BRPI0213813B1 - método para aprimorar o valor nutricional de uma ração consumida por um animal monogástrico e ração - Google Patents

Abstract

"alimento animal contendo fitase e seu método". é descrito um método para aprimorar o valor nutricional de uma ração compreendendo uma fonte de hexakisfosfato de mio-inositol mediante a alimentação de ração em combinação com uma fitase expressa em levedura. o método compreende a etapa de alimentar o animal com a ração em combinação com uma fitase expressa em levedura onde a fitase pode ser selecionada a partir do grupo que consiste de appa1, appa2 e um mutante direcionado a sítio de appa. a invenção também possibilita a redução da relação alimento para ganho de peso e um aumento da massa óssea e do teor mineral de um animal. a ração e um aditivo de alimento compreendendo appa2 ou um mutante direcionado a sítio de appa são também descritos.

Description

(54) Título: MÉTODO PARA APRIMORAR O VALOR NUTRICIONAL DE UMA RAÇÃO CONSUMIDA POR UM ANIMAL MONOGÁSTRICO E RAÇÃO (73) Titular: CORNELL RESEARCH FOUNDATION, Sociedade Norte Americana. Endereço: 20 Thornwood Drive, Suite 105, Ithaca, New York 14850, ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US); HUVEPHARMA AD. Endereço: 3A, Nicolay Haytov Stre., Sofia, BULGÁRIA(BG), 1113 (72) Inventor: DOUGLAS M. WEBEL; DONALD E. ORR, JR.; FRANK E. RUCH, JR.; XINGEN LEI.

Código de Controle: 3DE21D45AE97D464 3014BEAE1B26BEDE

Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 21/11/2018, observadas as condições legais

Expedida em: 21/11/2018

Assinado digitalmente por:

Alexandre Gomes Ciancio

Diretor Substituto de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados “MÉTODO PARA APRIMORAR O VALOR NUTRICIONAL DE UMA

RAÇÃO CONSUMIDA POR UM ANIMAL MONOGÁSTRICO E RAÇÃO

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção está relacionada a um método para o aprimoramento do valor nutricional de uma ração e para uma ração aprimorada. Mais particularmente, a invenção está relacionada a um método para aprimorar o valor nutricional de uma ração que compreende um hexakisfosfato de rnio-inositol mediante a alimentação da ração a um animal em combinação com uma fitase expressa em levedura.

FUNDAMENTOS E SUMÁRIO DA INVENÇÃO

As fitases são fosfohidrolases de hexakisfosfato de rnio-inositol que catalisam a remoção em etapas do ortofosfato inorgânico proveniente da fitase (hexakisfosfato de rnio-inositol). O fitato é a principal forma de armazenamento de fosfato em alimentos vegetais, incluindo cereais e legumes. Devido ao fato de animais tais como suínos, aves domésticas, e humanos possuírem pouca fitase em seus tratos gastrintestinais quase a totalidade do fosfato de fitato ingerido é não digerível. Conseqüentemente, esses animais requerem suplementação de suas dietas com fitase, ou fosfato inorgânico. Em contraste, os animais ruminantes possuem microorganismos no rúmen que produzem fitases e esses animais não requerem suplementação de fitase de suas dietas.

O fosfato de fitase não utilizado nos animais monogástricos cria problemas adicionais. O fosfato de fitato não utilizado é excretado no estrume e polui o ambiente.

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Além disso, nos animais monogástricos o fitato passa amplamente intacto através do trato gastrintestinal superior onde ele quelata os minerais essenciais (por ex., cálcio e zinco), liga aminoácidos e proteínas, e inibe as atividades 5 enzimáticas. Conseqüentemente, a suplementação fitase das dietas de animais monogástricos não apenas reduz as necessidades quanto à suplementação com fosfato inorgânico, mas também reduz a poluição do ambiente causado pelo fitato, reduz os efeitos antinutricionais do fitato, e aumenta o 10 valor nutricional do alimento.

Existem dois tipos de fitases que incluem uma 3fitase (EC.3.1.3.8) que remove grupos fosfato e as posições 1 e 3 do anel rnio-inositol, e uma 6-fitase (EC.3.1.3.6) que primeiramente libera o fosfato na posição-6 do anel. Os 15 vegetais usualmente contêm 6-fitases em uma ampla faixa de microorganismos, que incluem bactérias, fungos filamentosos, e leveduras, produzem 3-fitases. As duas fitases, phy-A e phy-B provenientes de Aspergillus niger, foram clonadas e seqüenciadas, PhyA foi expressa em Aspergillus niger e a 20 enzima recombinante é disponível comercialmente para uso na suplementação de dietas de animais.

Os genes phytase foram também isolados a partir de Aspergillus terreus, Myceliophtora thermophila, Aspergillus fumigatus, Emericella nidulans, Talaromyces thermophilus, 25 Escherichia coli (appA), e amido de milho. Adicionalmente, as enzimas fitase são isoladas e/ou purificadas a partir de Bacillus sp., enterobacter sp., Klebsiella terrigena, e Aspergillus ficum.

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O alto custo de produção da fitase tem restringido o uso da fitase nas fazendas industriais na medida que os suplementos fitase são geralmente mais dispendiosos que os menos ambientalmente desejáveis suplementos fosforosos 5 inorgânicos. O custo da fitase pode ser reduzido mediante a melhora da eficiência da produção e/ou da produção de uma enzima com atividade superior.

Sistemas de expressão em levedura podem ser usados para produzir de modo efetivo as enzimas. Adicionalmente, 10 com uma apropriada seqüência de sinal, a enzima expressa pode ser secretada para o interior do meio de cultura para conveniente separação e purificação. Alguns sistemas de expressão em levedura são também aceitos na indústria de alimentos como sendo seguros para a produção de produtos 15 alimentícios diferentemente de sistemas de expressão fúngica que podem ser em alguns casos não seguros, por exemplo, para a produção de alimentos para humanos.

Assim, um aspecto dessa invenção é um método para o aprimoramento do valor nutricional de uma ração mediante a 20 suplementação da ração com uma fitase expressa em levedura com capacidade superior para liberar fosfato a partir de fitato em rações. A invenção está também direcionada a uma ração com aprimorado valor nutricional que compreende fitase expressa em levedura. A fitase pode ser produzida de modo 25 eficiente e não dispendioso pelo fato de que a fitase expressa em levedura da presente invenção é adequada para uso comercial no alimento e nas indústrias de alimento com mínimo processamento.

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Em uma modalidade, o método é provido para o aprimoramento do valor nutricional de uma ração consumida por um animal monogástrico mediante o aumento da biodisponibilidade de fosfato proveniente de fitato onde a ração compreende hexakisfosfato de mio-inositol. O método compreende a etapa de alimentar o animal com a ração em combinação com menos de 1200 unidades de uma fitase expressa em levedura por kg da ração, onde a fitase é AppA2 derivada de EscherÍchia coli, e onde a biodisponibilidade de fosfato proveniente de fitato é aumentada em pelo menos duas vezes comparada com a biodisponibilidade de fosfato proveniente de fitato obtida pela alimentação de ração em combinação com as mesmas unidades de uma fitase expressa em uma célula hospedeira de não-levedura.

Em uma outra modalidade, é proporcionado um método de redução da relação alimento para ganho de peso de um animal monogástrico mediante alimentar o animal com uma ração onde a ração compreende hexakisfosfato de mioinositol. O método compreende a etapa de alimentar o animal com a ração em combinação com uma fitase expressa em levedura, onde a fitase é selecionada a partir do grupo que consiste de AppA2 derivada de Escherichia coli e um mutante direcionado a sítio de AppA derivada de Escherichia coli, e onde a relação de alimento para ganho de peso do animal é reduzida.

Em uma modalidade alternativa, um método para melhorar o valor nutricional de uma ração consumida por um animal monogástrico mediante aumentar a massa óssea e o teor

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 18/117 mineral do animal onde a ração compreende hexakisfosfato de rnio-inositol. O método compreende a etapa de alimentar o animal com a ração em combinação com uma fitase expressa em levedura, onde a fitase é selecionada a partir do grupo que consiste de AppA2 derivada de Escherichia coli e um mutante direcionado a sítio de AppA derivada de Escherichia coli, e onde a massa óssea e o teor mineral do animal são aumentados.

Ainda em outra modalidade, é proporcionada uma composição aditiva de alimento para adição a uma alimentação animal. A composição aditiva de alimento compreende uma fitase expressa em levedura e um veículo para a fitase onde a concentração da fitase na composição aditiva de alimento é maior que a concentração da fitase na mistura alimentícia final.

Ainda em uma outra modalidade é proporcionada uma ração. A ração compreende a composição aditiva de alimento acima descrita onde a concentração da fitase na mistura alimentícia final é menor que 1200 unidades de fitase por kg da mistura alimentícia final.

Em uma outra modalidade, é proporcionado um método de aperfeiçoamento do valor nutricional de uma ração consumida por um animal monogástrico onde a ração compreende hexakisfosfato de rnio-inositol. O método compreende as etapas de secar por aspersão uma fitase selecionada a partir do grupo que consiste de AppA2 derivada de Escherichia coli e um mutante direcionado a sítio de AppA derivada de Escherichia coli, misturar a fitase com um veículo para a

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Em uma modalidade alternativa, um método para aprimorar o valor nutricional de uma ração consumida por uma espécie ave mediante o aumento da biodisponibilidade de fosfato proveniente de fitato onde a ração compreende hexakisfosfato de mio-inositol. O método compreende a etapa de alimentar a espécie ave com a ração em combinação com menos de 1200 unidades de uma fitase expressa em levedura por kg da ração, onde a biodisponibilidade de fosfato proveniente de fitato é aumentada em pelo menos 1,5 vez comparada com a biodisponibilidade de fosfato proveniente de fitato obtida mediante alimentação a uma espécie não-ave de ração em combinação com a fitase expressa em levedura.

Ainda em uma outra modalidade, é proporcionado um método de redução da relação alimento para ganho de peso de uma espécie ave mediante alimentar a espécie ave com uma ração onde a ração compreende hexakisfosfato de mioinositol. O método compreende a etapa de alimentar a espécie ave com a ração em combinação com uma fitase expressa em levedura, onde a relação alimento para ganho de peso do animal é reduzida.

Ainda em uma outra modalidade, é proporcionado um método para aprimorar o valor nutricional de uma ração consumida por espécie ave mediante aumentar a massa óssea e

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 20/117 o teor mineral da espécie ave onde a ração compreende hexakisfosfato de mio-inositol. O método compreende a etapa de alimentar a espécie ave com a ração em combinação com uma fitase expressa em levedura onde a massa óssea e o teor mineral da espécie ave são aumentados.

Em uma outra modalidade, é proporcionado um método para aprimorar o valor nutricional de uma ração consumida por espécie ave onde a ração compreende hexakisfosfato de mio-inositol. O método compreende a etapa de alimentar a espécie ave com a ração em combinação com uma fitase expressa em levedura onde o número de ovos postos e os pesos dos ovos postos pelas espécies aves são aumentados.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra as de nucleotídeo de AppA2.

A Figura 2 mostra as de nucleotídeo de Mutante U.

A Figura 3 mostra biodisponibilidade fosfato in seqüências de aminoácidos e seqüências de aminoácidos e o aumento percentual na vivo em frangos alimentados com alimento animal suplementado com Natuphos®, Mutante U,

AppA ou AppA2.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona um método para aprimorar o valor nutricional de uma ração consumida por um animal onde a ração compreende hexakisfosfato de mioinositol, o substrato para as enzimas fitase da invenção. O método compreende a etapa de alimentar um animal com a ração em combinação com uma fitase expressa em levedura onde a

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 21/117 biodisponibilidade de fosfato proveniente de fitato é aumentada, a relação de alimento para ganho de peso é reduzida, a massa óssea e o teor mineral do animal são aumentados ou, para as espécies aves, adicionalmente os pesos dos ovos ou o número de ovos postos é aumentado. A fitase pode ser selecionada a partir do grupo que consiste de AppA2 derivada de Escherichia coli e mutante direcionado a sítio de AppA derivada de Escherichia coli. Em uma modalidade alternativa, para espécies aves, a fitase pode ser qualquer fitase, incluindo fitases selecionadas a partir do grupo que consiste de AppA derivada de Escuerichia coli, AppA2 derivada de Escherichia coli, e mutante direcionado a sídio de AppA derivada de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a biodisponibilidade de fosfato aprov de fitato, a relação de alimento para ganho de peso, e a massa óssea e o teor mineral são aprimorados em 2 vezes, por exemplo, em uma espécie ave, tal como aves domésticas, comparado com a melhoria no valor nutricional obtida mediante alimentar a ração em combinação com o mesmo percentual em peso de uma fitase expressa em uma célula hospedeira de não-levedura. A biodisponibilidade de fosfato proveniente de fitato é também aumentada em pelo menos 1,5 vez em espécies suínas comparada com a melhoria no valor nutricional obtida mediante a alimentação da ração em combinação com o mesmo percentual em peso de uma fitase expressa em uma célula de não-levedura. Adicionalmente, a biodisponibilidade de fosfato proveniente de fitato e a massa óssea e o teor mineral obtidos mediante a alimentação

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 22/117 de espécies aves com a ração em combinação com a fitase expressa em levedura é aumentada em pelo menos 1,5 vez comparada com a biodisponibilidade de fosfato proveniente de fitato e a massa óssea e o teor mineral obtidos mediante a alimentação de espécies de não-ave com a ração em combinação com fitase expressa em levedura.

Como usado aqui “aprimoramento do valor nutricional ou “aumentado valor nutricional significa uma melhoria no valor nutricional de uma ração refletida por um aumento na biodisponibilidade de fosfato proveniente de fitato, uma redução na relação alimento para ganho de peso, um aumento na massa óssea e no teor mineral na biodisponibilidade de inositol proveniente de fitato, um aumento na biodisponibilidade proveniente de fitato de minerais tais como magnésio, manganês, ferro e zinco em um animal alimentado com a ração, ou um aumento no peso ou no número de ovos postos por uma espécie ave alimentada com a ração (por ex., para galinhas poedeiras no primeiro ciclo ou ciclo subseqüente de postura de ovos).

Como usado aqui um aumento na “biodisponibilidade de fosfato proveniente de fitato significa um aumento na biodisponibilidade de fostato proveniente de fitato como refletido através de um aumento no ganho de peso ou no peso de cinzas de ossos.

Como usado aqui, o termo “célula hospedeira de não-levedura inclui uma célula fúngica.

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Como usado aqui, o termo fitase significa uma enzima capaz de catalisar a remoção de fosfato inorgânico a partir de hexakisfosfato de rnio-inositol.

Como usado aqui, o termo fitato significa uma composição que compreende hexakisfosfato de rnio-inositol.

De acordo com a invenção, a relação de alimento para ganho de peso é calculada mediante a divisão do ganho de peso pela ingestão de alimento. Um aumento na massa óssea ou no teor mineral é refletido mediante um aumento no peso seco dos ossos tíbia ou perônio ou mediante um aumento no peso de cinzas.

Uma variedade de genes fitases pode ser expressa para produzir fitase para uso de acordo com a invenção. Genes exemplares que podem ser usados de acordo com a invenção são genes fitase derivados de bactérias, fungos filamentosos, plantas, e leveduras, tais como os genes appA (Gene Bank número de acesso M58708) e appA2 (Gene Bank número de acesso 250016) derivados de Escherichia coli, ou um mutante direcionado a sítio desses genes que retém ou possui melhorada atividade fosfohidrolase hexakisfosfato de rnio-inositol.

Genes fitase podem ser obtidos a partir de microorganismos isolados, tais como bactéria, fungos, ou leveduras, que apresentem atividades fitase particularmente altas. Como descrito abaixo, o gene appA2 foi clonado a partir de um tal isolado de E.coli, e é exemplar de um tal gene fitase.

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O gene expresso em fitase pode ser um gene heterólogo, ou pode ser um gene homólogo. Um gene heterólogo é aqui definido como um gene originário a partir de uma espécie diferente que as espécies usadas para a expressão do gene. Por exemplo, no caso da expressão de um gene fitase heterólogo, um gene fitase derivado de E.coli ou uma outra espécie de bactéria pode ser expresso em uma espécie levedura tal como o Saccharomyces cerivisiae ou Pichia pastoris. Um gene homólogo é aqui descrito como um gene originário a partir das mesmas espécies usadas para a expressão do gene. No caso da expressão de um gene fitase homólogo, um gene fitase derivado de Saccharomyces cerivisiae pode ser expresso, por exemplo, nas mesmas espécies leveduras.

Genes exemplares para uso na produção de fitase para uso de acordo com a invenção são o appA, appA2, mutantes direcionados a sítios de appA ou appA2.

Genes fitase substituídos, deletados, e truncados, onde a fitase expressa resultante, ou um seu fragmento, retém substancialmente a mesma atividade fitase como as fitases especificamente aqui exemplificadas, são considerados equivalentes dos genes fitase exemplificados e estão inseridos no escopo da presente invenção.

O gene appA foi isolado a partir de E.coli (ver a Patente U.S. N° 6.451.572, aqui incorporada por referência). O gene appA2 foi isolado a partir de uma colônia de bactérias que apresentou atividade fitase particularmente alta obtida a partir de teores de cólons de porcos

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Hampshire-Yorkshire-Duroc de procriação cruzada (ver o

Pedido de Patente U.S. N° 09/540.149, aqui incorporado por referência). O produto de proteína AppA2 apresenta um pH ótimo entre cerca de 2,5 e cerca de 3,5. A seqüência aminoácida de AppA2 é como mostrada na SEQ ID Nos.: 2, 3 e

10. A Figura 1 mostra seqüências de aminoácidos e de nucleotídeos de AppA2. A região não traduzida é indicada pelas letras em caixa baixa. As seqüências sublinhadas são os primers (obs: primer significando iniciador é uma 10 terminologia do idioma inglês, e usualmente empregada para essa finalidade, e que será usada para significar o elemento que imprime o início da seqüência) usados para amplificar appA2 (Pfl: 1-22, e K2: 1468-1490), appA2 (E2: 243-252, e

K2: 1468-1490). Os sítios potenciais de N-glicosilação estão contidos em caixas. A seqüência de appA2 foi transmitida para uma biblioteca de dados Genebank com número de acesso 250016. A seqüência de nucleotídeo de AppA2 é como mostrado na SEQ ID No.: 1.

Diversos mutantes direcionados a sítio de appA foram isolados (ver Publicação PCT No. WO 01/36607 A1 (Pedido de Patente U.S. N° 60/166.179, aqui incorporado por referência)). Esses mutantes foram designados para estimular a glicosilação da enzima AppA. Os mutantes incluem A131N/V134N/D207N/S211N, C2 0 0N/D2 0 7N/S211N (Mutante U) , e 25 A131N/V134N/C200N/D207/S211N (ver Rodriguez e outros, Arch.

Of Biochem. And Biophys. 382: 105-112 (2000), incorporado por referência). O Mutante U possui uma atividade específica maior que a de AppA, e, igual a AppA2, possui um pH ótimo de

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 26/117 entre cerca de 2,5 e cerca de 3,5. A mutação C200N no Mutante U está em uma região contida em um intervalo e C200 está envolvido com C210 na formação de uma ligação dissulfeto única em AppA. A Figura 2 mostra as seqüências aminoácidas e de nucleotídeos de Mutante U. A seqüência aminoácida do Mutante U é mostrada em SEQ ID No.: 5, e seqüência de nucleotídeo de Mutante U é mostrada na SEQ ID No.: 4.

Qualquer sistema de expressão em levedura ou outro sistema de expressão eucariótica conhecido por aqueles com experiência na arte pode ser usado de acordo com a presente invenção. Por exemplo, diversos sistemas de expressão em levedura são descritos no Pedido de Patente U.S. No. 09/104.769 (agora Patente U.S. N° 6.451.572), Pedido de Patente U.S. No. 09/540.149, e no Pedido de Patente U.S. No. 60/166.179 (Publicação PCT N° WO 01/366707 A1), todas incorporadas aqui por referência. Qualquer desses sistemas de expressão em levedura pode ser usado. De modo alternativo, outros sistemas de expressão eucariótica podem ser usados tais como um sistema de expressão em célula de inseto (por ex., células Sf9), um sistema de expressão em célula fúngica (por ex., Trichoderma), ou um sistema de expressão em célula de mamífero.

Um sistema de expressão em levedura pode ser usado para produzir uma quantidade suficiente da fitase que está sendo secretada a partir do meio de cultura. A secreção para o interior do meio de cultura é controlada por meio de uma peptida-sinal (por ex., peptida-sinal phyA ou peptida-sinal

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 27/117 fator-α em levedura) capaz de direcionar a fitase expressa para fora da célula de levedura. Outras peptidas-sinal adequadas para facilitar a secreção da fitase a partir de células de levedura são conhecidas por aqueles com 5 experiência na arte. A peptida-sinal é tipicamente clivada a partir da fitase após secreção.

