CN107072182B - 用脱脂微藻动物饲料对家禽产品的ω-3脂肪酸富集 - Google Patents

用脱脂微藻动物饲料对家禽产品的ω-3脂肪酸富集 Download PDF

Info

Publication number
CN107072182B
CN107072182B CN201580048692.XA CN201580048692A CN107072182B CN 107072182 B CN107072182 B CN 107072182B CN 201580048692 A CN201580048692 A CN 201580048692A CN 107072182 B CN107072182 B CN 107072182B
Authority
CN
China
Prior art keywords
poultry
microalgae
defatted
3fatty
acids
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201580048692.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN107072182A (zh
Inventor
X·雷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cornell University
Original Assignee
Cornell University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cornell University filed Critical Cornell University
Publication of CN107072182A publication Critical patent/CN107072182A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107072182B publication Critical patent/CN107072182B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/02—Algae
    • A61K36/05—Chlorophycota or chlorophyta (green algae), e.g. Chlorella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/70—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds
    • A23K50/75—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds for poultry
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L15/00—Egg products; Preparation or treatment thereof
    • A23L15/20—Addition of proteins, e.g. hydrolysates, fats, carbohydrates, natural plant hydrocolloids; Addition of animal or vegetable substances containing proteins, fats, or carbohydrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/115—Fatty acids or derivatives thereof; Fats or oils
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/30—Dietetic or nutritional methods, e.g. for losing weight
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/56—Materials from animals other than mammals
    • A61K35/57—Birds; Materials from birds, e.g. eggs, feathers, egg white, egg yolk or endothelium corneum gigeriae galli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/02—Algae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/55—Linaceae (Flax family), e.g. Linum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Abstract

本发明涉及使用补充有脱脂微藻的动物饲料对家禽产品的ω‑3脂肪酸富集和n‑6与n‑3脂肪酸比率改善，以及涉及此类家禽产品的治疗方法。本发明的一个方面涉及生产具有升高量的n‑3脂肪酸的家禽蛋的方法。此方法包括在使家禽有效生产包含约300mg至约550mg的n‑3脂肪酸的蛋的条件下给所述家禽饲喂一定量的脱脂微藻。

