵素活性及び／又は
安定性の改良を実施している理由である。種々の方法が
このために行なわれた。
安定性の改良を実施している理由である。種々の方法が
このために行なわれた。
【０００５】酵素の安定性及び／又は酵素活性の非常に
特異的な改良を達成することは部位突然変異により可能
である。酵素の部位突然変異の欠点は、この方法が、Ｘ
−線構造解析から、モデリングから、及び同一又は類似
の特異性の他の酵素との比較からの酵素の構造及び機能
についての多くの知識の入手可能性を必要とすることで
ある。更に、酵素の目標のある改良を可能にするために
は、構造遺伝子の配列は知られていなければならない。
この情報は一般的に、獲得することができないか、又は
十分でないか、部分的にのみ獲得することができ、こう
してこの場合、酵素のどの領域を改変しなければならな
いのか明らかでないので、この方法は通常所望の結果を
もたらさない。もし酵素活性について僅かな情報のみ得
ることができるにすぎないのであれば、酵素を改良する
ために任意の戦術を包含する方法を実施することが有利
であるがそれにもかかわらず、この方法は可能な限り標
的を定めるべきである。
特異的な改良を達成することは部位突然変異により可能
である。酵素の部位突然変異の欠点は、この方法が、Ｘ
−線構造解析から、モデリングから、及び同一又は類似
の特異性の他の酵素との比較からの酵素の構造及び機能
についての多くの知識の入手可能性を必要とすることで
ある。更に、酵素の目標のある改良を可能にするために
は、構造遺伝子の配列は知られていなければならない。
この情報は一般的に、獲得することができないか、又は
十分でないか、部分的にのみ獲得することができ、こう
してこの場合、酵素のどの領域を改変しなければならな
いのか明らかでないので、この方法は通常所望の結果を
もたらさない。もし酵素活性について僅かな情報のみ得
ることができるにすぎないのであれば、酵素を改良する
ために任意の戦術を包含する方法を実施することが有利
であるがそれにもかかわらず、この方法は可能な限り標
的を定めるべきである。
【０００６】こうして、スピー等（Spee:Nucleic Acids
Research、Vol.21,No 3,1993:777-778）はラクトコッ
カス・ラクチス（Lactococcus lactis）のｎｉｓＺ遺伝
子の任意突然変異のためにｄＩＴＰを用いるＰＣＲ法を
記載している。
Research、Vol.21,No 3,1993:777-778）はラクトコッ
カス・ラクチス（Lactococcus lactis）のｎｉｓＺ遺伝
子の任意突然変異のためにｄＩＴＰを用いるＰＣＲ法を
記載している。
【０００７】スピー等により記載された方法は更にレロ
等（Rellos:Protein Expr.purif.,5,1994:270-277）に
より改良された。レロ等は、ヌクレオチドの限定は突然
変異速度の上昇のために、こうして所望の結果のために
完全に十分であるので、ｄＩＴＰを用いずにＰＣＲ法
で、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）の
アルコールデヒドロゲナーゼ−２−遺伝子の突然変異を
記載している。
等（Rellos:Protein Expr.purif.,5,1994:270-277）に
より改良された。レロ等は、ヌクレオチドの限定は突然
変異速度の上昇のために、こうして所望の結果のために
完全に十分であるので、ｄＩＴＰを用いずにＰＣＲ法
で、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）の
アルコールデヒドロゲナーゼ−２−遺伝子の突然変異を
記載している。
【０００８】分子進化のための試験管内組換え技術の使
用はステンマー（Stemmer:Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vo
l.91,1994:10747-10751）により記載されている。この
組換え技術により、２つの突然変異しかつ不活性化した
ｌａｃＺ遺伝子から、ｌａｃＺ遺伝子の酵素機能を回復
することが可能であった。
用はステンマー（Stemmer:Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vo
l.91,1994:10747-10751）により記載されている。この
組換え技術により、２つの突然変異しかつ不活性化した
ｌａｃＺ遺伝子から、ｌａｃＺ遺伝子の酵素機能を回復
することが可能であった。
【０００９】モア等（Moore:Nature Biotechnology Vo
l.14,1996:458-467）はＰＣＲとｐ−ニトロベンジルエ
ステルに対するエステラーゼの酵素活性を上昇させる組
換え法との組合せを記載している。
l.14,1996:458-467）はＰＣＲとｐ−ニトロベンジルエ
ステルに対するエステラーゼの酵素活性を上昇させる組
換え法との組合せを記載している。
【００１０】この方法の欠点は、突然変異の誘発のため
に、このＤＮＡを試験管中でＴａｑポリメラーゼ及び／
又は制限酵素及び／又はオリゴヌクレオチドのような酵
素で処理しなければならず、かつ種々の潜在的突然変異
体は個別の更なる処理及びテストを必要とするというこ
とである。これらの方法は比較的小さいＤＮＡ領域の突
然変異にのみ好適である。
に、このＤＮＡを試験管中でＴａｑポリメラーゼ及び／
又は制限酵素及び／又はオリゴヌクレオチドのような酵
素で処理しなければならず、かつ種々の潜在的突然変異
体は個別の更なる処理及びテストを必要とするというこ
とである。これらの方法は比較的小さいＤＮＡ領域の突
然変異にのみ好適である。
【００１１】酵素の突然変異の他の方法はグリーナー
（Greener）等により記載されている（Methods in Mole
cular Biology,Vol.57,1996:375-385）。グリーナー等
は特別な大腸菌株ＸＬ１−レッドを用いて、抗生物質耐
性の強化された大腸菌突然変異体を製造した。この強化
された抗生物質耐性はβ−ラクタマーゼをコードするプ
ラスミドｐＢＲ３２２の上昇するコピー数に起因する。
この大腸菌株は同様に栄養要求株の生成及び酵素活性の
上昇のために使用することもできる。
（Greener）等により記載されている（Methods in Mole
cular Biology,Vol.57,1996:375-385）。グリーナー等
は特別な大腸菌株ＸＬ１−レッドを用いて、抗生物質耐
性の強化された大腸菌突然変異体を製造した。この強化
された抗生物質耐性はβ−ラクタマーゼをコードするプ
ラスミドｐＢＲ３２２の上昇するコピー数に起因する。
この大腸菌株は同様に栄養要求株の生成及び酵素活性の
上昇のために使用することもできる。
【００１２】前記突然変異誘発法全ての欠点は、存在す
る酵素活性だけを最適化することが可能であるというこ
とである。もし新規の酵素反応、すなわち酵素の新規な
基質特異性、例えば新規基質の切断が必要とされるなら
ば、天然型の複雑なスクリーニングにおいてこの新規酵
素活性を探すことがまずは必要である。一般的には、更
にこの酵素を最適化する必要がある。
る酵素活性だけを最適化することが可能であるというこ
とである。もし新規の酵素反応、すなわち酵素の新規な
基質特異性、例えば新規基質の切断が必要とされるなら
ば、天然型の複雑なスクリーニングにおいてこの新規酵
素活性を探すことがまずは必要である。一般的には、更
にこの酵素を最適化する必要がある。
【００１３】従って、新規酵素活性を製造することを可
能とする、すなわち酵素の基質特異性を改変することが
可能である方法を獲得することが望まれる。
能とする、すなわち酵素の基質特異性を改変することが
可能である方法を獲得することが望まれる。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、前記欠点を有さず、かつ酵素の基質特異性を迅速か
つ簡単に改変することができる、広く適用可能な新規方
法を開発することである。
は、前記欠点を有さず、かつ酵素の基質特異性を迅速か
つ簡単に改変することができる、広く適用可能な新規方
法を開発することである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】この課題は酵素の基質特
異性を改変する方法によって達成され、この方法は次の
工程： ａ）大腸菌株ＸＬ１レッド中に又は機能誘導体中に、該
酵素をコードする遺伝子のコピーを有するＤＮＡを導入
し、 ｂ）形質転換した大腸菌株ＸＬ１レッド又はその機能誘
導体をインキュベートして酵素遺伝子中に突然変異を誘
発し、 ｃ）菌株ＸＬ１レッド又はその機能誘導体から突然変異
したＤＮＡを、阻害する酵素活性を有しない微生物に転
移し、 ｄ）酵素活性を検出するために、該酵素の未改変の基質
特異性を認識することを可能とする、少なくとも１種の
酵素基質を含有し、かつその他の指示物質を含有するか
又は含有しない、少なくとも１つの選択培地上で、又は
培地中でこの微生物をインキュベートし、 ｅ）基質特異性の改変を示す微生物を選択する、を実施
することからなる。
異性を改変する方法によって達成され、この方法は次の
工程： ａ）大腸菌株ＸＬ１レッド中に又は機能誘導体中に、該
酵素をコードする遺伝子のコピーを有するＤＮＡを導入
し、 ｂ）形質転換した大腸菌株ＸＬ１レッド又はその機能誘
導体をインキュベートして酵素遺伝子中に突然変異を誘
発し、 ｃ）菌株ＸＬ１レッド又はその機能誘導体から突然変異