Se um sistema de expressão em levedura é usado, qualquer espécie para a expressão de um gene fitase pode ser usada incluindo espécies de leveduras tais como espécies 10 Saccharomyces, e espécies de leveduras metilotróficas tais como espécies Pichia (por ex., Pichia pastoris), espécies Hansenula, espécies Torulopsis, espécies Candida, e espécies Karwinskia. Em uma modalidade o gene fitase é expresso na levedura metilotrófica Pichia pastoris. Leveduras metilotró15 ficas são capazes de utilizar metanol como a única fonte de carbono para a produção dos recursos de energia necessários para manter a função celular, e conter um gene codificador de álcool-oxidase para utilização de metanol.

Qualquer sistema vetor-hospedeiro conhecido por 20 aqueles versados na técnica (por ex., um sistema onde o vetor se replica de modo autônomo ou se integra na forma de um genoma hospedeiro) e compatível com levedura ou outro sistema de expressão em célula eucariótica pode ser usado. Em uma modalidade, o vetor possui sítios de restrição de 25 clivagem endonuclease para a inserção de fragmentos DNA, e marcadores genéticos para a seleção dos transformantes. O gene fitase pode ser articulado funcionalmente a um promotor capaz de direcionar a expressão da fitase, por exemplo, na

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 28/117 levedura, e, em uma modalidade, o gene fitase é dividido em quadros com um elemento estimulador transcricional e possui uma seqüência terminadora para a terminação da transcrição (por ex., terminador HSP150). O promotor pode ser um promotor constitutivo (por ex., o promotor 3-fosfo-glicerato quinase ou o promotor fator-α) ou um promotor induzível (por ex., o promotor ADH2, GAL-1-10, GAL 7, PHO5,T7, ou o promotor metalotionina). Diversos sistemas vetor-hospedeiro são descritos no Pedido de Patente U.S. N° 09/104.769 (agora Patente U.S. N° 6.451.572), Pedido de Patente U.S. N° 09/540.149, e Pedido de Patente U.S. N° 60/166.179 (Publicação PCT No. WO 01/36607 A1) todas incorporadas aqui por referência.

As células hospedeiras são transformadas com um construto gene-vetor que compreende um gene fitase acoplado de modo operativo a um sistema de expressão em levedura usando procedimentos conhecidos por aqueles com experiência na arte. Tais protocolos de transformação incluem a eletroporação e a transformação protoplástica.

As células de levedura transformadas podem ser crescidas por meio de uma variedade de técnicas incluindo fermentação em batelada e fermentação contínua em um meio líquido ou um meio semi-sólido. Meios de cultura para as células de levedura são conhecidos na arte e são tipicamente suplementados com uma fonte de carbono (por ex., glicose). As células de levedura transformadas podem ser crescidas aerobicamente a 30°C em um ambiente de pH controlado (a um pH em torno de 6) e com a fonte de carbono (por ex.,

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 29/117 glicose) mantida continuamente a um predeterminado nível sabido para suportar o crescimento das células de levedura até uma densidade desejada dentro de um período específico de tempo.

A fitase expressa em levedura para uso de acordo com o método da presente invenção pode ser produzida em forma purificada por meio de técnicas convencionais (por exemplo, pelo menos cerca de 60% pura, ou pelo menos 70-80% pura). Tipicamente, a fitase é secretada para o interior do meio de cultura e é coletada a partir do meio de cultura. Para purificação a partir do meio de cultura a fitase pode, por exemplo, ser submetida à precipitação por sulfato de amônio seguido por cromatografia em coluna DEAE-Sepharose. Outras técnicas convencionais conhecidas por aqueles com experiência na arte pode ser usadas tais como filtragem em gel, cromatografia por troca iônica, cromatografia em coluna DEAE-Sepharose, cromatografia por afinidade, extração solvente-solvente, ultrafiltragem, e HPLC. Alternativamente, etapas de purificação podem não ser requeridas porque a fitase pode estar presente em tais concentrações altas no meio de cultura que a fitase está essencialmente pura no meio de cultura (por ex., 70-80% pura).

Nos casos onde a fitase não é secretada para o interior do meio de cultura, as células de levedura podem ser lisadas; por exemplo, por ação sônica, calor, ou tratamento químico, e o homogenato centrifugado para remover fragmentos de células. O sobrenadante pode ser em seguida submetido à precipitação por sulfato de amônio, e técnicas

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 30/117 adicionais de fracionamento como o requerido, tal como filtragem em gel, cromatografia por troca iônica, cromatografia em coluna DEAE-Sepharose, cromatografia por afinidade, extração solvente-solvente, ultrafiltragem, e HPLC para purificar a fitase. Deverá ser entendido que os métodos de purificação descritos acima para a purificação de fitases a partir do meio de cultura ou a partir de células de leveduras não são limitantes e qualquer das técnicas de purificação conhecidas por aqueles com experiência na arte pode ser usada para purificar a fitase expressa em levedura se tais técnicas são requeridas para se obter uma fitase substancialmente pura.

Em uma modalidade a fitase é coletada a partir do meio de cultura sem etapas adicionais de purificação mediante o resfriamento da cultura de levedura (por ex., até cerca de 8°C) e removendo as células de levedura usando técnicas tais como centrifugação, microfiltração, e filtração giratória a vácuo. A fitase no meio livre de célula pode ser concentrada por meio de técnicas tais como, por exemplo, ultrafiltração e filtração por fluxo tangencial.

Várias formulações de preparação de fitase purificada podem ser preparadas. As enzimas fitase podem ser estabilizadas através da adição de outras proteínas (por ex., gelatina e pó de nata de leite), agentes químicos (por ex., glicerol, polietileno glicol, EDTA, sorbato de potássio, benzoato de sódio, e agentes redutores e aldeídos), polissacaridas, monossacaridas, lipídios (óleos vegetais hidrogenados), fitato de sódio, e outros compostos contendo

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 31/117 fitatos, e similares. Suspensões de enzima fitato podem ser também secadas (por ex., por secagem por aspersão, secagem em tambor, e liofilização) e formuladas como pós, grânulos, pílulas, blocos minerais, líquidos, e géis através de 5 processos conhecidos. Agentes de formação de gel tais como gelatina, alginato, colágeno, Agar, pectina e carrageenan podem ser usados. A invenção também se estende a uma preparação inoculante de alimento que compreende levedura não-patogênica liofilizada que podem expressar as fitases da 10 presente invenção no trato gastrintestinal do animal quando o animal é alimentado com a preparação.

Em uma modalidade, a fitase no meio de cultura livre de célula é concentrada tal como por meio de ultrafiltração e secagem por aspersão do que ficou retido 15 pela ultrafiltração. O pó secado por aspersão pode ser misturado diretamente a uma ração, ou o pó secado por aspersão pode ser misturado com um veículo para uso como uma composição aditiva de alimento para a suplementação de uma ração com fitase. Em uma modalidade, a fitase no que ficou 20 retido é co-secada com um veículo e/ou estabilizante. Em uma outra modalidade, a fitase é secada por aspersão com um ingrediente que ajuda a fitase secada por aspersão a aderir a um veículo, ou, alternativamente, a fitase pode livremente se associar com o veículo. A composição aditiva de alimento 25 (isto é, a composição fitase/veículo e, opcionalmente, outros ingredientes) pode ser usada para mistura com a ração para se conseguir distribuição ainda melhor da fitase na ração.

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Exemplares composições aditivas de alimento (isto é, composições de fitase/veículo e, opcionalmente, outros ingredientes) podem conter de 600 unidades de fitase/grama do veículo até 5000 unidades de fitase/grama do veículo. Essas composições fitase/veículo podem conter ingredientes adicionais. Por exemplo, as composições podem ser formuladas para conter cascas de arroz ou farelo de trigo como um veículo (de 25 a 80 por cento em peso), a fitase (0,5 a 20 por cento em peso), carbonato de cálcio (de 10 a 50 por cento em peso) , e óleos (de 1 a 3 por cento em peso) . De modo alternativo, a composição aditiva de alimento pode incluir a fitase e o veículo e não conter ingredientes adicionais. A composição aditiva de alimento pode ser misturada com o alimento para se obter uma mistura alimentícia final contendo de a partir de cerca de 50 até cerca de 2000 unidades de fitase/kg do alimento.

Desse modo, uma ração compreendendo uma fonte de hexakisfosfato de mio-inositol, uma fitase expressa em levedura, e um veículo são também providos de acordo com a invenção. Adicionalmente, é provido um método para aprimorar o valor nutricional de uma ração consumida por um animal monogástrico onde a ração compreende hexakisfosfato de mioinositol onde o método compreende as etapas de secar por aspersão uma fitase, incluindo uma fitase selecionada a partir do grupo que consiste de AppA derivada de Escherichia coli, AppA2 derivada de Escherichia coli e um mutante direcionado a sítio de AppA derivada de Escherichia coli, misturar a fitase com um veículo, e, opcionalmente, outros

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 33/117 ingredientes, para produzir uma composição aditiva de alimento para suplementar uma ração com a fitase, misturando a composição aditiva de alimento com a ração, e alimentando o animal com a ração suplementada com a composição aditiva de alimento.

Nessas modalidades, o veículo pode ser qualquer veículo adequado para produzir uma composição aditiva de alimento conhecido na arte incluindo, mas não limitado a, cascas de arroz, farelo de trigo, uma polissacarida (por ex., amidos específicos), uma monossacarida, óleo mineral, gordura vegetal, lipídios hidrogenados, carbonato de cálcio, gelatina, pó de nata de leite, fitato e outros compostos contendo fitato, uma mistura base, e similar. Uma mistura base tipicamente compreende a maioria dos ingredientes, incluindo vitaminas e minerais, de uma mistura alimentícia final exceto quanto à mistura de alimentos (por ex., alimento de milho e alimento de soja). A fitase para uso na composição aditiva de alimento é preferivelmente a AppA derivada de E.coli, AppA2 derivada de E.coli, ou um mutante direcionado a sítio de AppA derivada de E.coli.

A composição aditiva contendo a fitase secada por aspersão e um veículo e, opcionalmente, outros ingredientes, é misturada com a mistura alimentícia final para se obter um alimento com um número predeterminado de unidades de fitase/kg do alimento (por ex., cerca de 50 até cerca de 2000 unidades de fitase/kg do alimento). Antes da mistura com o veículo, a fitase secada por aspersão é analisada quanto à atividade fitase para determinar a quantidade de pó

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 34/117 seco a ser misturada com o veículo para se obter uma composição aditiva de alimento com um número predeterminado de unidades fitase/grama do veículo. O veículo contendo fitase é misturado em seguida com a mistura alimentícia final para se obter uma mistura alimentícia final com um número predeterminado de unidades fitase/kg do alimento. Conseqüentemente, a concentração de fitase na composição aditiva de alimento é maior que a concentração de fitase na mistura alimentícia final.

De acordo com uma modalidade da invenção a ração é alimentada em combinação com a fitase expressa em levedura a qualquer animal monogástrico (isto é, um animal que possui um estômago com um único compartimento). Os animais monogástricos que podem ser alimentados com uma ração em combinação com uma fitase expressa em levedura inclui animais agrícolas; tais como, espécies suínas (por ex., capões (isto é, machos suínos castrados), porcas (isto é, porcos fêmeas de primeira cobertura) e qualquer outro tipo de suíno), frangos, perus (galetos (isto é, os primeiros de várias semanas de pós-postura) e animais mais velhos), patos, e faisões, e qualquer outra espécie ave, animal marinho ou espécies aquáticas de água doce, animais mantidos em cativeiro (por ex., animais de zoológicos), ou animais domésticos (por ex., caninos e felinos).

Animais monogástricos agrícolas são tipicamente animais alimentados com composições alimentícias que compreendem produtos vegetais que contêm fitato (por ex. , alimento de milho e alimento de soja contêm fitato

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 35/117 (hexakisfosfato de mio-inositol)) como a principal forma de armazenamento de fosfato, e, desse modo, é vantajoso para suplementar o alimento com fitase. Conseqüentemente, as rações que podem ser suplementadas com fitase de acordo com 5 a invenção incluem alimentos para animais agrícolas tais como alimentos para porcos e alimentos para aves domésticas, e qualquer ração para espécies aves ou animais marinhos ou espécies aquáticas de água doce (pro ex., alimento para peixes). Adicionalmente, os humanos podem ser alimentados 10 com qualquer ração, tal como um produto cereal, contendo fitato em combinação com a fitase expressa em levedura da presente invenção.

No caso de um alimento animal fornecido como alimento a animais monogástricos, qualquer mistura alimen15 tícia animal conhecida na arte pode ser usada de acordo com a presente invenção tal como alimento de semente de colza, alimento de semente de algodão, alimento de feijão de soja, alimento de milho, mas alimento de soja e alimento de milho são particularmente preferidos. A mistura alimentícia animal 20 é suplementada com a fitase expressa em levedura, mas outros ingredientes podem ser opcionalmente acrescentados à mistura alimentícia animal. Ingredientes opcionais da mistura alimentícia animal inclui açúcares e carboidratos complexos tais como tanto solúveis em água e insolúveis em água 25 monossacaridas, dissacaridas e polissacaridas. Ingredientes aminoácidos opcionais que podem ser acrescentados à mistura alimentícia são arginina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano,

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 36/117 balina,

HCl etil tirosina, alanina, ácido aspártico, glutamato de sódio, glicina, prolina, serina,

HCl etil cisteína, e análogos, e seus sais. As vitaminas que podem ser opcionalmente acrescentadas são HCl tiamina, riboflavina,

HCl piridoxina, niacina, niacinamida, inositol, cloreto de colina, pantotenato de cálcio, biotina, ácido fólico, ácido ascórbico, e vitaminas

A, B, K, D, E, e similares. Minerais, ingredientes proteínas , incluindo proteína obtida a partir de alimento carne ou de alimento peixe, ovo líquido ou pulverizado, solúveis de peixe, concentrado de proteína do soro do leite, óleos (por ex., óleo de soja) , amido de milho, cálcio, fosfato inorgânico, sulfato de cobre, sal calcário podem ser também acrescentados. Quaisquer ingredientes medicamentos conhecidos na arte podem ser acrescentados à mistura alimentícia animal; tal como antibióticos.

As composições alimentícias podem também conter enzimas outras que a fitase expressa em levedura. Exemplares de tais enzimas são proteases, celulases, zilalanses, e posfatases ácidas. Por exemplo, a completa desfosforilação do fitato pode não ser conseguida pela fitase sozinha e a adição de uma fosfatase ácida pode resultar em adicional liberação de fosfato. Uma protease (por ex., pepsina) pode ser acrescentada, por exemplo, para clivar a fitase expressa em levedura para estimular a atividade da fitase. Uma tal fitase tratada por protease pode apresentar melhorada capacidade para aumentar a biodisponibilidade de fosfato proveniente de fitato, para reduzir a relação de alimento para ganho de peso, para aumentar a massa óssea e o teor

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 37/117 mineral, e para aumentar o peso dos ovos ou o número de ovos postos por uma espécie ave comparada à fitase expressa em levedura intacta. Adicionalmente, combinações de fitases podem ser usadas, tais como quaisquer combinações que possam 5 atuar de modo sinérgico para aumentar a biodisponibilidade de fosfato proveniente de fitato, ou de fragmentos proteolíticos de fitases ou combinações de fragmentos proteolíticos podem ser usadas. A esse respeito, o gene fitase expresso em levedura poderá ser usado para produzir 10 um produto truncado diretamente para uso no método da presente invenção.

Os antioxidantes podem ser também acrescentados à ração, tal como uma composição alimentícia animal, para prevenir a oxidação da proteína fitase usada para suplementar 15 a ração. A oxidação pode ser evitada mediante a introdução de antioxidantes naturalmente ocorrentes, tais como o betacaroteno, vitamina D, vitamina C, e tocoferol ou de antioxidantes sintéticos, tais como hidroxitolueno butilado, hidroxianisol butilado, butilhidroquinona terciária, galato 20 de propila ou etoxiquina à ração. Compostos que atuam de modo sinérgico com os antioxidantes podem ser também acrescentados tais como o ácido ascórbico, ácido cítrico, e ácido fosfórico. A quantidade dos antioxidantes incorporada desse modo depende de requisitos tais como a formulação do 25 produto, condições de transporte, métodos de embalagem, e tempo de prateleira desejado.

De acordo com um método da presente invenção, a ração, tal como uma ração animal, é suplementada com

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 38/117 quantidades de fitase expressa em levedura, suficientes para aumentar o valor nutricional da ração. Por exemplo, em uma modalidade, a ração é suplementada com menos de 2000 unidades (U) da fitase expressa em levedura por kg da ração. Essa quantidade de fitase é equivalente à adição de 34 mg da fitase para um kg da ração (cerca de 0,0034% p/p). Em uma outra modalidade, a ração é suplementada com menos de 1500 unidades (U) da fitase expressa em levedura por kg da ração. Essa quantidade de fitase é equivalente à adição de 26 mg da fitase para um kg da ração (cerca de 0,0026% p/p). Em uma outra modalidade, a ração é suplementada com menos de 1200 unidades (U) da fitase expressa em levedura por kg da ração. Essa quantidade de fitase é equivalente à adição de 17 mg da fitase para um kg da ração (cerca de 0,0017% p/p). Em uma outra modalidade a ração, tal como uma composição de alimentação animal, é suplementada com cerca de 50 U/kg até cerca de 1000 U/kg da fitase expressa em levedura (isto é, cerca de 0,7 até cerca de 14,3 mg/kg ou cerca de 0,00007% até cerca de 0,0014%(p/p)). Ainda em outra modalidade a ração é suplementada com cerca de 50 U/kg até cerca de 700 U/kg da fitase expressa em levedura (isto é, cerca de 0,7 até cerca de 10 mg/kg ou cerca de 0,00007% até cerca de 0,001% (p/p)). Ainda em outra modalidade a ração é suplementada com cerca de 50 U/kg até cerca de 500 U/kg da fitase expressa em levedura (isto é, cerca de 0,7 até cerca de 7 mg/kg ou cerca de 0,00007% até cerca de 0,007% (p/p)). Ainda em outra modalidade a ração é suplementada com cerca de 50 U/kg até cerca de 200 U/kg da fitase expressa em

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 39/117 levedura (isto é, cerca de 0,7 até cerca de 2,9 mg/kg ou cerca de 0, 00007% até cerca de 0,0003% (p/p)). Em cada uma dessas modalidades é para ser entendido que “kg se refere a kg da ração, tal que a composição alimentícia final no caso 5 de uma mistura alimentícia animal (isto é, a alimentação na composição como uma mistura final). Em adição, uma unidade (U) de atividade fitase é definida como a quantidade de enzima requerida para produzir um pmol de fosfato inorgânico por minuto a partir de 1,5 mmol/L de fitato de sódio a 37°C 10 e a um pH de 5,5.

A fitase expressa em levedura pode ser misturada com a ração, tal como uma alimentação animal (isto é, a composição alimentícia como uma mistura final), antes de alimentar o animal a ração ou a fitase podem ser alimentadas 15 ao animal com a ração sem prévia mistura. Por exemplo, a fitase pode ser acrescentada diretamente a uma ração não tratada, pelotizada, ou de outro modo processada, tal como uma alimentação animal, ou a fitase pode ser provida separadamente da ração em, por exemplo, um bloco mineral, 20 uma pílula, uma formulação em gel, uma formulação em líquido, ou na água de beber. De acordo com a invenção, a alimentação do animal com a ração “em combinação com a fitase significa alimentar a ração misturada com a fitase ou alimentar a ração e a fitase separadamente sem prévia mistura.

A	fitase expressa	em	levedura	pode estar	numa
forma não	encapsulada ou	numa	forma	encapsulada	para

alimentar o animal ou para mistura com uma mistura

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alimentícia animal. A encapsulação protege a fitase de colapso e/ou de oxidação antes da ingestão pelo animal (isto é, a encapsulação aumenta a estabilidade da proteína) e proporciona um produto seco para mais fácil alimentação ao animal ou para mais fácil mistura com, por exemplo, uma mistura alimentícia animal. A fitase expressa em levedura pode ser protegida desse modo, por exemplo, mediante revestimento da fitase com uma outra proteína ou quaisquer outras substâncias conhecidas na arte a serem agentes encapsulantes efetivos, tais como polímeros, ceras, gorduras, e óleos vegetais hidrogenados. Por exemplo, a fitase pode ser encapsulada usando uma técnica reconhecida na arte, tal como a técnica de encapsulação Na²⁺-alginato onde a fitase é revestida com Na²⁺-alginato seguido pela conversão para Ca²⁺-alginato em presença de íons Ca²⁺ para encapsulação. De modo alternativo, a fitase pode ser encapsulada mediante de técnica reconhecida na arte tal como perolização (isto é, atomização de líquido derretido e resfriando as gotículas para formar uma pérola). Por exemplo, a fitase pode ser perolizada em flocos de semente de algodão hidrogenada ou óleo de feijão de soja hidrogenado para produzir um produto seco. A fitase pode ser usada em uma forma inteiramente não encapsulada, uma forma inteiramente encapsulada, ou misturas de fitase não encapsuladas e encapsuladas podem ser acrescentadas à ração, tal como uma composição alimentícia animal, ou alimentada diretamente ao animal sem prévia mistura com a ração. Qualquer fitase para

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 41/117 uso de acordo com o método da presente invenção pode ser tratada de modo similar.