Description

用脱脂微藻动物饲料对家禽产品的ω-3脂肪酸富集
本申请要求于2014年7月17日提交的美国临时专利申请序列号 62/025,779的权益，其全部内容通过引用的方式在此并入。
发明领域
本发明涉及使用补充有脱脂微藻的动物饲料对家禽产品的ω-3 脂肪酸富集。
发明背景
已经将亚麻籽，亚麻籽油和芥花(canola)掺入产蛋鸡饮食中以生产ω-3(本文中也称为n-3)脂肪酸强化蛋。与其它油料种子相比，这些成分含有大量的α-亚麻酸(C18：3n3，“ALA”)。去饱和和延长可以将ALA转化为二十碳五烯酸(C20：5n3，“EPA”)或二十二碳六烯酸(C22：6n3，“DHA”)。由于这种转化在体内的低效率，用ALA补充用于产蛋鸡的饮食很少生产含有超过80mg DHA的蛋(Carrillo等人，“Potential Use of Seaweeds in the LayingHen Ration to Improve the Quality of n-3Fatty Acid Enriched Eggs，”于Nineteenth International Seaweed Symposium，Borowitzka，M.；Critchley，A.；Kraan，S.；Peters， A.；
Figure BDA0001242620920000011
K.；Notoya，M.编Springer Netherlands：2：271-278(2009)； VanElswyk，“Comparison of n-3Fatty Acid Sources in Laying Hen Rations forImprovement of Whole Egg Nutritional Quality：A Review，” British Journal ofNutrition 78：S61-S69(1997))。此外，由于亚麻籽的抗营养因子和高含量的多不饱和脂肪酸(“PUFA”)，以水平＞10％将其包含在饮食中降低了蛋生产(Leeson等人，“Response ofLayers to Dietary Flaxseed According to Body Weight Classification atMaturitym，”The Journal of Applied Poultry Research9：297-302 (2000))。高DHA和EPA的鱼粉或油的饮食补充有效使蛋富集这些不饱和脂肪酸，但是已经证明非常难以在没有适口性问题的情况下生产每个蛋超过100mg DHA的蛋(Leskanich等人，“Manipulationof the n-3 Polyunsaturated Fatty Acid Composition of Avian Eggs and Meat，”World’s Poultry Science Journal 53：155-183(1997))。单独使用亚麻籽粉或油生产n-3脂肪酸强化蛋对蛋生产，DHA和EPA含量，母鸡寿命和蛋的感官知觉均有限制。同样地，在产蛋鸡饮食中使用富含ω-3 脂肪酸的成分，如亚麻籽油，亚麻籽粉，鱼油和鱼粉导致异味或脱色蛋的形成。在产蛋鸡的饮食中使用新的饲料成分以强化n-3脂肪酸必须针对对蛋的感觉属性的潜在挑战进行权衡。如果所得产品不能被消费者接受，则没有提高蛋的营养价值的优点。
n-3脂肪酸的另外的替代来源是海洋微藻。微藻含有优于传统的动物饲料蛋白质来源的脂肪酸谱(fatty acid profile)，并且倾向于含有更大的EPA和DHA丰度(Fredriksson等人，“Fatty Acid and Carotenoid Composition of Egg Yolk as anEffect of Microalgae Addition to Feed Formula for Laying Hens，”Food Chemistry99：530-537(2006)； Kalogeropoulos等人，“Nutritional Evaluation and BioactiveMicroconstituents(Carotenoids，Tocopherols，Sterols and Squalene)of Raw andRoasted Chicken Fed on DHA-Rich Microalgae，”Food Res.Int. 43：2006-2013(2010)；Guschina等人，“Lipids and Lipid Metabolism in Eukaryotic Algae，”Prog.LipidRes.45：160-186(2006))。微藻还含有中等至大量的粗蛋白(Becker，“Micro-Algae as aSource of Protein，” Biotechnol.Adv.25：207-210(2007))、必需氨基酸(Gatrell等人，“Nonruminant Nutrition Symposium；Potential of Defatted Microalgae from theBiofuel Industry as an Ingredient to Replace Corn and Soybean Meal in Swineand Poultry Diets，”J.Anim.Sci.92：1306-1314(2014))和类胡萝卜素(Spolaore等人，“Commercial Applicatiohs of Microalgae，” J.Biosci.Bioeng.101：87-96(2006))，并且对家禽饮食的补充改善了蛋黄中的总体n-3脂肪酸状态(Fredriksson等人，“Fatty Acidand Carotenoid Composition of Egg Yolk as an Effect of Microalgae Addition toFeed Formula for Laying Hens，”Food Chemistry 99：530-537(2006)) 和胸部肌肉(Mooney等人，“Lipid and Flavour Quality of Stored Breast Meat from BroilersFed Marine Algae，”J.Sci.Food Agric.78：134-140 (1998))。
在不同种之间，藻含有非常不同量的粗蛋白(6-71％)，但与其它参考蛋白相比显示有利的氨基酸谱(amino acid profile)(Becker，“Micro-algae as a Source ofProtein，”Biotechnology Advances 25：207-210(2007)；Becker，“18Microalgae inHuman and Animal Nutrition，”Handbook of Microalgal Culture：Biotechnology andApplied Phycology 312(2004))。微藻长期以来被珍视为食品和饲料补充剂，或作为常规蛋白质来源的替代品。在1957年，Grau等人，“Sewage-grown Algae as a Feedstuff forChicks，”Poultry Science 36：1046-1051(1957)在雏鸡饮食中使用20％的污水生长的小球藻 (Chlorella)和栅藻属种(Scenedesmus sp.)，并且报告了与饲喂玉米 -大豆粉饮食的鸡相比，生长性能没有差异。以不同浓度将钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)掺入肉鸡饮食中，并且与饲喂玉米-大豆饲料的雏鸡相比显示对饲料效率没有影响，但是将超过10％的藻包含在饮食中降低了雏鸡的平均每日重量增加(Ross等人，“The Nutritional Valueof Dehydrated，Blue-green Algae(Spirulina plantensis)for Poultry，”PoultryScience 69：794-800(1990))。
与未补充对照饮食相比，在肉鸡饮食中的4或8％的螺旋藻属种不引起体重、肝脏、腹部脂肪和肾脏的差异(Toyomizu等人，“Effects of Dietary Spirulina on MeatColour in Muscle of Broiler Chickens，” British Poultry Science 42：197-202(2001))。含有12％极大螺旋藻 (Sprulnia maxima)的母猪饮食不引起在断奶猪的生长性能和仔猪的生长和窝特性方面的差异(Fevrier等人，于Incorporation of a Spirulnie(Spirulina maxima)in Swine Food，Annales de la nutrition et de l’alimentation，”第625页(1975))。在断奶猪饮食中用脱脂的十字脆杆藻亚属种(Staurospira Sp.)代替7.5％的玉米和大豆粉不影响生长性能和血浆生化健康指标；然而，由于不能耐受高的粗蛋白质含量，15％的替代导致体重下降(Isaacs等人，“A PartialReplacement of Soybean Meal by Whole or Defatted Algal Meal in Diet forWeanling Pigs Does Not Affect Their Plasma Biochemical Indicators，”J.Anim.Sci.89：723 (2011)；Lum等人，“Effects of Various Replacements of Corn andSoy by Defatted Microalgal Meal on Growth Performance and Biochemical Statusof Weanling Pigs，”J.Anim.Sci.90：701(2012))。
具有额外的合适氨基酸的脱脂硅藻十字脆杆藻亚属种的饮食补充可代替肉鸡饮食中的7.5％的大豆粉(Austic等人，“Potential and Limitation of a New DefattedDiatom Microalgal Biomass in Replacing Soybean Meal and Corn in Diets forBroiler Chickens，”Journal of Agricultural and Food Chemistry 61：7341-7348(2013))。此外，使用饮食蛋白酶的情况下，脱脂硅藻的增加的包含可以增加至15％，而不影响断奶猪和肉雏鸡的生长性能(Ekmay等人，“Nutritional and Metabolic Impacts of aDefatted Green Marine Microalgal (Desmodesmus sp.)Biomass in Diets forWeanling Pigs and Broiler Chickens，”Journal of Agricultural and FoodChemistry 62：9783-9791 (2014))。
对于脱脂微藻，培养后，微藻经脱水，细胞破坏，粒度降低，并干燥以提取脂质(Doe，“National Algal Biofuels Technology Roadmap，” U.S.Dept.Energy，Office ofEnergy Efficiency and Renewable Energy， Biomass Program(2010))。这种脂质提取后，微藻残留物含有比以前更高百分比的蛋白质。此外，Li等人，“A Comparative Study：The Impact of Different Lipid Extraction Methods on Current Microalgal LipidResearch，”Microbial Cell Factories 13：14(2014)，检查了不同的脂肪酸提取方法，并揭示了饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的不同提取率。这表明根据提取方法，脱脂微藻的脂肪酸谱可不同于非脱脂的微藻。
微藻是生物圈中长链PUFA的主要产生者(Behrens等人，“Microalgae as aSource of Fatty Acids，”Journal of Food Lipids 3：259-272(1996))。鱼产品是n-3脂肪酸的主要来源(Papadopoulos 等人，“Effects of Dietary Supplements of Algae，Containing Polyunsaturated Fatty Acids，on Milk Yield and the Composition ofMilk Products in Dairy Ewes，”Journal of Dairy Research 69：357-365 (2002))；然而，鱼不能合成n-3脂肪酸，因此它们通过消耗微藻或其它消耗藻的鱼获得这些n-3脂肪酸(Stamey等人，“Use of Algae or Algal Oil Rich in n-3Fatty Acids as a FeedSupplement for Dairy Cattle，” Journal of Dairy Science 95：5269-5275(2012))。
PUFA，特别是n-3脂肪酸对人健康具有有益效果(Daviglus等人，“FishConsumption and the 30-year Risk of Fatal Myocardial Infarction，” New EnglandJournal of Medicnie 336：1046-1053(1997)；Albert等人，“Fish Consumption and Riskof Sudden Cardiac Death，”JAMA 279：23-28(1998))，并且用n-3脂肪酸强化的蛋是给人补充n-3脂肪酸的天然的、健康的、廉价的和有效的方式(Oliveira等人，“Effects ofLipid Sources in the Diet of Laying Hens on the Fatty Acid Profiles of EggYolks，”Poultry Science 89：2484-2490(2010)；Grobas等人，“Influence of Source andPercentage of Fat Added to Diet on Performance and Fatty Acid Composition ofEgg Yolks of Two Strains of Laying Hens，”Poultry Science 80：1171-1179(2001))。
在n-3脂肪酸(ALA、EPA和DHA)中，EPA和DHA比ALA 具有更多的生物效应。此外，ALA在鸡和人中都不能有效地转化为 EPA和DHA(Carrillo等人，“Potential Use of Seaweedsin the Laying Hen Ration to Improve the Quality of n-3Fatty Acid EnrichedEggs，”于 Nineteenth International Seaweed Symposium，Borowitzka，M.；Critchley，A.；Kraan，S.；Peters，A.；
Figure BDA0001242620920000051
K.；Notoya，M.，Eds.Springer Netherlands：2：271-278(2009)；Wang等人，“n-3Fatty Acids From Fish or Fish-Oil Supplements，but notα-Linolenic Acid，Benefit Cardiovascular Disease Outcomes in Primary-andSecondary-Prevention Studies：A Systematic Review，”The American Journal ofClinical Nutrition 84：5-17(2006))。
除了高蛋白和PUFA含量，微藻还含有其它生物活性营养物、维生素、矿物质、抗氧化剂和类胡萝卜素(Austic等人，“Potential and Limitation of a New DefattedDiatom Microalgal Biomass in Replacing Soybean Meal and Com in Diets forBroiler Chickens，”Journal of Agricultural and Food Chemistry 61：7341-7348(2013))。Combs，“Algae (Chlorella)as a Source of Nutrients for the Chick，”Science 116：453-454 (1952))报道了向核黄素、维生素B和维生素A缺乏的饮食中补充10％的小球藻提高了饲料效率和雏鸡的生长性能。此外，微藻补充增加了来自产蛋鸡的蛋的类胡萝卜素含量(
Figure BDA0001242620920000061
等人，“Retention of Carotenoids in Egg Yolks ofLaying Hens Supplemented with Heterotrophic Chlorella，”Czech J.Ahim.Sci 58：193-200(2013)；Guedes 等人，“Microalgae as Sources of Carotenoids，”Marine Drugs9：625-644 (2011)；Fredriksson等人，“Fatty Acid and Carotenoid Composition ofEgg Yolk as an Effect of Microalgae Addition to Feed Formula for LayingHens，”Food Chemistry 99：530-537(2006))。微藻的营养特性为新型饮食配方提供了增加EPA和DHA浓度的潜力。
已调查将各种类型的脱脂硅藻和绿微藻生物质掺入肉鸡(Austic 等人，“Potential and Limitation of a New Defatted Diatom Microalgal Biomass inReplacing Soybean Meal and Corn in Diets for Broiler Chickens，”J.Agric.FoodChem.61(30)：7341-7348(2013)；Ekmay等人，“Nutritional and Metabolic Impacts of aDefatted Green Marine Microalgal(Desmodesmus sp.)Biomass in Diets forWeanling Pigs and Broiler Chickens，”J.Agric.Food Chem.62(40)：9783-9791(2014))和产蛋鸡(Leng等人，“Effect of Dietary Defatted Diatom Biomass on EggProduction and Quality of Laying Hens，”Journal of Animal Science andBiotechnology 5(1)：3(2014))饮食中的可行性。这些数据得出结论，中等水平(约7.5％)的补充不对生长或生产性能产生负面影响。
生物燃料研究工业不断发展以产生优异的生物燃料产物和优化的残余副产物。目前，绿微藻由于其生物燃料生产的前景和它们的脱脂生物质的优良营养物含量而被使用。因此，如果家禽可以耐受更高水平的营养优越的生物质，则问题出现。微藻生物质含有相对高浓度的中性洗涤剂纤维(“NDF”)和酸性洗涤剂纤维(“ADF”)(Gatrell 等人，“Nonruminant Nutrition Symposium：Potential of Defatted Microalgae from theBiofuel Industry as an Ingredient to Replace Com and Soybean Meal in Swineand Poultry Diets，”J.Anim.Sci. 92(4)：1306-1314.(2014))。仍然不清楚外源性非淀粉多糖降解酶(NSP 酶)是否改善含有生物质的饮食的营养价值(Ekmay等人，“Nutritionaland Metabolic Impacts of a Defatted Green Marine Microalgal (Desmodesmus sp.)Biomass in Diets for Weanling Pigs and Broiler Chickens，”J.Agric.Food Chem.62(40)：9783-9791(2014))。更重要的是，目前的生物质含有相对高水平的钠、磷和灰分(Gatrell等人，“Nonruminant Nutrition Symposium：Potential of DefattedMicroalgae from the Biofuel Industry as an Ingredient to Replace Corn andSoybean Meal in Swine and Poultry Diets，”J.Anim.Sci.92(4)：1306-1314 (2014))。作为单细胞蛋白补充剂，脱脂微藻生物质也含有高水平的核酸(Becker，“Microalgae inHuman and Animal Nutrition，”于：Handbook of Microalgal Culture：Biotechnologyand Applicd Phycology，Richmond， A.编Blackwell Science Ltd，Oxford，第312页(2004))。然而，这些营养物的代谢命运或排泄水平的指标尚未评估。特别地，饲喂生物质对家禽磷排泄和水摄入的潜在影响可能是主要的环境问题(Bourgeois，“A DiscountedThreat：Environmental Impacts of the Livestock Industry，” Earth CommonJournal2(1)(2012))。
消耗长链ω-3PUFA高的饮食已与心血管疾病、糖尿病、关节炎和癌症的流行率降低有关(Daviglus等人，“Fish Consumption and the 30-Year Risk of FatalMyocardial Infarction，”N.Engl.J.Med. 336：1046-1053(1997)；Albert等人，“FishConsumption and Risk of Sudden Cardiac Death，”JAMA 279：23-28(1998)；Ruggiero等人，“Omega-3Polyunsaturated Fatty Acids and Immune-Mediated Diseases：Inflammatory Bowel Disease and Rheumatoid Arthritis，”Curr.Pharm. Des.15：4135-4148(2009)；Sala-Vila等人，“Update on the Relationship of Fish Intake withProstate，Breast，and Colorectal Cancers，”Crit.Rev. Food Sci.Nutr.51：855-871(2011)；Delgado-Lista等人，“Long Chain Omega-3Fatty Acids and CardiovascularDisease：A Systematic Review，” Br.J.Nutr.107(2)：S201-13(2012))。然而，现代饮食习惯倾向于高饱和脂肪，并且包含“促炎”ω-6(本文也称为n-6)和“抗炎”n-3PUFA的不平衡比率。在典型的西方饮食中，平均n-6∶n-3比率范围为20-30∶1，与1-2∶1的传统范围形成对比(Simopoulos，“Essential Fatty Acids in Health and Chronic Disease，”Am.J.Clin.Nutr.70：560s-569s(1999))。增加公众对营养和n-3脂肪酸的健康益处的兴趣导致了研究人员试图改变通常消耗的动物产品的脂肪酸谱。由于美国人每年平均消耗大约40kg的肉鸡(USDA Economic Research Service Poultry Yearbook， Young chicken：PerCapita Consumption，Retail Weight Basis(2006))，所以家禽肉是n-3富集的有希望的候选者。
几十年来，已经很清楚的是鸡胸部、大腿和皮肤的脂肪酸谱与饮食中发现的脂肪酸相当(Marion等人，“The FattyAcid Composition of Breast，Thigh，and Skin Tissuesof Chicken Broilers as Influenced by Dietary Fats，”Poult.Sci.42：1202-1207(1963))。以前，通过饮食操作将n-3脂肪酸掺入家禽肉中已经集中于海洋来源，主要是鱼油和鱼粉 (Edwards等人，“Studies with Menhaden Oil in Practical-Type BroilerRatiohs，”Poult.Sci.44：685-689(1965)；Hulan等人，“Omega-3Fatty Acid Levels andPerformance of Broiler Chickens Fed Redfish Meal or Redfish Oil，”Can.J.Anim.Sci.68：533-547(1988)；Lopez-Ferrer等人，“n-3 Enrichment of ChickenMeat.1.Use of Very Long-Chain Fatty Acids in Chicken Diets and TheirInfluence on Meat Quality：Fish Oil，” Poult.Sci.80：741-752(2001))。然而，由于对鱼粉的需求而引起的最近成本增加导致了对于更可持续产业的替代富n-3脂肪酸来源的研究。
充分证明，消耗高PUFA的饮食最终使细胞膜富集脂肪酸，随后改变参与碳水化合物和脂质代谢的信号传导分子(Clarke等人，“Dietary Polyunsaturated Fatty AcidRegulation of Gene Transcription，” Annu.Rev.Nutr.14：83-98(1994))。已知参与从头脂肪酸合成的酶如苹果酸酶(ME)和脂肪酸合酶(FASN)受到饮食操作和进食状态的影响(Clarke等人，“Nutritional Control of Rat Liver Fatty Acid Synthase and S14mRNAAbundance，”J.Nutr.120：218-224(1990)；Blake等人，“Suppression of Rat HepaticFatty Acid Synthase and S14Gene Transcription by Dietary PolyunsaturatedFat，”J.Nutr.120：1727-1729 (1990)；Katsurada等人，“Influence of Diet on theTranscriptional and Post-Transcriptional Regulation of Malic Enzyme Inductionin the Rat Liver，”European Journal of Biochemistry168：487-491(1987)；Goodridge，“Dietary Regulation of Gene Expression：Enzymes Involved inCarbohydrate and Lipid Metabolism，”Annu.Rev.Nutr.7：157-185 (1987))。此外，向脂肪酸中引入双键的去饱和酶(包括Δ-6和Δ-9 去饱和酶)也受营养状态的影响(Nakamura等人，“Structure，Function， and Dietary Regulation ofΔ6，Δ5，andΔ9Desaturases，”Nutrition24 (2004)；Dridi等人，“The Regulation of Stearoy1-CoADesaturase Gene Expression is Tissue Specific in Chickens，”J.Endocrinol.192：229-236 (2007))。然而，脱脂微藻生物质，特别是对脂肪酸代谢基因的表达的影响是未知的。
本发明针对克服本领域中的这些和其它缺陷。
发明内容
本发明的一个方面涉及生产具有升高量的n-3脂肪酸的家禽蛋的方法。该方法包括在使家禽有效生产包含约300至约550mg的n-3 脂肪酸的蛋的条件下给家禽饲喂一定量的脱脂微藻。
本发明的另一方面涉及通过本发明的上述方法生产的蛋。
本发明的又一方面涉及治疗方法。该方法包括给受试者饲喂本发明的蛋以在有效治疗受试者的条件下增加受试者中n-3脂肪酸的量。
本发明的另一方面涉及防止饲喂亚麻籽或亚麻籽油的饮食补充剂的家禽的重量减轻的方法。该方法包括鉴定饲喂亚麻籽或亚麻籽油的饮食补充剂的家禽，并且在有效防止家禽由于亚麻籽或亚麻籽油而导致重量减轻的条件下，向家禽饲喂一定量的脱脂微藻。
本发明的又一方面涉及生产具有升高量的n-3脂肪酸的家禽肉的方法。该方法包括与不饲喂脱脂微藻的家禽的肉制品相比，在使所述家禽的肉制品有效富集n-3脂肪酸的条件下给家禽饲喂一定量的脱脂微藻。
本发明的另一方面涉及通过本发明的上述方法生产的家禽肉。
本发明的另一方面涉及治疗方法。该方法包括给受试者饲喂本发明的家禽肉以在有效治疗受试者的条件下增加受试者中n-3脂肪酸的量。
在本发明中，将亚麻籽油和微藻组合成产蛋鸡饮食以生产n-3脂肪酸强化蛋。在下文实施例中阐述的实验检查了纳入0、7.5和10％的脱脂微藻(藻A)与0、3和5％的亚麻籽油对饲料摄入、体重、产蛋性状和蛋脂肪酸组成的影响。此外，向产蛋鸡饮食中对不同种的脱脂微藻(藻A、藻B和藻C)补充有3.0％亚麻籽油，以确定对饲料摄入、体重、产蛋性状和蛋脂肪酸组成的协同效应。
此外，进行两个肉鸡实验以确定在具有或不具有NSP酶的饮食中新获得的脱脂绿微藻生物质对肉鸡生长性能、水摄入、骨特性和可溶性无机磷和DNA保留和排泄的影响。
附图简述
图1A-图1 B是阐明饮食微藻生物质和NSP酶纳入对水摄入和相对器官重量的影响的图。数据表示为平均值±SEM(n＝5/处理)。每组中具有不同字母的值根据单因素ANOVA显著不同(P＜0.05)。DGA＝脱脂绿微藻生物质(海洋微拟球藻(Nannochloropsis oceanica)，Cellana， Kailua-Kona，HI)。DGA-E＝脱脂绿微藻生物质加NSP酶。NSP酶是 Ronozyme WX：Ronozyme A：Roxazyme G2的1∶4∶5比率，(DSM Nutritional Products Inc.，Parsippany，NJ)。
图2A-图2 F是显示增加水平的饮食微藻生物质对肉仔雏鸡中第3周和第6周相对器官重量的影响的图。数据表示为平均值±SEM(n＝6/ 处理)。每组中具有不同字母的值根据单因素ANOVA显著不同 (P＜0.05)。线性和二次回归分析也被认为P＜0.05是显著的。DGA＝脱脂绿微藻生物质(海洋微拟球藻，Cellana，Kailua-Kona，HI)。
图3A-图3 D是显示增加水平的饮食微藻生物质对肉鸡胸部的第6周 n-3脂肪酸谱的影响的图。图3A＝n-3，图3B＝n-3：n-6，图3C＝EPA；图3D＝DHA。数据表示为平均值±SEM(n＝6/处理)。每组中具有不同字母的值根据单因素ANOVA显著不同(P＜0.05)。线性回归分析也被认为在P＜0.05是显著的。DGA＝脱脂绿微藻生物质(海洋微拟球藻，Cellana，Kailua-Kona，HI)。
图4A-图4 D是显示增加水平的饮食微藻生物质对肉鸡大腿的第6周 n-3脂肪酸谱的影响的图。图4A＝n-3，图4B＝n-3：n-6，图4C＝EPA，图4D＝DHA。数据表示为平均值±SEM(n＝6/处理)。每组中具有不同上标的值根据单因素ANOVA显著不同(P＜0.05)。线性回归分析也被认为在P＜0.05是显著的。DGA＝脱脂绿微藻生物质(海洋微拟球藻，Cellana，Kailua-Kona，HI)。
图5A-图5 B是显示补充的脱脂微藻对母鸡的体重或饲料摄入没有影响的图。每组中具有不同字母的值根据单因素ANOVA显著不同 (P＜0.05)。
图6A-图6 E显示补充的脱脂微藻产生蛋黄红色(图6A)的剂量依赖性线性增加和蛋黄明亮和蛋黄黄色的线性减少(图6B)。图6C-图6 E是显示补充的脱脂微藻对不同组织中的各种基因的表达产生剂量依赖性影响的图。
图7是显示来自接受生物强化蛋的蛋黄(EG)、正常蛋的蛋黄 (CG)、富含ω-3脂肪酸的鸡胸部肌肉(EG)或正常鸡胸部肌肉(CG) 的饮食的野生型(WT)和肥胖(OE)小鼠的血浆中甘油三酯水平的图。
图8是显示来自接受生物强化蛋的蛋黄(EG)、正常蛋的蛋黄 (CG)、富含ω-3脂肪酸的鸡胸部肌肉(EG)或正常鸡胸部肌肉(CG) 的饮食的野生型(WT)和肥胖(OE)小鼠的血浆中总胆固醇水平的图。
图9是显示来自接受生物强化蛋的蛋黄(EG)、正常蛋的蛋黄 (CG)、富含ω-3脂肪酸的鸡胸部肌肉(EG)或正常鸡胸部肌肉(CG) 的饮食的野生型(WT)和肥胖(OE)小鼠的血浆中的NEFA的图。
图10是显示来自接受生物强化蛋的蛋黄(EG)、正常蛋的蛋黄 (CG)、富含ω-3脂肪酸的鸡胸部肌肉(EG)或正常鸡胸部肌肉(CG) 的饮食的野生型(WT)和肥胖(OE)小鼠的血浆中的葡萄糖水平的图。
图11是显示接受生物强化蛋的蛋黄(EG)、正常蛋的蛋黄(CG)，富含ω-3脂肪酸的鸡胸部肌肉(EG)或正常鸡胸部肌肉(CG)的饮食的野生型(WT)和肥胖(OE)小鼠的肝脏中的甘油三酯水平的图。
图12是显示来自接受生物强化蛋的蛋黄(EG)、正常蛋的蛋黄 (CG)，富含ω-3脂肪酸的鸡胸部肌肉(EG)或正常鸡胸部肌肉(CG) 的饮食的野生型(WT)和肥胖(OE)小鼠的肌肉的甘油三酯水平的图。
图13是显示来自接受生物强化蛋的蛋黄(EG)、正常蛋的蛋黄 (CG)、富含ω-3脂肪酸的鸡胸部肌肉(EG)或正常鸡胸部肌肉(CG) 的饮食的野生型(WT)和肥胖(OE)小鼠的肾脏的甘油三酯水平的图。
图14是显示来自接受生物强化蛋的蛋黄(EG)、正常蛋的蛋黄 (CG)、富含ω-3脂肪酸的鸡胸部肌肉(EG)或正常鸡胸部肌肉(CG) 的饮食的野生型(WT)和肥胖(OE)小鼠的脂肪组织的甘油三酯水平的图。
图15是显示来自接受生物强化蛋的蛋黄(EG)、正常蛋的蛋黄 (CG)、富含ω-3脂肪酸的鸡胸部肌肉(EG)或正常鸡胸部肌肉(CG) 的饮食的野生型(WT)和肥胖(OE)小鼠的肝脏的总胆固醇水平的图。
图16是显示来自接受生物强化蛋的蛋黄(EG)、正常蛋的蛋黄 (CG)、富含ω-3脂肪酸的鸡胸部肌肉(EG)或正常鸡胸部肌肉(CG) 的饮食的野生型(WT)和肥胖(OE)小鼠的肌肉的总胆固醇水平的图。
图17是显示来自接受生物强化蛋的蛋黄(EG)、正常蛋的蛋黄 (CG)、富含ω-3脂肪酸的鸡胸部肌肉(EG)或正常鸡胸部肌肉(CG) 的饮食的野生型(WT)和肥胖(OE)小鼠的肾脏的总胆固醇水平的图。
图18是显示来自接受生物强化蛋的蛋黄(EG)、正常蛋的蛋黄 (CG)、富含ω-3脂肪酸的鸡胸部肌肉(EG)或正常鸡胸部肌肉(CG) 的饮食的野生型(WT)和肥胖(OE)小鼠的脂肪组织的总胆固醇水平的图。
图19是显示来自接受生物强化蛋的蛋黄(EG)、正常蛋的蛋黄 (CG)、富含ω-3脂肪酸的鸡胸部肌肉(EG)或正常鸡胸部肌肉(CG) 的饮食的野生型(WT)和肥胖(OE)小鼠的肝脏的NEFA的图。
图20是显示来自接受生物强化蛋的蛋黄(EG)、正常蛋的蛋黄 (CG)、富含ω-3脂肪酸的鸡胸部肌肉(EG)或正常鸡胸部肌肉(CG) 的饮食的野生型(WT)和肥胖(OE)小鼠的脂肪组织的NEFA的图。
图21是显示来自接受生物强化蛋的蛋黄(EG)、正常蛋的蛋黄 (CG)、富含ω-3脂肪酸的鸡胸部肌肉(EG)或正常鸡胸部肌肉(CG) 的饮食的野生型(WT)和肥胖(OE)小鼠的肌肉的NEFA的图。
图22是显示来自接受生物强化蛋的蛋黄(EG)、正常蛋的蛋黄 (CG)、富含ω-3脂肪酸的鸡胸部肌肉(EG)或正常鸡胸部肌肉(CG) 的饮食的野生型(WT)和肥胖(OE)小鼠的肾的NEFA的图。
图23是显示接受生物强化蛋的蛋黄(EG)、正常蛋的蛋黄(CG)，富含ω-3脂肪酸的鸡胸部肌肉(EG)或正常鸡胸部肌肉(CG)的饮食的肥胖(OE)小鼠的肝脏重量的图。
图24是显示接受生物强化蛋的蛋黄(EG)、正常蛋的蛋黄(CG)，富含ω-3脂肪酸的鸡胸部肌肉(EG)或正常鸡胸部肌肉(CG)的饮食的肥胖(OE)小鼠的肠系膜脂肪重量的图。
图25是显示接受生物强化蛋的蛋黄(EG)、正常蛋的蛋黄(CG)、富含ω-3脂肪酸的鸡胸部肌肉(EG)或正常鸡胸部肌肉(CG)的饮食的肥胖(OE)小鼠的附睾脂肪重量的图。
图26是显示接受生物强化蛋的蛋黄(EG)、正常蛋的蛋黄(CG)、富含ω-3脂肪酸的鸡胸部肌肉(EG)或正常鸡胸部肌肉(CG)的饮食的肥胖(OE)小鼠的腹膜后脂肪重量的图。
图27是显示接受生物强化蛋的蛋黄(EG)或正常蛋的蛋黄(CG) 的饮食的野生型(WT)小鼠的肝脏中DHA保留的图。
图28是显示接受生物强化蛋的蛋黄(EG)或正常蛋的蛋黄(CG) 的饮食的肥胖(OE)小鼠的肝脏中的DHA保留的图。
图29是显示接受富含ω-3脂肪酸的鸡胸部肌肉(EG)或正常鸡胸部肌肉(CG)的饮食的肥胖(OE)小鼠的肝脏中的DHA保留的图。
发明详述
本发明涉及使用补充有脱脂微藻的动物饲料的家禽产品的ω-3 脂肪酸富集以及涉及这种家禽产品的治疗方法。如本文所使用的，“家禽”是任何驯养的飞禽，如、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、日本鹌鹑或任何其它针对肉或蛋而饲养的鸟。在本发明的具体实施方案中，家禽是产蛋鸡(特别是当其涉及生产家禽蛋的方法时)或肉鸡(特别是当其涉及生产家禽肉时)。
本发明的一个方面涉及生产具有升高量的n-3脂肪酸的家禽蛋的方法。该方法包括在家禽有效生产包含约300至约550mg的n-3脂肪酸的蛋的条件下给家禽饲喂一定量的脱脂微藻。
如本文所使用的，术语“微藻”和“藻”可互换使用，并且是指含有叶绿体并且能或不能进行光合作用的真核微生物。微藻包括不能代谢固定碳源作为能量的专性光自养生物，以及可以单独离开固定碳源生存的异养生物，包括不能进行光合作用的专性异养生物。微藻包括在细胞分裂后不久与姐妹细胞分离的单细胞生物体，如衣藻属(Chlamydomonas)；以及微生物，例如团藻属(Volvox)，其是两种不同细胞类型的简单多细胞光合微生物。