したＤＮＡを、阻害する酵素活性を有しない微生物に転
移し、 ｄ）酵素活性を検出するために、該酵素の未改変の基質
特異性を認識することを可能とする、少なくとも１種の
酵素基質を含有し、かつその他の指示物質を含有するか
又は含有しない、少なくとも１つの選択培地上で、又は
培地中でこの微生物をインキュベートし、 ｅ）基質特異性の改変を示す微生物を選択する、を実施
することからなる。
【００１６】新規方法において基質特異性の改変とは、
この酵素に該方法を実施した後にはこれらの酵素は、従
来基質への酵素の親和性が低すぎるために（＝高いＫM
−値）及び／又は酵素の触媒活性（＝Ｋcat）が低すぎ
るために変換することができなかった基質を変換するこ
とができるようになる、ということを意味する。この改
変前の場合は、Ｋcat／ＫMの比はゼロ又はほとんどゼロ
である、すなわち触媒作用は生じない。基質における改
変はＫMを減少させるか又はＫcatを増大させるか、又は
両方を行なう、すなわち比Ｋcat／ＫMがゼロより大きく
なる。触媒反応は生じる。この酵素は突然変異の後には
新たな基質を変換する。
この酵素に該方法を実施した後にはこれらの酵素は、従
来基質への酵素の親和性が低すぎるために（＝高いＫM
−値）及び／又は酵素の触媒活性（＝Ｋcat）が低すぎ
るために変換することができなかった基質を変換するこ
とができるようになる、ということを意味する。この改
変前の場合は、Ｋcat／ＫMの比はゼロ又はほとんどゼロ
である、すなわち触媒作用は生じない。基質における改
変はＫMを減少させるか又はＫcatを増大させるか、又は
両方を行なう、すなわち比Ｋcat／ＫMがゼロより大きく
なる。触媒反応は生じる。この酵素は突然変異の後には
新たな基質を変換する。
【００１７】新規方法においては、原則的に全ての酵素
の基質特異性を改変することができる、有利にはヒドロ
ラーゼの基質特異性を改変することができる。ヒドロラ
ーゼはＩＵＢ命名法において酵素の第３群（＝３..）を
形成する。ヒドロラーゼは、一般にその簡単な検出反応
が存在し、かつ多くの場合このヒドロラーゼは工業的な
合成に使用されるので、新規方法に有利である。特に、
プロテアーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラー
ゼ、ホスファターゼ、アミダーゼ、ニトリラーゼ（nitr
ilase）、エーテル・ヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ
及びグリコシダーゼの群から選択されたヒドロラーゼの
基質特異性、特に有利にはリパーゼ、エステラーゼ、ニ
トリラーゼ又はフィターゼ（phytase）の基質特異性を
改変するのが有利である。
の基質特異性を改変することができる、有利にはヒドロ
ラーゼの基質特異性を改変することができる。ヒドロラ
ーゼはＩＵＢ命名法において酵素の第３群（＝３..）を
形成する。ヒドロラーゼは、一般にその簡単な検出反応
が存在し、かつ多くの場合このヒドロラーゼは工業的な
合成に使用されるので、新規方法に有利である。特に、
プロテアーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラー
ゼ、ホスファターゼ、アミダーゼ、ニトリラーゼ（nitr
ilase）、エーテル・ヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ
及びグリコシダーゼの群から選択されたヒドロラーゼの
基質特異性、特に有利にはリパーゼ、エステラーゼ、ニ
トリラーゼ又はフィターゼ（phytase）の基質特異性を
改変するのが有利である。
【００１８】基質の特異性を本発明による方法で改変し
た後、この酵素反応はキラル出発化合物の場合に選択性
なしに又は選択性を伴って行なわれる、すなわちこの反
応はラセミ体又は光学的活性生成物を生じる。有利な改
変は領域選択的、化学選択的又は立体選択的、又は領域
選択的のような基質特異性において、又は領域選択的、
化学選択的及び／又は立体選択的反応において選択的に
改変に導く。
た後、この酵素反応はキラル出発化合物の場合に選択性
なしに又は選択性を伴って行なわれる、すなわちこの反
応はラセミ体又は光学的活性生成物を生じる。有利な改
変は領域選択的、化学選択的又は立体選択的、又は領域
選択的のような基質特異性において、又は領域選択的、
化学選択的及び／又は立体選択的反応において選択的に
改変に導く。
【００１９】ＤＮＡを微生物中に導入するための専門家
に公知の全ての方法が本発明による方法に好適である
（第１図、工程ａ）。この際、このＤＮＡはファージに
より、形質転換により又は接合により大腸菌株ＸＬ１レ
ッド又はこの菌株の機能誘導体中に導入される。有利に
好適であり、かつ記載されているファージは全てラムダ
又はム（mu）のようなテンペレートファージである。こ
のファージＤＮＡを好適な微生物中に導入するための方
法は専門家に公知である（Microbiology,第三改訂版,Da
vis,B.D.,Dulbecco,R.,Eisen,H.N.及びGinsberg,H.S.
著,Harper International Edition,1980参照）。接合の
場合、ＤＮＡを直接転移することができ、すなわちＤＮ
ＡはＦ−ファクターのような接合媒介プラスミド上に位
置するか、又は共可動化ベクターにより接合で転移す
る。これらの方法は同様に専門家に公知である。有利で
あるとして記載されている方法は、形質転換によるＤＮ
Ａの導入である（Winnacker,E.L.,From Genes to Clone
s,VCH,1987:126-127,Williams等著,Ann.Rev.Gen.,Vol.1
4,1980:41-76）。微生物を形質転換するための多くの方
法は文献から専門家に公知であり、かつこれらの方法は
非常に広い範囲の試薬、例えばＰＥＧ（Chung等著,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.86,1989:2172-2175）、Ｃａ
Ｃｌ2（Mandel等著,J.Mol.Biol.Vol.53,1970:159-16
2）、一価又は二価のカチオンの存在下でのジメチルス
ルホキシド、ヘキサアンミンコバルト及びジチオトレイ
トール（DNA Cloning 第１改訂版,Glover等著,IRL Pres
s,1995,Hanahan等著,Technics for Transformation of
E.coli,page 1-36,ISBN 0199634769参照）を使用する。
に公知の全ての方法が本発明による方法に好適である
（第１図、工程ａ）。この際、このＤＮＡはファージに
より、形質転換により又は接合により大腸菌株ＸＬ１レ
ッド又はこの菌株の機能誘導体中に導入される。有利に
好適であり、かつ記載されているファージは全てラムダ
又はム（mu）のようなテンペレートファージである。こ
のファージＤＮＡを好適な微生物中に導入するための方
法は専門家に公知である（Microbiology,第三改訂版,Da
vis,B.D.,Dulbecco,R.,Eisen,H.N.及びGinsberg,H.S.
著,Harper International Edition,1980参照）。接合の
場合、ＤＮＡを直接転移することができ、すなわちＤＮ
ＡはＦ−ファクターのような接合媒介プラスミド上に位
置するか、又は共可動化ベクターにより接合で転移す
る。これらの方法は同様に専門家に公知である。有利で
あるとして記載されている方法は、形質転換によるＤＮ
Ａの導入である（Winnacker,E.L.,From Genes to Clone
s,VCH,1987:126-127,Williams等著,Ann.Rev.Gen.,Vol.1
4,1980:41-76）。微生物を形質転換するための多くの方
法は文献から専門家に公知であり、かつこれらの方法は
非常に広い範囲の試薬、例えばＰＥＧ（Chung等著,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.86,1989:2172-2175）、Ｃａ
Ｃｌ2（Mandel等著,J.Mol.Biol.Vol.53,1970:159-16
2）、一価又は二価のカチオンの存在下でのジメチルス
ルホキシド、ヘキサアンミンコバルト及びジチオトレイ
トール（DNA Cloning 第１改訂版,Glover等著,IRL Pres
s,1995,Hanahan等著,Technics for Transformation of
E.coli,page 1-36,ISBN 0199634769参照）を使用する。
【００２０】全ての従来のベクターを形質転換のために
使用することができる。これらの通常使用されるベクタ
ーは大腸菌中で複製されるベクターである。酵素活性の
検出を可能とする選択微生物として他の界の微生物、例
えば菌類、例えばアスペルギルス、アシュビヤ（Ashby
a）、又はベアウベリア（Beauveria）、又は酵母、例え
ばサッハロマイセス（Saccharomyces）、カンジダ又は
ピシア（Pichia）、他の科、例えばアクチノミセターレ
ス（Actinomycetales）、又は他の属例えばプソイドモ
ナス、ストレプトマイセス、ロドコッカス又はバシラス
を使用する場合、両方の微生物中で複製可能であるいわ
ゆるシャトルベクターを使用することが有利である、そ
れというのもこのシャトルベクターはＤＮＡの再クロー
ニングを必要としないためである。