De acordo com o método da presente invenção, a ração contendo fitase pode ser administrada aos animais por via oral em uma ração, tal como um alimento animal, ou em um bloco mineral ou na água de beber, mas qualquer outro método efetivo de administração conhecido por aqueles com experiência na arte pode ser utilizado (por ex., uma forma de pílula). A ração contendo a fitase expressa em levedura pode ser administrada aos animais durante qualquer período de tempo que seja efetivo para aumentar a biodisponibilidade do fosfato a partir de fitato, para reduzir a relação de alimento para ganho de peso, ou para aumentar a massa óssea e o teor mineral do animal. Por exemplo, no caso de uma composição alimentícia alimentada a um animal monogástrico, a composição alimentícia contendo fitase expressa em levedura pode ser alimentada ao animal diariamente durante o tempo de vida do animal ou durante um período de tempo mais curto. Os períodos de tempo para a alimentação da ração contendo fitase aos animais não são limitantes e deverá ser apreciado que qualquer período de tempo determinado a ser efetivo para aprimorar a nutrição animal mediante a administração da ração contendo fitase pode ser usado.

EXEMPLO 1

COMPOSIÇÃO DA MISTURA ALIMENTÍCIA ANIMAL

A composição da mistura alimentícia animal para frangos e porcos (isto é, a composição alimentícia sem fitase) foi a seguinte:

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TABELA 1

Composição da mistura alimentícia animal usada nos ensaios para frangos e porcos

Ingrediente	Ensaios com frangos	Ensaios com porcos
Amido de milho	para 100,0	para 100,0
Milho	50,89	61,35
Alimento de soja, descascado	39,69	31,19
Óleo de soja	5, 00	3,00
Calcário moído	1,67	1, 06
Sal	0, 40	—
Mistura vitamínica para frangos	0,20	—
Mistura vitamínica para porcos	—	0,20
Mistura de minerais traço para frangos	0,15	—
Mistura de minerais traço para porcos	—	0,35
Cloreto de colina (60%)	0,20	—
Pré-mistura antibiótica para porcos (CSP)	—	0,50
Pré-mistura bacitracin	0, 05	—
Sulfato de cobre	—	0, 08
HCl L-lisina, grau alimentício	—	0,17
DL-metionina, grau alimentício	0,20	0, 05

EXEMPLO 2

PREPARAÇÃO DA FITASE

Culturas semeadas de levedura foram inoculadas em meio de crescimento com Pichia pastoris X33 transformada com um ou outro de AOX1-appA, pGAP-appA2, ou AOX1-Mutante U. As culturas semeadas foram crescidas a 30°C por cerca de 24 horas até que um ODeoo de cerca de 50 fosse atingido. As culturas semeadas foram em seguida usadas para inocular fermentadores (processo em batelada) contendo meio de crescimento FM-22 estéril contendo 5% de glicose. As culturas semeadas por 24 horas foram diluídas em cerca de

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1:25 até cerca de 1:50 para o interior do meio de crescimento F-22. As culturas semeadas foram incubadas aerobicamente nos fermentadores a 30°C com controle de pH a 6,0 (usando NH2OH) e com alimentação contínua de glicose até que as culturas atingissem um OD600 de cerca de 400 (cerca de 36 horas).

Para coletar as fitases a partir do meio de cultura, as culturas de leveduras foram rapidamente resfriadas a 8°C. As células foram separadas do meio de cultura através de centrifugação e através de microfiltração. As fitases estavam 70-80% puras no meio de cultura e foram preparadas para mistura com um veículo como um aditivo alimentar como a seguir.

O meio livre de células contendo as fitases secretadas foi concentrado através de ultrafiltração (limite de exclusão 10.000 MW) . O que ficou retido pela ultrafiltração (7-5% de sólidos) foram transferidos para recipientes estéreis para secagem por aspersão. O material que ficou retido foi secado por aspersão usando técnicas padrões conhecidas na arte e o pó resultante foi coletado (4-6% de umidade).

A realização de testes microbiológicos do pó foi feita e o pó foi ensaiado quanto à atividade fitase. A atividade fitase do pó (unidades de atividade fitase/mg de pó) foi usada para determinar a quantidade de pó seco a ser misturada com farelo de trigo (isto é, o veículo) para obter uma mistura fitase/veículo com um número predeterminado de unidades fitase/grama do veículo. O pó de fitase seco foi

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 44/117 misturado com farelo de trigo e embalada em recipientes à prova de umidade. O farelo de trigo contendo fitase foi misturado com a mistura alimentícia animal, como o necessário para se obter uma mistura alimentícia final com um número predeterminado de unidades fitase/kg do alimento (cerca de 400 até cerca de 1000 U/kg).

EXEMPLO 3

COMPOSIÇÃO ADITIVA DE ALIMENTO

As composições a seguir são exemplos de composições aditivas de alimento que podem ser misturadas com uma mistura alimentícia animal; tal como a mistura alimentícia animal descrita no Exemplo 1; para se obter uma mistura alimentícia final contendo, por exemplo, cerca de 50 U de fitase/kg da mistura alimentícia final até cerca de 2000 U de fitase/kg do alimento. As composições aditivas de alimento descritas abaixo são exemplos não limitantes e deverá ser notado que qualquer composição aditiva de alimento contendo fitase determinada para ser efetiva para aprimorar o valor nutricional da alimentação animal pode ser usada. Composições aditivas de alimento exemplares são mostradas para uma composição aditiva de alimento contendo 600 unidades de fitase/grama da composição aditiva de alimento ou 5000 unidades de fitase/grama da composição aditiva de alimento.

	600 unidades de fitase/grama (porcentagem em peso)	5000 unidades de fitase/grama (porcentagem em peso)
Cascas de arroz	82,64	76,35
Carbonato de cálcio	15, 00	15, 00
Óleo	1,5	1,5
Enzima	0,86	7, 15

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	600 unidades de fitase/grama (porcentagem em peso)	5000 unidades de fitase/grama (porcentagem em peso)
Farelo de trigo	82,64	76,35
Carbonato de cálcio	15, 00	15, 00
Óleo	1,5	1,5
Enzima	0,86	7, 15

EXEMPLO 4

PROTOCOLO DE ALIMENTAÇÃO

Os pintos foram alimentados usando o protocolo descrito em Biehl e outros (J. Nutr. 125: 2407-2416 (1995)). Em resumo, os ensaios foram conduzidos com pintos machos e fêmeas a partir da cruza de machos New Hampshire e fêmeas Columbian e foram conduzidos em uma sala de laboratório em ambiente controlado com 24 horas de iluminação fluorescente. A partir do dia 0 até o dia 7 pós-incubação, os pintos foram alimentados com uma dieta basal de 23% de proteína bruta, alimento de milho-soja fortalecido com metionina como descrito no Exemplo 1. No dia 8, os pintos foram pesados, enfaixados nas asas e marcados randomicamente para os tratamentos experimentais. Cinco cercados de três ou quatro pintos por cercado receberam cada um o tratamento dietético durante um período experimental de 13 dias de alimentação, e os pintos tinham um peso inicial de 80 a 100 gramas.

Durante todo o período de 13 dias de alimentação, os pintos foram confinados em gaiolas de pintos em aço inoxidável controladas termostaticamente, alimentadores bebedouros em aço inoxidável foram também usados. Essas etapas foram tomadas para evitar contaminação mineral proveniente do ambiente. As dietas e a água destilada

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 46/117 deionizada estavam disponíveis livremente durante o período de alimentação.

Os porcos foram mantidos em jejum durante 12 horas antes do início de cada ensaio, foram alimentados com as dietas experimentais durante 23 dias, e foram mantidos em jejum durante 12 horas após cada ensaio ter sido completado. Dez porcos foram usados por grupo de tratamento e os porcos variaram na média de 8-120 kg no início do ensaio. Os porcos foram alojados em cercados individuais que continham um alimentador de aço inoxidável, um bebedouro em aço inoxidável, e cercas em barras cilíndricas galvanizadas.

Todos os pintos em cada grupo de tratamento e cinco porcos de peso mediano de cada grupo de tratamento foram sacrificados para a realização dos testes. O ganho de peso corpóreo foi medido e a tíbia (dos pintos) ou o perônio (dos porcos) foi colhido para análise de cinzas de ossos como um reflexo da massa óssea e do teor mineral.

EXEMPLO 5

MEDIÇÃO DO FOSFATO INORGÂNICO E DO FOSFATO BIODISPONÍVEL

O fosfato total nas amostras de alimento usado para gerar uma curva padrão foi quantificado por método colorimétrico de acordo com AOAC (1984) como descrito em Biehl e outros. O fosfato monobásico de potássio (KH2PO4) serviu como o padrão. Uma curva padrão foi gerada mediante a medição dos níveis de fosfato inorgânico na alimentação basal suplementada com KH2PO4 (eixo-X) e determinando o peso de cinzas da tíbia (mg) ou o ganho de peso (g) (eixo-Y) para os animais alimentados com alimentação basal suplementada

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 47/117 com vários níveis de KH2PO4. A biodisponibilidade de fosfato proveniente de fitato foi em seguida determinada para animais alimentados com alimentação basal suplementada com fitase mediante comparação do peso de cinzas da tíbia e do 5 ganho de peso nesses animais em relação à curva padrão.

EXEMPLO 6

ANÁLISE DAS CINZAS DOS OSSOS

Ao final de cada experimento, os pintos ou os porcos foram sacrificados, e os ossos da tíbia esquerda ou 10 do perônio esquerdo foram removidos quantitativamente dos pintos ou dos porcos, respectivamente. Os ossos foram somados por replicata de cercado e, após a remoção do tecido aderente, foram secados por 24 horas a 100°C e foram pesados. Após a pesagem, os ossos tiveram suas cinzas 15 secadas durante 24 horas a 600°C em uma fornalha. O peso das cinzas foi expresso como uma porcentagem do peso de osso seco e também como peso de cinzas por osso.

EXEMPLO 7

EXPRESSÃO FITASE EM LEVEDURA

De acordo com a presente invenção, qualquer gene fitase pode ser expresso em levedura, e qualquer sistema de expressão em levedura pode ser usado de acordo com os métodos conhecidos por aqueles com experiência na arte. Os sistemas de expressão em levedura são descritos para genes fitases exemplares, tais como genes appA e appA2 derivados de E.coli, e para um mutante direcionado a sítio de AppA derivada de Escherichia coli, no Pedido de Patente U.S. N° 09/104.769 (agora Patente U.S. N° 6.451.572), Pedido de

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Patente U.S. No. 09/450.149, e no pedido de Patente U.S. No. 60/166.179 (Publicação PCT N° WO 01/36607 A1), todas incorporadas aqui por referência. Sistemas exemplares de expressão em leveduras para expressar as enzimas AppA e AppA2 e um mutante direcionado a sítio de AppA são descritos resumidamente abaixo.

Expressão do gene appA em Saccharomyces cerevisiae

O gene appA foi expresso em Saccharomyces cerevisiae articulado à peptida-sinal do gene phyA (gene fitase proveniente de Aspergillus niger). O gene appA foi obtido de ATCC, P.O.Box 1549, Manassas, VA 20108, onde ele foi depositado consoante com os requisitos de Budapest Treaty, sob o número de acesso ATCC 87441. O gene appA (1,3 kb) foi transformado na linhagem E.coli BL21 usando o vetor de expressão pappAl (Ostanin e outros, J. Biol. Chem., 267: 22830-36 (1992)). Para preparar o construto peptida-sinal appA-phyA, a reação de cadeia polimerase (PCR) foi usada. dois primers foram sintetizados e o primer 5' foi pares base 80 no comprimento e continha a seqüência peptida-sinal phyA, um sítio de corte da enzima de restrição Kpnl, e a seqüência complementar do modelo como a seguir: 5' GGG GTA CCA TGG GCG TCT CTG CTG TTC TAC TTC CTT TGT ATC TCC TGT CTG GAG TCA CCT CCG GAC AGA GTG AGC CGG AG 3' (SEQ ID No.: 6). O primer 3' foi pares base 24 em comprimento e continham um sítio EcoRI e seqüência complementar ao modelo como a seguir: 5' GGG AAT TCA TTA CAA ACT GCA GGC 3' (SEQ ID No.: 7). A reação PCR foi corrida para 25 ciclos com um minuto de

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 49/117 desnaturação a 95°C, 1 minuto de recozimento a 58°C, e 1 minuto de extensão de cadeia a 72°C.

Um fragmento 1,3 kb foi amplificado por meio de PCR, e foi digerido com Kpnl e EcoRI e ligado na forma de pYES2, um vetor para a expressão em Saccharomyces cerivisiae. O construto peptida-sinal pYES2-appA-phyA foi transformado na forma da levedura (INVScI, Invitrogen, San Diego, CA) através do método acetato de lítio.

Transformantes selecionados foram inoculados para

o interior do	meio YEPD e a expressão foi induzida com
galactose após	um OD600 de 2 ter sido atingido. As células
foram colhidas	15-20 horas após a indução. A enzima fitase

AppA foi isolada do sobrenadante da cultura e foi a principal proteína presente eliminando a necessidade quanto a uma trabalhosa purificação.

Expressão do gene appA ou appA2 em Pichia pastoris appA. O modelo para a reação PCR foi descrito acima. O primer 5' usado para a reação PCR foi como a seguir: 5' GGA ATT CCA GAG TGA GCC GGA 3' (SEQ ID No.: 8). O primer 3' foi como a seguir: 5' GGG GTA CCT TAC AAA CTG CAC G 3'(SEQ ID No.: 9). A reação de amplificação incluiu 1 ciclo a 94°C (3 min), 30 ciclos a 94°C (0,8 min), 30 ciclos a 54°C (1 min), 30 ciclos a 72°C (2 min), e 1 cico a 72°C (10 min). O produto foi primeiramente inserido na forma do vetor pGEM T-easy (Promega), e linhagem E.coli TOP10F' foi usada como o hospedeiro para amplificar o construto. O construto foi em seguida inserido na forma do vetor de expressão em levedura pPIcZaA (Invitrogen) no sítio EcoRI, e

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 50/117 linhagem E.coli TOP10F' foi novamente usada como o hospedeiro para amplificar o construto.

O vetor PIcZa contendo appA foi transformado na linhagem Pichia pastoris X33 por eletroporação. As células transformadas foram plaqueadas para o interior de meio agar YPD-Zeocin e colônias positivas foram incubados em um meio mínimo com glicerol (BMGY) durante 24 horas. Quando um OD600 de 5 foi atingido, as células foram centrifugadas e foram re-suspensas em meio 0,5% metanol (BMMY) para indução. Metanol (100%) era acrescentado a cada 24 horas para manter uma concentração de 0,1-1%. As células foram colhidas a 192 horas após a indução e a proteína AppA foi purificada por meio de precipitação de sulfato de amônio e cromatografia em coluna DEAD-Sepharose.

appA2. O gene appA2 foi isolado (ver Pedido de Patente U.S. N° 09/540.179) a partir de uma colônia bacteriana que apresentou atividade fitase particularmente alta obtida a partir dos conteúdos de cólon de porcos de cruzamento Hampshire-Yorkshire-Duroc. Para isolar uma colonia de bactéria apresentando alta atividade fitase a amostra dos conteúdos de cólon foi diluída em um meio anaeróbico de fluido glicose do rúmen, foi sacudida vigorosamente durante 3 minutos, e foi diluída em série. As amostras diluídas foram cultivadas a 37°C durante 3 dias em um meio modificado de fluido de rúmen-glicose-celobiose contendo fitato de cálcio insolúvel. As colônias com uma zona clara foram ensaiadas quanto à atividade fitase usando fitato de sódio como um substrato. A colônia identificada

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 51/117 como produtora da mais alta atividade fitase foi identificada como uma linhagem E.coli. Conseqüentemente, o gene appA2 foi isolado usando os “primers como descrito acima para a expressão de appA em Pichia pastoris (SEQ ID Nos.: 8 e 9). O gene appA2 foi clonado ao vetor PIcZa e linhagem Pichia pastoris X33 foi transformada com o construto PIcZa-appA2 como descrito acima para a expressão appA em Pichia pastoris. A enzima AppA2 foi expressa como descrito acima para AppA, e a proteína de AppA2 foi coletada a partir do sobrenadante da cultura de levedura.

Mutantes direcionados a sítio de AppA

Mutantes direcionados a sítio de appA foram preparados como descrito no Pedido de Patente U.S. N° 06/166.179 (Publicação PCT No. WO 01/36607 A1), aqui incorporado por referência. Em resumo, mutantes appA E.coli foram construídos usando o método “megaprimer mutagênese sítio-direcionado (Seraphin, B. e outros, Nucleic Acids Res. 24: 3276-77 (1996); Smith, A.M. e outros, Biotechniques 22: 438-39 (1997), os quais são aqui incorporados por referência).

O modelo para a mutagênese foi obtido a partir de ATCC, e o gene (1,3 kb) foi transformado na forma da linhagem E.coli (N° 87441) usando o vetor de expressão pappaAl (Ostanin e outros, J. Biol. Chem., 267: 22830-36 (1992)). O modelo foi amplificado como descrito acima para appA expressa em Pichia pastoris usando os “primers usados acima para a expressão appA em Pichia pastoris (SEQ ID Nos.: 8 e 9). A reação de amplificação incluiu 1 ciclo a 94°C (3

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 52/117 min), 30 ciclos a 94°C (0,5 min), 30 ciclos a 54°C (1 min), ciclos a 72°C (1,5 min), e 1 ciclo a 72°C (10 min).

A reação de PCR de mutagênese foi realizada como descrito acima usando os primers como a seguir:

5CTGGGTATGGTTGGTTATATTACAGTCAGGT3'A131N (SEQ ID No.: 10)V131N

5'CAAACTTGAACCTTAAACGTGAG3'C200N (SEQ ID No.: 11)

5'CCTGCGTTAAGTTACAGCTTTCATTCTGTTT3'D207N (SEQ ID No.: 12)S211N

As reações PCR mutagênicas incorporaram primers apropriados para produzir A131N/V134N/D207N/S211N, C200N/ D207N/S211N (Mutante U), e A131N/V134N/C200N/D207N/S211N mutantes de appA. A primeira reação PCR mutagênica (100 gl) foi realizada como descrito acima, usando 4 gl da mistura de reação PCR appA intacta e os apropriados primers modificados listados acima. Todos os produtos PCR megaprimer foram separados em gel de agarose 1,5% de baixo ponto de derretimento. Os fragmentos esperados foram excisados e eluídos com um kit GENECLEAN. A reação PCR mutagênica final ajustada como descrito acima, usando 4 gl do produto de

PCR appA e variando as concentrações do megaprimer purificado (50ng a 4 gg), dependendo de seu tamanho. Cinco ciclos térmicos foram ajustados

94°C durante 1 minuto e 70°C por 2 minutos. Embora a 70°C, gmol de primer dianteiro e

U de polimerase AmpliTaq DNA foram acrescentados e misturados suavemente com a mistura

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 53/117 reacional, e a ciclagem térmica continuou por 25 ciclos a 94°C por 1 minuto e a 70°C por 1,5 minuto.

Os genes codificadores dos mutantes direcionados a sítio foram expressos em Pichia pastoris como descrito acima para o gene appA2. Os produtos de proteína foram expressos como descrito acima para AppA, e os mutantes direcionados a sítio foram purificados a partir do sobrenadante da cultura de levedura através da precipitação por sulfato de amônio e cromatografia DEAD-Sepharose.