在一个实施方案中，用于本发明的此方法和其它方法中的脱脂微藻选自微藻的种，所述微藻选自微拟球藻属或栅藻属。例如，合适的非限制性实例包括盐生微拟球藻(N.salnia)；舟形藻(N.avicula)，包括截形舟形藻(N.acceptata)、毕氏舟形藻(N.biskanterae)、假特氏舟形藻(N.pseudotenelloides)、薄膜舟形藻(N.pelliculosa)、和嗜腐舟形藻(N. saprophila)。其它微藻可以包括细胞，如小球藻属(Chlorella)、拟小球藻属(Parachlorella)和杜氏藻属(Dunaliella)。小球藻属是属于绿藻门的单细胞绿藻属。小球藻属细胞通常为球形形状，直径约2至 10μm，并且缺乏鞭毛。小球藻属的一些种是天然异养的。适用于本发明的本方法和其它方法的小球藻属的种的非限制性实例包括原壳小球藻(Chlorella protothecoides)、椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)、微小小球藻(Chlorella minutissima)、左氏小球藻(Chlorella zofinienesi)、黄绿小球藻(Chlorella luteoviridis)、凯氏小球藻(Chlorella kessleri)、Chlorellasorokiniana、小球藻空腔变种(Chlorella fiusca var. vacuolata Chlorella sp.)、Chlorella cf.minutissima、和浮水小球藻 (Chlorella emersonii)。已知原壳小球藻具有高脂质组成。
适用于本发明方法的小球藻的其它种包括但不限于以下种：无硝小球藻(anitrata)、南极洲小球藻(antarctica)、黄绿小球藻(aureoviridis)、念球菌小球藻(Candida)、囊状小球藻(capsulate)、干燥小球藻 (desiccate)、椭圆小球藻(ellipsoidea)(包括藻株CCAP 211/42)、谷氏小球藻(glucotropha)、水溪小球藻(infusionum)(包括变种actophila和变种auxenophila)、凯氏小球藻(kessleri)(包括UTEX藻株397、2229、 398中的任一种)、分叶小球藻(lobophora)(包括藻株SAG 37.88)、黄绿小球藻(包括藻株SAG 2203和变种aureoviridis和lutescens)、 miniata、突变小球藻(mutabilis)、夜间小球藻(nocturna)、卵圆形小球藻(ovalis)、小形小球藻(parva)、嗜光小球藻(photophila)、pringsheimii、原始小球藻(protothecoides)(包括UTEX藻株1806、411、264、256、 255、250、249、31、29、25或CCAP 211/8D或CCAP 211/17和变种 acidicola中的任一种)、规则小球藻(regularis)(包括变种minima和 umbricata)、瑞氏小球藻(reisiglii)(包括藻株CCP 11/8)、嗜糖小球藻 (saccharophila)(包括藻株CCAP 211/31，CCAP 211/32和变种 ellipsoidea)、盐生小球藻(salina)、单纯小球藻(simplex)、耐热性小球藻(sorokiniana)(包括藻株SAG 211.40B)、球抱小球藻(sphaerica)、stigmatophora、trebouxioides、万尼氏小球藻(vanniellii)、普通小球藻 (vulgaris)(包括藻株CCAP 211/1IK、CCAP 211/80和粗皮变型和普通小球藻自养变种(autotrophica)、普通小球藻绿色变种(viridis)、普通小球藻普通变种(vulgaris)、普通小球藻粗皮变种(tertia)、普通小球藻绿色变种)、黄色小球藻(xanthella)、和左氏小球藻(zoffngiensis)。
其它微藻属也可以用于本发明的方法中，并且可以包括例如，凯氏拟小球藻(Parachlorella kessleri)、拜氏拟小球藻(Parachlorella beijerinckii)、富油新绿藻(Neochloris oleabundans)、片球藻属 (Bracteacoccus)(包括大片球藻(B.grandis)、B.cinnabarinas、和空气片球藻(B.aerius)、球藻属种(Bracteococcus sp.)和Scenedesmus rebescens。
微藻种的其它非限制性实例包括东方曲壳藻(Achnanthes orientalis)；阿格门氏藻属(Agmenellum)；透明苗形藻(Amphiprora hyaline)；双眉藻属(Amphora)，包括咖啡形双眉藻(A.coffieiformis)，包括咖啡形双眉藻线状变种(A.c.linea)、咖啡形双眉藻斑点变种(A.c. punctate)、咖啡形双眉藻泰勒氏变种(A.c.taylori)、咖啡形双眉藻细薄变种(A.c.tenuis)、咖啡形双眉藻优美变种(A.c.delicatissima)、咖啡形双眉藻优美头状变种(A.c.delicatissima capitata)；鱼腥藻属(Anabaena)；纤维藻属(Ankistrodesmus)，包括镰形纤维藻(A.falcatus)；黄金色藻(Boekelovia hooglandii)；包特氏菌属(Borodinella)；布朗尼葡萄藻(Botryococcus braunii)，包括苏台德克斯葡萄藻(B.sudeticus)；片球藻属(Bracteoccocus)，包括空气片球藻(B.aerius)、大片球藻(B.grandis)、B.cinnabarinas、小片球藻(B.minor)、和中核片球藻(B. medionucleatus)；四鞭藻属(Carteria)：角毛藻属(Chaetoceros)，包括纤细角毛藻(C.gracilis)、牟氏角毛藻(C.muelleri)和牟氏角毛藻亚盐变种(C.muelleri subsalsum)；绿球藻属(Chlorococcum)，包括水溪绿球藻(C.infusionum)；长绿梭藻属(Chlorogonium)；蓝隐藻属(Chroomonas)；金球藻属(Chrysosphaera)；球丐板藻属 (Cricosphaera)；寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)；隐藻属 (Cryptomonas)；小环藻属(Cyclotella)，包括隐蔽小环藻(C.cryptica) 和梅尼小环藻(C.meneghiniana)；杜氏藻属(Dunaliella)，包括拜尔代维勒杜氏藻(D.bardawil)、双眼杜氏藻(D.bioculata)、颗粒状杜氏藻 (D.granulate)、海洋杜氏藻(D.maritime)、微小杜氏藻(D.minuta)、巴夫杜氏藻(D.parva)、比雷杜氏藻(D.peircei)、普林莫杜氏藻(D. primolecta)、盐生杜氏藻(D.salina)、陆生杜氏藻(D.terricola)、特氏杜氏藻(D.tertiolecta)、和绿色杜氏藻(D.viridis)；独球藻属(Eremosphaera)，包括绿色独球藻(E.viridis)；椭圆藻属(Ellipsoidon)；裸藻属(Euglena)；伏氏藻属(Franceia)；脆杆藻属(Fragilaria)，包括克罗脆杆藻(F.crotonensis)；粘球藻属(Gleocapsa)；丽丝藻属 (Gloeothamnion)；膜胞藻属(Hymenomonas)；等鞭金藻属(Isochrysis)，包括等鞭金藻球亲近种(I.affgalbana)和球等鞭金藻(I.galbana)；鳞孔藻属(Lepocinclis)；微星藻属(Micractinium)(包括UTEX LB2614)；单针藻属(Monoraphidium)，包括微小单针藻(M.minutum)；单针藻属；侏囊菌属(Nannochloris)；富油新绿藻；肾鞭藻属(Nephrochloris)；肾藻属(Nephroselmis)；普通菱形藻(Nitschia communis)；菱形藻属 (Nitzschia)，包括亚历山大菱形藻(N.alexandrina)、普通菱形藻(N. communis)，细端菱形藻(N.dissipata)、碎片菱形藻(N.frustulum)、汉氏菱形藻(N.hantzschiana)、平庸菱形藻(N.inconspicua)、中型菱形藻(N.intermedia)、小头菱形藻(N.microcephala)、微小菱形藻(N. pusilla)、微小菱形藻椭圆变种(N.pusilla elliptica)、微小菱形藻莫纳变种(N.pusilla monoensis)、和四边形菱形藻(N.quadrangular)；棕鞭藻属(Ochromonas)；；棕鞭藻属(Oocystis)，包括小形卵囊藻(O.parva) 和极小卵胞藻(O.pusilla)；颤藻属(Oscillatoria)，包括沼泽颤藻(O.limnetica)和亚短颤藻(O.subbrevis)；拟小球藻属，包括拜氏拟小球藻(P.beijerinckii)(包括藻株SAG 2046)和凯氏拟小球藻(包括SAG 藻株11.80、14.82、21.11H9中的任一种)；帕氏藻属(Pascheria)，包括嗜酸帕氏藻(P.acidophila)；巴夫藻属(Pavlova)；菌体属(Phagus)；席藻属(Phormidium)；扁藻属(Platymonas)；颗石藻属(Pleurochrysis)，包括卡氏颗石藻(P.carterae)和齿状颗石藻(P. dentate)；原壳藻属(Prototheca)，包括雍滞原壳藻(P.stagnora)(包括 UTEX 327)、波多黎各原壳藻(P.portoricensis)、和桑椹形原壳藻(P. moriformis)(包括UTEX藻株1441、1435、1436、1437、1439)；水生假小球藻(Pseudochlorella aquatic)；塔胞藻属(Pyramimonas)；桑堪藻属(Pyrobotrys)；混浊红球菌(Rhodococcus opacus)；囊状金藻(Sarcinoidchrysophyte)；栅藻属(Scenedesmus)，包括被甲栅藻(S.armatus) 和S.rubescens；裂殖壶菌属(Schizochytrium)；水绵属(Spirogyra)；钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis)；裂丝藻属(Stichococcus)；；聚球蓝细菌属(Synechococcus)；四角藻属(Tetraedron)；扁藻属(Tetraselmis)，包括亚心形扁藻(T.suecica)；微氏海链藻(Thalassiosiraweissflogii)；和Viridiella fridericiana。
用于本发明方法的微藻的合适来源是藻生物质。藻生物质是通过微藻细胞的生长和/或繁殖产生的物质。生物质可以含有细胞和/或细胞内内容物以及细胞外物质。细胞外物质包括但不限于由细胞分泌的化合物。
通常，微藻在液体培养基中培养以繁殖生物质。例如，微藻种可以在没有光的情况下在含有固定碳和/或固定氮源的培养基中生长。这种生长称为异养生长。对于一些微藻种，在有限的氮条件下延长时间段，如10至15天或更多天的异养生长导致在微藻细胞中高脂质含量的积累。
用于本发明的一种特别合适的微藻源是经培养用于生物燃料生产的微藻。为了生产生物燃料而培养的微藻包括在从藻中收获油之前的藻(全脂肪藻)和已经进行油提取的藻(脱脂藻)。因此，如本文所使用的，脱脂藻已经经历油提取过程，因此在油提取之前相对于藻包含较少的油。主要裂解脱脂藻的细胞。脱脂藻包括已经溶剂(例如己烷)提取的藻生物质。
从藻收获的油包括由藻产生的任何三酰基甘油(或甘油三酯油)。脱脂藻比提取前微藻所含有的油含有按干重或体积计更少的油。
在一个实施方案中，脱脂藻包括具有其提取油的50-99.9％的藻，使得脱脂藻含有例如提取之前生物质的油含量的约0.1-50％。然而，生物质在蛋白质和其它成分的含量方面仍具有高营养价值，使得其适合用于动物饲料中。
用于制备本发明方法的脱脂(或脱脂质)藻的方法可以通过本领域普通技术人员已知的标准方法进行。例如，可以裂解藻细胞，这可以通过任何方便的手段实现，包括热诱导裂解、添加碱、添加酸、使用酶(如蛋白酶和多糖降解酶，如淀粉酶)、使用超声波、基于机械压力的裂解、以及使用渗透压休克进行裂解。用于裂解微生物的这些方法中的每一种可以作为单一方法使用或者同时或顺序地组合使用。细胞破碎的程度可以通过显微镜分析观察。使用上述一种或多种方法，通常观察到超过70％的细胞破裂。
通过提取可以回收由微藻产生的脂质和油。在一些情况下，可以使用有机溶剂或油进行提取，或者可以使用无溶剂提取程序进行提取。
对于微藻油的有机溶剂提取，典型的有机溶剂是己烷。通常，将有机溶剂直接加入裂解物中，而不预先分离裂解物组分。在一个实施方案中，使通过一种或多种上述方法产生的裂解物与有机溶剂接触足以允许脂质组分与有机溶剂形成溶液的一段时间。在一些情况下，然后可以将溶液进一步精制以回收特定的期望脂质组分。然后可以将混合物过滤，并通过例如旋转蒸发除去己烷。己烷提取方法是本领域公知的(参见例如Frenz等人，“Hydrocarbon Recovery by Extraction with a Biocompatible Solvent from Freeand Immobilized Cultures of Botryococcus-braunii，”Enzyme Microb.Technol.11：717-724(1989)，其通过引用的方式整体并入本文。Miao和Wu，“Biodiesel Productionfrom Heterotrophic Microalgal Oil，”Biosource Technology 97：841-846 (2006)(其通过引用的方式整体并入本文)描述了一种从原壳小球藻的培养物中回收微藻脂质的方案，其中通过离心收获细胞，用蒸馏水洗涤，并通过冷冻干燥进行干燥。所得细胞粉末在研钵中研磨，然后用正己烷提取。
在一些情况下，可以使用液化(参见例如Sawayama等人，“Possibility ofRenewable Energy Production and C02Mitigation by Thermochemical Liquefactionof Microalgae，”Biomass and Bioenergy 17：33-39(1999)，其通过引用的方式整体并入本文)；油液化(参见例如Minowa等人，“Oil Production from Algal Cells ofDunaliella tertiolecta by Direct Thermochemical Liquefaction，”Fuel 74(12)：1735-1738(1995)，其通过引用的方式整体并入本文)；或超临界CO2提取(参见例如Mendes等人，“Supercritical Carbon Dioxide Extraction of Compounds withPharmaceutical Importance from Microalgae，”Inorganica Chimica Acta 356：328-334(2003)，其通过引用的方式整体并入本文)提取微藻油。通过超临界CO2提取所提取的藻油包含来自藻生物质的所有固醇和类胡萝卜素，并且根据提取过程天然不含有磷脂。来自所述方法的残余物基本上包含不含油的脱脂(或脱脂质)藻生物质，但仍保留预提取藻生物质的蛋白质和碳水化合物。因此，残余脱脂藻生物质是蛋白浓缩物/分离物和食用纤维的合适来源。
油提取还包括在没有事先分离裂解物组分的情况下将油直接添加到裂解物。添加油后，裂解物自身分离或由于离心等分离到不同的层中。所述层以密度递减的顺序可以包括：重固体的沉淀，水相，乳剂相和油相。乳剂相是脂质和水相的乳剂。
根据相对于裂解物添加的油的百分比(w/w或v/v)，离心力(如果有的话)、水性介质的体积和其它因素，乳剂和油相中的任一种或两种可以存在。用油温育或处理细胞裂解物或乳剂相进行足以使微生物产生的脂质溶解在油中形成异质混合物的时间。
也可以通过无溶剂提取程序从裂解物中提取脂质，而没有通过冷却裂解物对有机溶剂或油的实质性或任何使用。也可以使用超声处理，特别是如果温度在室温和65℃之间。离心或沉降上的此类裂解物可以分离成层，其中之一层是水性/脂质层。其它层可包括固体沉淀，水层和脂质层。可以通过冷冻融化或以其它方式冷却乳剂从乳剂层中提取脂质。在这种方法中，没有必要添加任何有机溶剂或油。如果添加任何溶剂或油，则其可以低于裂解物的5％v/v或w/w。
在本发明的方法中使用的藻通常干燥和/或研磨成藻粉。干燥主要是完整的或均质形式的微藻生物质有利于促进本发明的组合物和饲料补充剂中的生物质的进一步加工或使用。干燥是指从主要是完整的生物质中除去游离或表面水分/水，或从匀化(例如通过微粉化) 生物质的浆料中除去表面水。在一些情况下，干燥生物质可促进更有效的微藻油提取过程。
在一个实施方案中，将浓缩的微藻生物质滚筒式干燥成薄片形式以产生藻片。在另一个实施方案中，将浓缩的微藻生物质喷雾或闪蒸干燥(即，进行气动干燥过程)以形成主要含有完整细胞的粉末，以产生藻粉末。在另一个实施方案中，将浓缩的微藻生物质微粉化(均化)以形成主要裂解细胞的匀浆，然后将其喷雾或快速干燥以产生藻粉。
在本发明的该方法的一个实施方案中，以约1％至约23％、或约 1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、 6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、 12％、12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％、15％、15.5％、16％、16.5％、 17％、17.5％、18％、18.5％、19％、19.5％、20％、20.5％、21％、21.5％、22％、22.5％、或约23％(按家禽总饮食的重量/重量计)的量向家禽饲喂脱脂微藻。
如本文所使用的，“重量/重量”或“w/w”是指重量比，并且是指组合物中一种物质的重量与组合物的总重量的比率，或组合物中一种物质的重量与组合物的另一种物质的重量的比率。例如，提及包含组合物的总共15％w/w的藻的组合物是指15％的组合物重量由藻组成(例如，此类具有100mg重量的组合物将含有15mg藻)并且组合物的其余重量(例如，在该实例中为85mg)由其它成分组成。
本发明的脱脂微藻可以通过用脱脂微藻代替家禽正常饮食的一部分来饲喂家禽。根据一个实施方案，用脱脂微藻替代的家禽正常饮食的一部分是具有与藻相似的营养物(例如蛋白质)品质的动物饲料组分。这可以包括例如用脱脂微藻替代饲料的家禽的玉米或大豆组分的一部分。
在一个实施方案中，除了非藻蛋白质来源之外，向家禽饲喂脱脂微藻，其总量为饲料组合物的约7.5％至约15％重量/重量。非藻蛋白源包括通常为家禽饲料的一部分的那些，包括但不限于肉、鱼蛋白、大豆蛋白、乳清蛋白、小麦蛋白、豆蛋白、水稻蛋白、豌豆蛋白、乳蛋白等。
在本发明的此方法中，向家禽饲喂一定量的用于家禽的脱脂微藻以生产包含约300至约550mg的n-3脂肪酸的蛋。例如，蛋可以包含约300mg、310mg、320mg、330mg、340mg、350mg、375mg、400mg、 425mg、450mg、475mg、500mg、525mg或550mg的n-3脂肪酸。
如本文所使用的，n-3脂肪酸(也称为omega-3脂肪酸，ω-3脂肪酸)和n-6脂肪酸(也称为omega-6脂肪酸，ω-6脂肪酸)被认为是指具有在距离碳链末端的第三个碳原子处的碳-碳双键和在距离碳链末端的第六个碳原子处的最终碳-碳双键的长链多不饱和脂肪酸 (PUFA)。示例性的n-3脂肪酸包括α-亚麻酸(ALA)、十八碳四烯酸、二十碳四烯酸(ETA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸 (DPA)、十六碳三烯酸(HTA)、二十碳三烯酸(ETE)、二十一碳五烯酸(HPA)、二十四碳五烯酸、二十四碳六烯酸和二十二碳六烯酸(DHA)。示例性的n-6脂肪酸包括亚油酸、γ-亚麻酸、十八碳三烯酸(calendric acid)、二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳二烯酸、肾上腺酸、二十二碳五烯酸、二十四碳四烯酸和二十四碳五烯酸。根据USDA国家营养标准参考数据库(USDA National Nutrient Databasefor Standard Reference)，一个完整、生的、新鲜的蛋含有约60毫克DHA和0毫克EPA。
进行本发明的这种方法以生产具有升高量的n-3脂肪酸，特别是 EPA和DHA的家禽蛋。在一个实施方案中，通过本发明的方法生产的蛋含有至少约80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、110mg、120mg、 130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、200mg 或更多的二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)的组合。
还进行本发明的该方法以生产具有提高的n-6与n-3脂肪酸比率和/或降低的n-9脂肪酸的家禽蛋。在一个实施方案中，所述蛋具有的 n-3：n-6脂肪酸的比率大于在所述条件下通过不饲喂脱脂微藻的产蛋鸡产生产的蛋的比率。在此种或另一个实施方案中，与在该条件下没有饲喂脱脂微藻的家禽生产的蛋相比，该蛋具有降低的n-9脂肪酸。
根据另一个实施方案，还向家禽饲喂n-3脂肪酸的非微藻源。在一个实施方案中，n-3脂肪酸的非微藻源是亚麻籽油或亚麻籽油。例如，亚麻籽可以按重量/重量计以约0.5％至约5％，或按家禽的总饮食的重量/重量计至少约0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、 4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、 9.5％或10％的量饲喂家禽。或者，n-3脂肪酸的非微藻源是鱼油或鱼粉。
本发明还涵盖通过该方法生产的蛋。
本发明的另一方面涉及治疗方法。该方法包括向受试者饲喂本发明的n-3脂肪酸富集的蛋，以在有效治疗受试者的条件下增加受试者中n-3脂肪酸的量。
根据本发明该方面的一个实施方案，向受试者饲喂富集蛋以增加各种组织中n-3脂肪酸的量，并提高受试者中的n-6：n-3脂肪酸比率并降低n-9脂肪酸。
在实施本发明的这种方法时，可以作为受试者饮食的一部分和/ 或作为食物补充剂，例如在饮料、汤、加工食品、营养和保健补充剂中以原始、粗制、提取或纯化形式向受试者饲喂蛋。
根据本发明的该方面，受试者可以是人，或各种食物产生动物、伴侣/宠物、娱乐动物、动物园动物、野生动物、实验室动物或其它相关物种中的任一种，包括但不限于犬、猫、马、牛、绵羊、山羊、猪、小鼠、大鼠、豚鼠或猴。优选地，受试者是人。
受试者中的治疗可包括但不限于减少正常或超重或肥胖个体中的血液和/或组织甘油三酯。此类治疗可涉及例如但不限于预防或治疗脂肪肝、肥胖症和其它甘油三酯相关病症。在一个实施方案中，治疗受试者的n-3脂肪酸反应性疾病或病症，包括但不限于心脏相关病状、糖尿病、肥胖症、脂肪肝、炎症、癌症、高血压、衰老、神经变性、免疫功能丧失、生育力下降、肌肉萎缩、消化性肠病等。在一个实施方案中，心脏相关病状包括但不限于高胆固醇血症、冠状动脉疾病、充血性心力衰竭和心肌梗死。
本发明的另一方面涉及一种防止减轻饲喂亚麻籽油或亚麻籽油的饮食补充剂的家禽的体重的方法。该方法包括鉴定饲喂亚麻籽或亚麻籽油的饮食补充剂的家禽，并且在有效防止家禽由于亚麻籽或亚麻籽油而导致体重减轻的条件下，向家禽饲喂一定量的脱脂微藻。
在一个实施方案中，亚麻籽或亚麻籽油的饮食补充剂是基于家禽总饮食的重量/重量计约5％或更多的量。
脱脂微藻以及制备和饲喂脱脂微藻的方法在上文中描述。
本发明的另一方面涉及生产具有升高量的n-3脂肪酸的家禽肉的方法。该方法包括相比于不饲喂脱脂微藻的家禽，在对家禽肉制品有效富集n-3脂肪酸的条件下，向家禽饲喂一定量的脱脂微藻。
脱脂微藻以及制备和饲喂脱脂微藻的方法在上文中描述。
根据本发明的该方面的一个实施方案，按家禽的总饮食的重量/ 重量计以约2％至约16％、或约2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、 9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、或16％的量向家禽饲喂脱脂微藻。
实施本发明的这种方法以生产具有升高量的n-3脂肪酸，特别是 EPA和DHA的家禽肉。在一个实施方案中，与不饲喂脱脂微藻的家禽相比，富集的肉制品包含更多的n-3脂肪酸二十二碳六烯酸(DHA) 和二十碳五烯酸(EPA)。根据USDA国家营养标准参考数据库，家禽肉制品含有小于约20g EPA和小于约60g DHA/100g。因此，根据一个实施方案，本发明的这个方面涉及通过将n-3脂肪酸提高至大于 20g EPA和/或60g DHA/100g的水平或大于约80g/100g的EPA和 DHA组合水平来富集家禽的肉制品。
还进行本发明的这种方法以生产具有提高的n-6与n-3脂肪酸比率和/或降低的n-9脂肪酸的家禽肉。在一个实施方案中，肉具有的 n-3：n-6脂肪酸比率大于在所述条件下不饲喂脱脂微藻的家禽的比率。在该实施方案或另一个实施方案中，与在所述条件下没有饲喂脱脂微藻的家禽生产的家禽肉相比，所述家禽肉具有降低的n-9脂肪酸。
在一个实施方案中，富集的肉制品选自胸部肌肉、大腿肌肉和/ 或其它器官，如肝脏和脂肪组织。
在另一个实施方案中，与在所述条件下不饲喂脱脂微藻的家禽相比，富集的肉制品包含n-3脂肪酸的至少约3倍至15倍的增加，或与在该条件下不饲喂脱脂微藻的家禽相比，n-3脂肪酸增加约2倍、3 倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13 倍、14倍或15倍或更多。
在一个实施方案中，富集的肉制品含有的n-3：n-6脂肪酸比率大于在该条件下不饲喂脱脂微藻的家禽的比率。
本发明的另一方面涉及治疗方法，其包括向受试者饲喂本发明的家禽肉以在有效治疗受试者的条件下增加受试者中n-3脂肪酸的量。
属于本发明的这个方面的治疗包括上文所述的治疗。
根据本发明的这一方面的一个实施方案，向受试者饲喂富集的家禽肉以增加各种组织中n-3脂肪酸的量，并提高受试者中的n-6：n-3 脂肪酸比率并降低n-9脂肪酸。
在实施本发明的这种方法时，家禽肉可以作为受试者饮食的一部分和/或作为食品补充剂，例如饮料、汤、加工食品、营养和保健补充剂以原始、粗制、提取或纯化的形式向受试者饲喂。
根据本发明的该方面，受试者可以是人，或各种食物产生动物、伴侣/宠物、娱乐动物、动物园动物、野生动物、实验室动物或其它相关物种中的任何物种，包括但不限于狗、猫、马、牛、绵羊、山羊、猪、小鼠、大鼠、豚鼠或猴。优选地，受试者是人。
受试者中的治疗可包括但不限于减少正常或超重或肥胖个体中的血液和/或组织甘油三酯。此类治疗可涉及例如但不限于预防或治疗脂肪肝，肥胖症和其它甘油三酯相关病症。在一个实施方案中，治疗受试者的n-3脂肪酸反应性疾病或病症，包括但不限于心脏相关病状、糖尿病、肥胖症、脂肪肝、炎症、癌症、高血压、衰老、神经变性、免疫功能丧失、下降的生育能力、肌肉萎缩、消化系统肠病等。上文讨论了心脏相关的病状。
可以进行本发明的治疗方法以刺激内源性n-3脂肪酸合成途径，上调或下调关键酶基因表达，并且本文所述的本发明揭示了饮食组成和可施用以进行此类治疗方法的剂量。
有效的靶基因包括但不限于A-9去饱和酶、Δ-6去饱和酶、苹果酸酶、脂肪酸合酶、乙酰CoA羧化酶、延长酶2、延长酶3、延长酶 4、延长酶5和酰基CoA硫酯酶4。这些基因可以通过脱脂微藻或其它饮食组分、化学品、药物或遗传操作改变以富集各种物种的组织中的n-3脂肪酸或治疗和预防与n-3脂肪酸相关的疾病或病症。
实施例
提供以下实施例以阐明本发明的实施方案，但绝不意图限制其范围。
实施例1：微藻生物质和亚麻籽油对蛋的n-3脂肪酸富集的比较影响
材料和方法
动物
动物方案得到康奈尔大学机构动物护理和使用委员会(Cornell UniversityInstitutional Animal Care and Use Committee)批准。三种微藻生物质(表1)获自Cellana(Kailua-Kona，HI)。A型是全脂十字脆杆藻亚属种物种，B型是脱脂的链带藻属种(Desmodesmus sp.)，并且C型是脱脂的海洋微拟球藻。亚麻籽油购自Dyets(Bethlehem，PA，目录号402511)。
表1.用于实验I和II的亚麻籽油和藻的近似分析(％)和脂肪酸组成(％)
Figure BDA0001242620920000281
Figure BDA0001242620920000291
N.D.未检测到，SFA；饱和脂肪酸，MUFA；单不饱和脂肪酸， PUFA；多不饱和脂肪酸，n-3；ω-3脂肪酸，n-6；ω-6脂肪酸，n-9；ω-9脂肪酸。
实验I
进行3乘3析因实验持续4周，使用3个水平的亚麻籽油纳入(0、 3和5％)和3个水平的微藻A(0、7.5和10％)(表2)。将90只Shaver Leghorn产蛋鸡(20周龄)圈养在单独笼中的三层架(triple deck batteries)中，并分配到9个处理组(n＝10/处理)。在4周实验期间，将环境控制在23℃，20％相对湿度和8∶16小时的黑暗∶光照循环。每个处理随机分配10只禽。基于NRC要求(NRC.，“Nutrient Requirements of Poultry，”于National ResearchCouncil，National Academy Press Washington，USA(1994)，其通过引用的方式整体并入本文)制定实验饮食。在整个实验期间，禽可以自由获得饲料和水。
Figure BDA0001242620920000311
Figure BDA0001242620920000321
实验II
该实验包括5个处理组(表3)。组1饲喂没有微藻或亚麻籽油的玉米-大豆对照饮食(NRC.，“Nutrient Requirements of Poultry，”于National Research Council，NationalAcademy Press Washington，USA (1994)，其通过引用的方式整体并入本文)，组2和组3分别饲喂含有 7.5％微藻A和B的饮食，并且组4和5分别饲喂含有7.5和15％微藻C的饮食。组2-5的实验饮食含有3％亚麻籽油。选择50只Shaver Leghom产蛋鸡(28周龄)并将其圈养在单独笼中的三层架中，并随机分配到每个处理(n＝10)。实验持续4周，并且禽可以自由获得饲料和水。
表3.用于实验II的饮食的组成(g/kg)
Figure BDA0001242620920000331
Figure BDA0001242620920000341
*维生素和矿物质混合物每千克饮食提供以下营养物：维生素A， 11,000IU；维生素D，5,000IU；维生素E，75IU；甲萘醌亚硫酸氢盐，3mg；核黄素，8mg；D-Ca泛酸盐，15mg；烟酸，60mg；维生素B-12，0.016mg；生物素，4mg；叶酸，2mg；硫胺-HCl，3mg；盐酸吡哆醇，4mg；CuSO4·5H2O，16mg；KI，1.25mg；MnSO4·H2O，120mg； Na2SeO3，0.3mg；ZnO，100mg；Na2MoO4·2H2O，0.001261mg
测量
每周记录体重和饲料摄入，并且每天收集蛋。每周随机选择来自每次处理的5个蛋，并测量全蛋、蛋壳、蛋白和蛋黄重量。在每个实验结束时从翅静脉收集血液，通过离心(3000×g，4℃下15分钟)获得血浆，并储存在-20℃直至分析。
使用尿酸试剂盒(InfinityTM尿酸液体稳定试剂，Thermo scientific，Middletown，VA)测定血浆尿酸(“UA”)浓度。在用12.5％三氯乙酸使用Elon(对甲基氨基苯酚硫酸盐)溶液沉淀后，测量血浆无机磷 (“PIP”)(Gomori，“A Modification of theColorimetric Phosphorus Determination for Use with the PhotoelectricColorimeter，”J.Lab.Clin. Med 27：1941-42(1942)，其通过引用的方式整体并入本文)。通过对硝基苯酚磷酸盐水解成对硝基苯酚来定量碱性磷酸酶(“AKP”)(Bowers 等人，“AContinuous Spectrophotometric Method for Measuring the Activity of SerumAlkaline Phosphatase，”Clinical Chemistry 12：70-89 (1966)，其通过引用的方式整体并入本文)。
脂肪酸分析
根据Ichihara等人，“An Improved Method for Rapid Analysis of the FattyAcids of Glycerolipids，”Lipids31：535-539(1996)(其通过引用的方式并入本文)，将来自蛋的脂肪酸用甲醇-KOH甲基化。使用装配有火焰离子化检测器的气相色谱(Agilent6890N，Agilent Technologies， Santa Clara，CA)分析脂肪酸的甲酯。使用涂覆有用于脂肪酸甲酯的 CP-SIL88(100m×0.25mm i.d.，0.2mm膜厚度)的熔融石英毛细管柱 (VarianInc，Lake Forest，CA)。将炉温编程为在140℃保持4分钟，以4℃/分钟升至220℃，然后保持5分钟。载气为N2，恒定流速为 2ml/s，且注射器温度为230℃，且检测器温度为280℃。使用十三烷酸甘油三酯(Tritridecanoin)(Sigma-Aldrich Co.，St Louis，MO)作为内部标准品，并且通过每种脂肪酸相对于脂肪酸甲酯标准品 (Sigma-Aldrich Co.，St Louis，MO)的保留时间来鉴定每种脂肪酸。
统计分析
使用SAS系统(SAS Institute，Cary，NC)通过ANOVA分析数据。双因素(3×3因子排列)ANOVA用于实验I，并且主要因子是亚麻籽油和微藻，并且使用Duncan事后检验来进行处理平均值比较。使用单因素ANOVA及Duncan事后检验进行实验II的数据分析。差异的显著性定义为P＜0.05。
实验I结果
研究结束时与对照组相比(P＜0.05)，在饮食中纳入5％但不是 3％的亚麻籽油(表4)，降低体重(P＜0.05)。微藻补充(7.5％和10％) 防止了饲喂5％亚麻籽油的母鸡的体重减轻。微藻或亚麻籽油纳入均不影响平均每日饲料摄入或血浆尿酸浓度。通过微藻纳入使血浆无机磷浓度和AKP活性均降低(P＜0.05)。
Figure BDA0001242620920000361
蛋的数量、蛋重、蛋白重量(蛋清)、蛋黄重量和蛋壳重量不受微藻和(或)亚麻籽油的饮食补充影响(表5)。在第2周(表6和表8)，随着亚麻籽油或微藻补充的增加，蛋黄的饱和脂肪酸(“SFA”) 浓度降低(P＜0.05)。由于5％亚麻籽油和7.5％和10％微藻两者，单不饱和脂肪酸(“MUFA”)含量降低(P＜0.05)。PUFA和n-3脂肪酸的浓度由于亚麻籽油而升高(P＜0.05)，但不受微藻补充的影响。由于5％亚麻籽油和(或)10％微藻，n-6和n-9脂肪酸的浓度降低 (P＜0.05)。在第4周(表7和表9)，由于亚麻籽油和微藻，蛋黄中 SFA的浓度降低(P＜0.05)，并且由于微藻，MUFA的浓度也降低。虽然亚麻籽油和微藻两者增加了PUFA的浓度(P＜0.05)，但亚麻籽油提高了n-3脂肪酸的浓度(P＜0.05)，而在10％微藻的存在下，有更大(P＜0.05)的增量。由于微藻，n-9脂肪酸浓度降低(P＜0.05)。
Figure BDA0001242620920000381
Figure BDA0001242620920000391
Figure BDA0001242620920000401
Figure BDA0001242620920000411
Figure BDA0001242620920000421
Figure BDA0001242620920000431
Figure BDA0001242620920000441
实验II结果
饮食处理对体重、饲料摄入或血浆尿酸和无机磷浓度或AKP活性没有施加影响(表10)。同样地，蛋生产或蛋和蛋组分重量不受饮食处理影响(表11)。
表10.实验II中母鸡的体重、饲料摄入和血浆生物标志物
Figure BDA0001242620920000451
#UA；尿酸，PIP；血浆无机磷，AKP；碱性磷酸酶活性。
表11.实验II中的蛋生产、蛋组分、蛋脂肪酸谱
Figure BDA0001242620920000452
脂肪酸含量，mg/个蛋
Figure BDA0001242620920000461
a-d同一行中没有共同字母的平均值不同(P＜0.05)。
SFA，饱和脂肪酸；MUFA，单不饱和脂肪酸；PUFA，多不饱和脂肪酸；n-3，ω-3脂肪酸；n-6，ω-6脂肪酸；n-9，ω-9脂肪酸。
在第2周(表12和表13)，蛋黄中SFA的浓度由于7.5％藻B或藻C(均具有3％亚麻籽油)而降低(P＜0.05)。当藻C的包含率增加到15％时，降低更大(P＜0.05)。与对照相比，由于15％微藻C，MUFA 的浓度降低(P＜0.05)。虽然PUFA浓度在不同处理组中保持不变，但当饮食补充有微藻(和3％亚麻籽油)时，与对照相比，n-3和n-6 脂肪酸的浓度分别增加(P＜0.05)和降低(P＜0.05)。与其它处理 (P＜0.05)相比，由于15％微藻C，n-9脂肪酸浓度降低(P＜0.05)。
表12.来自实验II的蛋的脂肪酸组成(％)(第2周)
Figure BDA0001242620920000462
Figure BDA0001242620920000471
a-d同一行中没有共同字母的平均值通过单因素ANOVA与Duncan 多重范围检验不同(P＜0.05)。
N.D.未检测到；SFA；饱和脂肪酸，MUFA；单不饱和脂肪酸， PUFA；多不饱和脂肪酸，n-3；ω-3脂肪酸，n-6；ω-6脂肪酸，n-9；ω-9脂肪酸。
表13.来自实验II的蛋的脂肪酸含量(mg/个蛋黄)(第2周)
Figure BDA0001242620920000472
Figure BDA0001242620920000481
a-d同一行中没有共同字母的平均值通过单因素ANOVA与Duncan 多重范围检验不同(P＜0.05)。
N.D.未检测到；SFA；饱和脂肪酸，MUFA；单不饱和脂肪酸， PUFA；多不饱和脂肪酸，n-3；ω-3脂肪酸，n-6；ω-6脂肪酸，n-9；ω-9脂肪酸。
在第4周(表14和表15)，来自对照处理的蛋含有比来自其它四组(表11，上文)高的(P＜0.05)SFA。与对照相比，MUFA的浓度由于15％微藻C(3％亚麻籽油)而降低(P＜0.05)。饲喂7.5％微藻 A和B和15％微藻C(3％亚麻籽油)的母鸡比对照母鸡生产的蛋在蛋黄中含有更大量的(P＜0.05)PUFA。饲喂微藻以及3％亚麻籽油的的母鸡比对照母鸡生产的蛋含有更大量的(P＜0.05)n-3脂肪酸。饲喂7.5％微藻C的组中蛋黄中n-6脂肪酸的浓度最低，其次是7.5％微藻B、15％微藻C和7.5％微藻A。与其它处理相比，n-9脂肪酸的浓度由于15％微藻C而降低(P＜0.05)。
表14.来自实验II的蛋的脂肪酸组成(％)(第4周)
Figure BDA0001242620920000491