使用することができる。これらの通常使用されるベクタ
ーは大腸菌中で複製されるベクターである。酵素活性の
検出を可能とする選択微生物として他の界の微生物、例
えば菌類、例えばアスペルギルス、アシュビヤ（Ashby
a）、又はベアウベリア（Beauveria）、又は酵母、例え
ばサッハロマイセス（Saccharomyces）、カンジダ又は
ピシア（Pichia）、他の科、例えばアクチノミセターレ
ス（Actinomycetales）、又は他の属例えばプソイドモ
ナス、ストレプトマイセス、ロドコッカス又はバシラス
を使用する場合、両方の微生物中で複製可能であるいわ
ゆるシャトルベクターを使用することが有利である、そ
れというのもこのシャトルベクターはＤＮＡの再クロー
ニングを必要としないためである。
【００２１】挙げることのできるベクターの例は、次の
プラスミドである：ｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、
ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、
ｐＲｅｐ４、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２
００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ113−Ｂ１、λｇ
ｔ１１又はｐＢｄＣＩ。他のベクターは専門家には十分
に知られており、例えば文献クローニング・ベクターズ
（Cloning Vectors;Pouwels P.H.等,Elsevier,Amsterda
m-New York-Oxford,1985,ISBN 0444904018）中に見いだ
すことができる。
プラスミドである：ｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、
ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、
ｐＲｅｐ４、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２
００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ113−Ｂ１、λｇ
ｔ１１又はｐＢｄＣＩ。他のベクターは専門家には十分
に知られており、例えば文献クローニング・ベクターズ
（Cloning Vectors;Pouwels P.H.等,Elsevier,Amsterda
m-New York-Oxford,1985,ISBN 0444904018）中に見いだ
すことができる。
【００２２】本発明による方法にとって突然変異株を製
造するために特に有利であるのは（工程ｂ、図１）、大
腸菌株ＸＬ１レッド（＝Epicurian coli XL-1 red）で
あり、これはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｌａ Ｊｏｌｌａ、
ＣＡ.により市販されている。これは次の遺伝子マーカ
ーを有する：Δ［ｍｃｒＡ］１８３、Δ［ｍｃｒＣＢ−
ｈｓｄＳＭＲ−ｍｒｒ］１７３、ｅｎｄＡ１、ｓｕｐＥ
４４、ｔｈｉ−１、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｌＡ１、ｍｕｔ
Ｓ、ｍｕｔＴ、ｍｕｔＤ５、ｌａｃ。ｍｕｔＳはミスマ
ッチ修復経路（mismatch repair pathway）における突
然変異であり、ｍｕｔＴはｏｘｏ−ｄＧＴＰ修復経路に
おける突然変異であり、かつｍｕｔＤ５はＤＮＡポリメ
ラーゼＩＩＩの３′−５′エキソヌクレアーゼサブユニ
ット中の突然変異である。この菌株のコンピテント細胞
は発注番号２００１２９で、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから
購入可能である。この菌株の機能誘導体は有利に次の遺
伝マーカーを有する大腸菌株を表わす：ｒｅｌＡ１、ｍ
ｕｔＳ、ｍｕｔＴ及びｍｕｔＤ５。これらの遺伝子マー
カーは微生物中の突然変異速度をはっきりと増大させ
る。従って、これらを寒天培地上で又は培養培地中で、
長すぎる時間インキュベートしてはならない、そうでな
いとこれらはその活力を失う。
造するために特に有利であるのは（工程ｂ、図１）、大
腸菌株ＸＬ１レッド（＝Epicurian coli XL-1 red）で
あり、これはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｌａ Ｊｏｌｌａ、
ＣＡ.により市販されている。これは次の遺伝子マーカ
ーを有する：Δ［ｍｃｒＡ］１８３、Δ［ｍｃｒＣＢ−
ｈｓｄＳＭＲ−ｍｒｒ］１７３、ｅｎｄＡ１、ｓｕｐＥ
４４、ｔｈｉ−１、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｌＡ１、ｍｕｔ
Ｓ、ｍｕｔＴ、ｍｕｔＤ５、ｌａｃ。ｍｕｔＳはミスマ
ッチ修復経路（mismatch repair pathway）における突
然変異であり、ｍｕｔＴはｏｘｏ−ｄＧＴＰ修復経路に
おける突然変異であり、かつｍｕｔＤ５はＤＮＡポリメ
ラーゼＩＩＩの３′−５′エキソヌクレアーゼサブユニ
ット中の突然変異である。この菌株のコンピテント細胞
は発注番号２００１２９で、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから
購入可能である。この菌株の機能誘導体は有利に次の遺
伝マーカーを有する大腸菌株を表わす：ｒｅｌＡ１、ｍ
ｕｔＳ、ｍｕｔＴ及びｍｕｔＤ５。これらの遺伝子マー
カーは微生物中の突然変異速度をはっきりと増大させ
る。従って、これらを寒天培地上で又は培養培地中で、
長すぎる時間インキュベートしてはならない、そうでな
いとこれらはその活力を失う。
【００２３】改変した基質特異性（使用した酵素中での
突然変異）の検出のためには、ベクターを使用した場
合、そのＤＮＡを最初に大腸菌株ＸＬ１レッド又はその
機能誘導体から最初に単離すること、及び相応する酵素
活性を有しない微生物中に挿入することが可能でありか
つ有利である（工程Ｃ、図１）。もし、例えば、エステ
ラーゼをこれらの選択微生物中に導入するならば、これ
らの微生物はエステラーゼの基質特異性における改変に
関する選択に使用されるエステルを切断するエステラー
ゼ活性を有していてはならない。この微生物中の他のエ
ステラーゼ活性は選択を妨害しない。ＤＮＡの導入は前
記のように、ファージもしくはビールスを介して、接合
を介して又は形質転換を介して実施することができる。
ファージもしくはビールスを介して又は接合を介しての
導入の場合、ＤＮＡの特別な単離は必要ない。ＤＮＡは
接合を介して又はファージもしくはビールスを介して選
択のために使用する微生物中に直接導入することができ
る。こうして、これらの場合ＤＮＡの転移はＤＮＡの単
離なしに行なわれ、ベクターを使用する場合、形質転換
を介して行なわれる。選択の後に改変した基質特異性を
有する微生物のＤＮＡも、同様に単離することなく接合
を介して又はファージもしくはビールスを介して又は形
質転換を介して菌株大腸菌ＸＬ１レッド又は機能誘導体
中に更なる選択サイクルのために導入することが可能で
ある（図１、点線）。このようにして、本発明方法を１
回又は複数回連続して実施することができる。この際、
該ＤＮＡを大腸菌株ＸＬ１レッド又はその機能誘導体か
ら選択微生物に転移し、最後に新規選択サイクルのため
に大腸菌株中に再び戻す。
突然変異）の検出のためには、ベクターを使用した場
合、そのＤＮＡを最初に大腸菌株ＸＬ１レッド又はその
機能誘導体から最初に単離すること、及び相応する酵素
活性を有しない微生物中に挿入することが可能でありか
つ有利である（工程Ｃ、図１）。もし、例えば、エステ
ラーゼをこれらの選択微生物中に導入するならば、これ
らの微生物はエステラーゼの基質特異性における改変に
関する選択に使用されるエステルを切断するエステラー
ゼ活性を有していてはならない。この微生物中の他のエ
ステラーゼ活性は選択を妨害しない。ＤＮＡの導入は前
記のように、ファージもしくはビールスを介して、接合
を介して又は形質転換を介して実施することができる。
ファージもしくはビールスを介して又は接合を介しての
導入の場合、ＤＮＡの特別な単離は必要ない。ＤＮＡは
接合を介して又はファージもしくはビールスを介して選
択のために使用する微生物中に直接導入することができ
る。こうして、これらの場合ＤＮＡの転移はＤＮＡの単
離なしに行なわれ、ベクターを使用する場合、形質転換
を介して行なわれる。選択の後に改変した基質特異性を
有する微生物のＤＮＡも、同様に単離することなく接合
を介して又はファージもしくはビールスを介して又は形
質転換を介して菌株大腸菌ＸＬ１レッド又は機能誘導体
中に更なる選択サイクルのために導入することが可能で
ある（図１、点線）。このようにして、本発明方法を１
回又は複数回連続して実施することができる。この際、
該ＤＮＡを大腸菌株ＸＬ１レッド又はその機能誘導体か
ら選択微生物に転移し、最後に新規選択サイクルのため
に大腸菌株中に再び戻す。
【００２４】本発明方法における選択微生物としては原
則的に全ての原核又は真核微生物が好適であるが、この
際これらの微生物は選択を阻止する酵素活性を有してい
てはならない。このことは、微生物が求められている酵
素活性を全く有しないか、すなわち改変した基質特異性
の選択のために使用した基質がこの選択微生物中の酵素