EXEMPLO 8

EFEITOS IN-VIVO DE FITASES EXPRESSAS EM LEVEDURAS

ALIMENTADAS A PINTOS

Para avaliar seus potenciais como suplementos alimentícios animais, as fitases expressas em leveduras AppA e AppA2, foram secadas e acrescentadas à mistura de alimentação animal (23% proteína bruta) descrito acima no

Exemplo 1 usando farelo de trigo como um veículo. Os pintos (quatro pintos por cercado; peso médio inicial de 97 gramas) foram alimentados com as composições alimentícias suplementadas com fitase como descrito acima no Exemplo 4. os grupos de tratamento incluiam vários níveis de KH2PO4 para construír a curva padrão comercialmente disponível

500 U/kg de Natuphos®, uma fitase

Gist-Brocades) expressa no fungo

Aspergillus niger, 500 U/kg de Appa expressa em Pichia pastoris ou em E.coli, e vários níveis de AppA2/p (AppA2 expressa em Pichia pastoris usando o promotor constitutivo pGAP para a expressão do gene) como a seguir:

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 54/117

Grupos de Tratamento:

1.Dieta basal (	0,	10	% P, 0,75% Ca)
2.O	mesmo	como	1	+	0,05% P proveniente	de	KH2PO4
3.O	mesmo	como	1	+	0,10% P proveniente	de	KH2PO4
4.O	mesmo	como	1	+	0,15% P proveniente	de	KH2PO4
5.O	mesmo	como	1	+	500 U/kg AppA (levedura)
6 . O	mesmo	como	1	+	500 U/kg AppA (E.coli)
7.O	mesmo	como	1	+	500 U/kg AppA2/p
8.O	mesmo	como	1	+	1000 U/kg AppA2/p
9.O	mesmo	como	1	+	1500 U/kg AppA2/p
10.(	O mesmo	como	1	+	500 U/kg Natuphos®

Para os vários grupos de tratamento o ganho de peso, ingestão de alimento, relação de alimento para ganho de peso, peso de tíbia seca, peso de cinzas de tíbia, peso de cinzas de tíbia como um percentual do peso de tíbia seca, e porcentagem de fosfato biodisponível com base tanto no peso de cinzas de tíbia e no ganho de peso foram determinados. Os resultados são expressos abaixo como uma média para os quatro pintos para cada um dos cinco cercados (R1, R2, R3, R4 e R5), e a média para os cinco cercados foi

também	calculada (	^rotulada “média	nas	tabelas).	Os grupos
de tratamento são	rotulados T1-T10	nas	tabelas,	e g/c/d
indica	o ganho de	peso ou ingestão	de	alimento	em gramas/

pinto/dia.

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 55/117

GANHO DE PESO (g/c)

	T1	T2	T3	T4	T5	T6	T7	T8	T9	T10
R1	185	282	315	321	314	284	334	352	334	269
R2	219	286	315	336	317	322	315	326	348	274
R3	234	277	327	335	321	312	318	321	342	267
R4	234	291	309	311	316	308	326	342	333	276
R5	223	278	303	332	316	268	313	336	361	294
Média	219g	283ef	314bc	3 2 7bc	317c	2 99de	321bc	335ab	344a	276f
g/c/d	16, 8	21, 8	24,2	25,2	24,4	23,0	24,7	25, 8	26,5	21,2

MEV combinado = 6

LSD = 16

INGESTÃO DE ALIMENTO (g/c) DIA-13

	T1	T2	T3	T4	T5	T6	T7	T8	T9	T10
R1	303	392	434	434	426	389	450	474	465	397
R2	330	462	448	454	429	430	425	449	472	396
R3	336	391	445	458	446	425	428	445	464	397
R4	350	416	432	424	432	420	441	464	449	386
R5	335	388	421	467	425	389	453	461	483	420
Média	331f	410e	436c	447 abc	432cd	411de	439bc	459ab	467a	399e
g/c/d	25,5	31,5	33,5	34,4	33,2	31,6	33,8	35,3	35,9	30,7

MEV combinado = 7

LSD = 21

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 56/117

GANHO/ALIMENTO DE PESO (g/kg)

	T1	T2	T3	T4	T5	T6	T7	T8	T9	T10
R1	611	718	726	740	738	729	742	742	720	678
R2	665	618	703	741	738	749	741	727	738	692
R3	6 96	708	736	730	719	736	743	722	736	671
R4	668	700	715	733	731	733	738	738	743	715
R5	655	717	721	710	742	688	691	730	749	710
Média	6 61c	682b	720a	731a	734a	727a	731a	732a	737a	691b

MEV combinado = 10

LSD = 28

PESO DE TÍBIA SECA (mg/c)

	T1	T2	T3	T4	T5	T6	T7	T8	T9	T10
R1	659	804	883	981	892	787	914	1059	1106	757
R2	655	769	891	977	907	918	873	997	1083	759
R3	713	751	878	1008	901	820	905	964	1065	726
R4	740	742	931	925	823	809	923	1083	1096	729
R5	714	714	866	942	841	809	931	1036	1132	764
Média	6 9 8g	756f	890d	9 6 7c	8 73de	829e	909d	1028b	1096a	747f

MEV combinado = 16

LSD = 45

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 57/117

CINZAS DE TÍBIA (g/c)

	T1	T2	T3	T4	T5	T6	T7	T8	T9	T10
R1	232	307	406	492	434	345	439	590	617	278
R2	215	315	415	507	445	435	420	546	600	305
R3	259	300	406	520	435	382	451	523	604	284
R4	237	297	442	462	392	372	454	590	616	267
R5	242	277	396	471	432	373	471	548	642	316
Média	237h	299g	413e	490c	4 2 8de	381f	447d	559b	616a	290g

MEV combinado = 10

LSD = 28

INGESTÃO SUPLEMENTAR DE P (g)

	T1	T2	T3	T4
R1	0	0,196	0, 434	0,651
R2	0	0,231	0, 448	0,680
R3	0	0,196	0, 445	0,687
R4	0	0,208	0,432	0,636
R5	0	0,194	0, 421	0, 701
Média	0d	0,205c	0,436b	0,671a

MEV combinado = 0,007

LSD = 0,022

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 58/117

CINZAS DE TÍBIA (%)

	T1	T2	T3	T4	T5	T6	T7	T8	T9	T10
R1	35,15	38,22	46, 03	50,12	48,64	43,78	47,98	55,64	55, 79	36,78
R2	32,86	40,92	46,53	51,86	49, 06	47,31	48, 07	54,69	55,35	40,15
R3	36,30	39,96	46,22	51,61	48,31	46,62	49, 85	54,23	56,69	39,14
R4	32,01	40, 02	47, 47	49,96	47, 70	45,96	49,19	54, 44	56,23	36,68
R5	33,45	38,82	45,74	49,95	51,40	46,11	50,54	52,86	56,71	41,32
média	33,959	39,59f	46,40e	50,70c	49,02d	45,96e	49,13cd	54,37b	56,15a	38,81f

MEV combinado = 0,57

LSD = 1,62

AVALIAÇÕES DE EQUIVALÊNCIAS DE FÓSFORO

Peso de Cinzas de Tíbia

Curva Padrão KH2PO4: Y= cinzas de tíbia (mg)

X= ingestão suplementar ou equivalente de P(g)

Y = 232,0 + 389,9X r² = 0,97

Para 500 U/kg de atividade fitase (cálculos de exemplo usando médias dos tratamentos de cinzas de tíbia) % de P biodisponível

Appa (levedura: (428 - 232,0)/389,9 =

0,503 g de P proveniente de 432 g de FI =0,116%

AppA (E.coli): (381 - 232,0)/389,9 =

0,382 g de P proveniente de 411 g de FI = 0,093%

AppA2/p: (447 - 232,0)/389,9 =

0,551 g de P proveniente 439 g de FI = 0,126%

Natuphos®: (290-232,0)/389,9 =

0,149 g de P proveniente de 399 g de FI = 0,037% **Resultados proveniente de ANOVA (cálculo realizado para cada cercado de quatro aves; legenda do tratamento na página anterior)

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 59/117

P BIODISPONÍVEL (%)

	T5	T6	T7	T8	T9	T10
R1	0,122	0, 075	0,118	0,194	0,212	0, 030
R2	0,127	0,121	0,113	0,179	0,200	0, 047
R3	0,117	0, 091	0,131	0,168	0,206	0, 034
R4	0, 095	0, 085	0,129	0,198	0,219	0, 023
R5	0,121	0, 093	0,135	0,176	0,218	0, 051
Média	0,116c	0,093d	0,125c	0,183b	0,211a	0, 037e

MEV combinado = 0,005

LSD = 0,016

Contrastes Significância (Valor P)

AppA (levedura) vs. AppA (E.coli)0,006

AppA/p linear0,001

AppA2/p quadrático0,039

Ganho de peso

Curva Padrão KH2PO4:X= ganho de peso (g)

Y= ingestão suplementar ou de P (g)

Y = 234,1 + 157,2X r² = 0,84

Resultados proveniente de ANOVA (cálculo realizado para cada cercado de quatro aves; legenda do tratamento na página anterior

P BIODISPONÍVEL (%)

	T5	T6	T7	T8	T9	T10
R1	0,119	0, 082	0,141	0,158	0,137	0, 056
R2	0,123	0,130	0,121	0,130	0,154	0, 064
R3	0,124	0,117	0,125	0,124	0,148	0, 053
R4	0,121	0,112	0,133	0,148	0,140	0, 069
R5	0,123	0, 055	0,111	0,141	0,167	0, 091
Média	0,122b	0,099d	0,126b	0,140ab	0,149a	0, 067d

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 60/117

ContrastesSignificância (Valor-P)

AppA (levedura) vs. AppA (E.coli)0,038

AppA/p linear0,036

AppA2/p quadrático0,768

A suplementação da mistura alimentícia animal com quantidades crescentes de KH2PO4 resultou em aumentos lineares (p<0,001) em ganho de peso e em cinzas de tíbia. A suplementação da mistura alimentícia animal com Natuphos® resultou em aumentos lineares (p<0,001) em ganho de peso, em 10 cinzas de tíbia, e na % de fosfato biodisponível. A 500 U/kg as enzimas expressas em leveduras (AppA e AppA2/p) foram mais efetivas que AppA expressa e, E.coli e Natuphos® na melhora de cada uma das respostas in vivo testadas, incluindo a relação de alimento para ganho de peso, peso de 15 tíbia, e % de fosfato biodisponível. De fato, AppA e AppA2/p foram de 2-6 vezes mais efetivos no aumento do nível de fosfato biodisponível que Natuphos®. Dependendo no caso de ser usado peso de cinzas de tíbia ou ganho de peso para calcular o percentual de fosfato biodisponível.

EXEMPLO 9

EFEITOS IN-VIVO DE FITASES EXPRESSAS EM LEVEDURA ALIMENTADAS A FRANGOS

O procedimento foi descrito no Exemplo 8 exceto que os pintos tinham um peso inicial médio de 91 gramas, e 25 os grupos de tratamento foram os seguintes:

Grupos de Tratamento:

1.Dieta basal (0,10% P, 0,75% Ca)

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 61/117

	2.O	mesmo	como	1	+	0,05% P proveniente	> de KH2PO4
	3.O	mesmo	como	1	+	0,10	% P proveniente	> de KH2PO4
	4.O	mesmo	como	1	+	300	U/kg	de	fitase	Natuphos®
	5.O	mesmo	como	1	+	500	U/kg	de	fitase	Natuphos®
5	6 . O	mesmo	como	1	+	700	U/kg	de	fitase	Natuphos®
	7.O	mesmo	como	1	+	900	U/kg	de	fitase	Natuphos®
	8.O	mesmo	como	1	+	1100	U/kg	de	fitase	Natuphos®
	9.O	mesmo	como	1	+	1300	U/kg	de	fitase	Natuphos®

	10.O	mesmo	como	1	+	1500	U/kg	de	fitase	Natuphos®
10	11.O	mesmo	como	1	+	500	U/kg	de	fitase	Mutante	U
	12.O	mesmo	como	1	+	500	U/kg	de	fitase	Mutante	U
	13.O	mesmo	como	1	+	500	U/kg	de	fitase	AppA
	14.O	mesmo	como	1	+	500	U/kg	de	fitase	AppA2

A fitase Ronozyme® (Roche) é uma fitase expressa em fungo. O Mutante U é o mutante direcionado a sítio de

AppA derivada de EscherÍchia coli. As tabelas são rotuladas como descrito no Exemplo 8. Os efeitos in vivo da suplementação fitase descritos no Exemplo 8 foram avaliados e os resultados foram como a seguir:

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 62/117

GANHO DE PESO (g/c)

	T1	T2	T3	T4	T5	T6	T7	T8	T9	T10	T11	T12	T13	T14	T15
R1	287	295	318	269	295	271	301	305	304	317	256	324	340	319	343
R2	271	291	342	288	297	282	313	295	323	327	231	289	349	325	342
R3	268	302	326	286	278	267	298	309	308	327	274	332	337	348	336
R4	256	282	317	255	304	280	294	295	289	310	287	310	338	324	330
R5	215	279	310	292	270	290	302	270	295	306	284	316	329	319	331
Média	259	290	323	278	289	278	302	295	304	317	266	314	339	327	336
g/c/d	18,5	20, 7	23,1	19,9	20,6	19,9	21,6	21,1	21, 7	22,6	19, 0	22, 4	24,2	23,4	24, 0

MEV combinado = 6

LSD = 18

INGESTÃO DE ALIMENTO (g/c)

	T1	T2	T3	T4	T5	T6	T7	T8	T9	T10	T11	T12	T13	T14	T15
R1	463	450	489	428	450	435	466	479	445	489	422	500	487	483	503
R2	424	439	565	443	427	454	470	469	490	489	394	459	518	459	519
R3	425	446	526	444	417	425	444	480	483	485	427	522	496	520	535
R4	406	437	472	398	450	437	462	442	425	505	439	478	499	496	491
R5	381	443	478	421	423	438	447	423	455	452	427	463	496	476	519
Média	420	443	506	427	433	438	458	459	460	484	424	484	499	487	513
g/c/d	30,0	31,6	36,1	30,5	30,9	31,3	32,7	32,8	32,9	34,6	30,3	34,6	35,6	34, 8	36,6

MEV combinado = 10

LSD = 27

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 63/117

GANHO/ALIMENTO (g/kg)

	T1	T2	T3	T4	T5	T6	T7	T8	T9	T10	T11	T12	T13	T14	T15
R1	620	656	650	627	655	623	645	636	683	648	605	648	699	661	681
R2	639	662	606	651	6 96	621	665	629	659	668	587	629	672	709	659
R3	630	677	619	644	6 6 6	628	671	644	637	673	641	635	680	6 6 9	629
R4	631	645	671	641	675	642	636	668	679	614	654	649	678	652	671
R5	564	630	649	694	639	662	675	639	648	678	649	683	663	6 6 9	638
Média	617	654	639	651	6 6 6	635	658	643	661	656	627	649	678	672	656

MEV combinado = 10

LSD = 28

PESO DE TÍBIA SECA (mg/c)

	T1	T2	T3	T4	T5	T6	T7	T8	T9	T10	T11	T12	T13	T14	T15
R1	970	1010	1146	952	1028	1011	1007	995	1027	1131	—	1150	1169	1160	1234
R2	920	1029	1175	974	937	1047	1013	993	1077	1077	828	995	1251	1130	1209
R3	1038	872	1147	981	932	917	1049	1072	1030	1137	1029	1151	1238	1178	1215
R4	890	944	1125	957	1008	964	1073	1005	961	1100	919	1116	1273	1177	1128
R5	882	970	1078	954	976	1004	961	963	1065	1101	937	1046	1172	1141	1145
Média	940	965	1134	964	976	989	1021	1006	1032	1109	928	1092	1221	1157	186

MEV combinado = 22

LSD = 61

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 64/117

INGESTÃO DE P SUPLEMENTAR (g)

	1	2	3
R1	0	0,225	0, 489
R2	0	0,220	0,565
R3	0	0,223	0,526
R4	0	0,219	0, 472
R5	0	0,222	0, 478
Média	0c	0,222b	0,506a

CINZAS DE TÍBIA (mg/c)

	T1	T2	T3	T4	T5	T6	T7	T8	T9	T10	T11	T12	T13	T14	T15
R1	284	333	437	279	303	305	328	324	340	369	—	401	428	453	457
R2	270	318	447	298	290	336	336	325	383	363	226	355	481	441	470
R3	291	271	398	302	278	263	326	357	345	403	293	410	479	420	455
R4	234	305	398	281	314	297	341	317	324	364	264	406	500	447	413
R5	243	327	388	287	279	309	302	305	352	368	279	354	447	424	443
	264	311	414	289	293	302	327	326	349	373	266	385	467	437	448

MEV combinado = 10

LSD = 28

CINZAS DE TÍBIA (%)

	T1	T2	T3	T4	T5	T6	T7	T8	T9	T10	T11	T12	T13	T14	T15
R1	29,30	32,94	38,15	29,25	29, 48	30,18	32,55	32,54	33,10	32,60	—	34,90	36,63	39,07	37, 06
R2	29,29	30,97	38,03	30,61	30,99	32,06	33,21	32,73	35,51	33,67	27,33	35,66	38,48	39,04	38,89
R3	28, 03	31,08	34, 70	30,81	29, 79	28,71	31,12	33,26	33,45	35, 49	28,50	35,63	38,73	35,63	37, 48
R4	26,30	32,33	35,34	29,35	31,17	30,80	31,73	31,55	33,71	33,11	28,74	36,38	39,29	38,00	36,63
R5	27,52	33,76	35,98	30,13	28,60	30,81	31,44	31,67	33,09	33,41	29, 77	33,81	38,14	37,18	38,70
Média	28, 09	32,21	36,44	30,03	30,00	30,52	32,01	32,35	33,77	33,65	28,58	35,28	38,25	37, 78	37, 75

MEV combinado = 0,49

LSD = 1,39

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 65/117

Avaliações de equivalências de Fósforo

Curva Padrão KH2PO4:Y =cinzas de tíbia (mg)

X =ingestão suplementar ou equivalente de P (g) Y =257,1 + 299,0X r² =0,88

Para 500 U/kg de atividade fitase (cálculos de exemplo usando médias dos tratamentos de cinzas de tíbia) % de P biodisponível

Natuphos®: (293 - 257,1)/299,0 = 0,120 g de Ronozyme®: (266 - 257,1)/299,0 = 0,030 g de Mutante U: (437 - 257,1)/299,0 = 0,602 g de Natuphos®: (290-232,0)/299,0 = 0,638 g de P

P proveniente de 433 g de FI = 0,030%

P proveniente de 424 g de FI = 0,007%

P proveniente 487 g de FI = 0,124% proveniente de 513 g de FI = 0,124%

Resultados proveniente de ANOVA (cálculo realizado para cada cercado de quatro aves; legenda do tratamento na página anterior)

P BIODISPONÍVEL (%)

	T4	T5	T6	T7	T8	T9	T10	T11	T12	T13	T14	T15
R1	0, 017	0, 034	0, 037	0, 051	0, 047	0, 062	0, 076	—	0, 097	0,117	0,136	0,133
R2	0, 031	0, 026	0, 058	0, 057	0, 049	0, 086	0, 072	-0,026	0, 071	0,145	0,0134	0,137
R3	0, 034	0, 017	0, 005	0, 052	0, 069	0, 061	0,101	0, 028	0, 098	0,0150	0,105	0,0124
R4	0, 020	0, 043	0, 030	0, 060	0, 045	0, 053	0, 071	0, 006	0,104	0,163	0,128	0,106
R5	0, 024	0, 018	0, 040	0, 034	0, 038	0, 071	0, 082	0, 017	0, 070	0,128	0,117	0,120
Média	0, 025	0, 027	0, 034	0, 051	0, 050	0, 066	0, 080	0, 006	0, 088	0,140	0,124	0,124

MEV combinado = 0,006

LSD = 0,018

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 66/117

Contrastes

Significância (valor-P)

Resposta linear para Natuphos® (Grupos de tratamento 5 (trt) 4-10)0,001 Resposta quadrática para Natuphos®0,208

500

U/kg

Natuphos®

(trt

5)

vs

500

U/kg

fitases expressas em

levedura (

trt 13-15)

0,001

500

U/kg

Natuphos®

(trt

5)

vs

500

U/kg

Ronozyme® (

trt 11) 0,

031

500

U/kg

Ronozyme®

(trt

11

vs

500

U/kg

fitases expressas em levedura

(trt 13-15

) 0,001

300

U/kg

Mutante U

(trt

12

vs

500

U/kg

Mutante U

(trt 13) 0

,001

500

U/kg

Mutante U

(trt

12

vs

500

U/kg

AppA (trt

12) 0,074

500

U/kg

Mutante U

(trt

12

vs

500

U/kg

AppA2 (trt

15)0,074

Regressão Linear Múltipla:Y = cinzas de tíbia (mg) X = ingestão de fitase (U)

Y = 263,462+0,144 (Natuphos®+0,014 (Ronozyme®+0,823 (Mutante U)+0,711 (AppA)+0,718 (AppA2) R² = 0,93

Atividade Relativa Fitase Relação (%)Para 500 U/kg Natuphos® Ronozyme®: (0,014/0,144)*100 = 1050

Mutante U: (0,823/0,144)*100 = 5722860

AppA: (0,711/0,144)*100 = 4942470

AppA2: (0,718/0,144)*100 = 4992495

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 67/117

A 500 U/kg, as enzimas expressas em levedura (Mutante U, AppA e AppA2) foram mais efetivas que

Natuphos® ou Ronozyme® (ambas as enzimas são expressas em sists de expressão fúngica) na melhora das respostas in vivo testadas. Por exemplo, Mutante U, AppA vezes mais efetivos que Natuphos® na (ver Figura 3) .