a-d同一行中没有共同字母的平均值通过单因素ANOVA与Duncan 多重范围检验不同(P＜0.05)。
N.D.未检测到；SFA；饱和脂肪酸，MUFA；单不饱和脂肪酸， PUFA；多不饱和脂肪酸，n-3；ω-3脂肪-酸，n-6；ω-6脂肪酸，n-9；ω-9脂肪酸。
表15.来自实验II的蛋的脂肪酸含量(mg/个蛋)(第4周)
Figure BDA0001242620920000492
Figure BDA0001242620920000501
a-d在同一行中没有共同字母的平均值通过单因素ANOVA与 Duncan多重范围检验不同(P＜0.05)。
N.D.未检测到；SFA；饱和脂肪酸，MUFA；单不饱和脂肪酸， PUFA；多不饱和脂肪酸，n-3；ω-3脂肪酸，n-6；ω-6脂肪酸，n-9；ω-9脂肪酸。
讨论
亚麻籽粉和油是已知的用于生产富含n-3脂肪酸的蛋的饲料成分。在高含量的ALA的情况下(Gonzalez-Esquerra等人，“Studies on the Metabolizable Energy Contentof Ground Full-Fat Flaxseed Fed in Mash， Pellet，and Crumbled Diets Assayedwith Birds of Different Ages，” Poultry Science 79：1603-1607(2000)；Jia等人，“The Effect of Enzyme Supplementation on Egg Production Parameters and Omega-3Fatty Acid Deposition in Laying Hens Fed Flaxseed and Canola Seed，”PoultryScience 87：2005-2014(2008)；Jiang等人，“Effects of Feeding Flax and Two Typesof Sunflower Seeds on Fatty Acid Compositions of Yolk Lipid Classes，”PoultryScience 70：2467-2475(1991)，其通过引用的方式并入本文)，亚麻籽粉补充(10％)与基于玉米-大豆粉的饮食相比的确使蛋黄富集了ALA、二十二碳五烯酸(“DPA”)和DHA(Scheideler 等人，“The Combined Influence of Dietary Flaxseed Variety，Level，Form， and Storage Conditions on Egg Production and Composition Among VitaminE-Supplemented Hens，”Poultry Science 75：1221-1226(1996)，其通过引用的方式整体并入本文)。由于亚麻籽含有约45％的油 (NRC.，“Nutrient Requirements of Poultry，”于National Research Council，National Academy Press，Washington，USA(1994)，其通过引用的方式整体并入本文)，在本研究中补充5％亚麻籽油与12％亚麻籽的情况相似。然而，纳入超过10％的亚麻籽已经显示对蛋生产的负面影响(Leeson等人，“Response ofLayers to Dietary Flaxseed According to Body Weight Classification atMaturitym，”The Journal of Applied Poultry Research 9：297-302(2000)；Bean等人，“Long-term Effects of Feeding Flaxseed on Performance and Egg Fatty AcidComposition of Brown and White Hens，”Poultry Science 82：388-394(2003)，其通过引用的方式整体并入本文)。Schumann等人，“Effect ofDietary Flaxseed， Flax Oil andn-3Fatty Acid Supplement on Hepatic and Plasma Characteristics Relevant toFatty Liver Haemorrhagic Syndrome in Laying Hens，”British Poultry Scieuce 41：465-472(2000)，其通过引用的方式整体并入本文，证明5％亚麻籽油补充可能通过减少脂质合成而对母鸡的身体和肝脏重量具有负面影响。事实上，在实验I中，5％亚麻籽油补充导致母鸡体重的减少。7.5或10％微藻A防止了5％亚麻籽油对体重的负面影响。与Lipstein等人，“The Nutritional Value of Algae for Poultry.Dried Chlorella in LayerDiets，“British Poultry Science 21：23-27(1980)(其通过引用的方式整体并入本文)的结果相似，微藻补充不对蛋生产、饲料摄入、蛋组分性状或磷和氮代谢的血浆生物标志物产生负面影响(Ravindran等人，“Phytates：Occurrence， Bioavailability andImplications in Poultry Nutrition，”Poultry and Avian Biology Reviews(UnitedKingdom)(1995)；Sauveur等人，“Plasma Inorganic Phosphorus Concentration DuringEggshell Formation. II.-Inverse Relationships with Intestinal Calcium Contentand Eggshell Weight，”Reproduction Nutrition Développement 23：755-764(1983)；Hester等人，“Plasma Inorganic Phosphate，Calcium，and Magnesium Levels of HensWhich Laid Soft-Shelled or Shell-Less Eggs，”Poultry Science 59：2336-2341(1980)；Hurwitz等人，“The Response of Plasma Alkaline Phosphatase，Parathyroidsand Blood and Bone Minerals to Calcium Intake in the Fowl，”The Journal ofNutrition 73：177-185 (1961)，其通过引用的方式整体并入本文)。
在实验1中，亚麻籽油在蛋黄中产生n-3脂肪酸的剂量依赖性富集，而微藻A单独或与亚麻籽油组合没有显示效果。这与以前的研究的发现(Stamey等人，“Use of Algae orAlgal Oil Rich in n-3Fatty Acids as a Feed Supplement for Dairy Cattle，”Journal of Dairy Science 95：5269-5275(2012)；Fredriksson等人，“Fatty Acid andCarotenoid Composition of Egg Yolk as an Effect of Microalgae Addition toFeed Formula for Laying Hens，”Food Chemistry 99：530-537(2006)，其通过引用的方式整体并入本文)有些不同。原因之一可能是先前的研究和本文所述的研究之间的微藻的脂质浓度和脂肪酸谱差异。在先前的研究之一中使用的微藻(眼点微绿球藻(N.oculata))(Fredriksson等人，“Fatty Acid and Carotenoid Composition of Egg Yolk as anEffect of Microalgae Addition to Feed Formula for Laying Hens，”Food Chemistry99：530-537(2006)，其通过引用的方式整体并入本文)含有44.1％的 n-3脂肪酸，相比之下微藻A中仅为1.6％。与第2周相比，由于相同水平的亚麻籽油，蛋黄中的n-3脂肪酸富集似乎在第4周减弱。这可能是由于在饮食中的高n-3PUFA，特别是ALA浓度。PUFA(n-3) 减少肝脂质生物合成和分泌，同时促进脂肪的近端β-氧化(Harris，“Fish Oils and Plasma Lipidand Lipoprotein Metabolism in Humans：A Critical Review，”Journal of LipidResearch 30：785-807(1989)，其通过引用的方式整体并入本文)。C18：3n3(ALA)至C16：0、C16：1n7、 C18：0和C18：1n9的转化再循环用于较长链脂肪酸(DHA和EPA)合成的碳(Burdge等人，“Conversion ofα-Linolenic Acid to Palmitic， Palmitoleic，Stearic andOleic Acids in Men and Women，”Prostaglandins， Leukotrienes and EssentialFatty Acids 69：283-290(2003)，其通过引用的方式整体并入本文)。微藻A中的主要脂肪酸是C16：0和C16：1，并且10％微藻A连同5％亚麻籽油增加蛋中的n-3脂肪酸，特别是 C18：3n3(ALA)增加(表9，同上)，而C18：1n9减少。这些结果表明微藻A可能降低ALA至其它非必需脂肪酸的再循环，并通过供应其它脂肪酸来源(C16：0或C16：1)用于再循环碳源来维持其用于产生较长链脂肪酸(DHA和EPA)。
在实验II中，在含有3％亚麻籽油的饮食中，所有三种微藻均引起蛋黄中n-3脂肪酸的非常相似的富集。微藻B和C的脂肪酸谱与微藻A的脂肪酸谱不同。如果n-3脂肪酸强化蛋的持续生产仅仅是由于脂肪酸谱(例如C16：0和C16：1)，则已经从饲喂微藻B或C的母鸡预期蛋黄的降低的n-3脂肪酸含量。相反，这两种脱脂生物质维持了 n-3强化蛋生产。这可以是由于来自微藻B和C的n-3脂肪酸的直接生物强化。而且，所有微藻补充减少了蛋黄中的n-6脂肪酸。n-6脂肪酸是旁分泌系统的类二十烷酸(例如，前列腺素、白三烯、前列环素、血栓素和羟基酸)的重要前体(Brenna等人，“International Society for the Study ofFatty Acids and Lipids，ISSFAL.Alpha-Linolenic Acid Supplementation andConversion to n-3Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids in Humans，”Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 80：85-91(2009)，其通过引用的方式整体并入本文)。但在西方饮食中，总脂肪、饱和脂肪和n-6脂肪酸含量高，具有不期望的n-6与n-3脂肪酸比率(约15)(Fredriksson等人，“Fatty Acid and Carotenoid Composition ofEgg Yolk as an Effect of Microalgae Addition to Feed Formula for LayingHens，”Food Chemistry 99：530-537(2006)； Simopoulos，“New Products from theAgri-Food Industry：The Return of n-3FattyAcids into the Food Supply，”Lipids34：S297-S301(1999)，其通过引用的方式整体并入本文)。酶δ6和δ5去饱和酶是竞争相同酶的 n-6和n-3脂肪酸之间的平衡的限制因素。因此，富含n-6脂肪酸的饮食倾向于抑制从ALA形成EPA和DHA(Sargent等人，“Requirement Criteria for Essential Fatty Acids，”Journal of Applied Ichthyology 11：183-198(1995)，其通过引用的方式整体并入本文)。较短链ALA 需要转化为长链EPA和DHA以具有生物活性(Riediger等人，“A SystemicReview of the Roles of n-3Fatty Acids in Health and Disease，” Journal of theAmerican Dietetic Association 109：668-679(2009)，其通过引用的方式整体并入本文)。这些长链n-3脂肪酸(EPA和DHA) 更快地掺入血浆和膜脂质中，并比ALA产生更快的效果(Simopoulos，“Human Requirement for N-3Polyunsaturated Fatty Acids，”PoultryScience 79：961-970(2000)，其通过引用的方式整体并入本文)。然而，人类具有小于5％的ALA转化为EPA或DHA(Gerster，H.，“Can Adults Adequately Convert Alpha-LinolenicAcid(18：3n-3)to Eicosapentaenoic Acid(20：5n-3)and Docosahexaenoic Acid(22：6n-3)？”International Journal for Vitamin and Nutrition Research.InternationaleZeitschriftfur Vitamin-und Ernahrungsforschung.Journal international devitamniologie et de nutrition 68：159-173(1997)；Brenna，“Efficiency ofConversion of α-Linolenic Acid to Long Chain n-3Fatty Acids in Man，“CurrentOpinion in Clinical Nutrition &Metabolic Care 5：127-132 (2002)，其通过引用的方式整体并入本文)。ALA强化蛋的饮食消耗将具有有限的健康促进效果。虽然通过微藻以及亚麻籽油补充，蛋黄中的ALA和DHA含量没有改变，但通过补充微藻，EPA含量略有提高(表15，同上)。如果藻中的EPA含量是影响蛋中EPA含量的唯一因素，那么来自藻B组的蛋应当显示比来自藻A组的EPA含量较少少的EPA含量。来自微藻B组的蛋黄中的EPA富集与来自微藻A组的蛋黄相当，这表明微藻中的EPA不是富集的唯一来源，并且来自微藻的其它化合物可能调节EPA产生。
鱼腥味或异味是n-3脂肪酸强化蛋的消费者的主要抱怨。这是由于饲料成分(鱼油或鱼粉)对蛋的携带效应和/或PUFA的氧化。为了减轻n-3脂肪酸强化蛋的这种鱼腥味或异味，可限制应用于产蛋鸡饮食的鱼油或鱼粉的饮食补充水平(Gonzalez-Esquerra等人，“Effect of Feeding Hens Regular or Deodorized Menhaden Oil on ProductionParameters，Yolk Fatty Acid Profile，and Sensory Quality of Eggs，” PoultryScience 79：1597-1602(2000)；Baucells等人，“Incorporation of DifferentPolyunsaturated Fatty Acids into Eggs，”Poultry Science 79：51-59(2000)，其通过引用的方式整体并入本文)或高剂量的合成抗氧化剂已经提供在产蛋鸡饮食中(Meluzzi等人，“Effects of Dietary Vitamin E on the Quality of Table Eggs Enriched withn-3Long-Chain Fatty Acids，”Poultry Science 79：539-545(2000)；Parpinello等人，“Sensory Evaluation of Egg Products and Eggs Laid from Hens Fed Diets withDifferent Fatty Acid Composition and Supplemented with Antioxidants，”FoodResearch International39：47-52(2006)，其通过引用的方式整体并入本文)。除了n-3脂肪酸外，微藻含有大量的生物活性营养物、维生素、矿物质、抗氧化剂和类胡萝卜素(Austic等人，“Potential and Limitation of a New Defatted Diatom Microalgal Biomass inReplacing Soybean Meal and Com in Diets for Broiler Chickens，” Journal ofAgriculturaland Food Chemistry 61：7341-7348(2013)，其通过引用的方式整体并入本文)。植物和光合生物体中发现的类胡萝卜素具有高抗氧化活性(Paiva等人，“β-Caroteneand Other Carotenoids as Antioxidants，”Journal of the American College ofNutrition 18：426-433 (1999)，其通过引用的方式并入本文)。在产蛋鸡饮食中补充微藻通过增加类胡萝卜素沉积使蛋黄颜色变暗(Fredriksson等人，“Fatty Acid andCarotenoid Composition of Egg Yolk as an Effect of Microalgae Addition toFeed Formula for Laying Hens，”Food Chemistry 99：530-537 (2006)；Lorenz等人，“Commercial Potential for Haematococcus Microalgae as a Natural Source ofAstaxanthin，”Trends in Biotechnology 18：160-167(2000)；Herber-McNeill等人，“Dietary Marine Algae Maintains Egg Consumer Acceptability While EnhancingYolk Color，” Poultry Science 77：493-496(1998)，其通过引用的方式整体并入本文)，其可降低脂肪酸氧化和防止异味。
这些实验证明微藻可在具有亚麻籽油的情况下用作蛋白质和脂肪酸来源以产生富含n-3脂肪酸的蛋，而对母鸡体重、饲料摄入和产蛋性状没有不利影响。微藻的包含水平可以达到7.5至15％，以替代用于产蛋鸡的饮食中的玉米和大豆粉。微藻还可以减轻亚麻籽油对体重的负面影响。补充还减少蛋黄中的n-6脂肪酸，并且增加EPA和 DNA浓度，导致生产更有益于人健康的蛋。通过将微藻补充到母鸡饮食中来缓解n-3脂肪酸强化蛋的主要问题-鱼腥味和/或异味。在这些研究中使用的微藻处理有助于生产消费者可接受的n-3脂肪酸强化蛋，主要是由于异味的减少。这样的饮食应用于生产“消费者友好的”保健食品。
实施例2：补充脱脂绿微藻生物质对肉鸡的生长性能、水摄入、磷和DNA保留、和骨特性的剂量依赖性影响
材料和方法
实验饮食和动物护理
所有动物方案得到康奈尔大学机构动物护理和使用委员会批准。两个实验都在康奈尔大学家禽研究场进行(Cornell University Poultry Research Farm)。从商业孵化场获得孵化的雄性Ross肉雏鸡(1天龄)，并圈养在温度控制的笼层架中。在开始(0至3周)和生长(3至6 周)期期间，将雏鸡分别以每笼6只和4只的组圈养。所有的禽都可以自由获得饲料和水，并接受每天22小时的光和2小时的黑暗的关照计划。在每个实验开始时记录体重(“BW”)，并且此后每周记录 BW和饲料消耗。在实验1中每天记录水摄入，在实验2中记录第0-3 周，其中在第1周在500mL雏鸡饮水器中提供水，然后在第2周和第3周在3L水盘(waterpan)中提供水。在实验2的生长周期水由水线提供，并且没有评估水摄入。DGA生物质(海洋微拟球藻，Cellana， Kailua-Kona，HI)的营养组成示出在表16中。玉米-大豆粉基础饮食(BD)和所有其它实验饮食是等氮和等能量的并满足每个生长阶段的所有营养需求(NRC，“Nutrient Requirements of Poultry，”9th rev.ed. Natl.Acad.Press，Washington，DC(1994)，其据此通过引用的方式整体并入)。在每周记录动物BW和(或)采集血液和组织样品之前，饲料保留6小时。
表16.脱脂绿微藻生物质的营养组成1
Figure BDA0001242620920000571
1由Dairy One Inc.(Ithaca，NY)进行近似分析，并且由密苏里大学(Universityof Missouri)(Columbia，MO)的农业实验站化学实验室(Agricultural ExperimentStation Chemical Laboratories)测定氨基酸。
在实验1中，将日龄鸡(总计＝90)分成3个处理组(n＝5个笼 /处理)，并饲喂基于玉米-大豆粉的饮食(“BD”)、BD+20％DGA (DGA)或BD+20％DGA+NSP酶(DGA-E，1∶4∶5比率的Ronozyme WX：Ronozyme A：Roxazyme G2(DSM Nutritional Products Inc.， Parsippany，NJ)(表17)持续3周。
表17.用于实验1的饮食的配方和营养组成(第0-3周)
Figure BDA0001242620920000581
1提供(以mg/kg饮食计)：硫酸铜，31.42；碘化钾，0.046；硫酸铁，224.0；硫酸锰，61.54；亚硒酸钠，0.13；氧化锌，43.56；和钼酸钠，1.26。
2提供(以IU/kg饮食计)：维生素A，6500；维生素D3，3500；维生素E，25和(以mg/kg饮食计)：核黄素，25；d-泛酸钙，25；烟酸，150；氰钴胺素，0.011；氯化胆碱，1250；生物素，1.0；叶酸， 2.5；盐酸硫胺素，7.0；盐酸吡哆醇，25.0；和甲萘醌亚硫酸氢钠， 5.0。3分析值。
在实验2中，将日龄雏鸡(总数＝180)分成5个处理组(n＝6 个笼/处理)，并饲喂含有0％、2％、4％、8％或16％的DGA“原样”持续6周。从第0周至第3周饲喂开始饮食(表18)，并且从第3周至第6周饲喂生长饮食(表19)。
表18.在实验2的开始阶段中使用的饮食的组成
Figure BDA0001242620920000591
1提供(以mg/kg饮食计)：硫酸铜，31.42；碘化钾，0.046；硫酸铁，224.0；硫酸锰，61.54；亚硒酸钠，0.13；氧化锌，43.56；和钼酸钠，1.26。
2提供(以IU/kg饮食计)：维生素A，6500；维生素D3，3500；维生素E，25和(以mg/kg饮食计)：核黄素，25；d-泛酸钙，25；烟酸，150；氰钴胺素，0.011；氯化胆碱，1250；生物素，1.0；叶酸， 2.5；盐酸硫胺素，7.0；盐酸吡哆醇，25.0；和甲萘醌亚硫酸氢钠， 5.0。
3分析值。
表19.在实验2的生长期中使用的饮食的组成
Figure BDA0001242620920000601
1提供(以mg/kg饮食计)：硫酸铜，31.42；碘化钾，0.046；硫酸铁，224.0；硫酸锰，61.54；亚硒酸钠，0.13；氧化锌，43.56；和钼酸钠，1.26。
2提供(以IU/kg饮食计)：维生素A，6500；维生素D3，3500；维生素E，25和(以mg/kg饮食计)：核黄素，25；d-泛酸钙25；烟酸，150；氰钴胺素，0.011；氯化胆碱，1250；生物素，1.0；叶酸， 2.5；盐酸硫胺素，7.0；盐酸吡哆醇，25.0；和甲萘醌亚硫酸氢钠， 5.0。
3分析值。
血液收集、组织提取和生物化学分析
在实验1和实验2二者的第3周，以及另外在实验2的第6周，从2只雏鸡/笼中收集血液。在用CO2麻醉动物后，使用肝素化针通过心脏穿刺抽取血液。将血液在冰上冷冻，以3000g离心15分钟，并且将所得血浆储存在-20℃直至分析。在实验1(第3周)和实验2 (第3和6周)中取出胸大肌、肝脏和心脏并称重。在实验2的第3 周和第6周，取出包括砂囊和前胃的总胃肠道，并用PBS洗涤3次，以测量各节段的重量和(或)长度。
如先前所述(Austic等人，“Potential and Limitation of a New DefattedDiatom Microalgal Biomass in Replacing Soybean Meal and Corn in Diets forBroiler Chickens，”J.Agric.Food Chem. 61(30)：7341-7348(2013)，其通过引用的方式整体并入本文)测定血浆丙氨酸氨基转移酶(“ALT”)和碱性磷酸酶(“AKP”)活性和血浆无机磷浓度。使用商业试剂盒(GAGO20，Sigma-Aldrich，St.Louis， MO)测定血浆葡萄糖浓度。使用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，Invitrogen， Grand Island，NY)分离血浆DNA，并通过分光光度法(A260/280) 检测所得DNA质量和数量。
胫骨特征
在实验2的第6周从每个笼子的一只雏鸡获得胫骨。在除去腓骨和周围结缔组织和肌肉之后，将清洁的胫骨在4℃下储存在密封的塑料袋中，直到分析。记录骨的长度和重量，并使用Instron通用测试仪5965(Norwood，MA)使用3点弯曲测试测定机械性能。收集最大延伸、最大斜率、最大负荷和最大负荷下的延伸。
营养消化和保留
在实验2的第6周，从每个笼中选择两只禽用于总排泄物收集和磷的间接估计，并且都使用氧化铬得到的DNA消化率和保留是不可消化的标志物(0.3％纳入)。在饲喂含有氧化铬的饮食的4天驯化期和8小时禁食后，称重新鲜饲料并饲喂给禽，以从每个笼收集总排泄物，每天两次，持续3天。将收集的排泄物储存在-20℃直至干燥。在3天收集期结束时，所有动物禁食6小时，并通过CO2人道实施安乐死，以从回肠收集消化物样品。称量排泄物和消化物，然后在强制通风烘箱中在80℃下干燥(Ravindran等人，“A Comparison of IlealDigesta and Excreta Analysis for the Determination of Amino AcidDigestibility in Food Ingredients for Poultry，”Br.Poult.Sci. 40(2)：266-274(1999)，其通过引用的方式整体并入本文)。在笼内合并排泄物，并且在干燥过程之前除去任何羽毛或碎片。然后称重所得样品，研磨成细粉并储存在-20℃下用于分析。通过Bolin及其同事的方法(Bolin等人，“A Simplified Method for the Determination of ChromicOxide(Cr2O3)When Used as an Index Substance，”Science 116(3023)：634-635(1952)，其通过引用的方式整体并入本文)测定回肠消化物和饲料样品中的氧化铬。分别分析回肠消化物和排泄物中可溶性无机磷和DNA的消化率和保留的估计。应用与上述用于分析血浆无机磷和DNA相同的程序以确定其在干燥的回肠消化物和排泄物中的浓度。
统计分析
使用PC-SAS 8.1(SAS Inst.Inc.，Cary，NC)的GLM程序分析实验1和2二者的数据。使用单因素ANOVA确定饮食处理的总体主要效果。使用Duncan多重范围检验进行平均值比较。还使用SAS的线性和二次回归模型分析实验2的数据。数据表示为平均值，并且认为 P＜0.05是统计显著的，并且认为P＜0.10是一种趋势。
实验I结果
实验1的生长性能数据示出在表20中。在实验开始时，平均雏鸡重量在各个饮食组之间没有不同。消耗所有含有DGA的饮食的雏鸡在第1周和第2周时显示增加的体重(P＜0.05)；然而，DGA纳入在第3周未影响体重。饲喂DGA饮食的雏鸡在第1周，而不是在第 2周或第3周比饲喂BD的雏鸡具有更大的(P＜0.05)ADG。饲喂NSP 酶饮食的雏鸡在第1周时比饲喂BD+DGA饮食的雏鸡具有增加的 ADFI(P＜0.05)。饲喂DGA饮食的雏鸡在第1周和在整个3周时段里具有较大的饲料利用效率(P＝0.05)。此外，DGA和NSP酶都对 AKP和ALT的血浆活性或葡萄糖和无机磷的浓度没有任何影响。
表20：补充脱脂微藻和NSP酶对实验1中肉雏鸡的生长性能和血浆生化概况的影响
Figure BDA0001242620920000631
Figure BDA0001242620920000641
数据表示为平均值(n＝5/处理)。
1DGA＝脱脂绿微藻生物质(海洋微拟球藻，Cellana，Kailua-Kona， HI)。
21∶4∶5的比率的Ronozyme WX：Ronozyme A：Roxazyme G2(DSM NutritionalProducts Inc.，Parsippany，NJ)。
3AKP＝碱性磷酸酶，ALT＝丙氨酸氨基转移酶。
a-b每行中具有不同上标的值根据单因素ANOVA不同(P＜0.05) NS：不显著。
通过在所有时间点与对照相比饲喂含DGA的饮食提高每日水摄入(图1A)(P＜0.0001)，从而在3周实验期间增加54％。而饮食处理显示在第3周时对肝脏或胸部的相对重量没有影响，饲喂DGA饮食相对于对照将心脏的相对重量提高了35至41％(图1B)。
实验II结果
随着DGA的增加，体重在第3周和第6周降低。在第3周和第 6周，存在DGA消耗的线性(分别为P＜0.05，R2＝0.15和P＜0.01， R2＝0.37)和二次(分别为P＜0.01，R2＝0.37和P＜0.05，R2＝0.40) 影响。然而，与对照饲喂的禽相比，只有16％的DGA饲喂的禽的体重显示体重减少。在第0-3周，但不是第3-6周或第0-6周期间，增加饮食DGA浓度对ADG有线性(P＝0.05，R2＝0.13)和二次(P＜0.01， R2＝0.38)影响(表21)。在每个时间点，饲喂16％DGA饮食的雏鸡的ADG低于所有其它处理组的ADG(P＜0.05)。然而ADFI不受任何水平的DGA纳入的影响，但在生长(P＜0.01)和整个时期(P＜0.01) 中饲料利用效率随着DGA纳入增加而线性降低。饲喂16％DGA的雏鸡比对照和(或)其它处理组的饲料使用效率低(P＜0.05)。响应于在第1周(P＜0.01，R2＝0.29)，第2周(P＜0.0001，R2＝0.82)和第3周(P＜0.0001，R2＝0.91，数据未显示)时增加的DGA纳入，以线性方式增加水摄入。在3周开始期间，水摄入线性增加(P＜0.0001， R2＝0.76)；与对照相比，在第0周至第3周饲喂8和16％DGA饮食的鸡消耗了16至39％(P＜0.05)的水。
表21：增加的补充脱脂微藻水平对实验2中的肉雏鸡的生长性能和水摄入的影响
Figure BDA0001242620920000651
Figure BDA0001242620920000661
数据表示为平均值(n＝6/处理)。
1DGA＝脱脂绿微藻生物质(海洋微拟球藻，Cellana，Kailua-Kona， HI)
2使用SAS的线性和二次回归模型分析数据。
a-c每行中具有不同上标的值根据单因素ANOVA不同(P＜0.05)。
3NS＝不显著。
图2A-图2 F显示在第3周(图2A，P＜0.05，R2＝0.16)和第6周(图 2B，P＜0.10，R2＝0.19)的肝脏，第3周(图2C，P＝0.001，R2＝0.33) 和第6周(图2D，P＜0.0001，R2＝0.45)的心脏，和第6周(图2F， P＜0.05，R2＝0.19)的肠的相对重量随DGA纳入的线性增加。然而，对第6周胸部(13.5±0.48％)、砂囊(1.24±0.15％)、前胃(0.24±0.04％) 的相对重量或每长度的肠重量(0.25±0.02g/cm)没有此类影响。
虽然随着DGA纳入增加，胫骨重量(P＝0.01，R2＝0.27)和长度(P＜0.05，R2＝0.21)呈线性减小，但饲喂16％DGA饮食的雏鸡的仅胫骨重量，而非长度比饲喂BD的雏鸡的胫骨重量低(P＜0.05) (表22)。DGA纳入对最大斜率或能量和最大负荷下的延伸没有线性或二次效应。然而，饲喂8％DGA饮食的雏鸡比饲喂4或16％DGA 饮食的雏鸡具有较低的(P＝0.10)最大斜率，并且比饲喂对照饮食的雏鸡具有较低的(P＜0.10)最大负荷下延伸。第6周时的血浆无机磷浓度不受DGA纳入影响。回肠可溶性无机磷消化率呈线性下降 (P＜0.01，R2＝0.26)，但随着DGA纳入增加，可溶性无机磷保留呈线性增加(P＜0.001，R2＝0.39)。可溶性无机磷的每日排泄显示出随着DGA纳入增加而下降的趋势(P＝0.10)。DNA的血浆或排泄物浓度都不受DGA纳入影响(表23)。然而，响应于不同水平的DGA补充，回肠DNA浓度(P＜0.0001，R2＝0.50)和DNA保留(P＜0.001， R2＝0.46)线性增加。
表22：脱脂微藻的升高水平对实验2中胫骨特征和可溶性无机磷消化和保留的影响
Figure BDA0001242620920000671
Figure BDA0001242620920000681
数据表示为平均值(n＝6/处理)。
1DGA＝脱脂绿微藻生物质(海洋微拟球藻，Cellana，Kailua-Kona， HI)
2使用SAS的线性和二次回归模型分析数据。
a-c每行中具有不同上标的值根据单因素ANOVA不同(P＜0.05)。
3NS＝不显著。
4在第6周使用氧化铬作为不可消化标志物的间接法评估。
5在第6周使用总收集数据评估。
表23：补充脱脂微藻的增加水平对实验2的第6周的血浆、回肠消化道和排泄物中的磷和DNA浓度的影响
Figure BDA0001242620920000682
Figure BDA0001242620920000691
数据表示为平均值(n＝5/处理)。
1DGA＝脱脂绿微藻生物质(海洋微拟球藻，Cellana，Kailua-Kona， HI)
2使用SAS的线性和二次回归模型分析数据。
a-c每行中具有不同上标的值根据单因素ANOVA不同(P＜0.05)。
3NS＝不显著。
4在第6周基于来自总排泄物收集研究的数据评估。
讨论
来自实验1和2二者的最重要的发现是与对照相比，饲喂含有 8％或更高水平的DGA的饮食的雏鸡的每日水摄入实质性增加。当脱脂海洋微藻生物质的高盐浓度导致我们以前通过实验雏鸡对大量排泄物的观察(Austic等人，“Potential and Limitation ofaNew Defatted Diatom Microalgal Biomass in Replacing Soybean Meal and Com inDiets for Broiler Chickens，”J.Agric.Food Chem.61(30)：7341-7348 (2013)；Leng等人，“Effect of Dietary Defatted Diatom Biomass on Egg Production and Qualityof Laying Hens，”Journal of AnimalScience and Biotechnology 5(1)：3(2014)，其通过引用的方式整体并入本文)时，本研究表示通过饲喂生物质实际水摄入增加的第一直接测量。尽管增加的水摄入与实验1中的20％DGA饮食相关，并且实验2中的8％ DGA饮食没有抑制生长性能，但是额外的水使用将不仅导致对农业用水需要的更高需求，而且还导致较大量的废弃物。后者是现代家禽生产中的主要关注点(Francesch等人，“NutritionalFactors Affecting Excreta/Litter Moisture and Quality，”Worlds Poult.Sci.J.60(01)：64-75. (2004)，其通过引用的方式整体并入本文)。消耗实验1中20％DGA 饮食和实验2中16％DGA饮食的雏鸡也显示在一次饮水后饲喂时水反刍(water regurgitation)的发生。那可能是由于施加在作物上的压力，并可能导致饲料损失。同时，DGA饮食的增加的消耗，主要是由于高盐摄入，产生更重的心脏和(或)肝脏重量。Mirsalimi等人，“BloodVolume Increase in Salt-Induced Pulmonary Hypertension，Heart Failure andAscites in Broiler and White Leghorn Chickens，”Can.J.Vet.Res. 57(2)：110-113(1993)，其通过引用的方式整体并入本文)报道了与未处理的对照相比，消耗0.5％盐水的肉雏鸡的右心室和总心室的相对重量和总血液体积的增加。通过代谢性方式的高钠摄入导致血液体积和流动增加，最终导致右心室肥大和肺性高血压(Julian等人，“The Effect ofDietary Sodium on Right Ventricular Failure-Induced Ascites， Gain and FatDeposition in Meat-Type Chickens，”Can.J.Vet.Res. 56(3)：214-219(1992)，其通过引用的方式整体并入本文)。显然，必须采取额外的处理步骤以除去存在于DGA生物质中的额外的盐，用于动物饲喂中其高蛋白和其它营养物的全部潜力。
本研究的另一个新发现是在实验2中饲喂DGA级别水平的雏鸡中保留的线性增加和总可溶性无机磷排泄的线性减少。值得注意的是，与对照相比，饲喂16％DGA饮食的雏鸡将它们的总可溶性磷排泄减少了24％。这种减少是饲喂这种新型DGA生物质的意想不到的益处，因为使粪肥磷排泄的环境污染最小化目前是动物农业的主要兴趣(Bourgeois，“ADiscounted Threat：Environmental Impacts of the Livestock Industry，”EarthCommon Journal 2(1)(2012)，其通过引用的方式整体并入本文)。显然，需要更广泛的研究来跟踪这一发现以充分理解与DGA饲喂相关的这种减少的磷排泄的机制和环境影响。有趣的是，回肠总可溶性磷消化率显示随饮食DGA纳入增加的线性减少。以前报道了消化和保留营养物质对微藻饲喂之间的相反响应。饲喂微藻极大螺旋藻的断奶猪表现出降低的表观营养物消化率，同时增加吸收的营养物的代谢利用，从而补偿低消化率(Fevrier等人，“Incorporation of a Spiruline(Spirulina maxima)in Swine Food，”Ann.Nutr.Aliment.29(6)：625-650(1975)，其通过引用的方式整体并入本文)。在本研究中，回肠磷消化率相当高，而不论DGA纳入水平如何。血浆无机磷浓度也不受DGA水平的影响。虽然DGA纳入引起胫骨重量和长度的剂量依赖性线性减小，但处理不影响胫骨强度或其它功能指标。事实上，饲喂16％DGA饮食的雏鸡的胫骨重量或长度减少可能通过身体尺寸的相应减少来解释。