により変換しないか、又はなお選択を可能にする程度に
僅かな相当する酵素活性のみが存在する、ことを意味す
る。微生物としては本発明のために有利にグラム陽性菌
又はグラム陰性菌、菌類又は酵母を挙げることができ
る。有利にはグラム陽性菌、例えばバシラス、ロドコッ
カス、ストレプトマイセス、又はノカルディア又はグラ
ム陰性菌、例えばサルモネラ、プソイドモナス又は大腸
菌を使用する。特に有利であるのは大腸菌株を使用す
る。この際、選択のために使用する微生物の、属及び
種、又科又は界への帰属は、その微生物が改変した基質
特異性の選択を可能とする限り、重要ではない。
則的に全ての原核又は真核微生物が好適であるが、この
際これらの微生物は選択を阻止する酵素活性を有してい
てはならない。このことは、微生物が求められている酵
素活性を全く有しないか、すなわち改変した基質特異性
の選択のために使用した基質がこの選択微生物中の酵素
により変換しないか、又はなお選択を可能にする程度に
僅かな相当する酵素活性のみが存在する、ことを意味す
る。微生物としては本発明のために有利にグラム陽性菌
又はグラム陰性菌、菌類又は酵母を挙げることができ
る。有利にはグラム陽性菌、例えばバシラス、ロドコッ
カス、ストレプトマイセス、又はノカルディア又はグラ
ム陰性菌、例えばサルモネラ、プソイドモナス又は大腸
菌を使用する。特に有利であるのは大腸菌株を使用す
る。この際、選択のために使用する微生物の、属及び
種、又科又は界への帰属は、その微生物が改変した基質
特異性の選択を可能とする限り、重要ではない。
【００２５】改変した基質特異性の選択のためには、酵
素活性を検出するためにこの微生物を、酵素の改変した
基質特異性の認識を可能とする少なくとも１種の酵素基
質を含有する、少なくとも１種の選択培地上又は選択培
地中でインキュベートする（図１、工程ｄ）。この選択
培地は場合により他の、所望の改変のより良好な認識を
可能とする、指示物質を含有していてもよい。このタイ
プの付加的な指示物質は例えばｐＨ−指示物質であって
もよい。
素活性を検出するためにこの微生物を、酵素の改変した
基質特異性の認識を可能とする少なくとも１種の酵素基
質を含有する、少なくとも１種の選択培地上又は選択培
地中でインキュベートする（図１、工程ｄ）。この選択
培地は場合により他の、所望の改変のより良好な認識を
可能とする、指示物質を含有していてもよい。このタイ
プの付加的な指示物質は例えばｐＨ−指示物質であって
もよい。
【００２６】図１は、例としてベクター（１）を使用す
る方法の個々の工程を示す。方法工程ａはベクターを介
してＤＮＡ（２）を菌株大腸菌ＸＬ１レッド中に、又は
この菌株の機能誘導体（３）中に導入することを示す。
この酵素のＤＮＡはこの有機体中で突然変異する［図１
中の星印はＤＮＡ（２）中の突然変異を例として概略的
に示す］。この突然変異したベクター（４）を引き続
き、菌株大腸菌ＸＬ１レッド又はその機能誘導体から再
び単離し、引き続き直接又は貯蔵の後に、選択微生物
（５）中に形質転換する（工程ｃ）。引き続き、これら
の有機体を少なくとも１種の選択培地（６）上に塗布
し、かつ改変した酵素基質特異性を例えば生長アッセイ
及び／又は視覚アッセイにより同定する（工程ｄ）。最
後に、改変した基質特異性を有する、プラスのクローン
を選択し、改変した酵素をコードする突然変異した遺伝
子を単離することができる（工程ｅ）。この方法を、こ
の突然変異した遺伝子を使用して複数回繰り返す［図
１、点線（７）］。
る方法の個々の工程を示す。方法工程ａはベクターを介
してＤＮＡ（２）を菌株大腸菌ＸＬ１レッド中に、又は
この菌株の機能誘導体（３）中に導入することを示す。
この酵素のＤＮＡはこの有機体中で突然変異する［図１
中の星印はＤＮＡ（２）中の突然変異を例として概略的
に示す］。この突然変異したベクター（４）を引き続
き、菌株大腸菌ＸＬ１レッド又はその機能誘導体から再
び単離し、引き続き直接又は貯蔵の後に、選択微生物
（５）中に形質転換する（工程ｃ）。引き続き、これら
の有機体を少なくとも１種の選択培地（６）上に塗布
し、かつ改変した酵素基質特異性を例えば生長アッセイ
及び／又は視覚アッセイにより同定する（工程ｄ）。最
後に、改変した基質特異性を有する、プラスのクローン
を選択し、改変した酵素をコードする突然変異した遺伝
子を単離することができる（工程ｅ）。この方法を、こ
の突然変異した遺伝子を使用して複数回繰り返す［図
１、点線（７）］。
【００２７】本発明による方法においては、使用した微
生物、すなわち大腸菌ＸＬ１レッド菌株並びにその機能
誘導体並びに使用した選択有機体を、これらの有機体の
生長を可能とする培地中で培養する。この培地は合成又
は天然培地であってよい。それぞれの有機体により専門
家に公知の培地を使用する。微生物の生長のためには使
用した培地は、炭素源、窒素源、無機塩を含有し、かつ
場合により僅かな量のビタミン及び微量元素を含有す
る。
生物、すなわち大腸菌ＸＬ１レッド菌株並びにその機能
誘導体並びに使用した選択有機体を、これらの有機体の
生長を可能とする培地中で培養する。この培地は合成又
は天然培地であってよい。それぞれの有機体により専門
家に公知の培地を使用する。微生物の生長のためには使
用した培地は、炭素源、窒素源、無機塩を含有し、かつ
場合により僅かな量のビタミン及び微量元素を含有す
る。
【００２８】有利な炭素源の例は糖、例えば単糖類、二
糖類又は多糖類、例えばグルコース、フルクトース、マ
ンノース、キシロース、ガラクトース、リボース、ソル
ボース、リブロース、ラクトース、マルトース、ショ
糖、ラフィノース、デンプン又はセルロース、複合糖
源、例えば糖蜜、糖ホスフェート、例えばフルクトース
−１,６−ビスホスフェート、糖アルコール、例えばマ
ンニット、ポリオール例えばグリセリン、アルコール例
えばメタノール又はエタノール、カルボン酸例えばクエ
ン酸、乳酸又は酢酸、脂肪例えば大豆油又は菜種油、ア
ミノ酸例えばグルタミン酸又はアスパラギン酸又は同時
に窒素源としても使用することのできるアミノ糖であ
る。
糖類又は多糖類、例えばグルコース、フルクトース、マ
ンノース、キシロース、ガラクトース、リボース、ソル
ボース、リブロース、ラクトース、マルトース、ショ
糖、ラフィノース、デンプン又はセルロース、複合糖
源、例えば糖蜜、糖ホスフェート、例えばフルクトース
−１,６−ビスホスフェート、糖アルコール、例えばマ
ンニット、ポリオール例えばグリセリン、アルコール例
えばメタノール又はエタノール、カルボン酸例えばクエ
ン酸、乳酸又は酢酸、脂肪例えば大豆油又は菜種油、ア
ミノ酸例えばグルタミン酸又はアスパラギン酸又は同時
に窒素源としても使用することのできるアミノ糖であ
る。
【００２９】有利な窒素源は、有機又は無機窒素化合物
又はそれらの化合物を含有する材料である。例えば、ア
ンモニウム塩例えばＮＨ4Ｃｌ又は（ＮＨ4）2ＳＯ4、ニ
トレート、尿素、又は複合窒素源、例えばトウモロコシ
膨潤水、ビール酵母自家消化物、大豆粉、小麦グルテ
ン、酵母エキス、肉汁エキス、カゼイン加水分解物、酵
母又はジャガイモ蛋白質、これらはしばしば同時に炭素
源としても使用することができる。
又はそれらの化合物を含有する材料である。例えば、ア
ンモニウム塩例えばＮＨ4Ｃｌ又は（ＮＨ4）2ＳＯ4、ニ
トレート、尿素、又は複合窒素源、例えばトウモロコシ
膨潤水、ビール酵母自家消化物、大豆粉、小麦グルテ
ン、酵母エキス、肉汁エキス、カゼイン加水分解物、酵
母又はジャガイモ蛋白質、これらはしばしば同時に炭素
源としても使用することができる。
【００３０】無機塩の例はカルシウム、マグネシウム、
ナトリウム、マンガン、カリウム、亜鉛、銅及び鉄の塩
である。これらの塩のアニオンは特に塩素イオン、硫酸
イオン及びリン酸イオンを挙げることができる。
ナトリウム、マンガン、カリウム、亜鉛、銅及び鉄の塩
である。これらの塩のアニオンは特に塩素イオン、硫酸
イオン及びリン酸イオンを挙げることができる。
【００３１】場合により、栄養培地にその他の生長ファ
クターを添加する、例えばビタミン又は生長促進物質、
例えばリボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パ
ントテネート又はピリドキシン、アミノ酸例えばアラニ
ン、システイン、アスパラギン、アスパラギン酸、グル
タミン、セリン、メチオニン又はリジン、カルボン酸例
えばクエン酸、ギ酸、ピメリン酸又は乳酸、又はジチオ
トライトールのような物質。
クターを添加する、例えばビタミン又は生長促進物質、
例えばリボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パ
ントテネート又はピリドキシン、アミノ酸例えばアラニ
ン、システイン、アスパラギン、アスパラギン酸、グル
タミン、セリン、メチオニン又はリジン、カルボン酸例
えばクエン酸、ギ酸、ピメリン酸又は乳酸、又はジチオ
トライトールのような物質。
【００３２】ベクター又はファージ中に存在するＤＮＡ
を細胞中で安定化するために、場合により培地に抗生物
質を添加することができる。
を細胞中で安定化するために、場合により培地に抗生物
質を添加することができる。
【００３３】前記栄養物質の混合比は、インキュベーシ
ョン（＝発酵）の種類に依存し、かつ個々の場合で確立
される。必要により、培地成分を分離して滅菌するか又
は一緒に滅菌した後で、培地成分全てを発酵の開始時
に、予め装入しておくこともできるし、又は必要に応じ
てインキュベーションの際に後添加することもできる。