EXEMPLO 10 e AppA2 foram quatro liberação de fosfato

EFEITOS IN-VIVO DE FITASES EXPRESSAS EM LEVEDURA

ALIMENTADAS A SUÍNOS

O procedimento foi descrito no Exemplo 8 exceto que os porcos (tinham um peso inicial médio de 10 kg) foram alimentados com a comp alimentícia suplementada

Os grupos de tratamento foram os seguintes:

com fitase.

Grupos de Tratamento:

1.Dieta basal (	(0,	75	% P,	0,	60% Ca)
2.O	mesmo	como	1	+	0,05%	P	proveniente	de	KH2PO4
3.O	mesmo	como	1	+	0,10%	P	proveniente	de	KH2PO4
4.O	mesmo	como	1	+	0,15%	P	proveniente	de	KH2PO4
5.O	mesmo	como	1	+	400 U/kg de fitase	Natuphos®

400 U/kg .

O mesmo como 1 + de fitase Mutante U

7.O de fitase mesmo como 1 mesmo como 1 + 400 + 400

U/kg de

U/kg de fitase AppA fitase AppA2

Para os vários grupos de tratamento o ganho de peso, relação de alimento para ganho de peso, peso de cinzas de perônio, peso de cinzas de perônio como uma porcentagem

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 68/117 do peso de perônio seco, e a porcentagem de fosfato biodisponível baseado no peso de cinzas de perônio foram determinados.

Os resultados foram os seguintes:

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 69/117

TABELA 3

Ensaio em suínos^a

	Composição perônio
Grupos de Tratamento	Ganho de peso, g/d	G:F, g/kg	Ash, %	Ash, Mg	% de P Biodisponívelb
Dieta basal	369	533	29,31	6 6 6
O mesmo como 1 + 0,05% P proveniente de KH2PO4	435	576	32,83	766
O mesmo como 1 + 0,10% P proveniente de KH2PO4	446	618	36,62	972
O mesmo como 1 + 0,15% P proveniente de KH2PO4	509	660	36,57	1123
O mesmo como 1 + 400 U/kg de fitase Natuphos®	460	605	34,37	889	0, 081
O mesmo como 1 + 400 U/kg de fitase Mutante U de fitase	458	645	35, 45	961	0,116
O mesmo como 1 + 400 U/kg de fitase AppA	458	606	35,97	1035	0,136
O mesmo como 1 + 400 U/kg de fitase AppA2	443	583	34,96	968	0,108
Contraste	Significância (valor-P)
Natuphos® (Grupos de tratamento (trt 5) vs. fitases expressas em levedura (TRT 6-8)	NS	NS	NS	0, 05	0, 048
Mutante U (trt 6) vs (TRT 7) e AppA2 (trt 8)	0,10	0,10	NS	0, 001	0,239

^a Os dados são médias de dez replicatas por tratamento de porcos individualmente alojados durante um período de 23 dias; o peso médio inicial foi de 8,4 ± 0,2 kg.

^b Os cálculos da porcentagem de P biodisponível são avaliados da equivalência P com base na curva padrão de KH2PO4 (tratamentos 1-4) . Cálculos baseados na curva padrão KH₂PO₄ onde Y = cinzas de perônio (mg) e X = ingestão suplementar ou equivalente de P (g): Y = 664,49 + 15,29X (r²=0,87).

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 70/117

A 400 U/kg, as enzimas expressas em leveduras (Mutante U, AppA, e AppA2) foram mais efetivas que Natuphos® (expresso em fungo) na melhoria das respostas testadas.

EXEMPLO 11

EFEITOS IN VIVO DE FITASES EXPRESSAS EM LEVEDURAS EM PINTOS

O procedimento foi descrito nos Exemplos 8, exceto que os pintos tinham um peso médio inicial de 83 gramas, e os grupos de tratamento foram como a seguir:

Grupos de Tratamento:

1.Dieta basal (0,10% P, 0,75% Ca)

	2.O	mesmo	como 1	+	0	, 05%	P proveniente de	KH2PO4
	3.O	mesmo	como 1	+	0	,10%	P proveniente de	KH2PO4
	4.O	mesmo	como 1	+	0	, 15%	P proveniente de	KH2PO4
	5.O	mesmo	como	1	+	500	U/kg de	fitase	Natuphos®
batelada	1)
	6 . O	mesmo	como	1	+	500	U/kg de	fitase	Natuphos®
batelada	2)
	7.O	mesmo	como	1	+	1000 U/kg de	fitase	Natuphos®
batelada	2)
	8.O	mesmo	como	1	+	500	U/kg de	fitase	Ronozyme®
batelada	1)
	9.O	mesmo	como	1	+	500	U/kg de	fitase	Ronozyme®
batelada	2)
	10.O mesmo	como	1	+	100	0 U/kg de	fitase	Ronozyme®
batelada	2)
	11.O mesmo	como	1	+	500	U/kg de fitase Mutante U
	12.O mesmo	como	1	+	500	U/kg de fitase AppA
	13.O mesmo	como	1	+	500	U/kg de fitase AppA2

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 71/117

14.O mesmo como 1 + 500 U/kg de AppA2 + novo promotor fitase (AppA2/p).

As Tabelas são rotuladas como no Exemplo 8. Os efeitos in vivo da suplementação fitase descritos no Exemplo

8 foram avaliados e os resultados foram como a seguir:

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 72/117

GANHO DE PESO (g/c)

	T1	T2	T3	T4	T5	T6	T7	T8	T9	T10	T11	T12	T13	T14
R1	152	252	295	299	215	235	241	223	256	254	325	308	322	314
R2	199	238	290	332	206	210	256	237	212	243	312	316	309	306
R3	163	257	297	347	235	254	250	215	218	246	324	309	313	335
R4	167	262	288	330	242	250	288	228	195	223	329	318	310	317
R5	190	257	295	356	193	230	288	218	214	259	306	307	314	317
Média	176	253	293	333	218	236	265	224	219	245	319	312	314	318
g/c/d	12,6	18,1	20,9	23,8	15,6	16,9	18,9	16, 0	15,6	17,5	22, 8	22,3	22, 4	22, 7

MEV combinado = 7

LSD = 19

INGESTÃO DE ALIMENTO (G/C)

	T1	T2	T3	T4	T5	T6	T7	T8	T9	T10	T11	T12	T13	T14
R1	279	373	431	424	347	386	352	359	284	321	435	429	447	424
R2	335	352	407	441	333	340	375	363	325	368	395	441	427	465
R3	291	374	419	472	369	400	381	330	348	367	439	459	440	472
R4	292	386	400	457	36 6	370	405	358	328	356	451	473	421	441
R5	344	374	427	483	341	370	450	336	344	394	425	420	449	445
	308	372	417	455	351	373	393	349	326	361	429	444	437	449
g/c/d	22, 0	26,6	29,8	32,5	25,1	26,6	28,1	24,9	23,3	25, 8	30,6	31,7	31,2	32,1

MEV combinado = 10

LSD = 28

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 73/117

GANHO/ALIMENTO (g/c)

	T1	T2	T3	T4	T5	T6	T7	T8	T9	T10	T11	T12	T13	T14
R1	544	674	684	705	618	608	684	621	676	793	747	718	719	742
R2	593	676	713	752	617	616	682	653	651	659	790	716	722	657
R3	558	686	709	736	636	635	656	650	626	671	737	673	713	708
R4	601	680	720	723	662	677	711	637	594	627	729	673	737	719
R5	551	685	690	737	565	622	641	649	624	658	721	732	700	712
	569	680	703	731	620	632	675	642	634	682	745	702	718	708

MEV combinado = 13

LSD = 37

PESO DE TÍBIA SECA (mg/c)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14
R1	671	886	1048	1002	919	840	912	825	891	831	1117	1041	1057	1091
R2	815	—	1003	1298	752	765	906	865	756	916	1113	1152	1041	1070
R3	730	884	1036	1296	849	942	937	864	849	816	1154	1017	1130	1220
R4	698	911	931	1232	802	901	918	837	807	872	1163	1165	1047	1078
R5	773	929	1037	1266	793	845	867	768	825	962	1044	1054	1130	1140
	737	903	1011	1219	823	859	908	832	826	879	1118	1086	1081	1120

MEV combinado = 27

LSD = 77

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 74/117

INGESTÃO SUPLEMENTAR DE P (g)

	1	2	3	4
R1	0	0,187	0, 431	0,636
R2	0	0,176	0, 407	0,661
R3	0	0,187	0, 419	0, 708
R4	0	0,193	0, 400	0,685
R5	0	0,187	0,427	0,724
	0d	0,186c	0,417b	0,683a

CINZAS DE TÍBIA (mg/c)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14
R1	174	255	381	367	254	230	246	239	253	224	415	385	404	411
R2	197	279	343	483	199	198	244	242	200	249	395	425	357	353
R3	185	279	361	486	238	261	276	230	228	231	410	370	389	454
R4	175	287	315	45	220	262	282	222	210	244	416	455	371	396
R5	183	261	335	481	211	229	264	202	222	262	383	380	406	431
	183	272	347	455	224	236	262	227	223	242	404	403	385	409

MEV combinado = 12

LSD = 32

CINZAS DE TÍBIA (%)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14
R1	25, 88	28, 82	36,31	36,67	27,60	27,39	26,91	29, 01	28,42	26,99	37,15	37, 03	38,24	37,64
R2	24,20	—	34,21	37,18	26,51	25, 89	26, 86	27,97	26, 44	27,16	35, 49	36,9	34,33	32,98
R3	25, 43	31,61	34, 87	37,53	28, 06	27, 75	29,52	26,65	26, 85	28,35	35,54	36,34	34, 40	37,22
R4	25, 04	31,53	33,85	37,22	27,42	29,15	30,73	26, 46	26, 03	27,97	35, 76	39,09	35, 43	36,71
R5	23,72	28,11	32,27	38,02	26,61	27,17	30,41	26,26	26, 88	27,22	36,67	36,02	35,99	37, 80
	24, 85	30,02	34,30	37,32	27,24	27,47	28,89	27,27	26,92	27,54	36,12	37, 08	35,68	36,47

MEV combinado = 0,57

LSD = 1,61

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 75/117

Avaliações de equivalências de Fósforo Curva Padrão KH2PO4:Y= cinzas de tíbia (mg)

X= ingestão suplementar ou equivalente de P (g) Y = 187,9 + 393,4X r² = 0,95

Para 500 U/kg de atividade fitase (cálculos de exemplo usando médias dos tratamentos de cinzas de tíbia) % de P biodisponível (224 - 187,9)/393,4 = 0,092 g de P proveniente (236 - 187,9)/393,4 = 0,122 g de P proveniente (227 - 187,9)/393,4 = 0,099 g de P proveniente 349 (223 - 187,9)/393,4 = 0,089 g de P proveniente de (404 - 187,9)/393,4 - 187,9)/393,4 =

- 187,9)/393,4 = 187,9)/393,4

Natuphos®

Natuphos®

Ronozyme®:1

Ronozyme® 2:

Mutante U: (404 - 187,9)/393,4 = 0,549 g de P proveniente de 429 g de FI =0,128%

AppA: (403 - 187,9)/393,4 = 0,547 g de P proveniente de 444 g de FI = 0,123%

AppA2: (385 - 187,9)/393,4 = 0,501 g de P proveniente de 437 g de FI =0,115%

AppA2/p: (409 - 187,9)/393,4 = 0,562 g de P proveniente de 449 g de FI =0,125%

Resultados proveniente de ANOVA (cálculo realizado para cada cercado de quatro aves; legenda do tratamento na página anterior)

1:

:

de de de de

351 g

373 g g de FI = 0

326 g de FI =0,026% = 0,033%

P BIODISPONÍVEL (%)

	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14
R1	0, 048	0, 028	0, 042	0, 036	0, 058	0, 029	0,133	0,117	0,123	0,138
R2	0, 008	0, 008	0, 038	0, 038	0, 009	0, 042	0,133	0,137	0,101	0, 090
R3	0, 035	0, 047	0, 059	0, 032	0, 029	0, 030	0,129	0,101	0,116	0,143
R4	0, 022	0, 051	0, 059	0, 024	0, 017	0, 040	0,129	0,144	0,111	0,120
R5	0, 017	0, 028	0, 043	0, 011	0, 025	0, 048	0,117	0,116	0,123	0,139
	0,026c	0, 032bc	0,048b	0,028c	0,028c	0, 038bc	0,128a	0,123a	0,115a	0,125a

MEV combinado = 0,006

LSD = 0,018

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 76/117

A 500 U/kg, as enzimas expressas em levedura (Mutante U, AppA, AppA2, e AppA2/p) foram mais efetivas que Natuphos® ou Ronozyme® na melhoria das respostas in vivo testadas incluindo ganho de peso, relação de alimento para ganho de peso, massa óssea e teor mineral, e percentual de fosfato biodisponível. As enzimas expressas em leveduras foram cerca de quatro vezes mais efetivas no aumento do nível de fosfato biodisponível que uma ou outra das enzimas expressas em fungos.

EXEMPLO 12

EFEITOS IN VIVO DE FITASES EXPRESSAS EM LEVEDURA ALIMENTADAS A GALINHAS POEDEIRAS PÓS-MUDA

O procedimento foi descrito como no Exemplo 8, exceto que galinhas poedeiras pós-muda foram testadas, a produção de ovos e o peso dos ovos foram determinados, e os grupos de tratamento e a dieta basal foram como a seguir:

Tratamentos:

1.Dieta basal de alimento de milho-soja deficiente em P (0,10% Pa; 3,8% Ca; 17% CP)

2.Como em 1 + 0,10% Pi proveniente de KH2PO4

3.Como em 1 +

150 U/kg fitase r-AppA2

4.Como em 1 + 300 U/kg fitase r-AppA2

5.Como em 1 +

10.000 U/kg fitase r-AppA2

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 77/117

Dieta basal: Ingrediente	%
Milho	63,65
Alimento de soja, descascado	25,65
Calcário, moído	9,80
Sal	0,40
Pré-mistura mineral	0,20
Pré-mistura vitamínica	0,15
DL-metionina, grau alimentício	0,10
Cloreto de colina	0, 05

**Nota: O tratamento 1 foi descontinuado após 4 semanas devido a produção de ovo abaixo de 50%.

As tabelas a seguir são rotuladas como descrito no

Exemplo e algumas das respostas similares às descritas no

Exemplo 8 foram mensuradas

Os resultados mostram que AppA2 aumenta a produção de ovos e os pesos dos ovos em galinhas poedeiras pós-muda.

Tratamentos:

1.Dieta basal de alimento de milho-soja deficiente em P (0,10% Pa; 3,8% Ca; 17% CP)

	2.Como	em	1	+	0,1	0% Pi	proveniente de KH2PO4
	3.Como	em	1	+	150	U/kg	fitase r-AppA2
	4.Como	em	1	+	300	U/kg	fitase r-AppA2
15	5.Como	em	1	+	10.	000 U/kg fitase r-AppA2

Pesos corpóreos iniciais (g; média de 12 galinhas poedeiras)

	T1	T2	T3	T4	T5
R1	1699	1792	1682	1790	1707
R2	1785	1698	1734	1855	1694
R3	1690	1665	1775	1724	1824
R4	1688	1745	1739	1823	1760
Média	1716	1725	1733	1798	1746

MEV combinado = 26

LSD = 78

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 78/117

Pesos corpóreos em 4 semanas (g; média de 12 galinhas poedeiras)

	T1	T2	T3	T4	T5
R1	1566	1802	1763	1769	1748
R2	1558	1734	1816	1860	1723
R3	1633	1707	1744	1769	1850
R4	1615	1749	1762	1827	1757
Média	1593	1748	1771	1806	1770

MEV combinado = 21

LSD = 64

Pesos corpóreos em 12 semanas (g; média de 12 galinhas poedeiras)

	T1	T2	T3	T4	T5
R1	—	1876	1831	1792	1781
R2	—	1791	1775	1856	1791
R3	—	1800	1765	1806	1933
R4	—	1853	1814	1876	1815
Média	—	1830	1796	1833	1830

MEV combinado = 24

LSD = 74

Tratamentos:

1.Dieta basal de alimento de milho-soja deficiente

	em P (0,10% Pa; 2.Como	3,8%	Ca; 17% CP)
em	1	+	0,10% Pi	proveniente de KH2PO4
10	3.Como	em	1	+	150 U/kg	fitase r-AppA2
	4.Como	em	1	+	300 U/kg	fitase r-AppA2
	5.Como	em	1	+	10.000 U/kg fitase r-AppA2

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 79/117

6

INGESTÃO DE ALIMENTO (g/h/d)¹

	T1	T2	T3	T4	T5
R1	89	118	122	115	116
R2	92	125	114	122	119
R3	89	117	118	116	124
R4	94	123	119	115	123
Média	91b	121a	118a	117a	121a

MEV combinado = 2

LSD = 5 ¹ Médias são as ingestões médias diárias de galinhas poedeiras para o primeiro período de 4 o tratamento 1, e para o período completo de 12 os tratamentos 2-5.

alimento de semanas para semanas para

PESOS DOS OVOS (g)¹

	T1	T2	T3	T4	T5
R1	57,5	64, 0	65, 4	65, 7	64,5
R2	63,5	64, 7	64,3	66,0	65,5
R3	60,3	64,3	64,6	64, 8	65,6
R4	62,8	63,3	62,2	65,3	63, 7
Média	61,0b	64, 1a	64, 1a	65,5a	6 4,8a

MEV combinado = 0,7

LSD = 2,2 ¹ Médias são os pesos médios dos ovos de galinhas poedeiras para o primeiro período de 4 semanas para o tratamento 1, e para o período completo de 12 semanas para os tratamentos 2-5.

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 80/117

Tratamentos:
1. Dieta	basal
2.Como	em	1	+
3.Como	em	1	+
4.Como	em	1	+
5.Como	em	1	+

de alimento de milho-soja deficiente em P (0,10% Pa; 3,8% Ca; 17% CP) 0,10% Pi proveniente de KH2PO4

150 U/kg fitase r-AppA2

300 U/kg fitase r-AppA2

10.000 U/kg fitase r-AppA2

PRODUÇÃO DE OVOS POR SEMANA (%)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
D1	75,3	55, 7	36,0	22,9	—	—	—	—	—	—	—	—
D2	88,4	90,8	88,1	87, 8	88,4	85, 4	86, 0	81,8	80, 4	79,8	80, 7	78,3
D3	84,5	85,1	83,3	85,1	83,3	82,1	83,6	79,2	77, 4	774	79,5	76,5
D4	86,6	86,3	83,9	82, 4	82,1	84,5	81,5	77, 4	78, 0	74, 7	73,8	72, 0
D5	82, 4	83,3	83,6	84, 8	80, 7	81,3	82, 7	78,6	80,1	78,9	76, 8	72,6
SEM	3,0	3,2	3,4	3,5	3,3	3,2	3,2	4,1	3,4	4,5	3,5	3,9

PRODUÇÃO DE OVOS (%)¹

	T1	T2	T3	T4	T5
R1	44,	6	86,5	73,	0	81, 0	80,	7
R2	60,	1	85, 7	78,	1	81, 7	74,	7
R3	43,	2	87,2	84,	3	83,9	87,	8
R4	42,	0	80,9	90,	8	74,6	85,	3
Média	47,	5	85,1	81,	6	80,3	82,	1
Médias dos mínimos quadrados2	53,	8b	81,2a	80,	7a	77, 8a	82,	9a

¹ Médias são as produções médias de ovos de galinhas poedeiras para o primeiro período de 4 semanas para o tratamento 1, e para o período completo de 12 semanas para os tratamentos 2-5.

² Devido à variação na produção de ovos da semana 1 (acima), a co-variança foi usada para analisar a produção total de ovos, com as médias dos mínimos quadrados mostrando o efeito da co-variabilidade.