总而言之，来自DGA生物质的磷与来自BD的成分的磷在维持身体磷状态和骨功能方面一样生物可用(若不是超过的话)。DGA的这个特征是其在肉鸡饲喂中的应用的必要条件，因为在肉鸡中快速生长的选择可能使它们易于骨骼畸形或骨破裂(Julian，“RapidGrowth Problems：Ascites and Skeletal Deformities in Broilers，”Poult.Sci. 77(12)：1773-1780(1998)，其通过引用的方式整体并入本文)。这些问题导致死亡率，低生产率和屠体谴责，并且与每年损失几亿美元相关 (Rath等人，“Factors Regulating BoneMaturity and Strength in Poultry，”Poult.Sci.79(7)：1024-1032.(2000)，其通过引用的方式整体并入本文)。
本研究意味着确定DGA中DNA的命运和保留的第一次努力。使用单细胞蛋白质来源如微藻的一个值得关注的问题是高含量的核酸(Schulz等人，“Composition andNutritive Value of Single-Cell Protein (SCP)，”Anim.Feed Sci.Technol.1(1)：9-24(1976)；Giesecke等人，“Availability and Metabolism of Purines of Single-CellProteins in Monogastric Animals，”Proc.Nutr.Soc.41(03)：319-327(1982)，通过引用的方式将其全部并入本文)。核酸和其它非蛋白氮组成微藻中发现的总氮的10％(Becker，“Micro-algae as a Source of Protein，”Biotechnol. Adv.25(2)：207-210(2007)，其是通过引用的方式整体并入本文)。过量的核酸消耗导致高的尿酸产生，这可能在缺乏尿酸酶的动物中引起痛风和肾结石形成(Ravindra，“Value-added Food：Single Cell Protein，”Biotechnol.Adv.18(6)：459-479(2000)，其通过引用的方式整体并入本文)。因为尿酸是雏鸡中蛋白质代谢的最终产物，所以它们可能进化以消耗具有高核酸含量的饲料(Shannon等人，“The Effect of Different Dietary Levels of an-Paraffin-Grown Yeast on theGrowth and Food Intake of Broiler Chicks，”Br.Poult.Sci.13(3)：267-272(1972)，其通过引用的方式整体并入本文)。然而，尚未检查DGA中核酸的代谢命运和排泄。本研究的初步结果表明，DGA的消耗增加不会改变血浆DNA 浓度。当回肠DNA浓度在6周龄雏鸡中与DGA纳入呈线性增加时，其排泄物DNA在处理组之间保持相似，可能是由于肠微生物贡献。值得注意的是，DNA保留随DGA补充增加。保留的核苷酸可用于核酸合成，从而导致器官和肌肉中DNA和RNA含量增加(Schulz等人，“Composition and Nutritive Value of Single-CellProtein(SCP)，” Anim.Feed Sci.Technol.1(1)：9-24(1976)，其通过引用的方式整体并入本文)。
在20％DGA饮食中补充NSP酶在开始期间没有显示对肉鸡的额外的生长促进或水摄入节约益处。尽管这种影响缺乏好于在先前的肉鸡实验中看到的对生长性能的有害影响(Ekmay等人，“Nutritional and Metabolic Impacts of a Defatted Green MarineMicroalgal (Desmodesmus sp)Biomass in Dietsfor Weanling Pigs and BroilerChickens，”J.of Agric.Food Chem.62(40)：9783-9791(2014)，其通过引用的方式整体并入本文)，但在高水平的纤维和NSP的情况下难以解释，包括微藻中的纤维素(Northcote等人，“The Chemical Composition and Structure of the Cell Wall of Hydrodictyonafricanum Yaman，” Biochem.J.70(3)：391(1958)；Fu等人，“Hydrolysis of MicroalgaeCell Walls for Production of Reducing Sugar and Lipid Extraction，”Bioresour.Technol.101(22)：8750-8754.(2010)，其通过引用的方式整体并入本文) 和木糖(Takeda，H.，“Classification of Chlorella Strains by Means of the Sugar Components ofthe Cell Wall，”Biochem.Syst.Ecol.16(4)：367-371 (1988)，其通过引用的方式整体并入本文)。升高的NSP消耗可能对营养物消化具有有害的影响，并且高NSP的饮食可能引起高的肠粘度，最终降低了通过肠壁的营养物吸收的效率(Johnson等人，“Effect of Gel-Forming Gums on the Intestinal Unstirred Layer and Sugar Transport In Vitro，”Gut 22(5)：398-403(1981)，其通过引用的方式整体并入本文)。因此，通常掺入NSP酶以增加肉鸡饮食的营养价值(Edney 等人，“The Effect of β-glucanase Supplementation onNutrient Digestibility and Growth in Broilers Given Diets Containing Barley，Oat Groats or Wheat，”Anim.Feed Sci.Technol.25(1)：193-200.(1989)； Viveros等人，“Effect of Enzyme Supplementation of a Diet Based on Barley，and AutoclaveTreatment，on Apparent Digestibiliry，Growth Performance and Gut Morphology ofBroilers，”Anim.Feed Sci.Technol. 48(3)：237-251(1994)；Vranjes等人，“TheInfluence of Extruded vs. Untreated Barley in the Feed，with and WithoutDietary Enzyme Supplement on Broiler Performance，”Anim.Feed Sci.Technol. 54(1)：21-32(1995)；Steenfeldt等人，“Enzyme Supplementation of Wheat-Based Dietsfor Broilers：1.Effect on Growth Performance and Intestinal Viscosity，”Anim.Feed Sci.Technol.75(1)：7-43(1998)；Wang等人，“Effects of EnzymeSupplementation on Performance，Nutrient Digestibility，GastrointestinalMorphology，and Volatile Fatty Acid Profiles in the Hindgut of Broilers FedWheat-Based Diets，”Poult.Sci. 84(6)：875-881(2005)，其通过引用的方式整体并入本文)。随后，提出这些酶改善含有相对高水平纤维的DGA中营养物的消化和利用。当在所示的实验1中没有补充NSP酶的益处时，观察到实验2中相对肠重量随着食用DGA纳入增加的线性增加。已经证明，高食用纤维摄入增加相对小肠重量(Abdelsamie等人，“The Influence ofFibre Content and Physical Texture of the Diet on the Performance of Broilersin the Tropics，”Br.Poult.Sci.24(3)：383-390(1983)；
Figure BDA0001242620920000731
等人，“TheInfluence of Dietary Fibre Source and Level on the Development of theGastrointestinal Tract，Digestibility and Energy Metabolism in BroilerChickens，”Br.J.Nutr.75(03)：379-395(1996)，其通过引用的方式整体并入本文)。
总体上，来自实验1的结果表明，在肉鸡的开始饮食中补充 20％DGA不影响它们的生长性能，但是将它们的水摄入增加超过 50％。向饮食中添加NSP酶证明对生长或水摄入没有一致的益处。实验2中的多个测量显示肉雏鸡在整个开始和生长期间完全耐受4％的DGA纳入。尽管对生长性能或各种生化和代谢量度没有不利影响 (Austic等人，“Potentialand Limitation of a New Defatted Diatom Microalgal Biomass in ReplacingSoybean Meal and Corn in Diets for Broiler Chickens，”J.Agric.Food Chem.61(30)：7341-7348(2013)，其通过引用的方式整体并入本文)，但是8％DGA饮食导致升高的水消耗和重要器官的相对重量。同时，16％DGA饮食导致不如对照的许多 (如果不是全部)响应。在38％的CP的情况下，优良的氨基酸谱以及对可口性(饲料摄入)、磷或核酸(DNA)的未被认可的关注，测试的DGA生物质的最有限的因素可能是其高盐浓度。直接副作用包括升高的水摄入和心脏和(或)其它器官的肥大。在实验1中通过 20％DGA饮食对生长性能的影响的缺乏可能与来自“饲料驱动的”水消耗的BW增加混淆。显然，必须使用用于探索其完全营养、代谢和环境潜能的额外加工步骤去除DGA中的额外盐。
实施例3：使用脱脂绿微藻生物质产生ω-3富集的肉鸡
材料和方法
动物、饮食和管理
本实验的所有方案由康奈尔大学机构动物护理和使用委员会批准。孵化的雄性Ross肉雏鸡从商业孵化场获得，并且圈养在康奈尔大学家禽研究农场的动物研究楼中的温度控制室中。将肉雏鸡在恒温控制的笼式层架中圈养前3周，每笼6只雏鸡；然后从第3周至第6 周将4只雏鸡在室温下转移到生长笼中。雏鸡自由获得饲料和水，并且接受光照22小时和黑暗2小时的光照计划。将禽饲喂5种含有0％(对照)、2％、4％、8％或16％DGA(按“原样”计)的饮食处理(n＝ 6)之一，代替玉米和大豆粉的混合物。开始(0至3周)和生长(3-6 周)饮食配制成等能量的并且满足每个生长阶段对所有必需营养物的需求(NRC NutrientRequirements of Poultry：Ninth Revised Edition，The National Academies Press：Washington，DC(1994)，其通过引用的方式整体并入本文)。每个开始和生长饮食的脂肪酸谱在表24中给出。在第3周和第6周，通过用CO2窒息使两只禽安乐死，然后从每个笼子2只雏鸡使用肝素化针通过心脏穿刺抽取血液。将血液储存在冰上，以3000g离心15分钟，并且将血浆储存于-20℃直至分析。取出肝脏、胸部肌肉和腿，并且将每种的一部分在液氮中快速冷冻并储存在-80℃用于将来分析。将整个无皮的胸部和腿密封在塑料袋中并冷冻用于脂肪酸分析。
Figure BDA0001242620920000761
Figure BDA0001242620920000771
脂肪酸提取
对于脂肪酸提取，将所有饮食研磨成细粉。从肝脏、整个胸部的核心(胸大肌)和大腿(股二头肌)取组织样品。根据Ichihara等人“An Improved Method for Rapid Analysisof the Fatty Acids of Glycerolipids，”Lipids 31：535-539(1996)(通过引用的方式将其全部内容引入本文)，将来自饮食、血浆和组织中的脂肪酸用甲醇-KOH甲基化，使用十三烷酸(Sigma-Aldrich Co.，St Louis，MO)作为内部标准品。每种脂肪酸通过其相对于脂肪酸甲酯标准品(Sigma-Aldrich Co.，St Louis，MO)的保留来鉴定。使用装有火焰离子化检测器的气相色谱仪器(Agilent 6890N，Agilent Technologies，Santa Clara， CA)分析脂肪酸甲酯，并且使用涂有CP-SIL 88(100m×0.25mm i.d.， 0.2mm膜厚度；Varian Inc，LakeForest，CA)的熔融石英毛细管柱。将烘箱温度编程为在140℃保持4分钟，以每分钟4℃增加至220℃，然后保持5分钟。载气是具有2ml/s的恒定流速的N2，并且注射器温度为230℃，并且检测器温度为280℃。
基因表达
对快速冷冻的肝脏样品进行实时RT-PCR，以使用β-肌动蛋白作为参照基因来估计mRNA的丰度。靶基因包括ME、FASN、Δ-6去饱和酶和Δ-9去饱和酶。分离RNA，通过琼脂糖凝胶和光谱法 (A260/A280)验证其质量，并使用可商购试剂盒(Applied Biosystems，GrandIsland，NY)转录。将所得cDNA(0.3μg)加入到包括Power SYBR Green PCR主混合物(Applied Biosystems)和 0.625μM正向和反向引物(表25)的10μL总反应中。使用7900HTFast Real-Time PCR系统(Applied Biosystems)进行实时PCR分析。PCR 包括初始2分钟50℃步骤和在95℃10分钟的“热启动”步骤，然后是 95℃变性步骤15秒和60℃退火步骤60秒的40个循环。分析所有引物的解链曲线以评估扩增产物的质量。对于靶基因和感兴趣的基因二者，每个样品一式两份地进行分析。使用Δ循环阈值(ΔCt)方法测定相对mRNA丰度。对于每个样品，计算靶基因和参照基因之间的 Ct差异(ΔCt＝Ct靶标-Ct参考)。然后通过将2增加到幂(power)-ACt (2-ΔCt)而将ΔCt值转换为倍数差。
表25：引物设计
Figure BDA0001242620920000791
统计分析
对于6的实验单位，在笼内合并数据。通过ANOVA和使用 PC-SAS 9.2的线性回归模型分析数据。饮食组之间的差异通过 ANOVA确定，并使用Duncan多范围检验分离。对于基因表达数据，使用t检验将仅选择的处理效果直接与对照组比较。数据表示为平均值±SEM，并且数据被认为在P＜0.05是显著的，并且在P＜0.10视为趋势。
结果与讨论
对DGA的中等水平(8％)耐受6周而不影响生长性能。然而，生物质中残留的n-3脂肪酸的代谢命运以前是未知的。该实验表明，饮食脱脂微藻生物质消耗能够改变肉鸡的血浆、肝脏、胸部和大腿肌肉的脂肪酸谱。
脱脂微藻生物质和实验饮食的脂肪酸组成示出在上文表24中。 DGA的总脂质含量为3.6％，其总EPA含量为总脂肪酸的16.5％。第 6周血浆的脂肪酸谱(表示为总脂肪酸的百分比)示出在表26中，并且第3周显示在表27上。
表26.增加的补充脱脂微藻水平对肉雏鸡中表示为总脂肪酸的百分比的第6周血浆脂肪酸谱的影响
Figure BDA0001242620920000801
数据表示为平均值(n＝6/处理)。
1DGA＝脱脂绿微藻生物质(海洋微拟球藻，Cellana，Kailua-Kona， HI)。
2使用SAS的线性回归模型分析数据。
a-d每行中具有不同上标的值根据单因素ANOVA不同(P＜0.05)。
3NS＝不显著。
表27：增加的补充脱脂微藻水平对肉雏鸡中表示为总脂肪酸的百分比的第3周血浆脂肪酸谱的影响
Figure BDA0001242620920000811
数据表示为平均值(n＝6/处理)。
1DGA＝脱脂绿微藻生物质(海洋微拟球藻，Cellana，Kailua-Kona， HI)。
2使用SAS的线性回归模型分析数据。
a-d每行中具有不同上标的值根据单因素ANOVA不同(P＜0.05)。
3NS＝不显著。
在两个时间点时的所有饮食处理中发现的主要脂肪酸是亚油酸 (C18：2n6)，随后是棕榈酸(C16：0)和硬脂酸(C18：0)。不管年龄如何，DGA纳入对饱和脂肪酸(“SFA”)、单不饱和脂肪酸(“MUFA”) 或PUFA没有影响。然而，存在n-3脂肪酸的线性增加(P＜0.0001)，在第3周(P＜0.0001，R2＝0.93)和第6周(P＜0.0001，R2＝0.75) 与对照组相比当雏鸡消耗16％DGA饮食时增加5和15倍。n-3脂肪酸的增加是由于EPA(C20：5n3)和DHA(C22：6n3)两者的增加。在第6周时，n-6脂肪酸呈线性减少(P＜0.05)，导致n-6与n-3脂肪酸比率相应降低(P＜0.0001)。
第6周(表28)和第3周(表29)肝脏的脂肪酸谱(表示为总脂肪酸的百分比)也受到饮食DGA纳入的影响。在第6周，主要的 4种脂肪酸(不管饮食处理如何)是棕榈酸、硬脂酸、反油酸(C18：1 n9)和亚油酸。此外，总SFA、MUFA和PUFA的百分比不受DGA 纳入影响。总的n-3脂肪酸的确线性增加(P＜0.001，R2＝0.38)，与对照相比，在16％DGA饮食的情况下增加3.1倍。类似于血浆，由于EPA(P＜0.0001，R2＝0.47)和DHA(P＝0.002，R2＝0.31)二者的增加，n-3脂肪酸的增加是明显的。存在n-6脂肪酸的线性减少趋势(P＝0.09，R2＝0.10)，导致n-6与n-3比率的相应的线性减小(P ＝0.0002，R2＝0.40)。在第3周显示类似的结果。
表28.增加的补充脱脂微藻水平对肉雏鸡中表示为总脂肪酸的百分比的第6周肝脏脂肪酸谱的影响
Figure BDA0001242620920000821
Figure BDA0001242620920000831
数据表示为平均值(n＝6/处理)。
1DGA＝脱脂绿微藻生物质(海洋微拟球藻，Cellana，Kailua-Kona， HI)。
2使用SAS的线性回归模型分析数据。
a-d每行中具有不同上标的值根据单因素ANOVA不同(P＜0.05)。
3NS＝不显著。
表29.增加的补充脱脂微藻水平对肉雏鸡中表示为总脂肪酸的百分比的第3周肝脂肪酸谱的影响
Figure BDA0001242620920000832
Figure BDA0001242620920000841
数据表示为平均值(n＝6/处理)。
1DGA＝脱脂绿微藻生物质(Cellana，Kailua-Kona，HI)。
2使用SAS的线性回归模型分析数据。
a-d每行中具有不同上标的值根据单因素ANOVA不同(P＜0.05)。
3NS＝不显著。
表30显示第6周胸部的脂肪酸谱(表示为总脂肪酸的百分比和 mg/g肌肉)。该组织中主要的脂肪酸不受DGA纳入影响，并且是反油酸和亚油酸，随后是棕榈酸。类似于血浆和肝脏中显示的结果， DGA对总SFA、MUFA或PUFA没有影响；然而，n-3脂肪酸有线性增加(P＜0.0001，R2＝0.76)。第3周显示类似的结果(表31)。还评估了总脂肪酸，表示为每100克肌肉样品中的mg。饮食DGA纳入对总脂肪没有影响，对总SFA、MUFA或PUFA也没有影响。然而， DGA纳入线性增加n-3(图3A，P＜0.0001，R2＝0.52)、EPA(图3C， P＜0.0001，R2＝0.87)和DHA(图3D，P＜0.0001，R2＝0.78)，并降低了n-6：n-3比率(图3B，P＜0.0001，R2＝0.57)。在100克胸部肌肉组织中的总组合EPA和DHA达到16.9mg，其中消耗16％DFA饮食，与消耗对照饮食的雏鸡相比，其增加超过60倍。虽然没有广泛研究，类似的实验支持了用微藻产品进行n-3补充的概念。饲喂全脂金黄海藻(Mooney等人，″Lipid and Flavour Quality of StoredBreastMeat from Broilers Fed Marine Algae，”J.Sci.Food Agric.78：134-140(1998)，其通过引用的方式整体并入本文)和富含DHA的微藻(Kalogeropoulos等人，“NutritionalEvaluation and Bioactive Micoconstituents (Carotenoids，Tocopherols，Sterolsand Squalene)of Raw and Roasted Chicken Fed on DHA-Rich Microalgae，”FoodRes.Int.43：2006-2013 (2010)；Abril等人，“Production of Docosahexaenoic Acid-Enriched Poultry Eggs and Meat Using an Algae-Based Feed Ingredient，”TheReturn of W3 Fatty Acids Into the Food Supply：Land-Based Animal Food Productsand Their Health Effects1：77-88(1998)，其通过引用的方式整体并入本文)的肉雏鸡显示与那些消耗对照给量的雏鸡相比，胸部肌肉总n-3含量增加和n-6：n-3比率减少。
表30.增加的补充脱脂微藻水平对肉雏鸡中表示为总脂肪酸的百分比和mg/100g样品的第6周的胸部脂肪酸谱的影响
Figure BDA0001242620920000851
Figure BDA0001242620920000861
数据表示为平均值(n＝6/处理)。
1DGA＝脱脂绿微藻生物质(海洋微拟球藻，Cellana，Kailua-Kona， HI)。
2使用SAS的线性回归模型分析数据。
a-d每行中具有不同上标的值根据单因素ANOVA不同(P＜0.05)。
3NS＝不显著。
表31.增加的补充脱脂微藻水平对肉雏鸡中表示为总脂肪酸的百分比和mg/100g样品的第3周的胸部脂肪酸谱的影响
Figure BDA0001242620920000862
Figure BDA0001242620920000871
数据表示为平均值(n＝6/处理)。
1DGA＝脱脂绿微藻生物质(海洋微拟球藻，Cellana，Kailua-Kona， HI)。
2使用SAS的线性回归模型分析数据。
a-d每行中具有不同上标的值根据单因素ANOVA不同(P＜0.05)。
3NS＝不显著。
大腿中的主要脂肪酸(表示为总脂肪酸的百分比和mg/g肌肉) 与在胸部组织中发现的脂肪酸相似(表32)。有趣的是，在第3周和第6周，SFA的百分比分别有趋势(P＝0.09)和显著的线性降低(P ＝0.01，R2＝0.20)，然而，对MUFA或PUFA没有影响。此外，在第 6周，n-3脂肪酸的百分比线性增加(P＜0.0001，R2＝0.80)。在第3 周显示类似的结果(表33)。当表示为mg/100克组织时，随着DGA 纳入的增加，第6周大腿肌肉PUFA有显著增加(P＝0.05)，并且总脂肪(P＝0.08)和SFA(P＝0.10，R2＝0.10)有增加的趋势；这可能是由于饮食SFA的增加。增加DGA消耗也降低了n-6：n-3脂肪酸的比率(图4B，P＜0.001，R2＝0.38)，其在最高水平的DGA纳入的情况下降低5.5倍。此外，n-3(图4A，P＜0.0001，R2＝0.78)、EPA (图4C，P＜0.0001，R2＝0.86)和DHA(图4D，P＜0.0001，R2＝0.83) 有线性增加。在100克大腿肌中的总组合EPA和DHA在DGA纳入的最高水平下为18mg，其是相对于对照的16.5倍增加。
表32.增加的补充脱脂微藻水平对肉雏鸡中表示为总脂肪酸的百分比和mg/100g样品的第6周大腿脂肪酸谱的影响
Figure BDA0001242620920000881
Figure BDA0001242620920000891
数据表示为平均值(n＝6/处理)。
1DGA＝脱脂绿微藻生物质(海洋微拟球藻，Cellana，Kailua-Kona， HI)。
2使用SAS的线性回归模型分析数据。
a-d每行中具有不同上标的值根据单因素ANOVA不同(P＜0.05)。
3NS＝不显著。
表33：增加的补充脱脂微藻水平对肉雏鸡中表示为总脂肪酸的百分比和mg/100g样品的第3周大腿脂肪酸谱的影响
Figure BDA0001242620920000892
Figure BDA0001242620920000901
数据表示为平均值(n＝6/处理)。
1DGA＝脱脂绿微藻生物质(海洋微拟球藻，Cellana，Kailua-Kona， HI)。
2使用SAS的线性回归模型分析数据。
a-d每行中具有不同上标的值根据单因素ANOVA不同(P＜0.05)。
3NS＝不显著。
增加DGA纳入通过其对EPA的贡献，同时完全缺乏DHA而提高了总饮食n-3脂肪酸。然而，在用DGA消耗分析的所有组织中， EPA和DHA二者的沉积都增加。有趣的是，在消耗16％DGA饮食的雏鸡组织中，DHA的沉积比EPA高1.12至2.50倍，表明EPA至 DHA的有效体内转化。此外，脱脂的DGA提高了测量的所有组织中 EPA、DHA和总n-3脂肪酸并且降低n-6：n-3比率。虽然高水平的DGA 产生最显著的结果，但是微藻产物的少至2％纳入能够显著增加血浆、肝脏、胸部和大腿组织中的n-3含量和降低n-6与n-3比率。这些数据强调了DGA产生更健康、更高附加值的肉类产品的可行性。
已知参与肝脂肪生成的基因，如FAS和ME，是营养受控的 (Clarke等人，“Nutritional Control of Rat Liver Fatty Acid Synthase and S14mRNA Abundance，”J.Nutr.120：218-224(1990)；Blake等人，“Suppression of Rat Hepatic Fatty AcidSynthase and S 14Gene Transcription by Dietary Polyunsaturated Fat，”J.Nutr.120：1727-1729 (1990)；Hillgartner等人，“Glucose Stimulates Transcriptionof Fatty Acid Synthase and Malic Enzyme in Avian Hepatocytes，”Am.J.Physiol.274：E493-501(1998)，其通过引用的方式整体并入本文)。理解这种控制是重要的，因为脂肪酸合成的改变的调节与若干种疾病相关 (Hillgartner等人，“Glucose StimulatesTranscription of Fatty Acid Synthase and Malic Enzyme in Avian Hepatocytes，”Am.J.Physiol. 274：E493-501(1998)，其通过引用的方式整体并入本文)。虽然DGA 纳入对苹果酸酶没有影响(表34)，但与对照相比，在消耗8％DGA 饮食的雏鸡中脂肪酸合酶增加(P＜0.10)。这些数据与其他人不一致，他们发现PUFA的消耗增加导致随后FAS表达的降低(Blake等人，“Suppression of Rat Hepatic Fatty Acid Synthase and S14GeneTranscription by Dietary Polyunsaturated Fat，”J.Nutr.120：1727-1729 (1990)；Clarke等人，“Dietary Polyunsaturated Fats Uniquely Suppress Rat Liver FattyAcid Synthase and S14mRNA Content，”J.Nutr. 120：225-231(1990)，其在此并入通过引用的方式全文)；然而，这些实验利用含有20％鲱鱼油的饮食。这里测试的饮食可能不含足够高水平的PUFA以引起类似的响应。
表34：增加的补充脱脂微藻水平对第6周肝基因表达的影响
Figure BDA0001242620920000911
数据表示为平均值(n＝6/处理)。
1DGA＝脱脂绿微藻生物质(海洋微拟球藻，Cellana，Kailua-Kona， HI)。
2ME-苹果酸酶，FASN-脂肪酸合酶。
值表示为与β-肌动蛋白的比率并相对于对照标准化。
使用t检验分离数据，并且与对照相比
Figure BDA0001242620920000921
和与对照相比
Figure BDA0001242620920000922
将双键引入长链脂肪酸的去饱和酶产生对细胞功能必不可少的不饱和脂肪酸。众所周知，PUFA是这些酶的主要饮食调节剂 (Nakamura等人，“Structure，Function，andDietary Regulation ofΔ6，Δ5，andΔ9Desaturases，”Nutrition 24(2004)；Cho等人，“Cloning， Expression，and Nutritional Regulation of the Mammalian Delta-6Desaturase，”J.Biol.Chem.274：471-477(1999)，其通过引用的方式整体并入本文)。具体地，分别负责催化MUFA和PUFA合成的酶Δ-9 和Δ-6去饱和酶的表达通常在PUFA补充的存在下被钝化(Cho等人，“Cloning，Expression，and Nutritional Regulation of theMammalian Delta-6Desaturase，”J.Biol.Chem.274：471-477(1999)；Ntambi等人，“AModel Cell Line to Study Regulation of Stearoyl-CoA Desaturase Gene1Expression by Insulin and Polyunsaturated Fatty Acids，”Biochem.Biophys.Res.Commun.220：990-995(1996)；Mauvoisin等人，“Hormonal and NutritionalRegulation of SCD1Gene Expression，” Biochimie 93：78-86(2011)，其通过引用的方式以其整体并入本文)。在该实验中，没有基因表达中的线性或二次回归的证据。然而，与消耗对照的那些雏鸡相比，消耗8％DGA饮食的雏鸡显示出Δ-9去饱和酶表达升高(P＜0.05)。与那些消耗对照饮食的雏鸡相比，消耗4 (P＜0.05)和8％(P＜0.10)DGA饮食的雏鸡也显示Δ-6去饱和酶表达的增加。在第6周体重和Δ-9去饱和酶之间也存在相关性的趋势(P ＝0.09，R2＝0.34)；脂肪生成FAS的表达与Δ-9(P＝0.10，R2＝0.35) 和Δ-6去饱和酶(P＝0.007，R2＝0.54)表达呈正相关。
总之，本实验的结果表明，脱脂微藻生物质海洋微拟球藻显著改善了肉鸡产品的脂肪酸谱。虽然高水平的纳入产生了最高速率的肌肉 EPA和DHA沉积，但是低至2％的DHA纳入足以显著增加胸部和大腿肌肉n-3脂肪酸含量和降低n-6：n-3比率。
实施例4-在产蛋鸡表现、组成和基因表达方面对饮食脱脂微藻纳入的剂量依赖性响应
材料和方法
动物饲养与实验设计
方案由康奈尔大学的机构动物护理和使用委员会(Ithaca，NY) 批准。将初始平均体重为1.70±0.27kg的Shaver-White产蛋鸡(Midwest Hatcheries LLC；Blackstone，VA，USA)(n＝50，47周龄)随机分配至5个饮食处理。每次处理有10只禽。将每只母鸡单独笼养在配备有乳头式饮水器和槽式喂食器的0.44m高×0.30m宽×0.45m深的栏中。母鸡可以自由获得饲料和水，并且每天提供16小时的光。将禽保持饮食处理持续6周。
在0、2.86、5.75、11.5和23％的5种实验饮食中纳入脱脂绿微藻、海洋微拟球藻(Cellana，Kailua-Kona，Hawaii)，部分替代大豆粉和磨碎玉米。添加结晶氨基酸、矿物质和维生素以满足营养需求 (NRC推荐的水平的1.5倍，1994)。所有饮食设计为等热量和等氮的。近似值和矿物质分析由Dairy One，Inc.(Ithaca，NY，USA)完成。饮食配方示于表35中，并且脂肪酸组成示于表36。
表35：产蛋鸡饮食配方1
Figure BDA0001242620920000931
Figure BDA0001242620920000941
1由Dairy One Coop Inc.(Ithaca，NY)进行近似值和矿物质分析。
2DFA＝脱脂微藻，Cellana，Kailua-Kona，HI。
表36：产蛋鸡脂肪酸组成，mg/g样品
Figure BDA0001242620920000942
Figure BDA0001242620920000951
1DFA＝脱脂微藻，Cellana，Kailua-Kona，HI。
对禽称重，并且在6小时禁食后的0、2、4和6周从翅静脉抽取血液。在血液取样后，在6周时通过二氧化碳窒息对每种饮食5只禽实施安乐死。取出器官和胃肠道并称重。将胸部肌肉、大腿肌肉和肝脏的子样品立即在液氮中冷冻，并储存在-80℃用于基因表达分析。将储存在-20℃的冷冻胸部、大腿、肝脏和脂肪组织样品用于组成分析。
蛋质量
每天收集蛋，并且将蛋生产报告为百分比生产；每只母鸡产蛋的天数显示为百分比。每周测量全蛋重量。在0、2、4和6周分别对蛋组分，包括蛋白、蛋黄和壳称重。用MacbethColor Eye(Macbeth Division of Kollmorgen Instruments Corp.Newburgh，NY)测定以L*、 a*-和b*-值测量的蛋黄颜色。L*值表示亮度(负向黑色，正向白色)， a*值表示红绿色(负向绿色，正向红色)，并且b*值表示蓝色-黄色色度(负向蓝色，正向黄色)。
胫骨强度
在骨测量和断裂之前手动除去组织。对于两个胫骨在羽轴的中心处测量长度、宽度和深度，并对每只禽进行平均。使用配备有5kN 测压元件的Instron 5965(InstronCorp.，Norwood，MA)和20mm/min 的十字头速度在右胫骨上测量骨强度。使用Bluehill 3测试软件 (Instron Corp.，Norwood，MA，USA)进行38mm支撑长度的挠曲测试。记录每个胫骨的最大斜率、最大负荷和到最大负荷的能量。
血浆测定法
在6小时禁食后的0、2、4和6周从翅静脉抽取血液。在收集期间将血液保持在冰上，在4℃下以2,000g离心20分钟，并储存在-80℃直到分析。使用葡萄糖测定试剂盒GAG020(Sigma-Aldrich，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)通过分光光度法测定血浆葡萄糖水平。使用Infinity尿酸液体稳定试剂(Thermo-Fisher Scientifc，Inc.，MA) 分析血浆尿酸。使用商业酶试剂盒根据制造商的方案(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，Richmond，VA)分析血浆非酯化脂肪酸 (NEFA)、甘油三酯(TAG)和总胆固醇(CHOL)。所有样品一式两份进行分析。
脂肪酸提取和甲基化
将来自胸部和大腿的生肌肉在液氮中冷冻，使用Waring商业级混合器(型号51BL31；Waring Commercial；Torrington，CT)粉末化，并储存在-80℃直到分析。在分析时切碎蛋黄、肝脏和脂肪垫样品。将0.5g蛋黄、肝脏和粉状肌肉样品，0.05g脂肪组织样品和1g饲料样品用于脂肪酸分析，以400mg/100ml用200μL 13：0作为内部标准品。根据Bligh等人，“A Rapid Method of Total Lipid Extraction and Purification，”Canadian Journalof Biochemistry and Physiology 37：911-917(1959)(其通过引用的方式整体并入本文)使用氯仿-甲醇混合物(2：1v/v)提取总脂质。然后使用Fritshe等人，“Effect of Dietary-Linolenic Acid on Growth，Metastasis，Fatty Acid Profile and ProstaglandinProduction of Two Murine Mammary Adenocarcinomas，” Journal of Nutrition 120：1601-1609(1990)(其通过引用的方式整体并入本文)描述的方法将脂肪酸甲基化。使用具有火焰离子化检测器的气相色谱(Hewllet-Packard 6890；Palo-Alto CA)量化脂肪酸甲酯(“FAME”)。用CP-Sil 88的固定相，和氮气作为载气的壁涂层的开口管(WCOT)熔融石英毛细管柱(长度100-m，内径0.25-mm；Varian Inc.，Walnut Creek，CA)分离FAME。烘箱温度在125℃保持1分钟，以4℃/分钟升至220℃(保持5分钟)，然后以4℃/分钟升至235℃(保持20分钟)。每个样品的总分离时间为57.5分钟。基于与标准FAME (Supelco TM定量标准品FAME37；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO) 的保留时间的比较来鉴定FAME。通过使用ChemStationPlus软件 (Agilent Technologies，Santa Clara，CA)的积分器计算峰面积计数。
基因表达
为了分离RNA，使用Polytron PT3100(Kinematica AG； Littau-Luzern，Switzerland)在1mL TRIzol(Invitrogen；Carlsbad， CA)中使20-50mg组织匀浆。根据制造商的方案分离总RNA。用75％乙醇洗涤RNA沉淀并重悬浮于无核酸酶的水中。在Bio-tek分光光度计上以260nm的光密度和在Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)上测定RNA浓度和质量。使用随机引物/寡聚引物混合物按照制造商的说明书(Life Technologies， Carlsbad，CA)进行反转录。通过使用SYBR Green在ABI 7700(Life Technologies，Carlsbad，CA)上进行的RT-qPCR测定相对基因表达。使用Primer3软件(Steve Rozen and Helen J.Skaletsky(1998)，Primer3). Whitehead Institute forBiomedical Research Cambridge，MA，USA)设计引物，并报告在表37中。
Figure BDA0001242620920000981
Figure BDA0001242620920000991