ョン（＝発酵）の種類に依存し、かつ個々の場合で確立
される。必要により、培地成分を分離して滅菌するか又
は一緒に滅菌した後で、培地成分全てを発酵の開始時
に、予め装入しておくこともできるし、又は必要に応じ
てインキュベーションの際に後添加することもできる。
【００３４】プレート培地は基質特異性の所望の改変の
容易な検出を可能にするので、プレート培地が液状培地
より有利である。重要であるのは、変更した酵素活性の
検出を妨害することのある培地成分を使用しないことで
ある。
容易な検出を可能にするので、プレート培地が液状培地
より有利である。重要であるのは、変更した酵素活性の
検出を妨害することのある培地成分を使用しないことで
ある。
【００３５】培養条件を、有機体（＝大腸菌株ＸＬ１レ
ッド及び選択有機体）が最適に生長し、かつ可能な限り
の収率が得られるように確立することである。有利な培
養温度は１５〜４０℃であり、特に有利であるのは、２
５〜３７℃の間の温度である。ｐＨ値を３〜９の範囲に
保持するのが有利である。特に有利であるのは５〜８の
ｐＨ値である。一般に、１〜２４０時間、有利に５〜１
７０時間、特に有利に１０〜１２０時間のインキュベー
ション時間が十分であるが、いくつかの場合には突然変
異又は検出のためにより長い時間が必要な場合もある。
ッド及び選択有機体）が最適に生長し、かつ可能な限り
の収率が得られるように確立することである。有利な培
養温度は１５〜４０℃であり、特に有利であるのは、２
５〜３７℃の間の温度である。ｐＨ値を３〜９の範囲に
保持するのが有利である。特に有利であるのは５〜８の
ｐＨ値である。一般に、１〜２４０時間、有利に５〜１
７０時間、特に有利に１０〜１２０時間のインキュベー
ション時間が十分であるが、いくつかの場合には突然変
異又は検出のためにより長い時間が必要な場合もある。
【００３６】改変した基質特異性は相応するクローンの
同定の後に、有利に試験管内アッセイにおいて再度、チ
ェックすることができる。
同定の後に、有利に試験管内アッセイにおいて再度、チ
ェックすることができる。
【００３７】
【実施例】レトロ合成分析は、マクロライド系抗生物質
エポチロン（Epothilon）Ａ（式Ｉ参照）の合成のため
に、３−ヒドロキシエステル［式ＩＩ、（１）及び
（３）参照］が有用な出発化合物であることを示した。
エポチロン（Epothilon）Ａ（式Ｉ参照）の合成のため
に、３−ヒドロキシエステル［式ＩＩ、（１）及び
（３）参照］が有用な出発化合物であることを示した。
【００３８】
【化１】
【００３９】化合物の光学的に活性の製造のためには、
エステラーゼもしくはリパーゼを用いる酵素法が行なわ
れた。意外にも、使用した１８種のリパーゼ及び２種の
エステラーゼのいずれもが３−ヒドロキシエステルに対
する酵素活性を示した（表Ｉ参照）。リン酸塩緩衝液中
で実施した加水分解方向においても、トルエン中の酢酸
ビニルで実施した合成方向においても、酵素活性は全く
検出することができなかった。
エステラーゼもしくはリパーゼを用いる酵素法が行なわ
れた。意外にも、使用した１８種のリパーゼ及び２種の
エステラーゼのいずれもが３−ヒドロキシエステルに対
する酵素活性を示した（表Ｉ参照）。リン酸塩緩衝液中
で実施した加水分解方向においても、トルエン中の酢酸
ビニルで実施した合成方向においても、酵素活性は全く
検出することができなかった。
【００４０】
【表１】
【００４１】
【表２】
【００４２】これらの化合物（ＩＩ）の変換を可能にす
るために、突然変異戦略は、大腸菌中にクローン化され
た、プソイドモナス・フルオレッセンスからのエステラ
ーゼからの出発を実施した。このエステラーゼのクロー
ン化及び配列決定は最初にチョイ等（Choi;Agric.Biol.
Chem.Vol.54,No.8,1990:2039-2045）により記載され
た。ペレティーヤ（Pelletier）及びアルテンブフナー
（Altenbuchner）（Microbiology,Vol.141,1995:459-46
8）はこのエステラーゼを再度配列決定し、チョイ等の
最初の配列中にいくつかの誤りを見いだした。
るために、突然変異戦略は、大腸菌中にクローン化され
た、プソイドモナス・フルオレッセンスからのエステラ
ーゼからの出発を実施した。このエステラーゼのクロー
ン化及び配列決定は最初にチョイ等（Choi;Agric.Biol.
Chem.Vol.54,No.8,1990:2039-2045）により記載され
た。ペレティーヤ（Pelletier）及びアルテンブフナー
（Altenbuchner）（Microbiology,Vol.141,1995:459-46
8）はこのエステラーゼを再度配列決定し、チョイ等の
最初の配列中にいくつかの誤りを見いだした。
【００４３】エステラーゼの突然変異に関しては、菌株
大腸菌ＸＬ−１レッド（＝Epicurian coli XL-1 Red）
を使用した。
大腸菌ＸＬ−１レッド（＝Epicurian coli XL-1 Red）
を使用した。
【００４４】１.エステラーゼ及び突然変異したエステ
ラーゼの製造 ラムノースを生産可能なプラスミド２７９２.１（図２
参照）を有する、菌株大腸菌ＪＭ１０９又はＤＨ５αを
３７℃で、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを補充したＬ
Ｂ（Luria-Bertani）−培地中で、早期対数期（ＯＤ600
０.５−０.６、約３時間）まで培養した。エステラー
ゼ遺伝子ｅｓｔＦはプラスミド２７９２.１上に位置決
めされる。遺伝子発現は培地中にラムノースを添加する
際に誘発された［最終濃度 ０.２％］。引き続き、この
細胞を更に３.５時間３７℃でインキュベートし、遠心
分離により（５０００ｒｐｍ、５分間、４℃）収穫し、
かつリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７.５、４
℃）で２回洗浄した。引き続き、この細胞を同じ緩衝液
中に再懸濁させ、かつ超音波で砕壊した。細胞の破片を
遠心分離により（５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）除去
した。上澄み中の蛋白質濃度をビシンコニン酸−蛋白質
測定キット（Pierce,Rockford,Illinois,USA:発注ナン
バー 23223,US 4839295）を用いて測定した。ＰＦＥの
比活性を測光法により又はｐＨスタット（２.エステラ
ーゼ活性を参照）で測定した。このＰＦＥを直接加水分
解実験に使用した。加水分解のためのＰＦＥの更なる精
製は、このエステラーゼがすでに菌株から高い純度で生
産されるために、実施しなかった。亜鉛−親和性クロマ
トグラフィーを用いての簡単な精製が均質なエステラー
ゼ溶液に導いた。その際比活性は僅かに高まったに過ぎ
ない。
ラーゼの製造 ラムノースを生産可能なプラスミド２７９２.１（図２
参照）を有する、菌株大腸菌ＪＭ１０９又はＤＨ５αを
３７℃で、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを補充したＬ
Ｂ（Luria-Bertani）−培地中で、早期対数期（ＯＤ600
０.５−０.６、約３時間）まで培養した。エステラー
ゼ遺伝子ｅｓｔＦはプラスミド２７９２.１上に位置決
めされる。遺伝子発現は培地中にラムノースを添加する
際に誘発された［最終濃度 ０.２％］。引き続き、この
細胞を更に３.５時間３７℃でインキュベートし、遠心
分離により（５０００ｒｐｍ、５分間、４℃）収穫し、
かつリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７.５、４
℃）で２回洗浄した。引き続き、この細胞を同じ緩衝液
中に再懸濁させ、かつ超音波で砕壊した。細胞の破片を
遠心分離により（５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）除去
した。上澄み中の蛋白質濃度をビシンコニン酸−蛋白質
測定キット（Pierce,Rockford,Illinois,USA:発注ナン
バー 23223,US 4839295）を用いて測定した。ＰＦＥの
比活性を測光法により又はｐＨスタット（２.エステラ
ーゼ活性を参照）で測定した。このＰＦＥを直接加水分
解実験に使用した。加水分解のためのＰＦＥの更なる精
製は、このエステラーゼがすでに菌株から高い純度で生
産されるために、実施しなかった。亜鉛−親和性クロマ
トグラフィーを用いての簡単な精製が均質なエステラー
ゼ溶液に導いた。その際比活性は僅かに高まったに過ぎ
ない。
【００４５】２.エステラーゼ活性の測定 エステラーゼ活性は蒸留水の他にアラビアゴム２％（ｗ
／ｖ）を含有するエマルション中の酢酸エチル５％（ｗ
／ｖ）を用いて、ｐＨスタットアッセイで、３７℃及び
ｐＨ７.５で測定した。このエマルション２０ｍｌに公
知量のエステラーゼを添加した。遊離した酢酸を自動的
にｐＨスタット（Metrohm:Herisau,witzerland）中で
０.１ＮＮａＯＨで滴定し、ｐＨを一定に保持した。エ
ステラーゼ活性を単位で記載した。１単位（＝Ｕ）をア
ッセイ条件下に１分当たり酢酸１μｍｏｌを生産する酵
素の量と定義する。測定した単位値をこの条件下での酢
酸エチルの自己分解の値で補正した。この値は３７℃で
１分当たり０.２５μｍｏｌである。
／ｖ）を含有するエマルション中の酢酸エチル５％（ｗ
／ｖ）を用いて、ｐＨスタットアッセイで、３７℃及び