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 81/117

EXEMPLO 13

EFEITOS IN VIVO DE FITASES EXPRESSAS EM LEVEDURA ALIMENTADAS

A PORCOS FINALIZADOS

O procedimento foi como o descrito no Exemplo 8 exceto que porcos finalizados (isto é, machos capões e femeas de primeira cobertura) foram testados e a dieta basal e os grupos de tratamento foram como a seguir:

Tratamentos:

1.Dieta basal de alimento de milho-soja deficiente em P

2.Como	em	1	+	0,10	% Pi	proveniente de KH2PO4
3.Como	em	1	+	250	U/kg	fitase r-AppA2
4.Como	em	1	+	500	U/kg	fitase r-AppA2
5.Como	em	1	+	1000	U/kg	fitase r-AppA2
6.Como	em	1	+	10.000 U/kg de fitase AppA2
Dietas	basais:

	Variação dc	:> Peso (kg)
Ingrediente	50-80	80-120
Amido de milho	para 100	para 100
Milho	78, 42	83,35
Alimento de soja, descascada	18, 08	12,65
Calcário, moído	1, 06	1, 07
Fosfato dicálcico	0,16	—
Pré-mistura mineral	0,35	0,35
Pré-mistura vitamínica	0,10	0,10
HCl L-lisina, grau alimentício	0,16	0,11
L-treonina, grau alimentício	0, 02	—
Pré-mistura antibiótica	0, 75	0, 75
Composição Calculada (NCR, 1998)
Proteína bruta, (%)	15,1	13,0
Lisina total, (%)	0, 88	0,69
Cálcio, (%)	0,50	0, 45
Fósforo, total (%)	0,38	0,32
Fósforo, biodisponível estimado, %	0, 09	0, 05
ME, kcal/kg	3293	3295

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 82/117

As tabelas a seguir são rotuladas como descrito no

Exemplo 8 e algumas das respostas similares às descritas no

Exemplo 8 foram mensuradas. A relação ganho/alimento é mostrada preferencialmente que uma relação de alimento/ 5 ganho.

Os resultados mostram que AppA2 foi efetivo como fosfato no aumento da massa óssea e do teor mineral, e na melhoria da relação ganho/alimento.

Tratamentos:

1.Dieta basal de alimento de milho-soja deficiente em P

	2.Como	em	1	+	0,10	% Pi	proveniente de KH2PO4
	3.Como	em	1	+	250	U/kg	fitase r-AppA2
	4.Como	em	1	+	500	U/kg	fitase r-AppA2
15	5.Como	em	1	+	1000	U/kg	fitase r-AppA2
	6.Como	em	1	+	10.000 U/kg de fitase AppA2

PESOS INICIAIS DOS PORCOS (kg)

	Capões	Fêmeas de primeira cobertura
1	2	3	4	5	6	1	2	3	4	5	6
R1	52,2	52,8	53,0	51,8	52,0	51,8	51,2	50, 8	52,2	52,2	51,3	52,4
R2	51,0	51,1	51,7	50,3	51,6	50,4	49, 6	49, 6	50,3	50,0	50,4	50,8
R3	48,2	49,6	49,8	49,6	50,1	49,2	48, 1	49, 6	47,9	47,1	48,8	48, 4
R4	46, 4	46,5	46,5	46,9	47, 4	47,9	45, 9	45, 4	44,3	46,6	46,5	45, 7
R5	52,0	44,1	51,0	52,4	46, 4	50,7	43, 4	43,9	44, 0	43,1	44,1	44, 0
Média	50,0	48,8	50,4	50,2	49,5	50,0	47, 6	47, 9	47, 7	47, 8	48,2	48,3

MEV combinado = 0,4

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 83/117

PESOS DOS PORCOS NA ALTERAÇAO DE FASE (kg)

	Capões	Fêmeas de primeira cobertura
1	2	3	4	5	6	1	2	3	4	5	6
R1	78,8	83,0	85,0	76, 0	79,6	79,2	79, 7	80, 1	88,6	84,1	83,1	89,6
R2	76, 8	80,6	86,9	79, 9	82,2	83,8	80, 0	83,5	87, 7	84,5	87,3	83,5
R3	73,7	79,8	77,1	79, 1	79, 0	75,9	77, 1	77, 6	81,3	79,9	82, 6	82, 4
R4	82,3	82,5	79,2	79, 1	84, 4	84,5	74, 7	78, 1	73,9	84,6	78,9	79,1
R5	84,5	78,5	84, 7	83,2	85,3	85,2	83,3	80,5	84, 4	87,2	81, 7	82,5
Média	79,2	80,9	82,6	79,5	82,1	81, 7	78,9	79, 9	83,2	83,4	82, 7	83,4

MEV combinado = 0,8

PESOS FINAIS DOS PORCOS (kg)

	Capões	Fêmeas de primeira cobertura
1	2	3	4	5	6	1	2	3	4	5	6
R1	111,3	121, 2	121,9	115, 9	112, 9	111, 1	105, 9	109,5	119,9	116,1	105, 4	130,1
R2	111,5	119, 6	132,7	111,9	121,3	116,3	105, 8	115, 6	118,3	115,3	123, 3	112, 5
R3	115, 9	216, 4	117,1	119,9	114, 0	120, 7	104, 9	107, 9	123,6	125, 2	127, 1	130, 8
R4	116,6	117, 9	110,0	110,0	119, 7	122, 1	120,2	121,6	117, 9	127, 7	109, 3	123, 0
R5	118,3	111, 6	122,3	114, 2	123, 0	117, 1	115, 2	110,4	119,2	135,1	119, 1	117,1
Média	114, 7	119,3	120,8	114, 4	118, 2	117, 5	110,3	113,0	119,8	123,9	116, 8	122, 7

MEV combinado = 3,0 (Sex x Diet, P<0,10)

Tratamentos:

1.Dieta basal de alimento de milho-soja deficiente em P

2.Como	em	1	+	0,10% Pi	proveniente de KH2PO4
3.Como	em	1	+	250	U/kg	fitase r-AppA2
4.Como	em	1	+	500	U/kg	fitase r-AppA2
5.Como	em	1	+	1000	U/kg	fitase r-AppA2
6.Como	em	1	+	10.000 U/kg de fitase AppA2

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 84/117

GANHO DE PESO, ALTERAÇÃO INICIAL (g/d)

	Capões	Fêmeas de primeira cobertura
1	2	3	4	5	6	1	2	3	4	5	6
R1	1024	1163	1233	931	1061	1055	816	836	1040	911	909	1063
R2	993	1135	1353	1140	1178	1283	867	96 6	1068	986	1055	936
R3	979	1162	1048	1131	1109	1028	829	801	955	935	965	971
R4	1025	1028	936	921	1057	1046	822	936	847	1001	925	952
R5	931	983	963	881	1109	984	950	870	962	1048	895	918
Média	990	1094	1107	1001	1103	1079	857	882	974	976	950	968

MEV combinado = 0,24

Contrastes: Capões(Ba) vs Fêmeas de primeira cobertura (Gi), P<0,02; 2 vs 2-6, P<0,01

GANHO DE PESO, ALTERAÇÃO FINAL (g/d)

	Capões	Fêmeas de primeira cobertura
1	2	3	4	5	6	1	2	3	4	5	6
R1	832	979	945	1023	855	818	706	794	844	865	604	1095
R2	890	1000	1174	822	1001	833	688	874	835	830	974	784
R3	919	1013	870	889	762	974	545	593	829	888	871	949
R4	927	971	832	833	954	1015	893	854	861	904	596	862
R5	912	895	1018	836	1020	864	531	499	581	798	624	577
Média	896	972	968	881	918	901	673	723	790	857	734	853

MEV combinado = 0,37

Contrastes: Ba vs Gi, P<0,05

GANHO DE PESO, TOTAL (g/d)

	Capões	Fêmeas de primeira cobertura
1	2	3	4	5	6	1	2	3	4	5	6
R1	909	1053	1060	986	937	913	760	814	940	887	752	1079
R2	931	1054	1246	949	1072	1013	775	919	948	906	1013	858
R3	941	1066	934	976	888	993	660	678	880	907	910	958
R4	975	1006	882	876	1004	1030	864	887	855	944	730	898
R5	922	938	992	858	1063	922	703	652	738	901	735	717
Média	935	1023	1023	929	993	974	752	790	872	909	828	902

MEV combinado = 38 (Sexo x dieta, P<0,10) Contrastes: Sexo x Pi(2) Fitase (3-6), P<0,05

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 85/117

Tratamentos :

l.Dieta basal de alimento de milho-soja deficiente em P

2.Como em 1	+	0,10% Pi proveniente de KH2PO4
3.Como	em	1	+	250	U/kg	fitase r-AppA2
4.Como	em	1	+	500	U/kg	fitase r-AppA2
5.Como	em	1	+	1000	U/kg	fitase r-AppA2
6.Como	em	1	+	10.000 U/kg de fitase AppA2

INGESTÃO DE ALIMENTO, ALTERAÇÃO INICIAL (g/d)

	Capões	Fêmeas de primeira cobertura
1	2	3	4	5	6	1	2	3	4	5	6
R1	2670	2733	2947	2271	2516	2448	2152	2029	2437	2074	2211	2579
R2	2541	2563	2940	2590	2484	2899	2425	2068	2543	2326	2363	1979
R3	2277	2499	2338	2385	2601	2066	2134	2020	2388	2168	2207	2093
R4	2371	2370	2311	2206	2457	2077	2104	2230	1919	2139	2260	2215
R5	2665	2312	2603	2308	2696	2366	2008	1289	2396	2237	1494	1866
Média	2505	2496	2628	2352	2551	2371	2165	1927	2337	2189	2107	2146

MEV combinado = 67

Contrastes: Ba vs Gi. P<0,01

INGESTÃO DE ALIMENTO, ALTERAÇÃO FINAL (g/d)

	Capões	Fêmeas de primeira cobertura
1	2	3	4	5	6	1	2	3	4	5	6
R1	3181	3427	3559	3270	2962	2918	2443	2615	2890	2651	2094	3739
R2	2922	3039	3833	3011	3141	3147	2481	2652	2936	2796	3316	2565
R3	3087	3330	2847	2877	2904	2686	2241	2110	2849	2692	2820	2952
R4	2978	2945	2872	2646	3104	2876	2935	2946	2373	2685	2481	2836
R5	3244	2958	3549	3106	3517	3008	2307	1747	2728	2947	2224	2385
Média	3082	3140	3332	2982	3126	2926	2482	2414	2755	2754	2587	2895

MEV combinado = 105

Contrastes: Ba vs Gi. P<0,01

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 86/117

INGESTÃO DE ALIMENTO, TOTAL (g/d)

	Capões	Fêmeas de primeira cobertura
1	2	3	4	5	6	1	2	3	4	5	6
R1	2977	3149	3314	2870	2784	2726	2302	2330	2670	2370	2151	3175
R2	2770	2849	3476	2842	2878	3048	2454	2368	2745	2568	2853	2280
R3	2794	3030	2663	2699	2794	2462	2197	2073	2661	2479	2571	2603
R4	2683	2632	2599	2432	2790	2488	2597	2655	2188	2463	2391	2583
R5	2963	2644	3089	2718	3118	2696	2184	1559	2591	2654	1993	2171
Média	2837	2861	3028	2712	2873	2684	2347	2197	2571	2507	2378	2565

MEV combinado = 81

Contrastes: Ba vs Gi. P<0,01

Tratamentos:

1. Dieta basal de alimento de milho-soja deficiente em P

5	2.Como	em	1	+
	3.Como	em	1	+
	4.Como	em	1	+
	5.Como	em	1	+
	6.Como	em	1	+

0,10% Pi proveniente de KH2PO4

250 U/kg fitase r-AppA2

500 U/kg fitase r-AppA2

1000 U/kg fitase r-AppA2

10.000 U/kg de fitase AppA2

GANHO/PESO, ALTERAÇÃO INICIAL (g/kg)

	Capões	Fêmeas de primeira cobertura
1	2	3	4	5	6	1	2	3	4	5	6
R1	383	425	418	410	421	431	379	412	427	439	411	412
R2	391	443	460	440	474	442	357	467	420	424	447	473
R3	430	465	448	474	427	498	388	396	400	431	437	464
R4	432	434	405	418	430	504	390	420	441	468	409	430
R5	349	425	370	382	411	416	473	675	402	469	599	492
Média	397	438	420	425	433	458	397	474	428	446	461	454

MEV combinado = 12

Contrastes: 1 vs 2-6, P<0,01; 3 vs 4-6, P<0,10

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 87/117

GANHO/PESO, ALTERAÇAO FINAL (g/d)

	Capões	Fêmeas de primeira cobertura
1	2	3	4	5	6	1	2	3	4	5	6
R1	262	286	265	313	289	281	289	304	292	326	289	293
R2	305	329	306	273	319	265	277	329	285	297	294	306
R3	298	304	307	309	262	363	243	281	291	330	309	321
R4	311	329	290	315	307	353	304	290	363	337	240	304
R5	281	303	287	269	290	287	230	285	213	271	281	242
Média	291	310	291	296	293	310	269	298	289	312	283	293

MEV combinado = 8

GANHO/PESO, TOTAL (g/d)

	Capões	Fêmeas de primeira cobertura
	1	2	3	4	5	6	1	2	3	4	5	6
R1	305	334	320	344	337	335	330	349	352	374	350	340
R2	336	370	358	334	372	332	316	388	345	353	355	376
R3	337	352	351	362	318	403	301	327	331	36 6	354	368
R4	363	381	339	361	360	414	333	334	391	383	305	348
R5	311	355	321	316	341	342	322	418	285	340	382	330
	331	358	338	343	346	365	320	363	341	363	349	352

MEV combinado = 8

Contrastes: 1 vs 2-6, P<0,01

Tratamentos:

1.Dieta basal de alimento de milho-soja deficiente em P

	2.Como	em	1	+	0,10% Pi proveniente de KH2PO4
	3.Como	em	1	+	250 U/kg fitase r-AppA2
	4.Como	em	1	+	500 U/kg fitase r-AppA2
10	5.Como	em	1	+	1000 U/kg fitase r-AppA2
	6.Como	em	1	+	10.000 U/kg de fitase AppA2

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 88/117

PESO DE PERÔNIO SECO (g)

	Capões	Fêmeas de primeira cobertura
1	2	3	4	5	6	1	2	3	4	5	6
R1	8, 18	10,90	11,45	12,11	10,08	12, 08	7,54	10, 95	9, 92	9, 42	9, 87	11,29
R2	8, 84	11,74	8, 66	10,98	11,21	11,66	7, 96	8, 81	9,33	11,41	10, 70	12, 73
R3	8, 54	11,29	9, 81	11,90	10,10	12, 77	8,62	10,25	9, 94	10,50	11,86	12,46
R4	9, 82	10,69	9, 06	10,22	11,05	12, 40	8,26	11,61	9,67	10,92	10,91	10, 49
R5	7, 88	8, 88	10,33	10,51	12,01	11,26	7,68	9,51	11,16	11,48	10,10	11,44
Média	8, 65	10, 70	9, 86	11,14	10,89	12, 03	8,01	10,23	10,00	10, 75	10,69	11,68

MEV combinado = 0,27

Contrastes: 1 vs 2-6, P<0,01; 3 vs 4-6, P<0,01

PESO DE CINZAS DE PERÔNIO (g)

	Capões	Fêmeas de primeira cobertura
1	2	3	4	5	6	1	2	3	4	5	6
R1	4,37	6,32	6,34	6,90	6, 03	6, 94	4, 06	6, 42	5,21	5,33	5,61	6, 78
R2	4,26	7, 05	5, 12	6, 49	6,24	6, 80	4,36	5,18	5,51	6,25	6,21	7,16
R3	4,51	6,54	5, 78	7,17	5, 81	7, 49	4,35	5,91	6,11	5, 79	6,93	7,23
R4	5,34	6,35	5, 19	5,90	6, 73	7,33	4,28	7,13	5,66	6,35	6,56	6,22
R5	4,37	5, 22	6, 02	6,34	7, 06	6, 64	3,91	5,64	7, 02	6,25	5,88	6,93
Média	4,57	6,30	5, 69	6,56	6,37	7, 04	4,19	6, 06	5,90	5,99	6,24	6, 86

MEV combinado = 0,17

Contrastes: Ba vs Gi. P<0,10; 1 vs 2-6, P<0,01; 3 vs 4-6, P<0,01; 4 vs

5-6, P<0,10; 5 vs 6, P<0,01

PORCENTAGEM DE CINZAS DE PERÔNIO (%)

	Capões	Fêmeas de primeira cobertura
1	2	3	4	5	6	1	2	3	4	5	6
R1	53,42	57,98	55,37	56,98	59,82	57, 45	53, 85	58,63	52,52	56,58	56,84	60, 05
R2	48,19	60,06	59,12	59,11	55,66	58, 32	54, 77	58,80	59,06	54, 78	58, 04	56,25
R3	52,81	57,93	58,92	60,25	57,52	58, 65	50, 46	57,66	61,47	55,14	58, 43	58, 03
R4	54,38	59,40	57,28	57, 73	60,90	59, 11	51, 82	61,41	58,53	58,15	60,13	59,29
R5	55,46	58, 78	58,28	60,32	58, 78	58, 97	50, 91	59,31	62,90	54, 44	58,22	60,58
Média	52,85	58,83	57, 79	58,88	58,54	58, 40	52,36	59,16	58,90	55, 82	58,33	58, 84

MEV combinado = 0,65

Contrastes: 1 vs 2-6, P<0,01

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 89/117

Tratamentos :

l.Dieta basal de alimento de milho-soja deficiente em P

2.Como	em	1	+	0,10% Pi	proveniente de KH2PO4
3.Como	em	1	+	250	U/kg	fitase r-AppA2
4.Como	em	1	+	500	U/kg	fitase r-AppA2
5.Como	em	1	+	1000	U/kg	fitase r-AppA2
6.Como	em	1	+	10.000 U/kg de fitase AppA2

PESO METARTASAL SECO (g)

	Capões	Fêmeas de primeira cobertura
1	2	3	4	5	6	1	2	3	4	5	6
R1	11,42	14,03	15,84	15,36	14,43	13, 85	11, 77	15,90	16,00	15, 48	12,65	15, 05
R2	11,89	14,52	13,27	14,26	13,73	15, 06	11,66	13,74	14,14	14,19	13, 75	14,87
R3	14,01	14,45	13,20	13,99	14,91	17, 43	10, 52	12,20	11,95	16,31	17,53	17,13
R4	12,25	14,38	12,54	15,99	15,26	17, 01	11,68	13,49	13,16	14,20	12, 77	14,23
R5	12,55	13,30	14,30	14,36	17, 79	14, 29	11,26	12,76	12,47	16,93	12, 78	13,10
Média	12,42	14,14	13,83	14, 79	15,22	15, 53	11,38	13,62	13,54	15, 42	13,90	14, 88

MEV combinado = 0,44

Contrastes: 1 vs 2-6, P<0,01; 3 vs 4-6, P<0,05

PESO DE CINZAS METARTASAL (g)

	Capões	Fêmeas de primeira cobertura
1	2	3	4	5	6	1	2	3	4	5	6
R1	5,28	6,59	7, 97	6,93	6, 74	6, 86	4,74	7,32	6, 72	7, 09	6,07	7,50
R2	6, 81	7, 10	5, 94	6, 74	6,32	7, 44	4,84	6,28	6, 40	6,55	6, 71	7, 07
R3	4, 82	6, 95	6, 41	6, 77	6, 72	7, 88	4, 82	5,59	6,67	6,99	8,13	8,11
R4	4, 83	6, 81	6, 26	7, 73	7, 88	7, 48	4, 86	7,27	5,92	7,15	6,97	7,13
R5	5,20	5, 75	7, 22	6,99	8,33	7,14	5,24	6,61	6,65	7,07	6,04	6,55
Média	5,39	6, 64	6, 76	7, 03	7,20	7,36	4,90	6,59	6, 47	6,97	6, 78	7,27

MEV combinado = 0,18

Contrastes: 1 vs 2-6, P<0,01; 3 vs 4-6, P<0,05

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 90/117

PORCENTAGEM DE CINZAS METARTASAL (%)

	Capões	Fêmeas de primeira cobertura
1	2	3	4	5	6	1	2	3	4	5	6
R1	46,25	46,99	50,31	45,15	46,75	49,56	40, 22	45,37	42,01	45, 80	47, 96	49,84
R2	39,90	48,90	44, 75	47,16	46,02	49,39	41,50	45, 72	45,27	46,18	48,80	47,55
R3	34,38	48,12	48,59	48,36	45,09	45, 18	45, 84	45, 78	55,84	42,87	46,39	47,35
R4	39,44	47,27	49,89	48,36	51,65	43, 98	41,63	53,93	44,97	50,32	54,59	50,11
R5	41,44	43,26	50,50	48,69	46,81	49, 95	46,50	51,82	53,33	41, 74	47,28	50,00
Média	40,28	46,91	48,81	47,54	47,26	47, 61	43, 14	48,52	48,28	45,38	49,00	48,97

MEV combinado = 1,05

Contrastes: 1 vs 2-6, P<0,01

EXEMPLO 14

EFEITOS IN VIVO DE FITASES EXPRESSAS EM LEVEDURAS

ALIMENTADAS A SUÍNOS

O procedimento foi como o descrito no Exemplo 8, exceto que os grupos de tratamento foram como a seguir:

Período 28-dias

	1.Basal:	0,	08% fó
	2.Basal	+	0,05
10	mono-sódico
	3.Basal	+	0,10
	mono-sódico
	4.Basal	+	0,15

mono-sódico foro disponível

fósforo	proveniente	de	fosfato
fósforo	proveniente	de	fosfato
fósforo	proveniente	de	fosfato

5.Basal + 250 FTU/kg produto fitase experimental

6.Basal + 500 FTU/kg produto fitase experimental

7.Basal + 1000 FTU/kg produto fitase experimental

8.Basal + 2000 FTU/kg produto fitase experimental

9.Basal + Natuphos® 500 FTU/kg

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 91/117

Os resultados são mostrados na tabela a seguir. Os resultados mostram que AppA2 aumenta a massa óssea e o teor mineral e melhora a relação ganho/peso tão efetivamente como o fosfato.

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 92/117

EFEITO DA SUPLEMENTAÇAO FITASE NA PERFORMANCE DE CRESCIMENTO DE SUÍNOS E NAS CINZAS DE OSSOS

Unidades fitase/gc NaH2PO4H2Oh adicionado	0, 00	0, 05	0,10	0,15	250	500	1.000	2.000	500 BASF	S.E.
Ganho diário, kgij	0,359	0,39fg	0, 46de	0, 49d	0,389	0, 42el	0, 47d	0, 49d	0, 421	0, 01
Ingestão diária de alimento, kgj	0, 75f	0, 75f	0, 81def	0, 85d	0, 77ef	0, 79def	0,83def	0, 85d	0, 85de	0, 07
G:Fijk	0, 48f	0,53de	0,57d	0,58d	0,50ef	0,54de	0,57d	0,57d	0, 49ef	0, 02
Cinzas de perônio, gij	0,57h	0,659h	0, 77f	0, 88c	0,59h	0, 72f	0, 85e	0,9 7d	0, 70f9	0, 03
Cinzas de perônio, %ij	34,6h	36,09h	37, 89	41,5de	33,9h	38,2f9	40, 4ef	42,6d	38,5f	0, 84
% disponível P1	18,439				22,569	38,31f	53,56e	66,71d	34, 47f	4, 07
Ingestão aP, g/dijl	0,589	0,929	1, 45f	1,92c	0,689	1,22f	1, 81e	2,31d	1,17f	0,13
Ingestão suplementar aP, g/dijm	0, 02h	0,3 49h	0, 84f	1,27e	0,12h	0,62f9	1,17e	1,6 4d	0,57f9	0,13

^aseis replicações de dois porcos por cercado para os dados de performance; seis replicações de dois porcos por cercado para os dados de ossos exceto para o tratamento com fitase acrescentada a 500 unidades/g, que tem cinco replicações.

^bP acrescentado a partir de fosfato mono-sódico (NaH₂PO₄H₂O) à dieta basal. ^cFitase suplementar adicionada à dieta basal.

^defghmédias dentro de uma fila sem diferenciar sobrescritos comuns (P<0,05). ^jEfeito linear de P acrescentado a partir de fosfato mono-sódico (P<0,001). fitase UF v. fitase BASF (P<0,07).

^lassume que P em milho, alimento de soja, e fosfato mono-sódico é 11,25, e 100% disponível, respectivamente. ^massume que P em fosfato mono-sódico é 100% disponível.

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 93/117

EXEMPLO 15

EFEITOS IN VIVO DE FITASES EXPRESSAS EM LEVEDURAS

ALIMENTADAS A PINTOS E PORCOS

O procedimento para os estudos sumariados nas tabelas a seguir foi como o descrito no Exemplo 8. Os grupos de tratamento são mostrados em cada tabela e as composições da dieta basal são mostradas nas tabelas seguintes (ver próxima página). Os resultados mostram que AppA2 (ECP) é tão efetivo quanto o fosfato na melhoria da relação ganho/ alimento e no aumento da massa óssea e do teor mineral. Os resultados também mostram que AppA2 é mais efetiva que Natuphos® e Ronozyme® no aumento do fosfato biodisponível. Além disso, os resultados mostram também que AppA2 aumenta os pesos dos ovos e a produção de ovos de galinhas poedeiras tão eficazmente quanto o fosfato.

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 94/117

COMPOSIÇÃO PERCENTUAL DAS DIETAS (BASE COMO ALIMENTADAS)

Ingredientes	Ensaios com pintos	Ensaios com porcos j ovens	Ensaio com porcos finalizados	Ensaios com galinhas poedeiras
50-80 kg	80-120 kg
Amido de milho	para 100	para 100	para 100	para 100	-
Milho	50,89	60, 85	78, 42	83,85	63,65
Alimento de soja, descascada	39,69	31,19	18, 08	12,65	25,65
Óleo de soja	5, 00	3,00	-	-	-
Calcário, moído	1,67	1, 06	1, 06	1, 07	9,80
Sal	0, 40	-	-	-	0, 40
Fosfato dicálcico	-	-	0,16	-	-
Pré-mistura mineral traço	0,15a	0,35b	0,35b	0,35b	0,20a
Pré-mistura vitamínica	0,20c	0,2 0d	0,10d	0,10d	0,15c
Cloreto de colina (60%)	0,20	-	-	-	0, 05
Pré-mistura antibiótica	0, 05c	1, 00f	0, 75g	0, 75g	-
Sulfato de cobre	-	0, 08	-	-	-
HCl L-lisina, grau alimentício	-	0,17	0,16	0,11	-
L-treonina, grau alimentício	-	-	0, 02	-	-
MDL-metionina, grau alimentício	0,20	0, 05	-	-	0,10
Composição Química
Proteína bruta, (%)h	22,6	20, 8	15,1	13,0	17, 0
Fósforo, total (%)h	0, 42	0,35	0,38	0,32	0,34
Fósforo, biodisponível estimado, %i	0,10	0, 075	0, 09	0, 05	0, 07
Cálcio, (%)1	0, 75	0,60	0,50	0, 45	3,8
ME, kcal/kgi	3123	3387	3293	3295	2758

forneceu o seguinte por kg de dieta completa: Fe, 75 mg (FeSO₄H₂SO₄H₂O); Zn, 100 mg (ZnO); Mn, 75 mg (MnO); Cu, 8 mg (CUSO4H2O); I, 0,35 mg (CaI₂); Se, 0,3 mg (Na₂SeO3); NaCl, 3 mg.

forneceu o seguinte por kg de dieta completa: Fe, 90 mg (FeSO4H₂SO4H₂O); Zn, 100 mg (ZnO); Mn, 20 mg (MnO); Cu, 8 mg (CuSO4H2O); I, 0,35 mg (CaI2); Se, 0,3 mg (Na2SeO3); NaCl, 3 mg.

^cforneceu o seguinte por kg de dieta completa: acetato de retinila, 2.273 gg; colecasciferol, 16,5 gg; acetato de DL-a-tocoferila, 88 mg; menadiona, 4,4 mg (complexo bissulfito de menadiona sódica); niacina, 33 mg, D-Ca-pantotenato, 24,2 mg; riboflavina, 8,8 mg; vitamina B₄₂, 35 μg, cloreto de colina, 319 mg.

^eprovido com 50 mg de bacitracin por kg de dieta completa.

^fprovido com 55 mg de mecadox por kg de dieta completa.

^gprovido com 38 mg de roxarsone por kg de dieta completa. ^hanalisado (AOAC, 1999).

ⁱcalculado (NRC, 1994; NRC, 1998).

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 95/117

AVALIAÇÃO DA BIODISPONIBILIDADE RELATIVA DE FÓSFORO EM

PINTOS COMO AFETADOS POR DUAS ENZIMAS FITASES DIFERENTES (ENSAIOS DE PINTOS 1)^a

Dieta	Ganho de peso, g	Ganho/ Alimento, g/kg	Cinzas de tíbia	Biodisponibilidade de p, %
%	mg
1. Dieta basal	259e	617d	28, 1	264	-
2. Como 1 + 0,05% Pi(KH2PO4)	290d	654c	32,2d	311e	-
3. Como 1+0,10% Pi (KH2PO4)	323c	639cd	36,4c	414d	-
4. Como 1+Natuphos® 500 FTU/kg	289d	6 6 6c	30,0c	293c	0,027d
5. Como 1+500 FTU/kg ECP	346c	656c	37,8c	448c	0,124c
MEV combinado	6	10	0,5	10	0, 006

^avalores são médias de cinco cercados de quatro pintos machos alimentados com as dietas experimentais durante o período de 8 a 22 d pós-incubação; peso médio inicial foi de 91 g.

^ba regressão linear das cinzas de tíbia (mg) para as Dietas 1 a 3 como uma função da ingestão suplementar de P (g) foi Y = 257,1 ± 9,8 + 299,0 ± 30,7X (r² = 0,88); concentrações de P biodisponível (rendimentos de P equivalente) para as Dietas 4 e 5 foram determinados mediante o cálculo da ingestão de P biodisponível (g) a partir da curva padrão, dividindo este pela ingestão de alimento (g), e multiplicando por 100.

^c,d,e,fmédias dentro de uma coluna com diferentes sobrescritos são diferentes, P<0,05.

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 96/117

BIODISPONIBILIDADE RELATIVA DE FÓSFORO EM PINTOS ALIMENTADOS

COM ENZIMAS FITASES DIFERENTES (ENSAIOS DE PINTOS 2)^a

Dieta	Ganho de peso, g	Ganho/ Alimento, g/kg	Cinzas de tíbia	Biodisponibilidade de p, %
%	mg
1. Dieta Basal	176k	569k	24,9k	183k	-
2. Como 1 + 0,05% Pi(KH2PO4)	253hi	6 8 0h	3 0,0h	272h	-
3. Como 1 + 0,10% Pi(KH2PO4)	293g	703fgh	34,3g	3 4 7g	-
4. Como 1 + 0,15% P4(KH2PO4)	333f	731ef	37,3e	455e	-
5. Como 1+Natuphos® 500 FTU/kgc	218j	620j	27,2j	224j	0,026g
6. Como 1+Natuphos® 500 FTU/kgd	236ij	632j	27,5ij	236ij	0,032fg
7. Como 1+Natuphos® 500 FTU/kgd	265i	6 7 5gh	28,9hi	262hi	0,048f
8. Como 1+Ronozyme® 500 FTU/kg	219j	634j	26,9j	223j	0,028g
9. Como 1+Ronozyme® 500 FTU/kg	245i	6 82gh	27,5ij	242hij	0,038fg
10. Como 1+500 FTU/kg ECP	318ef	708fgh	36,5ef	409f	0,125e
MEV combinado	7	10	0,6	12	0, 006

^avalores são médias de cinco cercados de quatro pintos machos alimentados com as dietas experimentais durante o período de 8 a 22 d pós-incubação; peso médio inicial foi de 83 g.

^ba regressão linear das cinzas de tíbia (mg) para as Dietas 1 a 4 como uma função da ingestão suplementar de P (g) foi Y = 187,9 ± 8,7 + 393,4 ± 21,2X (r² = 0,95); concentrações de P biodisponível (rendimentos de P equivalente) para as Dietas 4-11 foram determinados mediante o cálculo da ingestão de P biodisponível (g) a partir da curva padrão, dividindo este pela ingestão de alimento (g), e multiplicando por 100.

^ca enzima foi proveniente da mesma da batelada que foi usada para o ensaio para pintos 1.

^da enzima foi proveniente de uma batelada diferente daquela que foi usada para o ensaio para pintos 1.

^e,f,g,h,imédias dentro de uma coluna com diferentes sobrescritos são diferentes, P<0,05.

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 97/117

O EFEITO DO NÍVEL DE ATIVIDADE NA EFICÁCIA DE LIBERAÇAO DE

FÓSFORO DA FITASE E.COLI EM PINTOS (ENSAIOS DE PINTOS 3)^a

Dieta	Ganho de peso, g	Ganho/ Alimento, g/kg	Cinzas de tíbia mg	Biodisponibilidade de p, %
1. Dieta Basal			237a	-
2. Como 1 + 0,05% Pi(KH2PO4)	283fg	692d	299h	-
3. Como 1 + 0,10% Pi(KH2PO4)	314c	720c	413g	-
4. Como 1+0,15% Pi(KH2PO4)	327dc	731c	490e	-
5. Como 1+500 FTU/kg ECP	321dc	731c	447f	0,125c
6. Como 1+1000 FTU/kg ECP	335cd	732c	559d	0,183d
7. Como 1+1.500 FTU/kg ECP	344c	737c	616c	0,211c
8. Como 1+Natuphos® 500 FTU/kg	276g	691d	290h	0,037f
MEV combinado	6	10	12	0, 005

^avalores são médias de cinco cercados de quatro pintos machos alimentados com as dietas experimentais durante o período de 8 a 22 d pós-incubação; peso médio inicial foi de 97 g.

^ba regressão linear das cinzas de tíbia (mg) para as Dietas 1 a 4 como uma função da ingestão suplementar de P (g) foi Y = 232,0 ± 6,9 + 389,9 ± 16,7X (r² = 0,97); concentrações de P biodisponível (rendimentos de P equivalente) para as Dietas 5 a 8 foram determinados mediante o cálculo da ingestão de P biodisponível (g) a partir da curva padrão, dividindo este pela ingestão de alimento (g), e multiplicando por 100.

^{c,d,e,f,g,h,i}médias dentro de uma coluna com diferentes sobrescritos são diferentes, P<0,05.

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 98/117

A COMBINAÇÃO DE FITASES 3- E 6- NÃO PRODUZ EFEITOS

SINÉRGICOS NA LIBERAÇÃO PI EM PINTOS ALIMENTADOS COM UMA

DIETA DE ALIMENTO DE MILHO-SOJA (ENSAIOS DE PINTOS 4)^a

Dieta	Ganho de peso, g	Ganho/ Alimento, g/kg	Cinzas de tíbia	Biodisponibilidade de p, %b
%	mg
1. Dieta Basal	137g	610g	25,4g	134h	-
2. Como 1 + 0,05% Pi(KH2PO4)	191ef	678dc	29, 0f	198fg	-
3. Como 1 + 0,10% Pi(KH2PO4)	225d	712d	32,8e	253e	-
4. Como 1+0,15% Pi(KH2PO4)	276c	762c	36,3d	339d	-
5. Como 1+Natuphos® 500 FTU/kg	192ef	624fg	28, 0f	187g	0,041g
6. Como 1+ Ronozyme® 500 FTU/kg	182f	655cf	27,7f	188g	0,047fg
7. Como 1+500 FTU/kg ECP	272c	760c	37,0d	343d	0,153d
8. Como 5+6	211de	693de	28,3f	212fg	0,064ef
9. Como 5+7	282c	763c	37,8d	360d	0,162d
10. Como 1+Natuphos® 1.000 FTU/kg	217d	703d	29, 0f	217f	0,067c
11. Como 1+ Ronozyme® 1.000 FTU/kg	201def	6 6 6ef	27,9f	194fg	0, 050efg
12. Como 1+1.000 FTU/kg ECP	292c	758c	41,1c	433c	0, 206c
MEV combinado	9	15	0,6	10	0, 007

^avalores são médias de cinco cercados de quatro pintos machos alimentados com as dietas experimentais durante o período de 8 a 22 d pós-incubação; peso médio inicial foi de 68 g.

^ba regressão linear das cinzas de tíbia (mg) para as Dietas 1 a 4 como uma função da ingestão suplementar de P (g) foi Y = 138,6 ± 4,9 + 371,3 ± 14,7X (r² = 0,97); concentrações de P biodisponível (rendimentos de P equivalente) para as Dietas 5 a 8 foram determinados mediante o cálculo da ingestão de P biodisponível (g) a partir da curva padrão, dividindo este pela ingestão de alimento (g), e multiplicando por 100.

^c,d,e,f,gmédias dentro de uma coluna com diferentes sobrescritos são diferentes, P<0,05.

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 99/117

EFEITOS DA FITASE E.COLI NA PERFORMANCE DE GALINHAS

POEDEIRAS A PARTIR DA SEMANA 1-4^a

Dieta	Peso inicial da galinha, g	Peso da galinha 4 semanas, g	Ingestão de alimento, g/d	Produção de ovos, %	Peso dos ovos, g
1. Dieta basal deficiente em P	1716	1593	90	54, 0	61, 0
2. Como 1+0,10% Pi	1725	1748	122	84, 8	64,2
3. Como 1+150 FTU/kg ECP	1733	1771	119	83,7	63,8
4. Como 1+300 FTU/kg ECP	1798	1806	119	82,3	65, 4
5. Como 1+10.000 FTU/kg ECP	1746	1770	123	85,9	65,1
MEV combinado	26	21c	2c	1, 6c	0, 7c

^aos dados são médias de quatro replicatas de 12 galinhas poedeiras para as primeiras 4 semanas do período de estudo.

^bprodução de ovos (%) analisada usando co-variança; dados apresentados são médias dos mínimos quadrados.

^cdieta 1 vs dietas 2-5, P<0,01.

EFEITOS DA FITASE E.COLI NA PERFORMANCE DE GALINHAS

POEDEIRAS A PARTIR DA SEMANA 5-12^a

Dieta	Peso da galinha 4semanas, g	Ingestão de alimento, g/d	Produção de ovos, %b O	Peso dos ovos, g
2. Como 1+0,10% Pi	1830	120	80,5	64, 0
3. Como 1+150 FTU/kg ECP	1796	118	80,6	64,1
4. Como 1+300 FTU/kg ECP	1833	116	77,2	65,5
5. Como 1+10.000 FTU/kg ECP	1830	120	81,2	64, 8
MEV combinado	24	2	2,5	0,5c

^aos dados são médias de quatro replicatas de 12 galinhas poedeiras para as semanas 5 a 12 do período de estudo.

^bprodução de ovos (%) analisada usando co-variança; dados apresentados são médias dos mínimos quadrados.

^cdieta 3 vs dietas 4 e 5, P<0,01.

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EFEITOS DA FITASE E.COLI NA PERFORMANCE DE GALINHAS

POEDEIRAS A PARTIR DA SEMANA 1-12

Dieta	Pesos	das galinhas	Ingestão de alimento, g/d	Produção de ovos, %b O	Peso dos ovos, g
Inicial	4- semana	12- semana
1. Dieta basal deficiente em P	1716	1593	-	90	53,8	61, 0
2. Como 1+0,10% Pi	1725	1748	1830	121	81,2	64,1
3. Como 1+150 FTU/kg ECP	1733	1771	1796	118	80, 7	64,1
4. Como 1+300 FTU/kg ECP	1798	1806	1833	117	77, 8	65,5
5. Como 1+10.000 FTU/kg ECP	1746	1770	1830	121	82,9	64, 8
MEV combinado	26	21c	24	2c	2,1c	0,7c

^aos dados são médias de quatro replicatas de 12 galinhas. Os dados são médias para as primeiras 4 semanas para a dieta 1, a não ser para todas as 12 semanas para as dietas 2-5.

^bprodução de ovos (%) analisada usando co-variança; dados apresentados são médias dos mínimos quadrados.

^cdieta 1 vs dietas 2-5, P<0,01.

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 101/117

BIODISPONIBILIDADE RELATIVA DE FÓSFORO EM PORCOS JOVENS

ALIMENTADOS COM DIFERENTES ENZIMAS (ENSAIOS DE PORCOS 1)

Dieta	Ganho de peso, g/da	Ganho/ Alimento, g/kga	Cinzas de tíbia	Biodisponibilidade de p, o,c 0
%	mg
1. Dieta basal	369f	533f	29,3g	6 6 6f	-
2. Como 1 + 0,05% Pi(KH2PO4)	435e	576ef	32,8	766hi	-
3. Como 1 + 0,10% Pi(KH2PO4)	4 7 6de	618de	36,6d	972ef	-
4. Como 1 + 0,15% Pi(KH2PO4)	509d	660d	36,6d	1123d	-
5. Como 1+Natuphos® 400 FTU/kg	460c	6 0 5de	3 4,4de f	889fg	0,081dc
6. Como 1+ Ronozyme® 400 FTU/kg	445e	565ef	33,5ef	8 0 5gh	0,043f
7. Como 1+400 FTU/kg ECP	443e	583ef	35, 0de f	968ef	0,108d
MEV combinado	17	21	0, 8	38	0, 016

^aos dados são médias 10 porcos alimentados individualmente durante um período de alimentação de 23 dias; o peso médio inicial foi de 8,4 kg.

^bos dados são médias de cinco porcos alimentados individualmente, escolhidos a partir de blocos de pesos medianos ao final do período de alimentação de 23 dias.

^cregressão linear das cinzas de tíbia (mg) para as Dietas 1 a 4 como uma função da ingestão suplementar de P (g) foi Y = 664, 5 ± 25,5 + 15,3 ± 1,4X (r² = 0,87); concentrações de P biodisponível (rendimentos de P equivalente) para as Dietas 5 a 7 foram determinados mediante o cálculo da ingestão de P biodisponível (g) a partir da curva padrão, dividindo este pela ingestão de alimento (g), e multiplicando por 100.

^d,e,f,g,h,imédias dentro de uma coluna com diferentes sobrescritos são diferentes, P<0,05.

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 102/117

EFEITO DA ITASE E.COLI NA PERFORMANCE DO CRESCIMENTO DE PORCOS FINALIZADOS (ENSAIO DE PORCOS 2)

Variável de resposta	Tratamento dietético
dieta basal deficiente em P	Como 1+0,10% Pi	Como 1+250 FTU/kg ECP	Como 1+500 FTU/kg ECP	Como 1+1.000 FTU/kg ECP	Como 1+10.000 FTU/kg ECP	MEV combinado
Ganho de peso, gb
Capões	935	1023	1023	929	993	974
Fêmeas de primeira cobertura	752	790	872	909	828	902
Média	844	907	947	919	910	938	38
Alimentação diária, gc
Capões	2837	2861	3028	2712	2873	2684
Fêmeas de primeira cobertura	2347	2197	2571	2507	2378	2562
Média	2592	2529	2800	2610	2625	2623	81
Ganho/alimentação, g/kgd
Capões	331	358	338	343	346	365
Fêmeas de primeira cobertura	320	363	341	363	349	352
Média	325	361	339	353	347	359	9

^aos dados são médias de cinco porcos alimentados individualmente de cada sexo alimentados com suas dietas experimentais de 48,9 a 117,6 kg por peso corpóreo.

^binteração sexo x dieta, P<0,01.

^ccapões vs fêmeas de primeira cobertura, P<0,01.

^ddietas deficientes em P vs dietas suplementadas com fitase, P<0,01.

Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 103/117

EFEITO DA ITASE E.COLI NAS CARACTERÍSTICAS ÓSSEAS DE PORCOS FINALIZADOS (ENSAIO DE PORCOS 2)^a

Variável de resposta	Tratamento dietético
dieta basal deficiente em P	Como 1+0,10% Pi	Como 1+250 FTU/kg ECP	Como 1+500 FTU/kg ECP	Como 1+1.000 FTU/kg ECP	Como 1+10.000 FTU/kg ECP	MEV combinado
Cinzas de perônio, gb
Capões	52,9	58,8	57, 8	58,9	58,5	58,5
Fêmeas de primeira cobertura	52,4	59,2	58,9	55, 8	58,3	58,8
Média	52,6	59,0	58,3	57,3	58,4	58,7	0,7
Cinzas de perônio, gbcdef
Capões	4,57	6,30	5,69	6,56	6,37	7, 04
Fêmeas de primeira cobertura	4,19	6, 06	5,90	5,99	6,24	6, 86
Média	4,38	6,18	5, 80	6,28	6,31	6,95	0,17
Cinzas metatarsal, %b
Capões	40,3	46,9	48,8	47,5	47,3	47,6
Fêmeas de primeira cobertura	43,1	48,5	48,3	45, 4	49, 0	49, 0	49, 0
Média	41, 7	47, 7	48,5	46,5	48,1	48,3	1,1
Cinzas metatarsal, gbd
Capões	5, 4	6,6	6, 8	7, 0	7,2	7, 4
Fêmeas de primeira cobertura	4,9	6,6	6,5	7, 0	6, 8	7,3
Média	5,1	6,6	6,6	7, 0	7, 0	7,3	0,2

^aos dados são médias de cinco porcos alimentados individualmente de cada sexo alimentados com suas dietas experimentais de 48,9 a 117,6 kg por peso corpóreo.

^bdietas deficientes em P vs dietas suplementadas com fitase, P<0,01.

^ccapões vs fêmeas de primeira cobertura, P<0,01.

^d250 U/kg vs níveis maiores de atividade fitase, P<0,01.

^e500 U/kg vs 1000 e 10000 U/kg fitase, P<0,10.

^f1000 U/kg vs 10.000, P<0,10.

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Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para aprimorar o valor nutricional de uma ração consumida por um animal monogástrico mediante o aumento da biodisponibilidade de fosfato proveniente de fitato, em que a ração compreende hexaquisfosfato de rnio-inositol, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a etapa de alimentar o animal com a ração em combinação com 50 a 1200 unidades de uma fitase recombinante expressa em levedura por quilograma da ração, em que a fitase é uma AppA derivada de Escherichia coli ou uma AppA2 derivada de Escherichia coli; e em que a biodisponibilidade de fosfato proveniente de fitato é aumentada em pelo menos duas vezes comparada à biodisponibilidade de fosfato proveniente de fitato obtida pela alimentação da ração em combinação com as mesmas unidades de uma fitase expressa em uma célula hospedeira de não-levedura.
2. 2. Método, de acordo com a reivindicação1,

   CARACTERIZADO pelo fato de que o animal é de espécie aviária.
3. 3. Método, de acordo com a reivindicação2,

   CARACTERIZADO pelo fato de que a espécie aviáriaé selecionada a partir do grupo que consiste em frango, peru, pato e faisão.
4. 4. Método, de acordo com a reivindicação1,

   CARACTERIZADO pelo fato de que o animal é uma espécie suína.
5. 5. Método, de acordo com a reivindicação1,

   CARACTERIZADO pelo fato de que o animal é uma espécie marinha ou uma espécie aquática de água doce.

   Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 105/117

   6 . Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o animal é um animal doméstico. 7 . Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o animal doméstico é de uma

   espécie canina.

   8 . Método, d e acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o animal doméstico é de uma espécie felina. 9 . Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o animal é um humano. 10. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a ração é alimento para suínos. 11. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a ração é alimento para aves domésticas. 12. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a levedura é selecionada a

   partir do grupo que consiste em espécies Saccharomyces, espécies Pichia, espécies Kluyveromyces, espécies Hansenula e espécies Candida.

   13. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a levedura é Saccharomyces cerevisiae.

   14. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a levedura é Pichia pastoris.

   Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 106/117

   15. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o animal é alimentado com a ração em combinação com 50 a 1000 unidades da fitase expressa em levedura por quilograma da ração.

   16. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o animal é alimentado com a ração em combinação com 50 a 700 unidades da fitase expressa em levedura por quilograma da ração.

   17. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o animal é alimentado com a ração em combinação com 50 a 500 unidades da fitase expressa em levedura por quilograma da ração.

   18. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o animal é alimentado com a ração em combinação com 50 a 200 unidades da fitase expressa em levedura por quilograma da ração.

   19. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a fitase possui uma atividade ótima em um pH inferior a 4.

   20. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a fitase expressa em levedura é clivada com uma protease para estimular a capacidade da fitase para aumentar a biodisponibilidade do fosfato proveniente de fitato comparada à fitase expressa em levedura intacta.

   21. Ração CARACTERIZADA pelo fato de que compreende fitato para alimentação de animais monogástricos e um aditivo de alimento compreendendo uma fitase recombinante expressa em

   Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 107/117 levedura selecionada a partir de uma AppA derivada de Escherichia coli ou uma AppA2 derivada de Escherichia coli, em que a ração combinada com o aditivo de alimento é uma mistura alimentícia final e em que a concentração da fitase na mistura alimentícia final é de 50 a 1200 unidades da fitase por quilograma da mistura alimentícia final.

   22. Ração, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADA pelo fato de que a mistura alimentícia final compreende de 50 a 1000 unidades da fitase expressa em levedura por quilograma da mistura alimentícia final.

   23. Ração, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADA pelo fato de que a mistura alimentícia final compreende de 50 a 700 unidades da fitase expressa em levedura por quilograma da mistura alimentícia final.

   24. Ração, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADA pelo fato de que a mistura alimentícia final compreende de 50 a 500 unidades da fitase expressa em levedura por quilograma da mistura alimentícia final.

   25. Ração, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADA pelo fato de que a mistura alimentícia final compreende de 50 a 200 unidades da fitase expressa em levedura por quilograma da mistura alimentícia final.

   26. Ração, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADA pelo fato de que a mistura alimentícia final adicionalmente compreende 0,1% ou menos de fosfato inorgânico acrescentado de modo exógeno.

   27. Ração, de acordo com a reivindicação 21,

   CARACTERIZADA pelo fato de que a ração apresenta valor

   Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 108/117 nutricional aumentado em comparação com o valor nutricional de uma ração contendo as mesmas unidades de uma fitase expressa em uma célula hospedeira de não-levedura.

   28. Método para aprimorar o valor nutricional de uma ração consumida por um animal monogástrico, em que a ração compreende hexaquisfosfato de rnio-inositol, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de:

   secar por aspersão uma fitase recombinante expressa em levedura selecionada a partir do grupo que consiste em uma AppA derivada de EscherÍchia coli, uma AppA2 derivada de Escherichia coli e uma fitase derivada de Escherichia coli que possui a SEQ ID NO:5;

   misturar a fitase com um veículo para a fitase e, opcionalmente, outros ingredientes para produzir uma composição aditiva de alimento para suplementar uma ração com a fitase;

   misturar a composição aditiva de alimento com a ração para obter uma mistura alimentícia final compreendendo de 50 a 1200 unidades da fitase por quilograma da mistura alimentícia final; e alimentar o animal com a mistura alimentícia final.

   Petição 870180056619, de 29/06/2018, pág. 109/117

   FIGURA 1

   Pfl

   1 1 taaggagcacaaaca ATG TGG TAT TTC CTT TGG TTC GTC GGC ATT TTG TTG ATG TGT TCG CTC 63 16 M W Y F L W F V G I L L M C S L 64 TCC ACC CTT GTG TTG GTA TGG CTG GAC CCG CGA TTG ΆΆΆ AGT TAAcgaacgtaagcctgatccgg 128 17 S T L V L V W L D P R L K S

   129 cgcattagcgtcgatcaggcaataatatcggatatcaaagcggaaacatatcg

   ATG AAA GCG ATC TTA ATC 201

   Μ K A I L I 6

   E2

   382 GGT TGG CTG ACA CCA CGC GGT GGT GAG CTA ATC GCC TAT CTC GGA CAT TAC CAA CGC CAG ' ”441 67 G W L T P R G G E L I A Y L G H Y Q R Q 86 442 CGT CTG GTG GCC GAC GGA TTG CTG GCG AAA AAG GGC TGC CCG CAG CCT GGT CAG GTC GCG 501 87 R L V A D G L L A K K G C P Q P G Q V A 106 502 ATT ATT GCT GAT GTC GAC GAG CGT ACC CGT AAA ACA GGC GAA GCC TTC GCC GCC GGG CTG 561 107 I I A D V D E R T R K T G E A F A A G L 126 562 GCA CCT GAC TGT GCA ATA ACC GTA CAT ACC CAG GCA GAT ACG TCC AGT CCC GAT CCG TTA 621 127 A P D C A I T V H T Q A D T S S P D P L 146 622 TTT AAT CCT CTA AAA ACT GGC GTT TGC CAA CTG GAT AAC GCG AAC GTG ACT GAC GCG ATC 681 147 F N P L K T G V C Q L D N A 0 V T D A I 166 682 CTC AGC AGG GCA GGA GGG TCA ATT GCT GAC TTT ACC GGG CAT CGG CAA ACG GCG TTT CGC 741 167 L S R A G G S I A D F T G H R Q T A F R 186 742 GAA CTG GAA CGG GTG CTT MT TTT TCC CAA TTA AAC TTG TGC CTT AAC CGT GAG ΑΛΑ CAG 801 187 E L E R V L N F S Q L N L C L N R E K Q 206 802 GAC GAA AGC TGT TCA TTA ACG CAG GCA TTA CCA TCG GAA CTC AAG GTG AGC GCC GAC AAT 861 207 D E S C S L T ' Q A L P S E L K V S A D 0 226 862 GTT TCA TTA ACC GGT GCG GTA AGC CTC GCA TCA ATG CTG ACG GAA ATA TTT CTC CTG CAA 921 227 V S L T G A V S L A S M L T E I F L L Q 246 922 CAA GCA CAG GGA ATG CCG GAG CCG GGG TGG GGA AGG ATC ACT GAT TCA CAC CAG TGG AAC 981 247 Q A Q G M P E P G W G R I T D s H Q W W 286 982 ACC TTG CTA AGT TTG CAT N\C GCG CAA TTT TAT TTA CTA CAA CGC ACG CCA GAG GTT GCC 1041 267 T L L S L H N A Q F Y L L Q R T P E V A 286 1042 CGC AGT CGC GCC ACC CCG TTA TTG GAT TTG ATC ATG GCA GCG TTG ACG CCC CAT CCA CCG 1101 287 R S R A T P L L D L I M A A L T P H P P 306 1102 CAA AAA CAG GCG TAT GGT GTG ACA TTA CCC ACT TCA GTG CTG TTT ATT GCC GGA CAC GAT 1161 307 Q K Q A Y G V T L P T S V L F I A G H D 326 1162 ACT AAT CTG GCA AAT CTC GGC GGC GCA CTG GAG CTC AAC TGG ACG CTT CCA GGT CAG CCG 1221 327 T N L A N L G G A L E L 0 W T L P G Q P 346 1222 GAT AAC ACG CCG CCA GGT GGT GAA CTG GTG TTT GAA CGC TGG CGT CGG CTA AGC GAT AAC 1281 347 D N T P P G G E L V F E R W R R L S D N 366 1282 AGC CAG TGG ATT CAG GTT TCG CTG GTC TTC CAG ACT TTA CAG CAG ATG CGT GAT AAA ACG 1341 367 S Q W I Q V S L V F Q T L Q Q M R D K T 386 1342 CCG CTA TCA TTA AAT ACG CCG CCC GGA GAG GTG AAA CTG ACC CTG GCA GGA TGT GAA GAG 1401 387 P L S L N T P P G E V K L T L A G C E E 406 1402 CGA AAT GCG CAG GGC ATG TGT TCG TTG GCC GGT TTT ACG CAA ATC GTG AAT GAA GCG CGC 1461 407 R N A Q G M C S L A G F T Q I V N E A R 426

   E2

   1462

   427

   ATA

   I

   CCG

   P

   GCG t8c AGT TTG TAA TGGTACCCC

   A C S L

   1491

   433

   FIGURA

   Met 1 Lys Ala Ile Leu 5 Ile Pro Phe Leu Ser 10 Leu Leu Ile Pro Leu 15 Thr Pro Gin Ser Ala Phe Ala Gin Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser 20 25 30 Vai Vai Ile Vai Ser Arg His Gly Vai Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr 35 40 45 Gin Leu Met Gin Asp Vai Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Vai 50 55 60 Λ Lys Leu Gly Trp Leu Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu 65 70 75 80 Gly His Tyr Gin Arg Gin Arg Leu Vai Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys 85 90 95 Lys Gly Cys Pro Gin Pro Gly Gin Vai Ala Ile Ile Ala Asp Vai Asp 100 105 110 - Glu Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro 115 120 125 Asp Cys Ala Ile Thr Vai His Thr Gin Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp 130 135 140 - Pro Leu Phe Asn Pro Leu Lys Thr Gly Vai Cys Gin Leu Asp Asn Ala 145 150 155 160 Asn Vai Thr Asp Ala 165 Ile Leu Ser Arg Ala 170 Gly Gly Ser Ile Ala 175 Asp Phe Thr Gly His Arg Gin Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Vai Leu 180 185 190 Asn Phe Pro Gin Ser Asn Leu Asn Leu Lys Arg Glu Lys Gin Asn Glu 195 200 205

   Ser Cys 210 Asn Leu Thr Gin Asp 225 Asn Vai Ser Leu Thr 230 Glu Ile Phe Leu Leu 245 Gin Gly Arg Ile Thr 260 Asp Ser f Asn Ala Gin 275 Phe Tyr Leu Arg Ala 290 Thr Pro Leu Leu Pro 305 Pro Gin Lys Gin Ala 310 Phe Ile Ala Gly His 325 Asp Glu Leu Asn Trp 340 Thr Leu - Gly Glu Leu 155 Vai Phe Glu Trp Ile 370 Gin Vai Ser Leu Lys 385 Thr Pro Leu Ser Leu 390 Leu Ala Gly Cys Glu 405 Glu Gly Phe Thr Gin 420 Ile Vai

   FIGURA 2B Ala Leu Pro Ser Gin Leu Lys Vai Ser Ala 215 220 Gly Ala Vai Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr 235 240 Gin Ala Gin Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp 250 255 His Gin Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His 2 65 270 Leu Gin Arg Thr Pro Glu Vai Ala Arg Ser 280 285 Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His 295 300 Tyr Gly Vai Thr Leu Pro Thr Ser Vai Leu 315 320 Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu 330 335 Pro Gly Gin Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly 345 350 Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gin 360 365 Vai Phe Gin Thr Leu Gin Gin Met Arg Asp 375 380 Asn Thr Pro Pro Gly Glu Vai Lys Leu Thr 395 400 Arg Asn Ala Gin Gly Met Cys Ser Leu Ala 410 415 Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu 425 430

   FIGURA 2C

   1 taa gga gea gaa aça ATG TGG TAT TTA CTT TGG TTC GTC GGC ATT 46 TTG TTG ATG TGT TCG CTC TCC ACC CTT GTG TTG GTA TGG CTG GAC 91 CCG CGA TTG AAA AGT T aac gaa cgt agg cct gat gcg gcg cat 134 tag cat cgc ate agg caa tea ata atg tea gat atg aaa age gga 179 aac ata tcg ATG AAA GCG ATC TTA ATC CCA TTT TTA TCT CTT CTG 224 ATT CCG TTA ACC CCG CAA TCT GCA TTC GCT CAG AGT GAG CCG GAG < 259 CTG AAG CTG GAA AGT GTG GTG ATT GTC AGC CGT CAT GGT GTG CGT 314 GCC CCA ACC AAG GCC ACG CAA CTG ATG CAG GAT GTC ACC CCA GAC 359 GCA TGG CCA ACC TGG CCG GTA AAA CTG GGT TGG CTG ACA CCA CGC 404 GGT GGT GAG CTA ATC GCC TAT CTC GGA CAT TAC CAA CGC CAG CGT 449 CTG GTG GCC GAC GGA TTG CTG GCG AAA AAG GGC TGC CCG CAG CCT 494 GGT CAG GTC GCG ATT ATT GTC GAT GTC GAC GAG CGT ACC CGT AAA ^r 539 ACA GGC GAA GCC TTC GCC GCC GGG CTG GCA CCT GAC TGT GCA ATA 584 ACC GTA CAT ACC CAG GCA GAT ACG TCC AGT CCC GAT CCG TTA TTT 629 ATT CCT CTA AAA ACT GGC GTT TGC CAA CTG GAT AAC GCG AAC GTG W 67 4 ACT GAC GCG ATC CTC AGC AGG GCA GGA GGG TCA ATT GCT GAC TTT 719 ACC GGG CAT CGG CAA ACG GCG TTT CGC GAA CTG GAA CGG GTG CTT 764 AAT TTT CCG CAA TCA AAC TTG AAC CTT AAA CGT GAG AAA CAG AAT 809 GAA AGC TGT AAC TTA ACG CAG GCA TTA CCA TCG GAA CTC AAG GTG 854 AGC GCC GAC AAT GTT TCA TTA ACC GGT GCG GTA AGC CTC GCA TCA 899 ATG CTG ACG GAA ATA TTT CTC CTG CAA CAA GCA CAG GGA ATG CCG 944 GAG CCG GGG TGG GGA AGG ATC ACT GAT TCA CAC CAG TGG AAC ACC 989 TTG CTA AGT TTG CAT AAC GCG CAA TTT TAT TTA CTA CAA CGC ACG

   FIGURA 2D

   1034 CCA GAG GTT GCC CGC AGT CGC GCC ACC CCG TTA TTG GAT TTG ATC 1079 AAG ACA GCG TTG ACG CCC CAT CCA CCG CAA AAA CAG GCG TAT GGT 1124 GTG ACA TTA CCC ACT TCA GTG CTG TTT ATT GCC GGA CAC GAT ACT 1169 AAT CTG GCA AAT CTC GGC GGC GCA CTG GAG CTC AAC TGG ACG CTT 1214 CCA GGT CAG CCG GAT AAC ACG CCG CCA GGT GGT GAA CTG GTG TTT 1259 GAA CGC TGG CGT CGG CTA AGC GAT AAC AGC CAG TGG ATT CAG GTT 1304 TCG CTG GTC TTC CAG ACT TTA CAG CAG ATG CGT GAT AAA ACG CCG 1349 CTA TCA TTA AAT ACG CCG CCC GGA GAG GTG AAA CTG ACC CTG GCA 1394 GGA TGT GAA GAG CGA AAT GCG CAG GGC ATG TGT TCG TTG GCC GGT 1439 TTT ACG CAA ATC GTG AAT GAA GCG CGC ATA CCG GCG TGC AGT TTG

   1484 ΤΑΑ dp (Μ

   Ο •Η η

   0,16

   Natuphos Mutante υ ΑρρΑ

   ΑρρΑ2