每个样品一式两份运行。使用ΔΔCt方程(Livak等人，“Analysis of RelativeGene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2[-delta deltaC(T)]Method，”Methods 25：402-408(2001)，其通过引用的方式整体并入本文)，用对照基因actb(NM_205518.1)的表达调整每个样品的相对基因表达，并且相对于对照母鸡标准化。
统计分析
使用PC-SAS(版本9.1，SAS Institute，Inc.，Cary，NC)一般线性模型程序，使用方差分析来分析所有数据以在具有或没有时间重复测量的情况下测试饮食的主效果。差异的显著性水平为P≤0.05。在 SAS中使用关联程序进行关联分析。使用用于多重回归分析的Bonferroni校正程序调整p值，将显著性水平设置为P≤0.002。
结果
饮食对WBW、ADFI或器官重量没有影响；除了饲喂0％藻的母鸡确实具有较大的盲肠外(表38和图5A和5B)。
Figure BDA0001242620920001011
Figure BDA0001242620920001021
在胫骨形态测量中饮食之间也没有差异。然而，来自饲喂23％藻的母鸡的胫骨需要更大的能量来破碎(表38，同上)。增加的饮食藻纳入不影响蛋生产、重量或蛋黄、蛋白和壳含量(表39)。当与来自对照组的蛋相比时，来自饲喂23％藻饮食的母鸡的蛋具有最低的L*- 和b*-值，并且具有a*-值的3倍增加(表39和图6A-图6 B)。此外，血浆参数、葡萄糖、NEFA、TAG、CHOL和尿酸不随饮食而不同(表 40)。
表39：6周时的蛋质量1，
Figure BDA0001242620920001031
1数据报告为LS平均值(n＝5只母鸡/饮食)。没有类似上标的平均值被认为显著不同(P≤0.05)。
2每天收集蛋，并将蛋生产报告为百分比生产；每只母鸡产蛋的天数显示为百分比。
3用Macbeth Color Eye(Macbeth Division of Kollmorgen InstrumentsCorp.Newburgh，NY，USA)测定以L*-、a*-和b*-值测量的蛋黄颜色。L*值表示亮度(负向黑色，正向白色)，a*值表示红绿色(负向绿色，正向红色)，b*值表示蓝色-黄色色度(负向蓝色，正向黄色)。
表40：血浆测定法1，2
Figure BDA0001242620920001041
1数据报告为LS平均值(n＝5只母鸡/饮食)。没有类似上标的方法被认为显著不同(P≤0.05)。所有分析一式两份进行。
2在研究的第0天记录初始数据，并且在研究的第6周记录最终数据。
3用葡萄糖测定试剂盒GAG020(Simgma-Aldrich，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)通过分光光度法测定血浆葡萄糖水平。
4使用商业酶试剂盒根据制造商的方案(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，Richmond，VA，USA)分析血浆非酯化脂肪酸(NEFA)，甘油三酯(TAG)和总胆固醇(CHOL)。
5用Infinity尿酸液体稳定试剂(Thermo-Fisher Scientific，Inc.， MA，USA)分析血浆尿酸。
饮食或饮食x周相互作用对卵黄16：0、18：0、18：1n-9、18：2n-6、 18：3n-6、18：3n-3、SFA、MUFA，PUFA或ω6没有影响。然而，这些脂肪酸确实具有周的显著效果。一般来说，在来自饲喂23％藻的母鸡的蛋中，16：0和16：1从第0周至第6周增加。来自所有饮食的蛋在18：2n-6、18：3n-6、PUFA和ω6方面从第0周至第6周增加(表41)。
Figure BDA0001242620920001061
Figure BDA0001242620920001071
当与其它饮食比较时，来自饲喂23％藻的母鸡的蛋在6周时具有最大量的16：1、20：4n-6、20：5n-3、22：6n-3、ω3和DHA+EPA以及最低的ω6：ω3(表41)。在饮食中的藻纳入水平与14：1、16：1、20：5n-3、 22：6n-3、ω3和EPA+DHA正相关(P＜0.002)(R2＝0.9776、0.8993、 0.9843、0.9143、0.9394、0.9418和0.7145)。相反，饮食中的藻纳入与ω6：ω＝3、L*-和b*-值呈负相关(P＜0.002)(分别为R2＝0.6535、 0.9729和0.7963)。
当与饲喂0％藻的禽相比时，藻的饮食纳入在母鸡肝脏中增加了 fads6的表达和降低了acot4的表达(图6C)。肝脏me、elvol3、elcol4 和elvol5具有剂量依赖性的表达增加，其与藻的饮食水平显著相关 (P＜0.002)(R2分别＝0.9724、0.7837、0.9667和0.8588)。当与饲喂 0％藻的禽类相比时，在所有水平的藻纳入下胸部fasn表达降低。随着藻纳入增加，胸部acc表达降低(R2＝0.8677)和acot4表达增加 (R2＝0.9145)(图6D)。当与对照饮食的母鸡相比时，大腿fads6和 elvol5表达在所有水平的藻纳入下增加。在饲喂2.85％藻饮食的禽中，大腿elvol4表达具有超过4倍增加(图6E)。
将产蛋鸡肝脏和脂肪垫脂肪酸组成(mg/g样品)示于表42中。
将产蛋鸡胸部和大腿脂肪酸组成(mg/g样品)示于表43中。
Figure BDA0001242620920001091
Figure BDA0001242620920001101
Figure BDA0001242620920001111
讨论
本研究的目的是研究脱脂微藻作为饮食ω3脂肪酸来源以富集鸡蛋的用途。这项研究检查了饲喂不同水平的微藻纳入(范围为饮食的0 至23％)的母鸡的生长、蛋生产、蛋质量、身体组成和肝脏、白色肌肉和红色肌肉中脂肪酸合成基因的表达。基因表达分析允许鉴定负责增加鸡的DHA合成的生理机制的差异调节基因。虽然在饮食处理之间没有生长的差异，但在本研究中研究的质量和组成属性上存在差异。此外，这些发现与肝脏和白色肌肉中的差异基因表达相关。这些发现表明，产蛋鸡可能有不同的脂肪酸代谢，这可能促成用藻补充观察到的蛋质量和组成的差异。
一般来说，微藻的粗蛋白和粗脂质含量是广泛可变的并且取决于物种(Gatrell等人，“Potential of Defatted Microalgae from the Biofuel Industry as anIngredient to Replace Com and Soybean Meal in Swine and Poultry Diets，”Journal of Animal Science 92(4)：1306-14(2014)，其通过引用的方式整体并入本文)。再生脱脂绿微藻生物质，海洋微拟球藻，具有43.9％的粗蛋白含量，其约占大豆粉中粗蛋白(49.0％) 的90％。这些脱脂微藻的粗脂质含量为5.2％，相比之下大豆粉和玉米分别为1.1％和3.0％。通常，海洋微藻含有更大量的ω3脂肪酸，包括EPA和DHA，其次是常规动物蛋白质来源(Fredriksson等人，“Fatty Acid and Carotenoid Composition of Egg Yolksas an Effect of Microalgae Addition to Feed Formula for Laying Hens，”FoodChemistry 99：530-537(2006)；Kalogeropoulos等人，“Nutritional Evaluation andBioactive Microconstituents(Carotenoids，Tocopherols，Sterols，And Squalene)ofRaw and Roasted Chicken Fed on DHA-rich Microalgae，” Food ResearchInternational 43：2006-2013(2010)，其通过引用的方式整体并入本文)。微藻也是类胡萝卜素，脂溶性色素的来源；虾青素是大多数微藻中的主要类胡萝卜素(Dominguez-Bocanegra等人，“Influence of Environmental and Nutritional Factors in theProduction of Astaxanthin from Haematococcus pluvialis，”BioresourceTechnology 92：209-214(2004)，其通过引用的方式并入本文)。已知这些色素在包括在饮食中时改变动物产品的颜色。虽然微藻补充对蛋生产或组分大小没有影响，但是有蛋黄颜色的差异。来自饲喂藻的母鸡的蛋黄颜色较深，具有较低的L*-和b*-值和较高的a-*值；表明蛋黄比饲喂对照饮食的母鸡的蛋黄更黑、更蓝和更红。
来自我们实验室的先前研究显示，当补充必需氨基酸(Met、Lys、 Ile、Thr、Trp、Tyr和Val)时，用脱脂微藻(十字脆杆藻属种)替换多达7.5％的大豆粉在肉鸡中保持与对照饮食相当的性能特征。此外，血浆响应、肝脏生物标志物和消化道的总检查显示没有毒性(Austic 等人，“Potential and Limitation of a New Defatted Diatom MicroalgalBiomass in Replacing Soybean Meal and Corn in Diets for Broiler Chickens，”Journal of Agricultural and Food Chemistry 61：7341-7348 (2013)，其通过引用的方式整体并入本文)。在16％的脱脂藻纳入下，与在饲喂对照饮食的肉鸡中0.28mg EPA+DHA/100g相比，肉鸡胸部肉具有EPA和DHA的总量(16.9mg)的60倍增加(Gatrell等人，“Potential of Defatted Microalgae from the Biofuel Industry as an Ingredientto Replace Corn and Soybean Meal in Swine and Poultry Diets，”Journal ofAnimal Science 92(4)：1306-14(2014)，其通过引用的方式整体并入本文)。目前的研究表明，来自饲喂23％藻的母鸡的蛋黄在补充6周后具有DHA的3倍增加，与1.7±0.35mg DHA/g蛋黄相比为4.8±0.35mg。有趣的是，更新的脱脂绿微藻生物质不含DHA 或ARA，但含有4.9mg EPA/g，并且分别具有5.0和1.1mg/g的ω3 和ω6。
ω3脂肪酸的合成需要一系列延长和去饱和步骤。ω6和ω3PUFA 合成途径二者是不同的，没有交叉反应，但它们的确经历采用相同酶去饱和和延长的相同交替反应(Ratnayake等人，“Fat and Fatty Acid Terminology，Methods of Analysis and FatDigestion，and Metabolism：A Background Review Paper，”Annals of Nutrition andMetabolism 55(1-3)：8-43(2009)，其通过引用的方式整体并入本文)。第一步使用 FADS6，然后用ELVOL5延伸，随后用FADS5去饱和以形成20：4n-6 和20：5n-3。FADS6是哺乳动物中的限速步骤，并且与18：2n-6相比，其对18：3n-3具有更高的亲和力(Ratnayake等人，“Fat andFatty Acid Terminology，Methods of Analysis and Fat Digestion，and Metabolism：ABackground Review Paper，”Annals of Nutrition and Metabolism 55(1-3)：8-43(2009)，其通过引用的方式整体并入本文)。下一步涉及通过ELOVL2进行的两个连续的延伸步骤和通过FADS6去饱和以形成24：6n-3。脂肪酸然后经历一轮β-氧化以产生22：6n-3(Ratnayake 等人，“Fat and Fatty Acid Terminology，Methods of Analysis and FatDigestion，and Metabolism：A Background Review Paper，”Annals of Nutrition andMetabolism 55(1-3)：8-43(2009)，其通过引用的方式整体并入本文)。哺乳动物具有低水平的ω3脂肪酸合成，因为它们具有 ELOVL2和ELOVL5的低表达水平和酶活性。另外，仅ELOVL2可以合成DHA(Gregory等人，“Functional Characterization of the ChickenFatty Acid Elongases 1，2，”Journal of Nutrition 143：12-16(2013)，其通过引用的方式整体并入本文)。
一般来说，当与对照禽类相比时，参与PUFA合成的基因的表达在饲喂23％藻的母鸡的肝脏中更高。elvol3、elvol4和elvol5对增加的饮食藻纳入水平的强正相关的剂量依赖性响应不仅表明这些基因的表达依赖于藻补充，它还表明可能有通过PUFA合成途径的增加的通量。ω3脂肪酸水平的增加进一步支持这种主张。有趣的是，有证据表明，鸡具有增加的合成PUFA，特别是DHA的能力(Gregory等人，“Functional Characterization of theChicken Fatty Acid Elongases 1， 2，”Journal of Nutrition 143：12-16(2013)，其是通过引用的方式整体并入本文)。鸡肝脏ELOVL5与ELOVL2一起延长DPA，并且当与大鼠肝脏相比时鸡具有更高的elvol5表达水平；只有ELVOL2在哺乳动物中具有这种能力(Gregory等人，“Functional Characterization of the Chicken Fatty Acid Elongases 1，2，”Journal of Nutrition 143：12-16 (2013)，其通过引用的方式整体并入本文)。Gregory等人，“Functional Characterization of the Chicken Fatty Acid Elongases 1，2，”Journal of Nutrition 143：12-16(2013)(其通过引用的方式整体并入本文)确定延伸酶是重要的差异，允许在与哺乳动物相比时，鸡具有更大的DHA 合成。这些作者还显示，当用芥花油代替饮食牛油时，肝脏elvol2和 elvol5的表达水平没有改变，但随后通过添加的芥花油补充ALA而增加DHA(Gregory等人，“Functional Characterization of the ChickenFatty Acid Elongases 1，2，”Journal of Nutrition 143：12-16(2013)，其通过引用的方式整体并入本文)。然而，这项研究显示，当将微藻(一种EPA的来源)加入到饮食中时，肝脏elvol5以及elvol3和elvol4 的表达增加。然而，有证据表明，鸡具有合成DHA并将其沉积在组织中的能力。
胸部和大腿的表达谱与在肝脏中观察到的表达谱不同；虽然，这并不奇怪，因为肝脏是脂肪酸合成的主要视野。来自饲喂藻的母鸡的胸部具有降低的acc和fasn表达。胸部acc以与饮食微藻纳入的增加的水平有关的剂量依赖的方式减少，表明减少的表达依赖于藻补充。从头脂肪酸合成被认为在物种中是高度保守的，并涉及两种主要的酶，ACC和FASN。ACC是速率决定步骤并催化将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A的胞质反应。FAS是参与脂肪酸合成的第二种酶，并且是催化七种酶反应的多功能酶。FAS催化从7个乙酰辅酶A分子和丙二酰辅酶A形成16：0(Chow，C.K.，Fatty Acids in Foods and their HealthImplications.Boca Raton，FL：Taylor and Francis Group， LLC(2008)；Ratnayake等人，“Fat and Fatty Acid Terminology，Methods of Analysis and Fat Digestion，andMetabolism：A Background Review Paper，”Annals of Nutrition and Metabolism 55(1-3)：8-43(2009)，其通过引用的方式并入本文)。这些基因的下调表明藻补充可能减少较短链脂肪酸的合成。来自饲喂藻的鸡的胸部也显示acot4的剂量依赖性增加。ACOT4参与
Figure BDA0001242620920001151
-氧化，这是DHA合成的最后一步。此外，大腿elvol5表达增加2倍。在大腿中受到藻补充影响的唯一其它基因是fads9和elvol5；当将藻添加到饮食中时，两种基因都具有增加的表达。这些发现表明藻补充的影响可能不仅改变肝脏脂肪酸代谢，它也可能影响肌肉中的脂肪酸代谢。
来自该研究的数据表明藻补充可能影响产蛋鸡中的脂肪酸代谢。虽然在生长或蛋生产上没有差异，但在蛋的颜色和组成上有明显的差异。在与其它饮食相比时，来自饲喂23％藻的母鸡的蛋在6周时具有最大量的20：5n-3、22：6n-3和总ω3脂肪酸。基因表达数据表明饲喂藻的母鸡中PUFA的合成增加。肝脏me、elvol3、elcol4和elvol5具有剂量依赖性的表达增加。在与饲喂0％藻的禽相比时，在所有水平的藻纳入下，胸部acc和fasn表达降低。在饲喂2.85％藻饮食的禽中，大腿elvol4表达具有超过4倍增加。这些结果支持Gregory等人，“Functional Characterization of the Chicken Fatty Acid Elongases 1，2，”Journal of Nutrition 143：12-16(2013)(其通过引用的方式整体并入本文)的发现；有证据表明鸡具有增加的合成长链PUFAS(主要是DHA) 的能力。此外，这些发现表明藻补充可能不仅改变肝脏脂肪酸代谢，它也可能影响肌肉中的脂肪酸代谢。总体而言，在中等饮食纳入水平下给鸡饲喂脱脂微藻确实增加了蛋的ω3脂肪酸含量。因此，微藻不仅是蛋白质的来源；它们是用于动物饲料的必需脂肪酸的来源。增加ω3脂肪酸含量将是有益的，不仅对消费者的健康，而且对于可以从生产增值产品中获益的生产者是有益的。
实施例5：低浓度的补充脱脂微藻在饲喂含有玉米和亚麻籽油的饮食的产蛋鸡中差异影响蛋和组织脂肪酸组成
材料和方法
藻
所有藻均获自Cellana(Kailua-Kona，HI，USA)。藻是生物燃料提取后的海洋微拟球藻。
动物和饮食
将60只shaver leghorn产蛋鸡(约20周龄)在单独的笼子中圈养。环境控制在23℃，20％相对湿度，在6周的实验期间具有16小时光照和8小时黑暗循环。每种处理随机分配10只禽，并且认为每只母鸡是重复。六种饮食配制为完全因子扩增(亚麻籽油×藻A)。包括的亚麻籽油的水平为总饮食的0和1.5以及0、3和5％藻(表44)，基于NRC.，于“NutrientRequirements of Poultry，”in National Research Council，National Academy PressWashington，USA(1994)，其通过引用的方式整体并入本文。在整个实验期，禽可以自由获得饲料和水。
Figure BDA0001242620920001181
Figure BDA0001242620920001191
每周测量体重和饲料摄入，并每天收集蛋以确定蛋生产。每7天收集所有的蛋，并取全蛋、蛋壳、蛋白和蛋黄重量。每隔一周从翅静脉收集血液。在收集期间保持在冰中后，通过离心(3000×g，4℃下 15分钟)获得血浆，并储存在-20℃直到分析。在实验结束时收集肝脏和脂肪组织。
使用来自Thermo Scientific(Middletown，VA)的尿酸试剂盒 (InfinityTM尿酸液体稳定试剂测量血浆尿酸浓度。使用来自Wako Chemical(Richmond，VA)的试剂盒测量血浆三酰基甘油和胆固醇。
根据Folch等人，“A Simple Method for the Isolation and Purification ofTotal Lipids from Animal Tissues，”J.Biol.Chem. 226：497-509(1957)(其通过引用的方式整体并入本文)从蛋黄、血浆、肝脏和脂肪组织中提取脂质。脂肪酸用甲醇硫酸(1％)甲基化(Christie，“Preparation of Ester Derivatives of Fatty Acids forChromatographic Analysis，”于Advances in Lipid Methodology-Two，第69-111页，编辑W.W.Christie，Oily Press，Dundee(1993)，其通过引用的方式整体并入本文)。使用十三烷酸甘油三酯(Tritridecanoin)(Sigma-Aldrich Co.， St Louis，MO)作为内部标准品，并且用脂肪酸甲酯标准品 (Sigma-Aldrich Co.，St Louis，MO)通过其保留来鉴定每种脂肪酸。使用装备有火焰离子化检测器的气相色谱仪器(Agilent 6890N， Agilent Technologies，Santa Clara，CA)分析脂肪酸的甲酯。使用用 CP-SIL 88(针对fame)涂覆的熔融石英毛细管柱(100m×0.25mm i.d.， 0.2mm膜厚)(Varian Inc，Lake Forest，CA)。将烘箱温度编程为在 140℃保持4分钟，以每分钟4℃增加至220℃，然后保持5分钟。载气为N2，恒定流速为2ml/s，注射器温度为230℃，并且检测器温度为280℃。
统计分析
使用SAS系统(SAS Institute，Cary，NC)及Duncan事后检验通过GLM程序分析数据。差异显著性定义为在P＜0.05。
结果
实验期间的体重和饲料摄入总结在表45中。体重不受通过实验的饮食处理影响，并且饲料摄入也不受影响。在实验结束时肝脏重量和肝脏重量与体重的百分比没有差异。
Figure BDA0001242620920001221
所有母鸡显示出超过95％的蛋生产，并且对蛋生产没有饮食影响 (表46)。蛋组分重量(全蛋、蛋黄、蛋白和蛋壳)不受亚麻籽油和藻补充的影响。蛋黄颜色受藻补充的影响，但油源对蛋黄颜色没有任何影响。随着藻浓度增加，蛋黄颜色增加，并且5％藻补充显示约14 点Roche色盘(color pan)。
血浆TG、胆固醇和尿酸呈现于表47中。血浆TG浓度高且显示巨大的偏差。血浆TG在处理间无差异。血浆胆固醇和尿酸不受饮食处理影响。
Figure BDA0001242620920001241
Figure BDA0001242620920001251
Figure BDA0001242620920001261
Figure BDA0001242620920001271
在表48中汇总了脂肪组织脂肪酸组合物。C16：0浓度在玉米油饲喂处理中高于亚麻籽油饲喂组。已知多不饱和脂肪酸降低脂肪酸合成，并且含有亚麻籽油的饮食中的高PUFA含量可能降低脂肪酸合成并导致C16：0脂肪酸含量降低。然而，C18：0不受饮食处理的影响，并且C18：1n9也不受影响。在亚麻籽油饲喂组中，C18：2n6减少，并且C18：3n3增加。在脂肪组织中没有长链PUFA(EPA和DHA)。通过亚麻籽油补充，多不饱和脂肪酸增加，并且饱和脂肪酸减少。亚麻籽油饲喂组显示较高百分比的n-3脂肪酸，并且5％藻饲喂组显示比 0％或3％藻饲喂组较高的n-3。但在玉米油饲喂组中，藻补充不影响 n-3脂肪酸组成。玉米油饲喂组显示比亚麻籽油饲喂组高的n-6脂肪酸，并且导致更高的n-6与n-3脂肪酸比率。
Figure BDA0001242620920001291
在表49中，呈现了肝脏脂肪酸谱。C16：0脂肪酸通过补充亚麻籽油而减少，但藻补充对肝脏中的C16：0脂肪酸没有影响。C18：3n3 在亚麻籽油饲喂组中增加，并且EPA和DHA百分比也增加。单不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸不受饮食处理影响，但PUFA增加并且导致 n-6与n-3比值降低。
在实验开始时，血浆的脂肪酸谱没有差异(表50)。血浆中的主要脂肪酸是C18：1n9和C18：2n6，并且单不饱和脂肪酸是总脂肪酸的约50％。
在第2周时，通过亚麻籽油补充降低血浆C16：0，并且C18：1n9 增加(表51)。通过藻补充和亚麻籽油补充来增加血浆EPA和DHA。通过饮食处理没有改变MUFA、PUFA和SAT。藻和亚麻籽油补充增加n-3脂肪酸，但n-6脂肪酸只受亚麻籽油补充影响。来自第4周和第6周的血浆(表52和表53)显示与第2周相同的趋势，但藻没有显示亚麻籽油饲喂组的EPA和DHA浓度的任何另外的影响。
在第0周时的蛋脂肪酸谱显示主要脂肪酸为C18：1n9和C18：2n6，并且DHA含量为蛋脂肪酸的约1.3％(表54)。在1周的实验饮食饲喂(表55)后，C18：1n9脂肪酸不受亚麻籽油补充的影响，但是藻补充倾向于降低C18：1n9。C18：2n6通过亚麻籽油补充而减少。C18：3n3 在亚麻籽油补充组中增加，并且EPA和DHA浓度也通过藻和亚麻籽油补充而增加。n-3和n-6脂肪酸受亚麻籽油补充的影响。藻对n-3 和n-6脂肪酸组成没有影响，但是通过藻补充降低了n-6与n-3的比率。
在第2周(表56)，亚麻籽油饲喂组中C18：1n9和C18：2n6降低，并且C18：3n3增加。EPA和DHA浓度在亚麻籽油饲喂组中较高，并且藻具有一些额外的效果。亚麻籽油减少蛋黄n-6脂肪酸，并且增加 n-3脂肪酸。藻也增加了n-3浓度，因为它们的纳入率增加。第3-6 周的蛋脂肪酸谱的数据分别提供在表57-60中。
Figure BDA0001242620920001311
Figure BDA0001242620920001321
Figure BDA0001242620920001331
Figure BDA0001242620920001341
Figure BDA0001242620920001351
Figure BDA0001242620920001361
Figure BDA0001242620920001371
Figure BDA0001242620920001381
Figure BDA0001242620920001391
Figure BDA0001242620920001401
Figure BDA0001242620920001411
Figure BDA0001242620920001421
Figure BDA0001242620920001431
Figure BDA0001242620920001441
Figure BDA0001242620920001451
Figure BDA0001242620920001461
Figure BDA0001242620920001471
Figure BDA0001242620920001481
实施例6：饲喂由饲喂脱脂微藻(23％)的母鸡生产的蛋黄和鸡肌肉的影响
实验1
10只32-33天龄的野生型(WT)雄性小鼠，体重16-17克。将小鼠随机分成两组，“CG”和“EG”。用微拟球藻藻生物强化的蛋黄用于使蛋富集ω-3脂肪酸。EG组接受生物强化蛋的蛋黄，而CG组接受正常蛋的蛋黄。给予每只小鼠的蛋黄中的ω-3脂肪酸的量为 0.378mg/小鼠/天，其等于对于健康个体的93.77mg。
HED＝以mg/kg计的动物剂量x(以kg计的动物体重/以kg计的人体重)(Reagan-Shaw等人，“Dose Translation from Animal to Human Studies Revisited，”FASEB 22：659-661(2008)，其通过引用的方式整体并入本文)。健康的个体每天需要400mg的ω-3脂肪酸。对每只小鼠每天给予5g饮食。EG和CG组两者的饮食组成显示在下文表 61中。
表61：饮食组成
Figure BDA0001242620920001491
每周后测量体重变化。在3和4周后采集血液样品以分析来自血浆的脂质谱(TG、TC、NEFA)。从血液中分析血糖。在研究结束时还从组织(肝脏、肾、肌肉和脂肪组织)分析脂质谱。实验持续时间为4周。在实验结束时，使用CO2气体杀死小鼠。通过应用T检验尾-2类型-2(T-test tail-2type-2)分析数据。
生物强化蛋的蛋黄饮食导致野生型(WT)小鼠中血浆甘油三酯水平(图7，p＝0.001)、血浆总胆固醇(图8，p＝0.002)、肝脏甘油三酯(图11，p＝0.0002)、肌肉甘油三酯(图12，p＝0.007)、脂肪组织甘油三酯(图14，p＝0.03)、脂肪组织总胆固醇(图18，p＝0.03)、肝脏NEFA(图19，p＝0.01)、脂肪组织NEFA(图20，p＝0.003) 和肌肉NEFA(图21，p＝0.003)的显著降低。血浆NEFA(图9)、血糖水平(图10)、肾甘油三酯(图13)、肝脏总胆固醇(图15)、肌肉总胆固醇(图16)、肾总胆固醇(图17)和肾NEFA(图22)不受显著影响。
实验2
获取重量为31-42克的14只OE小鼠，并随机分为2组。一组是“CG”(n＝7)，而另一组是“EG”(n＝7)。EG组接受生物强化蛋的蛋黄，而CG组在其饮食中接受正常蛋的蛋黄。
饮食组成与实验1中使用的饮食组成相同。将相同重量的小鼠配对，CG中的一只和EG中的一只。给予每只小鼠的蛋黄中的ω-3脂肪酸的量为0.378mg/小鼠/天。每只小鼠每天给予5g饮食。每周后测量体重变化。在研究开始时采集血样，然后每周采集血样以分析血浆的脂质谱。每周后从尾部中的血液测量葡萄糖。在研究结束时还从组织(肝脏、肾、肌肉和脂肪组织)分析脂质谱。在实验结束时，使用 CO2气体杀死小鼠。实验持续时间为4周。通过应用配对的T检验尾 -1类型-1来分析数据。
生物强化蛋的蛋黄饮食导致肥胖(OE)小鼠中的血浆甘油三酯水平(图7，第2周，p＝0.05)、血浆总胆固醇(图8，第4周，p＝0.012)、肝脏甘油三酯(图11，p＝0.001)、肌肉甘油三酯(图12，p＝0.002)、脂肪组织甘油三酯(图14，p＝0.007)、肝脏NEFA(图19，p＝0.04) 和肾NEFA(图22，p＝0.02)的显著降低。4周后血糖水平增加(图 10)。血浆NEFA(图9)、肾甘油三酯(图13)、肝脏总胆固醇(图 15)、肌肉总胆固醇(图16)、肾总胆固醇(图17)、脂肪组织NEFA (图20)和肌肉NEFA(图21)不受显著影响。
此外，生物强化蛋的蛋黄饮食导致WT和OE小鼠二者的肝脏中 DHA保留(图27-28)。
实验3
获得重量为23-33克的12只OE小鼠，并且随机分为2组，包括“CG”(n＝6)和“EG”(n＝6)。将相同重量的小鼠配对，CG中一只和EG中一只。
向EG小鼠饲喂通过给雏鸡饲喂微拟球藻属藻而富集ω-3脂肪酸的鸡胸部肌肉，而CG小鼠在饮食中接受正常的鸡胸部肌肉。给予每只小鼠的鸡胸部肌肉中的ω-3脂肪酸的量为0.126mg/小鼠/天。每只小鼠每天给予5g饮食。每周后测量体重变化。在研究开始时采集血液样品，然后每周后采集血样以分析来自血浆的脂质谱。每周后从尾部中的血液测量葡萄糖。在研究结束时还从组织(肝脏、肾、肌肉和脂肪组织)分析脂质谱。在实验结束时，使用CO2气体杀死小鼠。实验持续时间为3周。通过应用配对的T检验尾-1类型-1来分析数据。
富集ω-3脂肪酸的鸡胸部肌肉的饮食在肥胖(OE)小鼠中导致血浆甘油三酯水平(图7，第2周，p＝0.02)、肝脏甘油三酯(图11， p＝0.0003)、脂肪组织甘油三酯(图14，p＝0.037)、肾总胆固醇(图 17，p＝0.01)、脂肪组织总胆固醇(图18，p＝0.03)、肝脏NEFA(图19，p＝0.04)和肾NEFA(图22，p＝0.007)的显著降低。血糖水平没有显著受影响(图10)。在第3周时血浆NEFA水平显著增加(图 9)。血浆NEFA(图9)、血浆总胆固醇(图8)、肌肉甘油三酯(图 12)、肾甘油三酯(图13)、肝脏总胆固醇(图15)、肌肉总胆固醇(图 16)、脂肪组织NEFA(图20)和肌肉NEFA(图21)没有显著影响。
该饮食还导致肝脏重量(图23)、肠系膜脂肪重量(图24)降低，并且附睾脂肪重量(图25)或腹膜后脂肪重量(图26)没有变化。此外，DHA也保留在肝脏中(图29)。
讨论
这些实验的结果表明，可以以高效率在身体中消化、利用和保留微藻饲喂产生的富集EPA/DHA的蛋/肌肉/组织。此外，这些产品可以在正常野生型或肥胖小鼠中一致地显著降低血液和组织甘油三酯，其可以用于预防和治疗脂肪肝、肥胖症和其它甘油三酯相关病状。
虽然已经在本文中详细地描绘和描述了各种实施方案，但是对于相关领域的技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明的精神的情况下，可以进行各种修改、添加、替换等，并且因此认为这些在如所附权利要求书中所限定的本发明的范围内。
序列表
<110> X·雷
<120> 用脱脂微藻动物饲料对家禽产品的ω-3脂肪酸富集
<130> 29543.7531 (6770-02-PC)
<150> 62/025,779
<151> 2014-07-17
<160> 34
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 1
ggatagggct gctttcaaca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
ctccagggaa cacgtaggaa 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
gcagggaaaa ttctgtggaa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
cagcggtcaa caacaacatc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
ccaccataca ttcccctacg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
cgctcttgtg actcccatct 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
cgcattcagc agatgagtct 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
gccgtaggtg tcctcattgt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
cacaatgtac cctggcattg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
tccggattca tcgtactcct 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 11
cacaatgtac cctggcattg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 12
tccggattca tcgtactcct 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 13
gttccaggag gaccaaacaa 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 14
tctcctaaag cccacattgc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 15
gcagggaaaa ttctgtggaa 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 16
cagcggtcaa caacaacatc 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 17
agctttgaac ccagcaagaa 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 18
agcaacgcag agaagaggaa 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 19
cgcattcagc agatgagtct 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 20
gccgtaggtg tcctcattgt 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 21
ccaccataca ttcccctacg 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 22
cgctcttgtg actcccatct 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 23
cttgggatta cgctgctctc 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 24
tctggctgct tttcttcctc 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 25
ggatgaggtc tgccttttca 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 26
aaaagttccc ctttccctca 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 27
ttcactttgt ggtggattgg 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 28
tggccaatag tcacatggaa 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 29
ccaaagtaca tgcggaacaa 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 30
ccaccagagg acacgtatga 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 31
gccatcatct ggtgagaggt 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 32
gatttcggtt ttgctgccta 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 33
ggatagggct gctttcaaca 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 34
ctccagggaa cacgtaggaa 20