ｐＨ７.５で測定した。このエマルション２０ｍｌに公
知量のエステラーゼを添加した。遊離した酢酸を自動的
にｐＨスタット（Metrohm:Herisau,witzerland）中で
０.１ＮＮａＯＨで滴定し、ｐＨを一定に保持した。エ
ステラーゼ活性を単位で記載した。１単位（＝Ｕ）をア
ッセイ条件下に１分当たり酢酸１μｍｏｌを生産する酵
素の量と定義する。測定した単位値をこの条件下での酢
酸エチルの自己分解の値で補正した。この値は３７℃で
１分当たり０.２５μｍｏｌである。
【００４６】３.生体内変化 ３−ヒドロキシエステルの加水分解を丸底フラスコ中で
撹拌（７００ｒｐｍ）下に実施した。このためにエステ
ル１又は３の０.５ｍｍｏｌをトルエン１ｍｌに３７℃
で添加した。この反応を培養上澄み３ｍｌの添加により
開始し、かつエーテルで抽出することにより停止した。
有機相をＭｇＳＯ4上で乾燥した。基質及び生成物をシ
リカゲルカラムを用いて分離した（石油エーテル：エー
テル、２：１）。
撹拌（７００ｒｐｍ）下に実施した。このためにエステ
ル１又は３の０.５ｍｍｏｌをトルエン１ｍｌに３７℃
で添加した。この反応を培養上澄み３ｍｌの添加により
開始し、かつエーテルで抽出することにより停止した。
有機相をＭｇＳＯ4上で乾燥した。基質及び生成物をシ
リカゲルカラムを用いて分離した（石油エーテル：エー
テル、２：１）。
【００４７】反応生成物の分析のために、反応混合物１
００μｌを遠心分離し、かつ上澄みを薄層クロマト（シ
リカゲルプレート、ＵＶで又はＣｅｒ−試薬を噴霧する
ことで可視とする）又はキラルカラム［＝Heptakis,
（６−Ｏ−テキシルジメチルシリル−２,３−ジ−Ｏ−
メチル）−β−シクロデキストリン、２５×０．２５ｍ
ｍ、１５ｍ、Prof.W.Koenig,Institute of Organic Che
mistry,Hamburg University,Germany］を用いてＧＣ（H
ewlett Packard,Model HP5890 series II）により、分
析した。ＧＣ−分析は１２５℃（恒温）でキャリヤーガ
スとしてヘリウムを用いて（８０ｋＰａ）、火炎イオン
化検出器及びスプリット比１：１００で実施した。
００μｌを遠心分離し、かつ上澄みを薄層クロマト（シ
リカゲルプレート、ＵＶで又はＣｅｒ−試薬を噴霧する
ことで可視とする）又はキラルカラム［＝Heptakis,
（６−Ｏ−テキシルジメチルシリル−２,３−ジ−Ｏ−
メチル）−β−シクロデキストリン、２５×０．２５ｍ
ｍ、１５ｍ、Prof.W.Koenig,Institute of Organic Che
mistry,Hamburg University,Germany］を用いてＧＣ（H
ewlett Packard,Model HP5890 series II）により、分
析した。ＧＣ−分析は１２５℃（恒温）でキャリヤーガ
スとしてヘリウムを用いて（８０ｋＰａ）、火炎イオン
化検出器及びスプリット比１：１００で実施した。
【００４８】４.微生物の培養 使用した微生物（突然変異菌株：大腸菌ＸＬ−１レッ
ド、選択菌株：大腸菌ＤＨ５α）をＬＢ−培地、ＬＢ／
Ａｍｐ−培地［アンピシリン（１％ｗ／ｖ）を補充した
ＬＢ］、ＬＢ／ＴＢ／Ａｍｐ−培地［トリブチリン（１
％ｖ／ｖ）及びアンピシリン（１％ｗ／ｖ）及び１％寒
天を補充したＬＢ］及びＭＭ／Ａｍｐ／Ｉｎｄ／Ｒｈａ
［アンピシリン（１％ｗ／ｖ）、指示物質としてのクリ
スタルバイオレット（１ｍｇ／ｌ）及びニュートラルレ
ッド（３０ｍｇ／Ｌ）及び誘発のためのラムノース
（０.２％ｗ／ｖ）並びに１％寒天を補充した最少培
地］中で培養した。ＬＢ−培地並びに最少培地（Ｍ９）
の組成はマニアティス等著、モレキュラール・クローニ
ング：ア ラボラトリー・マニュアル（Maniatis et a
l.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual）(Sec.Edi
tion,Vol.I,II,III,Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess,1989,ISBN 0-87969-309-6)又はグリーナー等（Gree
ner et al.）（Methods in Molecular Biology,Vol.57,
1996:375-385）に記載されている。
ド、選択菌株：大腸菌ＤＨ５α）をＬＢ−培地、ＬＢ／
Ａｍｐ−培地［アンピシリン（１％ｗ／ｖ）を補充した
ＬＢ］、ＬＢ／ＴＢ／Ａｍｐ−培地［トリブチリン（１
％ｖ／ｖ）及びアンピシリン（１％ｗ／ｖ）及び１％寒
天を補充したＬＢ］及びＭＭ／Ａｍｐ／Ｉｎｄ／Ｒｈａ
［アンピシリン（１％ｗ／ｖ）、指示物質としてのクリ
スタルバイオレット（１ｍｇ／ｌ）及びニュートラルレ
ッド（３０ｍｇ／Ｌ）及び誘発のためのラムノース
（０.２％ｗ／ｖ）並びに１％寒天を補充した最少培
地］中で培養した。ＬＢ−培地並びに最少培地（Ｍ９）
の組成はマニアティス等著、モレキュラール・クローニ
ング：ア ラボラトリー・マニュアル（Maniatis et a
l.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual）(Sec.Edi
tion,Vol.I,II,III,Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess,1989,ISBN 0-87969-309-6)又はグリーナー等（Gree
ner et al.）（Methods in Molecular Biology,Vol.57,
1996:375-385）に記載されている。
【００４９】５.突然変異 突然変異を図１に示すように実施した。プラスミドＰＦ
Ｅ−ＷＴをＬＢ／Ａｍｐ−培地中の一夜培養からクイア
ゲン（Quiagen）社（Hilden,Germany）からのキットを
用いて単離し、引き続き菌株大腸菌（Epicurian coli）
ＸＬ−１レッドのコンピテント細胞中に形質転換し、Ｍ
ｇＣｌ2２０ｍＭ及びグルコース２０ｍＭで補充したＬ
Ｂ／Ａｍｐ培地５０ｍｌ中で、３７℃で一夜培養した。
この培養物５００μｌを新鮮なＬＢ／Ａｍｐ−培地（５
０ｍｌ）中にインキュベートし、かつ更なる突然変異サ
イクルを実施した。残りの培養物から細胞２ｍｌを取り
出し、遠心分離し（３０００ｒｐｍ、１０分、４℃）か
つこのプラスミドをこれらの細胞から単離した（Maniat
is et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Se
c.Edition,Vol.I,II,III,Cold Spring Harbor Laborato
ry Press,1989,ISBN0-87969-309-6参照)。突然変異サイ
クルを７回まで連続して実施した。最初のサイクルで同
定されたプラスの突然変異体（例えば、ＰＦＥ−Ｕ３）
に第２の突然変異サイクル（７サイクルまで）を実施し
た。
Ｅ−ＷＴをＬＢ／Ａｍｐ−培地中の一夜培養からクイア
ゲン（Quiagen）社（Hilden,Germany）からのキットを
用いて単離し、引き続き菌株大腸菌（Epicurian coli）
ＸＬ−１レッドのコンピテント細胞中に形質転換し、Ｍ
ｇＣｌ2２０ｍＭ及びグルコース２０ｍＭで補充したＬ
Ｂ／Ａｍｐ培地５０ｍｌ中で、３７℃で一夜培養した。
この培養物５００μｌを新鮮なＬＢ／Ａｍｐ−培地（５
０ｍｌ）中にインキュベートし、かつ更なる突然変異サ
イクルを実施した。残りの培養物から細胞２ｍｌを取り
出し、遠心分離し（３０００ｒｐｍ、１０分、４℃）か
つこのプラスミドをこれらの細胞から単離した（Maniat
is et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Se
c.Edition,Vol.I,II,III,Cold Spring Harbor Laborato
ry Press,1989,ISBN0-87969-309-6参照)。突然変異サイ
クルを７回まで連続して実施した。最初のサイクルで同
定されたプラスの突然変異体（例えば、ＰＦＥ−Ｕ３）
に第２の突然変異サイクル（７サイクルまで）を実施し
た。
【００５０】６.微生物の形質転換 微生物大腸菌ＸＬ１レッド又は大腸菌ＤＨ５αの形質転
換をチャン（Chung）等（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.
86,1989:2172-2175）により記載された方法に従って実
施した。形質転換体をＬＢ／Ａｍｐ−培地中で３７℃で
約１時間培養した後、培養物の部分量（５０〜１００μ
ｌ）をＬＢ／Ａｍｐ−寒天プレート上に塗抹し、３７℃
で一夜インキュベートした。このプレートをレダーベル
グ（Laderberg）により記載されたように、引き続き行
なわれるレプリカ平板法のためのマスタープレートとし
て、スクリーニング実験に使用した（Manual of Method
sfor General Bacteriology,American Sociaty For Mic
robiology,Washington,DC20006,ISBN 0-914826-29-
8）。更に、活性エラスターゼを生産するコロニーを同
定するために、０.２％ラムノースを含有するＬＢ／Ｔ
Ｂ／Ａｍｐ−プレート上に培養物５０μｌを塗抹した。
換をチャン（Chung）等（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.
86,1989:2172-2175）により記載された方法に従って実
施した。形質転換体をＬＢ／Ａｍｐ−培地中で３７℃で
約１時間培養した後、培養物の部分量（５０〜１００μ
ｌ）をＬＢ／Ａｍｐ−寒天プレート上に塗抹し、３７℃
で一夜インキュベートした。このプレートをレダーベル
グ（Laderberg）により記載されたように、引き続き行
なわれるレプリカ平板法のためのマスタープレートとし
て、スクリーニング実験に使用した（Manual of Method
sfor General Bacteriology,American Sociaty For Mic
robiology,Washington,DC20006,ISBN 0-914826-29-
8）。更に、活性エラスターゼを生産するコロニーを同
定するために、０.２％ラムノースを含有するＬＢ／Ｔ
Ｂ／Ａｍｐ−プレート上に培養物５０μｌを塗抹した。
【００５１】７.スクリーニングシステム 突然変異した遺伝子を同定するためにコロニーをマスタ
ープレートから次の選択プレートにレプリカ平板法を実
施した（Manual of Methods for General Bacteriolog
y,American Sociaty For Microbiology,Washington,DC
20006,ISBN 0-914826-29-8）：ａ）基質（化合物１）
０.１％（ｗ／ｖ）を含有するＭＭ／Ａｍｐ／Ｉｎｄ／
Ｒｈａ、ｂ）基質（化合物３）０.１％（ｗ／ｖ）を含
有するＭＭ／Ａｍｐ／Ｉｎｄ／Ｒｈａ。このプレートを
３７℃でインキュベートした。プラスのクローンをプレ
ートタイプ（ａ）及び（ｂ）に関して、コロニーの周辺
及び中の赤色への着色−ｐＨ値の低下−及び（ｂ）プレ
ート上でのより迅速な生長に基づき同定した。ＬＢ／Ａ
ｍｐ／Ｉｎｄ−プレート上には、全てのコロニーにおい
て２日後赤色が観察された。このことは多分副反応に起
因する。従って、このアッセイのためには前記最少培地
が好適である。マスタープレートとの比較により、両方
の方法においてプラスの結果を示すコロニー、すなわち
完全なエステラーゼを生産し、かつ赤色への着色を示す
コロニーだけを選択した。最初の突然変異サイクルの約
７５０コロニーから２つのプラスのクローン（＝ＰＦＥ
−Ｕ１及びＰＦＥ−Ｕ３）が２〜６日間の３７℃でのイ
ンキュベーションの後、同定された。ＰＦＥ−Ｕ１の場
合弱い赤色への着色を形成するだけであり、一方ＰＦＥ
−Ｕ３の場合深い赤色への着色が形成され、かつ化合物
３は良好な生長を示した。これらのクローンのベクター
（＝プラスミド）を単離し、かつ新たに菌株大腸菌ＤＨ
５α中に形質転換した。これらの有機体をＬＢ／Ａｍｐ
−培地２５０ｍｌ中でラムノース誘発による突然変異エ
ステラーゼの生産のために使用した。このエステラーゼ
（前記）を単離し、かつ化合物１の調製反応に使用し
た。コントロールとしては突然変異を行なっていない野
生型−エステラーゼを使用した。
ープレートから次の選択プレートにレプリカ平板法を実
施した（Manual of Methods for General Bacteriolog
y,American Sociaty For Microbiology,Washington,DC
20006,ISBN 0-914826-29-8）：ａ）基質（化合物１）
０.１％（ｗ／ｖ）を含有するＭＭ／Ａｍｐ／Ｉｎｄ／
Ｒｈａ、ｂ）基質（化合物３）０.１％（ｗ／ｖ）を含
有するＭＭ／Ａｍｐ／Ｉｎｄ／Ｒｈａ。このプレートを
３７℃でインキュベートした。プラスのクローンをプレ
ートタイプ（ａ）及び（ｂ）に関して、コロニーの周辺
及び中の赤色への着色−ｐＨ値の低下−及び（ｂ）プレ
ート上でのより迅速な生長に基づき同定した。ＬＢ／Ａ
ｍｐ／Ｉｎｄ−プレート上には、全てのコロニーにおい
て２日後赤色が観察された。このことは多分副反応に起
因する。従って、このアッセイのためには前記最少培地
が好適である。マスタープレートとの比較により、両方
の方法においてプラスの結果を示すコロニー、すなわち
完全なエステラーゼを生産し、かつ赤色への着色を示す
コロニーだけを選択した。最初の突然変異サイクルの約
７５０コロニーから２つのプラスのクローン（＝ＰＦＥ
−Ｕ１及びＰＦＥ−Ｕ３）が２〜６日間の３７℃でのイ
ンキュベーションの後、同定された。ＰＦＥ−Ｕ１の場
合弱い赤色への着色を形成するだけであり、一方ＰＦＥ
−Ｕ３の場合深い赤色への着色が形成され、かつ化合物
３は良好な生長を示した。これらのクローンのベクター
（＝プラスミド）を単離し、かつ新たに菌株大腸菌ＤＨ
５α中に形質転換した。これらの有機体をＬＢ／Ａｍｐ
−培地２５０ｍｌ中でラムノース誘発による突然変異エ
ステラーゼの生産のために使用した。このエステラーゼ
（前記）を単離し、かつ化合物１の調製反応に使用し
た。コントロールとしては突然変異を行なっていない野
生型−エステラーゼを使用した。
【００５２】８.ヌクレオチド配列分析 エステラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列をフルオレッセ
ンス−ジデオキシ−ＤＮＡ−配列決定法を使用して測定
した。ＤＮＡ−配列決定をＴａｑ Ｄｙｅ ＤｅｏｘｙTM
Ｃｙｃｌｅ 配列決定キット（Biosystems,Weiterstadt,
Germany）を用いて、製造者の記載に従って核酸配列か
ら誘導されたプライマー（Interactiva,Ulm,Germany）
を使用して実施した。ＰＦＥ−Ｕ１−遺伝子の配列決定
は構造遺伝子に全く突然変異を有さず、一方ＰＦＥ−Ｕ
３−遺伝子は２個の点突然変異を示した。これにより、
２０９位（ＡがＤにより）及び１８１位（ＬがＶによ
り）にアミノ酸交換が行なわれた。モデル化分析は、ア
ミノ酸交換が活性中心から遠く離れたところにあること
を示した。
ンス−ジデオキシ−ＤＮＡ−配列決定法を使用して測定
した。ＤＮＡ−配列決定をＴａｑ Ｄｙｅ ＤｅｏｘｙTM
Ｃｙｃｌｅ 配列決定キット（Biosystems,Weiterstadt,
Germany）を用いて、製造者の記載に従って核酸配列か
ら誘導されたプライマー（Interactiva,Ulm,Germany）
を使用して実施した。ＰＦＥ−Ｕ１−遺伝子の配列決定
は構造遺伝子に全く突然変異を有さず、一方ＰＦＥ−Ｕ
３−遺伝子は２個の点突然変異を示した。これにより、
２０９位（ＡがＤにより）及び１８１位（ＬがＶによ
り）にアミノ酸交換が行なわれた。モデル化分析は、ア
ミノ酸交換が活性中心から遠く離れたところにあること
を示した。
【００５３】９.化合物１及び３の化学合成 ａ）５−（ベンジルオキシ）−３−ヒドロキシ−４,４
−ジメチル−ペンタン酸エチルエステル（＝化合物１） ＴＨＦ／ヘキサン中のリチウムジイソプロピルアミド１
７０ｍｌの溶液（１１０ｍｍｏｌ、ジイソプロピルアミ
ン１１.１ｇ及びブチルリチウム、ヘキサン中１.６Ｎ
６８.８ｍｌから製造）に、−６０℃で酢酸エチル溶液
（８.８ｇ、ＴＨＦ１０ｍｌ中１００ｍｍｏｌ）を滴加
した。３０分後にＴＨＦ中の３−ベンジルオキシ−２,
２−ジメチルプロパナール３０ｍｌ（１９.２ｇ、１０
０ｍｍｏｌ）を、迅速に添加し、この配合物を５分間撹
拌し、その後、硫酸水素カリウム水溶液を中和のために
添加した。この反応混合物をジエチルエーテルで抽出
し、複数回水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥さ
せ、かつ有機溶剤を減圧下に留去した。化合物２６.１
ｇ（９３％）が僅かに黄色の油状物質として単離され
た。この化合物をシリカゲルカラムを介して精製した
（エーテル：石油エーテル、１：３〜１：１）。
−ジメチル−ペンタン酸エチルエステル（＝化合物１） ＴＨＦ／ヘキサン中のリチウムジイソプロピルアミド１
７０ｍｌの溶液（１１０ｍｍｏｌ、ジイソプロピルアミ
ン１１.１ｇ及びブチルリチウム、ヘキサン中１.６Ｎ
６８.８ｍｌから製造）に、−６０℃で酢酸エチル溶液
（８.８ｇ、ＴＨＦ１０ｍｌ中１００ｍｍｏｌ）を滴加
した。３０分後にＴＨＦ中の３−ベンジルオキシ−２,
２−ジメチルプロパナール３０ｍｌ（１９.２ｇ、１０
０ｍｍｏｌ）を、迅速に添加し、この配合物を５分間撹
拌し、その後、硫酸水素カリウム水溶液を中和のために
添加した。この反応混合物をジエチルエーテルで抽出
し、複数回水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥さ
せ、かつ有機溶剤を減圧下に留去した。化合物２６.１
ｇ（９３％）が僅かに黄色の油状物質として単離され
た。この化合物をシリカゲルカラムを介して精製した
（エーテル：石油エーテル、１：３〜１：１）。
【００５４】
【数１】
【００５５】ｂ）５−（ベンジルオキシ）−３−ヒドロ
キシ−４,４−ジメチル−ペンタン酸−２,３−ジヒドロ
キシプロピルエステル（＝化合物３） ａに記載した合成法に相応して、リチウムジイソプロピ
ルアミド３５ｍｍｏｌ、１−アセチル−２,３−イソプ
ロピリデングリセリン３０ｍｍｏｌ及び３−ベンジルオ
キシ−２,２−ジメチルプロパナール３０ｍｍｏｌを使
用して、化合物５−（ベンジルオキシ）−３−ヒドロキ
シ−４,４−ジメチル−ペンタン酸−２,２−ジメチル−
１,３−ジオキソラン−４−イル）メチルエステル（＝
化合物２）を合成した。メトキシエタノール３０ｍｌ中
のこの化合物２ ３.６６ｇ（１０ｍｍｏｌ）から出発
し、化合物３を合成した。化合物２の溶液をホウ酸５.
０ｇと共に１１０℃に２０分間加熱した。この溶剤を除
去した後、この残分に僅かな量の水を添加し、ジエチル
エーテルで抽出した。この抽出液を硫酸マグネシウム上
で乾燥させ、かつ溶剤を減圧下に留去し、かつ化合物３
をシリカゲルカラムを介して精製した（エーテル及びエ
ーテル：ジオキサン、９：１）。化合物３ ２．３ｇ
（７０％）が１：１のジアステレオマー混合物の形で無
色油状物質として単離された。
キシ−４,４−ジメチル−ペンタン酸−２,３−ジヒドロ
キシプロピルエステル（＝化合物３） ａに記載した合成法に相応して、リチウムジイソプロピ
ルアミド３５ｍｍｏｌ、１−アセチル−２,３−イソプ
ロピリデングリセリン３０ｍｍｏｌ及び３−ベンジルオ
キシ−２,２−ジメチルプロパナール３０ｍｍｏｌを使
用して、化合物５−（ベンジルオキシ）−３−ヒドロキ
シ−４,４−ジメチル−ペンタン酸−２,２−ジメチル−
１,３−ジオキソラン−４−イル）メチルエステル（＝
化合物２）を合成した。メトキシエタノール３０ｍｌ中
のこの化合物２ ３.６６ｇ（１０ｍｍｏｌ）から出発
し、化合物３を合成した。化合物２の溶液をホウ酸５.
０ｇと共に１１０℃に２０分間加熱した。この溶剤を除
去した後、この残分に僅かな量の水を添加し、ジエチル
エーテルで抽出した。この抽出液を硫酸マグネシウム上
で乾燥させ、かつ溶剤を減圧下に留去し、かつ化合物３
をシリカゲルカラムを介して精製した（エーテル及びエ
ーテル：ジオキサン、９：１）。化合物３ ２．３ｇ
（７０％）が１：１のジアステレオマー混合物の形で無
色油状物質として単離された。
【００５６】
【数２】
【００５７】１０.ＰＦＥ−Ｕ３での酵素による加水分
解 ラセミ化合物１を突然変異したエステラーゼＰＦＥ−Ｕ
３を用いて、酵素的加水分解を実施し、相応する酸にし
た［α］D 20＝−１１.０１゜（ｃ＝０.９６５、ＣＨＣ
ｌ3）、油状物質、収率１１.６％及び残留出発物質（２
４.９％ｅｅ）［α］D 20＝＋０.９７゜（ｃ＝３.０７
１、ＣＨＣｌ3）、油状物質、収率６１.４％。すなわち
この加水分解は１の立体選択的識別で行なわれた。コン
トロールとして使用した野生型ヒドロラーゼは突然変異
体ＰＦＥ−Ｕ１と同様に化合物１を変換することはでき
ない。ＰＦＥ−Ｕ３から出発した第二世代の突然変異体
は加水分解反応における立体選択性に関して全く改良を
示さなかった。第二世代の突然変異体はＰＦＥ−３−３
１１〜ＰＦＥ−３−７１３である（表ＩＩ参照）。表Ｉ
Ｉは種々のエステラーゼの比活性を基質として酢酸エス
テルを用いて単位で示した（表ＩＩ、Ｕ／ｍｇ蛋白
質）。種々異なるエステラーゼの光学活性は化合物１を
基礎とする（表ＩＩ）。
解 ラセミ化合物１を突然変異したエステラーゼＰＦＥ−Ｕ
３を用いて、酵素的加水分解を実施し、相応する酸にし
た［α］D 20＝−１１.０１゜（ｃ＝０.９６５、ＣＨＣ
ｌ3）、油状物質、収率１１.６％及び残留出発物質（２
４.９％ｅｅ）［α］D 20＝＋０.９７゜（ｃ＝３.０７
１、ＣＨＣｌ3）、油状物質、収率６１.４％。すなわち
この加水分解は１の立体選択的識別で行なわれた。コン
トロールとして使用した野生型ヒドロラーゼは突然変異
体ＰＦＥ−Ｕ１と同様に化合物１を変換することはでき
ない。ＰＦＥ−Ｕ３から出発した第二世代の突然変異体
は加水分解反応における立体選択性に関して全く改良を
示さなかった。第二世代の突然変異体はＰＦＥ−３−３
１１〜ＰＦＥ−３−７１３である（表ＩＩ参照）。表Ｉ
Ｉは種々のエステラーゼの比活性を基質として酢酸エス
テルを用いて単位で示した（表ＩＩ、Ｕ／ｍｇ蛋白
質）。種々異なるエステラーゼの光学活性は化合物１を
基礎とする（表ＩＩ）。
【００５８】
【表３】
【図１】例としてベクターを使用する方法の各工程を示
した図である。
した図である。
【図２】ラムノース誘発性プラスミド２７９２.１の制
限地図を示した図である。
限地図を示した図である。
【符号の説明】 １ ベクター ２ ＤＮＡ ３ 機能誘導体 ４ 突然変異したベクター ５ 選択有機体 ６ 選択培地
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ヨーゼフ アルテンブーフナー ドイツ連邦共和国 ヌフリンゲン ヒンデ ンブルクシュトラーセ ６
Claims (9)
- 【請求項１】 酵素の基質特異性を改変するために、次
の工程： ａ）大腸菌株ＸＬ１レッド中に又は機能誘導体中に、該
酵素をコードする遺伝子のコピーを有するＤＮＡを導入
し、 ｂ）形質転換した大腸菌株ＸＬ１レッド又はその機能誘
導体をインキュベートして酵素遺伝子中に突然変異を誘
発し、 ｃ）菌株ＸＬ１レッド又はその機能誘導体から突然変異
したＤＮＡを、阻害する酵素活性を有しない微生物に転
移し、 ｄ）酵素活性を検出するために、該酵素の未改変の基質
特異性を認識することを可能とする、少なくとも１種の
酵素基質を含有し、かつその他の指示物質を含有するか
又は含有しない、少なくとも１つの選択培地上で、又は
培地中でこの微生物をインキュベートし、 ｅ）基質特異性の改変を示す微生物を選択する、を実施
することからなる、酵素の基質特異性を改変する方法。 - 【請求項２】 工程（ａ）〜（ｅ）を連続して複数回実
施し、その際工程（ｅ）で選択された微生物からのＤＮ
Ａを再び大腸菌株ＸＬ１−レッド又はその機能誘導体中
に戻す、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 原核微生物又は真核微生物を微生物とし
て使用する請求項１又は２記載の方法。 - 【請求項４】 グラム陽性又はグラム陰性菌、菌類又は
酵母を微生物として使用する請求項１から３までのいず
れか１項記載の方法。 - 【請求項５】 ヒドロラーゼを酵素として使用する請求
項１から４までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項６】 プロテアーゼ、リパーゼ、ホスホリパー
ゼ、エステラーゼ、ホスファターゼ、アミダーゼ、ニト
リラーゼ、エーテル・ヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ
及びグリコシダーゼの群から選択されたヒドロラーゼを
酵素として使用する請求項１から５までのいずれか１項
記載の方法。 - 【請求項７】 リパーゼ、エステラーゼ、ニトリラーゼ
又はフィターゼを使用する請求項１から６までのいずれ
か１項記載の方法。 - 【請求項８】 基質特異性の改変が選択的酵素活性に導
く請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項９】 基質特異性の改変が領域選択的、化学選
択的又は立体選択的、又は領域選択的、化学選択的及び
／又は立体選択的の酵素活性に導く請求項８記載の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19743683.8 | 1997-10-02 | ||
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