Claims (27)

1.一种生产具有升高量的n-3脂肪酸的家禽蛋的方法，所述方法包括：
在使家禽有效生产包含300至550mg的n-3脂肪酸的蛋的条件下给所述家禽饲喂一定量的脱脂微藻和n-3脂肪酸的非微藻源，其中所述脱脂微藻选自微藻种，所述微藻种选自微拟球藻属或链带藻属。
2.根据权利要求1所述的方法，其中与非脱脂微藻相比，所述脱脂微藻包含0.1％至50％的油含量。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋含有80mg或更多的二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)的组合。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋具有比在所述条件下由不饲喂脱脂微藻的家禽生产的蛋更大的n-3:n-6脂肪酸的比率，且与在所述条件下由不饲喂脱脂微藻的家禽生产的蛋相比具有降低的n-9脂肪酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其中以按所述家禽总饮食的重量计1％至23％的量给所述家禽饲喂所述脱脂微藻。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述n-3脂肪酸的非微藻源是亚麻籽或亚麻籽油。
7.根据权利要求6所述的方法，其中以按所述家禽总饮食的重量计0.5％至5％的量给所述家禽饲喂所述亚麻籽或亚麻籽油。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述家禽是鸡。
9.一种通过根据权利要求1所述的方法生产的蛋。
10.根据权利要求9所述的蛋在制备用于增加受试者中的n-3脂肪酸的量的治疗剂中的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述受试者是人受试者。
12.根据权利要求10所述的用途，其中所述治疗剂用于治疗所述受试者的心脏相关病症。
13.一种防止饲喂亚麻籽或亚麻籽油的饮食补充剂的家禽的重量减轻的方法，所述方法包括：
鉴定正在饲喂亚麻籽或亚麻籽油的饮食补充剂的家禽，并且
在有效防止所述家禽由于所述亚麻籽或亚麻籽油而导致的重量减轻的条件下给所述家禽饲喂一定量的脱脂微藻。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述亚麻籽或亚麻籽油的饮食补充剂是按所述家禽总饮食的重量计5％或更多的量。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述脱脂微藻选自微藻种微拟球藻属或链带藻属。
16.根据权利要求13所述的方法，其中与非脱脂微藻相比，所述脱脂微藻包含0.1％至50％的油含量。
17.根据权利要求13所述的方法，其中以按所述家禽总饮食的重量计1％至23％的量给所述家禽饲喂脱脂微藻。
18.一种生产具有升高量的n-3脂肪酸的家禽肉的方法，所述方法包括：
与不饲喂脱脂微藻的家禽的肉制品相比，在使家禽的肉制品有效富集n-3脂肪酸的条件下给所述家禽饲喂一定量的所述脱脂微藻，其中与在所述条件下不饲喂所述脱脂微藻的家禽的肉制品相比，所述富集的肉制品含有n-3脂肪酸的3倍至15倍的增加，其中所述富集的肉制品具有比在所述条件下不饲喂脱脂微藻的家禽的肉制品更大的n-3:n-6脂肪酸比率，其中所述脱脂微藻选自微藻种，所述微藻种选自微拟球藻属或链带藻属。
19.根据权利要求18所述的方法，其中与非脱脂微藻相比，所述脱脂微藻包含0.1％至50％的油含量。
20.根据权利要求18所述的方法，其中与不饲喂所述脱脂微藻的家禽的肉制品相比，所述富集的肉制品含有更多的所述n-3脂肪酸二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)。
21.根据权利要求18所述的方法，其中以按所述家禽总饮食的重量计2％至16％的量给所述家禽饲喂脱脂微藻。
22.根据权利要求18所述的方法，其中所述富集的肉制品选自胸部肌肉和大腿肌肉。
23.根据权利要求18所述的方法，其中所述家禽是鸡。
24.通过根据权利要求18所述的方法生产的家禽肉。
25.根据权利要求24所述的家禽肉在制备用于增加受试者中的n-3脂肪酸的量的治疗剂中的用途。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述受试者是人受试者。
27.根据权利要求25所述的用途，其中所述治疗剂用于治疗所述受试者的心脏相关病症。
CN201580048692.XA 2014-07-17 2015-07-17 用脱脂微藻动物饲料对家禽产品的ω-3脂肪酸富集 Active CN107072182B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462025779P 2014-07-17 2014-07-17
US62/025,779 2014-07-17
PCT/US2015/041000 WO2016011410A1 (en) 2014-07-17 2015-07-17 Omega-3 fatty acid enrichment of poultry products with defatted microalgae animal feed

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107072182A CN107072182A (zh) 2017-08-18
CN107072182B true CN107072182B (zh) 2021-11-09

Family

ID=55079107

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580048692.XA Active CN107072182B (zh) 2014-07-17 2015-07-17 用脱脂微藻动物饲料对家禽产品的ω-3脂肪酸富集

Country Status (3)

Country Link
US (1) US11077158B2 (zh)
CN (1) CN107072182B (zh)
WO (1) WO2016011410A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109156424B (zh) * 2018-08-15 2022-01-21 湖南农业大学 一种饲喂镉超标饲用苎麻的黑山羊体内镉的测试方法
CN109105636A (zh) * 2018-09-10 2019-01-01 浙江山诺生物科技有限公司 一种在鸡饲料中添加配方微藻以制备高营养鸡蛋的方法
EP3852544A4 (en) 2018-09-21 2022-07-06 Heliae Development LLC COMPOSITIONS AND METHODS FOR INTRODUCING ODD-CHAIN FATTY ACIDS INTO POULTRY EGGS
CN111567698B (zh) * 2020-06-11 2023-07-04 蜜儿乐儿乳业(上海)有限公司 饲料添加剂、营养强化饲料及其利用方法和营养强化禽蛋
CN113243333B (zh) * 2021-05-18 2022-09-13 中山大学 一种模拟肥胖人群膝骨关节炎动物模型的建立方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09135665A (ja) * 1995-11-15 1997-05-27 Iida Katsuya 海産微細藻類を投与して卵中の生理活性物資含有の増加 方法
WO2010107422A1 (en) * 2009-03-16 2010-09-23 Monsanto Technology Llc Poultry meat and eggs comprising beneficial fatty acids
CN102415504A (zh) * 2011-10-17 2012-04-18 北京中科邦尼国际科技有限责任公司 含有海藻蛋白粉富集dha的蛋鸡饲料预混料
WO2014015000A1 (en) * 2012-07-17 2014-01-23 Cornell University Algal-based animal feed composition, animal feed supplement, and uses thereof

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4218437A (en) 1976-07-23 1980-08-19 Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien (Henkel Kgaa) Animal feeds containing a mixture of virginiamycin, zinc bacitracin or flavophospholipol and proteolytic enzymes
RU2108102C1 (ru) 1995-04-11 1998-04-10 Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности Противоанемическое средство
US5900525A (en) 1996-04-26 1999-05-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Animal feed compositions containing phytase derived from transgenic alfalfa and methods of use thereof
AU5121498A (en) 1996-10-29 1998-05-22 Finnfeeds International Limited Use of an enzyme for promoting pigment uptake from a feed
JP2001286262A (ja) 2000-04-05 2001-10-16 Nikken Sohonsha Corp 鶏用飼料添加物
US20020192731A1 (en) 2001-04-12 2002-12-19 H. Shih Jason C. Method and composition for sterilizing surgical instruments
BRPI0213813B1 (pt) 2001-10-31 2018-11-21 Cornell Res Foundation Inc método para aprimorar o valor nutricional de uma ração consumida por um animal monogástrico e ração
US20050186282A1 (en) 2002-08-01 2005-08-25 The Regents Of The University Of California, A California Corporation Method and compositions for preparing and delivering lipids, other nutrients and medicaments
US8092853B2 (en) 2003-12-02 2012-01-10 Purina Mills, Llc Gel based livestock feed, method of manufacture and use
AR050646A1 (es) 2004-09-20 2006-11-08 Cargill Inc Suplemento alimenticio mineral
CN1965676B (zh) 2005-11-18 2010-06-23 司建茨 一种生产富硒、碘蛋的鸡饲料生产方法
US20070172514A1 (en) 2006-01-20 2007-07-26 Francis Chi Materials and methods for improving livestock productivity
CA2702577A1 (en) 2007-10-15 2009-04-23 Jbs United, Inc. Method for increasing performance of offspring
US8343753B2 (en) * 2007-11-01 2013-01-01 Wake Forest University School Of Medicine Compositions, methods, and kits for polyunsaturated fatty acids from microalgae
CN104770424A (zh) 2008-10-14 2015-07-15 索拉兹米公司 微藻生物质的食品组合物
US20100303990A1 (en) 2008-10-14 2010-12-02 Solazyme, Inc. High Protein and High Fiber Algal Food Materials
EP2381951B1 (en) 2009-01-28 2015-12-23 Life Science Nutrition AS Compositions and methods of treating viral infections
EP3622828B1 (en) 2009-04-14 2022-11-16 Corbion Biotech, Inc. Novel microalgal food compositions
JP2011068741A (ja) 2009-09-25 2011-04-07 Nippon Shokubai Co Ltd イカダモ属藻類から油脂類を抽出する方法並びに油脂類及び脱油脂残渣の用途
CN101766259B (zh) 2009-10-22 2012-05-09 东莞市静茵饲料生物科技有限公司 一种复合型饲用添加剂
US8486675B2 (en) 2009-11-11 2013-07-16 Bioexx Specialty Proteins Ltd. Protein concentrates and isolates, and processes for the production thereof from macroalgae and/or microalgae
WO2011100763A2 (en) 2010-02-15 2011-08-18 Alltech, Inc. Ruminant dietary supplement compositions and methods of manufacturing and using the same
MX347228B (es) 2010-04-14 2017-04-19 Solazyme Roquette Nutritionals Llc Composiciones alimenticias de harina de microalgas ricas en lípidos.
KR20140010126A (ko) * 2011-03-03 2014-01-23 터서스 파마수티칼 엘엘씨 C16:1n7-팔미톨리에이트를 포함하는 조성물들 및 방법들
CN102326687B (zh) 2011-07-14 2013-02-20 山东新希望六和集团有限公司 一种添加小麦胚芽的肉鸡配合饲料及其制备方法
CN102423000B (zh) 2011-11-11 2013-06-12 陕西华秦农牧科技有限公司 一种氨基酸平衡的低蛋白质产蛋鸡浓缩饲料
WO2014058516A1 (en) 2012-07-27 2014-04-17 Luitpold Pharmaceuticals, Inc. Method of treating iron deficiency anemia
CN105555146A (zh) 2013-07-11 2016-05-04 康奈尔大学 包含外源性蛋白酶的基于藻类的动物饲料组合物、动物饲料添加剂、及其用途
US20170119018A1 (en) 2014-04-28 2017-05-04 Cornell University Compositions comprising defatted microalgae, and treatment methods

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09135665A (ja) * 1995-11-15 1997-05-27 Iida Katsuya 海産微細藻類を投与して卵中の生理活性物資含有の増加 方法
WO2010107422A1 (en) * 2009-03-16 2010-09-23 Monsanto Technology Llc Poultry meat and eggs comprising beneficial fatty acids
CN102415504A (zh) * 2011-10-17 2012-04-18 北京中科邦尼国际科技有限责任公司 含有海藻蛋白粉富集dha的蛋鸡饲料预混料
WO2014015000A1 (en) * 2012-07-17 2014-01-23 Cornell University Algal-based animal feed composition, animal feed supplement, and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
WO2016011410A1 (en) 2016-01-21
CN107072182A (zh) 2017-08-18
US20170202894A1 (en) 2017-07-20
US11077158B2 (en) 2021-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Madeira et al. Microalgae as feed ingredients for livestock production and meat quality: A review
Świątkiewicz et al. Application of microalgae biomass in poultry nutrition
CN107072182B (zh) 用脱脂微藻动物饲料对家禽产品的ω-3脂肪酸富集
Hur et al. Overview of conjugated linoleic acid formation and accumulation in animal products
Alvarenga et al. Manipulation of omega‐3 PUFAs in lamb: Phenotypic and genotypic views
Gerzilov et al. Effect of a dietary herbal mixture supplement on the growth performance, egg production and health status in chickens
US20100086638A1 (en) Feed formulations containing docosahexaenoic acid
US20150201649A1 (en) Algal-based animal feed composition, animal feed supplement, and uses thereof
Valente et al. Microalgae as feed ingredients for livestock production and aquaculture
Leng et al. Effect of dietary defatted diatom biomass on egg production and quality of laying hens
WO2015168136A1 (en) Compositions comprising defatted microalgae, and treatment methods
US10986856B2 (en) Human and non-human animal use of microbial anaplerotic oil
EP3407729A1 (en) Protein containing material biomass and methods of production
AU2019337405A1 (en) Method for extracting an oil rich in polyunsaturated fatty acids (PUFA)
Eid et al. Effect of plant source of omega-3 fatty acids and green tea powder on the performance and meat quality of growing rabbits
Salim et al. PRODUCTIVE PERFORMANCE, PHYSIOLOGICAL AND ANTIOXIDANT STATUS OF GROWING V-LINE RABBITS DRINKING WATER SUPPLEMENTED WITH AMPHORA COFFEAEFORMIS DIATOMS ALGA EXTRACT DURING HOT CONDITIONS.
US11758934B2 (en) Human and non-human animal use of microbial anaplerotic oil
Jack et al. Microalgae application in feed for ruminants
Shunthwal et al. Effect of feeding linseed oil on growth performance and nutrients utilization efficiency in broiler chicks
Westbrook Enzyme supplementation of layer hen diets containing whole flaxseed to increase n-3 fatty acids in chicken eggs
Ganna et al. Effect of Dietary Supplementation of Some Emulsifiers on Growth Performance, Carcass Traits, Lipid Peroxidation and Some Nutrients Digestibility in Broiler Chickens
Li et al. Nutrition and feeds for abalone: Current knowledge and future directions
Carvalho et al. Research Article Oils Combination with Microalgal Products as a Strategy for Increasing the N-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acid Content in Fish Oil-Free Diets for Meagre (Argyrosomus regius)
EL-Sayed Effect of adding soy lecithin, xylanase and their combination to low energy diet on carcass traits, meat quality, and some blood parameters of broiler chicks.
Farina Use of functional fatty acids in animal nutrition to improve animal health status and derived products

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant