CN113243333B - 一种模拟肥胖人群膝骨关节炎动物模型的建立方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型模拟肥胖人群膝骨关节炎动物模型及其建立方法和应用，通过结合饮食和一定强度的跑轮运动，采用上坡运动的方式增加了关节应力，更好的模拟膝关节软骨受损，造成关节力学性能的改变，对肥胖人群膝骨关节炎发病过程进行了有效模拟，建立了一种与临床上肥胖患者膝骨关节炎发病机理相类似的新型动物模型。同时，通过不同时间的跑轮运动得到了不同时期(早、中、晚期)的骨关节炎模型。本发明建模方法简单有效，可以模拟肥胖人群骨关节炎的发病过程，可以为肥胖人群膝骨关节炎发病原因、机理、进展研究提供更为贴近的动物模型，为后续研究骨关节炎发病机制及治疗方法提供了一定的基础，适合使用并推广。
Description
技术领域
本发明涉及骨关节炎动物模型建立技术领域，更具体地，涉及一种模拟肥胖人群膝骨关节炎动物模型及其建立方法和应用。
背景技术
骨关节炎(Osteoarthritis, OA)主要是以关节软骨退变，伴随软骨下骨重塑、骨赘增生、滑膜炎症为特征的一种慢性退行性疾病，临床表现为关节疼痛、水肿、活动受限。由于关节软骨主要由软骨细胞和细胞外基质组成，无血管，神经和淋巴的特性使其失去了自我修复和再生能力，因此研究骨关节炎的发病机制对其进行相关的治疗是极为有意义的。骨关节炎疾病相关的危险因素包括年龄、肥胖、外力损伤、关节软骨微环境代谢紊乱等，目前已经有研究发现骨关节炎的发病率及严重程度跟体重指数（BMI）有着明显的联系，BMI的数值越大，越容易引发骨关节炎且伤病的程度更严重，表明肥胖是引起关节软骨损伤病变造成骨关节炎的重要因素。中国的超重成年人数目前仅次于美国，位于全球第二；而超重儿童人数，目前为世界第一，同时，根据世界卫生组织(WHO)的最新数据，全球OA人数已超过4亿，我国约有1亿人患有OA，其中40%为肥胖患者。
目前已经建立了多种模拟骨关节炎的动物模型，其中主要是以小动物（小鼠、大鼠、兔）为模型对象。宏观上可分为两大类：实验动物自发模型及人为诱导模型。实验动物自发模型包括天然自发型和基因敲除型等；人为诱导模型包括手术诱导、化学药物诱导、非侵入机械力作用诱导，但是目前尚无较好的模拟肥胖病人的骨关节炎模型。因为对于自发型肥胖模型，仅仅通过诱发肥胖缓慢造成骨关节炎，所需建模时间过长；而非侵入机械力作用诱导及手术诱导模型通过人为诱导得到的模型，虽然这些模型能造成关节的病理学改变，但是与肥胖人群的OA发病原因、机理、进展过程不大相符。中国专利CN112400800A公开了一种劳损性膝骨关节炎动物模型的构建方法，利用小鼠在DMM手术和跑台运动的干预下出现OA程度的软骨损伤得到膝骨关节炎模型，这主要争对研究高强度运动人群OA罹患机制建模，所以这种模型的OA发病原因、机理、进展过程都与肥胖人群不大相符，肥胖人群易患OA可能是由于肥胖会引起局部或全身炎症及体重增加关节负荷等原因造成了关节生物力学的改变，为了更好的研究肥胖人群膝骨关节炎发病过程，需建立一种与临床上肥胖人群膝骨关节炎发病机理相类似的动物模型。
发明内容
本发明的目的是提供一种模拟肥胖人群膝骨关节炎动物模型的建立方法，通过给予小鼠高脂饲料饮食造成其肥胖，在肥胖的基础上，给予一定强度的跑轮运动，采用上坡运动的方式增加了关节应力，更好的模拟肥胖人群的膝关节软骨受损，从而建立模拟肥胖人群的膝骨关节炎动物模型，同时，还得到了早、中、晚期骨关节炎模型。
本发明的又一目的是提供一种模拟肥胖人群膝骨关节炎动物模型。
本发明的另一目的是提供一种模拟肥胖人群膝骨关节炎动物模型的建立方法的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种模拟肥胖人群膝骨关节炎动物模型的建立方法，先高脂饲养模型动物，使其体重至少高于正常饲养的模型动物体重20%，为肥胖造模成功，然后进行上坡运动，第一周为适应性运动周，每次运动时间为60~80分钟；适应性运动结束后进行正式运动周，正式运动周为2~8周，每次运动时间为60~80分钟。
本发明先通过高脂的饮食造成模型动物的肥胖，在有一定程度的肥胖基础上，还给予一定强度的上坡运动，由于这种上坡运动的方式增加了关节应力，更好的模拟膝关节软骨受损，从而建立膝骨关节炎动物模型。同时，通过控制跑轮训练的模式，设置了适应性运动周和正式运动周，适应性运动周可以更好的使模型动物达到同一训练效果，让后期进入正式运动时更加稳定，而且本发明还通过控制不同的运动时间长短，得到了不同时期（早、中、晚期）的骨关节炎动物模型。
优选地，所述上坡运动为跑轮运动。
优选地，所述适应性运动周的运动速度从0转/分钟以每日增加5转/分钟逐渐递增到25转/分钟。
优选地，所述模型动物为小鼠、大鼠、兔中的一种。
优选地，所述小鼠为雄性C57BL/6小鼠。
优选地，所述模型动物为4~8周龄。
优选地，所述高脂饲养的时间为8~12周。
优选地，所述高脂饲养的饲料含有60kcal%脂肪供能。
优选地，所述高脂饲养时每隔三-五天进行一次换食。以保持食物的新鲜干燥。
优选地，所述适应性运动周和正式运动周连续进行五天的上坡运动，剩下的时间不进行上坡运动。
优选地，所述正式运动周的上坡运动包括准备活动和匀速运动。
优选地，所述准备活动持续20分钟，速度从5转/分钟逐渐递增到25转/分钟，所述匀速运动持续60分钟，速度为25转/分钟。
经过上述的上坡运动后，经过2周的正式运动周的上坡运动后得到骨性关节炎早期模型、经过4周的正式运动周的上坡运动方案得到骨性关节炎中期模型、经过8周的正式运动周的上坡运方案得到骨性关节炎晚期模型。
上述生化指标检测，包括如下步骤：
S1. 血清检测：将模型动物进行腹腔麻醉之后，通过摘眼球取血收集模型动物血液，室温放置60分钟后，以3500g的速度离心10 分钟，小心吸取上层血清放入到无菌EP管中，得到模型动物血清样本，检测血液中TNF-α的水平；
S2. 膝关节组织学检测：模型动物处死后收集膝关节，清除膝关节周围的软组织，进行固定，脱钙，石蜡包埋并切片；切片常规脱蜡脱水清洗后，进行组织化学染色及免疫组织化学染色；由三位独立观察者按Pelletier评分标准、OARSI评分标准和Mankin评分标准进行评分，取三组评分均值作为最终得分；
S3. 模型构建和数据分析：实验中所有数据结果均采用均数±标准差来进行表示，然后使用SPSS软件进行分析处理；组内采用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验分析；以P＜0.05表示结果具有显著差异；再对实验数据结果做图总结。
上述生化指标检测中，膝关节标本固定，脱钙后，采用浓度75％、80％、90％、95％、100％的乙醇逐级脱水，二甲苯透明、浸蜡后石蜡包埋，采取冠状位进行切片，连续切片厚6.0μm，再对切片进行染色处理。
上述生化指标检测中，对切片进行HE染色、番红固绿染色及甲苯胺蓝染色。
HE染色：切片在苏木精中浸染3分钟，水洗脱色，然后放入1％盐酸酒精中分化3秒，再放到伊红染液中染色1分钟，之后酒精逐级脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；由三位独立观察者按Pelletier评分标准对滑膜炎症进行评分，取三组均值作为最终得分。
番红固绿染色：将切片浸入固绿浸染5分钟，水洗至软骨绿色较浅，再放入番红O染液中30秒，酒精逐级脱水；二甲苯透明；中性树胶封片；由三位独立观察者按OARSI评分标准对关节软骨损伤进行评分，取三组均值作为最终得分。
甲苯胺蓝染色：将切片浸入甲苯胺蓝浸染30分钟，水洗2分钟,之后酒精逐级脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；由三位独立观察者按Mankin评分标准对关节软骨损伤进行评分，取三组均值作为最终得分。
上述生化指标检测中，对切片进行免疫组织化学染色。
所述免疫组织化学染色为CollagenⅡ免疫组织化学染色。
CollagenⅡ免疫组织化学染色：将切片脱蜡至水、抗原热修复、灭活内源性过氧化物酶等处理后，组织玻片滴加小鼠Ⅱ型胶原单克隆抗体(1∶200)，4 ℃孵育过夜，PBS冲洗5分钟×3次；滴加二抗（1：500），37 ℃孵育20 分钟，PBS冲洗5 分钟×3次。DAB显色，苏木精轻度复染，盐酸乙醇分化，水洗、梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片，镜下观察并拍照。采用Image-Pro plus 6.0图像分析软件，测定单位面积组织切片Ⅱ型胶原纤维免疫组化的相对染色强度。
在上述生化指标检测中，小鼠腹腔麻醉之后，通过摘眼球取血收集小鼠血液，室温放置60分钟后，以3500g的速度离心10 分钟，小心吸取上层血清放入到无菌EP管中，得到小鼠血清样本，检测血液中TNF-α的水平。
在上述生化指标检测中，采用Pelletier评分标准、OARSI评分标准和Mankin评分标准对膝关节组织进行评分，评分标准如下表1~3所示。
表1 OARSI评分标准
OARSI评分标准：0-1正常；1-5 早期；5-9中期；9-14晚期。
表2 Mankin评分标准
Mankin’s评分：0-1正常；1-6早期；6-11中期；12-18晚期。
表3 Pelletier评分标准
Pelletier评分：0正常，1-2早期；2-5中期；5-10晚期。
本发明保护上述建立方法得到的模拟肥胖人群膝骨关节炎动物模型。
本发明还保护上述建立方法在构建模拟肥胖人群膝骨关节炎动物模型中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的方法结合饮食和一定强度的上坡运动，采用上坡运动的方式增加了关节应力，更好的模拟膝关节软骨受损，造成关节力学性能的改变，对肥胖人群膝骨关节炎发病过程进行了有效模拟，建立了一种与临床上肥胖患者膝骨关节炎发病机理相类似的动物模型。同时，通过不同时间的上坡运动得到了不同时期（早、中、晚期）的骨关节炎模型。本发明建模方法简单有效，与现有技术相比，极大的缩短了自发型OA的造模时间，针对肥胖人群患骨关节炎的风险更高的现象，可以更好的为研究肥胖人群骨关节炎的发病原因、机理、进展提供更为贴近动物模型，为后续研究骨关节炎发病机制及治疗方法提供了一定的基础，适合使用并推广。
附图说明
图1 为实施例1的实验过程图。
图2为肥胖模型的构建；A:高脂运动2周组小鼠体重图；B:高脂运动4周组小鼠体重图；C:高脂运动8周组小鼠体重图；D:各组小鼠LEE’S指数。
图3为肥胖运动模型的构建；A:正常组小鼠（左边）与肥胖小鼠（右边）的直观比较；B:跑轮运动训练。
图4为番红固绿染色，每组n=8；A:番红固绿染色结果（黑色箭头表示软骨缺损，图片放大倍数20X，标尺50um）；B:各组小鼠OARSI评分结果（*p < 0.05, **p < 0.01, ***p <0.001, 与control group进行比较）；C:各组小鼠软骨厚度（*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, 与control group进行比较）。
图5为甲苯胺蓝染色，每组n=8；A:甲苯胺蓝染色结果（黑色箭头表示软骨缺损，图片放大倍数20X，标尺50um）；B:各组小鼠OARSI评分结果（*p < 0.05, **p < 0.01, ***p <0.001, 与control group进行比较）;C:各组小鼠蛋白聚糖含量评分结果（*p < 0.05, **p< 0.01, ***p < 0.001, 与control group进行比较）。
图6为HE染色，每组n=8；A:HE染色结果（图片放大倍数20X，标尺50um）；B:各组小鼠Pelletier评分结果（*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, 与control group进行比较）。
图7为CollagenⅡ免疫组织化学染色，每组n=8；A:CollagenⅡ免疫组织化学染色结果（图片放大倍数40X，标尺20um)；B:各组小鼠染色强度分析结果（*p < 0.05, **p <0.01, ***p < 0.001, 与control group进行比较）。
图8为TNF-α炎性因子的ELISA结果，每组n=3（*p < 0.05, **p < 0.01, ***p <0.001, 与control group进行比较， ns：not significant ）。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。
其中出现的部分名词及其缩写：
| 缩写 | 英文全称 | 中文全称 |
| OA | Osteoarthritis | 骨关节炎 |
| BMI | Body mass index | 体重指数 |
| DMM | Destabilization of the medial meniscus | 内侧半月板失稳 |
| HFD | High fat diet | 高脂饮食 |
| HFD+Run | High fat diet+Run | 高脂饮食+跑步 |
| TNF-α | Tumor necrosis factor-α | 肿瘤坏死因子-α |
| Col2 | CollagenⅡ | 二型胶原 |
实施例1
一种模拟肥胖人群膝骨关节炎动物模型的建立方法，包括如下步骤：
S1.实验原料准备：配置实验用到的主要试剂，包括4％多聚甲醛、PBS缓冲液、4％水合氯醛、各比例的乙醇、1％生理盐水、番红固绿染色液、HE染色液、甲苯胺蓝染色液、ELISA试剂盒、CollagenⅡ抗体；将购买32只4周龄小鼠随机分为对照组（control）、高脂运动2周组(HFD+Run-2w)、高脂运动4周组(HFD+Run-4w)、高脂运动8周组(HFD+Run-8w)，每组8只；准备跑轮运动实验相关的器具；
S2 .高脂饲养：将对照组小鼠整个实验周期内给予普通饲料喂养；将高脂组及高脂运动组小鼠整个实验周期内给予高脂饲料喂养，高脂饲料含有60kcal%脂肪供能，为保持食物的新鲜干燥，每三-五天进行一次换食；
S3.跑轮运动培养：高脂运动组小鼠进行12周高脂饲养后，小鼠体重高于对照组小鼠体重20%即为肥胖造模成功，选取造模成功的肥胖小鼠进行跑轮训练；每周进行五天的跑轮运动；周一到周五为训练日；
a1：第一周小鼠的适应性运动周，每次60分钟，速度从5转/分钟开始以每天增加5转的速度逐渐递增到25转/分钟；
a2：适应性运动结束后进行正式运动周；根据实验要求建立早期、中期和晚期骨性关节炎模型；即2周跑轮运动方案为骨性关节炎早期模型、4周跑轮运动方案为骨性关节炎中期模型、8周跑轮运动方案为骨性关节炎晚期模型；正式运动周每次运动时间为80分钟，包括准备活动和匀速运动；准备活动：持续20分钟，速度从0转/分钟逐渐递增到25转/分钟；匀速运动：持续60分钟，速度为25转/分钟，周一到周五为训练日；
S4. 生化指标检测：对三组小鼠分别进行病理检测；
a1：血清检测；将小鼠进行腹腔麻醉之后，通过摘眼球取血收集小鼠血液，室温放置60分钟后，以3500g的速度离心10分钟，小心吸取上层血清放入到无菌EP管中，得到小鼠血清样本，检测血液中TNF-α的水平；
a2：膝关节组织学检测；小鼠处死后收集膝关节，清除膝关节周围的软组织，进行固定，脱钙，石蜡包埋并切片；切片常规脱蜡脱水清洗后，进行组织化学染色及免疫组织化学染色；由三位独立观察者按Pelletier评分标准、OARSI评分标准和Mankin评分标准进行评分，取三组评分均值作为最终得分；
S5. 模型构建和数据分析：实验中所有数据结果均采用均数±标准差来进行表示，然后使用SPSS软件进行分析处理；组内采用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验分析；以P＜0.05表示结果具有显著差异；再对实验数据结果做图总结。
上述的对照组（control）、高脂运动2周组(HFD+Run-2w)、高脂运动4周组(HFD+Run-4w)、高脂运动8周组(HFD+Run-8w)的实验过程如图1所示，其中图中的n为小鼠数量。
1、肥胖模型及肥胖运动模型的构建
与对照组相比，高脂饲养12周之后，结果如图2所示，小鼠体重高于对照组小鼠的平均体重20%，同时，肥胖小鼠与正常小鼠的lee’s指数有着显著性差异（lee’s指数越大，肥胖程度越高）。从图3（A）可以更直观地看出正常组小鼠与肥胖小鼠，说明通过高脂饲养后成功得到肥胖的小鼠模型。图3（B）为跑轮运动训练的仪器。
2、膝关节组织学染色
（1）番红固绿染色
通过对小鼠的膝关节进行番红固绿染色和OARSI评分发现，由图4（A）可以看出，正常关节软骨表面光滑完整，四层结构（软骨表层、过渡区、辐射层、钙化层）清晰可辨，无裂缝，软骨细胞排列紧密，潮线完整，细胞核清晰，染色均匀。
而从图4（A）和图4（B）的各组小鼠OARSI评分结果，可以得知，高脂运动组小鼠软骨损伤严重，运动2周的小鼠表面有软骨层缺损，表面裂隙深达过渡层，软骨下骨小梁变薄，软骨细胞簇集，潮线不完整，为OA早期表现，说明获得了OA早期模型；运动4周的小鼠关节软骨表面粗糙不平，软骨层缺损，表面裂隙深达辐射层，细胞弥漫性增多，出现明显的纤维化增生，潮线不完整，为OA中期表现，说明获得了OA中期模型；运动8周的小鼠关节面萎缩、塌陷，四层结构紊乱，软骨层基本消失，细胞数目明显减少，有显著的纤维化增生，出现多重潮线，软骨下骨暴露，为OA晚期表现，说明获得了OA晚期模型。图C通过image J软件对染色结果分析可知，正常小鼠软骨厚度为270um左右，而高脂运动后小鼠的软骨厚度随运动时间加长而减少，运动8周后厚度仅为50um左右。
（2）甲苯胺蓝染色
通过图5（A）-（B）的对小鼠的膝关节进行甲苯胺蓝染色和Mankin评分发现，正常组可见软骨组织染色均匀，软骨组织层次分明；高脂运动组与对照组比较，软骨表面粗糙，软骨层变薄，着色明显下降，染色不均匀。
其中，运动2周的小鼠软骨浅表区出现裂缝，同时蛋白聚糖含量在浅表区部分区域减少，软骨细胞出现一定的簇集（为OA早期表现）；运动4周的小鼠关节软骨中间区出现裂缝，同时蛋白聚糖含量在中间区部分区域减少，软骨细胞弥散（为OA中期表现）；运动8周的小鼠软骨深层区出现裂缝，同时蛋白聚糖含量在深层区部分区域减少，软骨细胞减少，潮线不完整（为OA晚期表现）。以上结果说明，随着跑轮时间的延长，出现了不同阶段的骨关节炎，软骨损伤不断加重，蛋白聚糖的含量逐渐减少。
（3）H&E染色
通过对小鼠的膝关节进行H&E染色和Pelletier评分发现（图6（A）-（B）），与正常组相比，高脂运动小鼠滑膜炎评分显著高于对照组，有轻度至中度内膜增生，炎症细胞浸润。以上结果说明，随着OA的发展进程伴随着滑膜炎症，跑轮时间的延长会加重滑膜炎症。
3、膝关节CollagenⅡ免疫组织化学染色
通过对小鼠的膝关节进行Col2免疫组织化学染色发现（图7（A）-（B）），与正常组相比，高脂运动小鼠Col2表达水平显著低于对照组，以上结果说明，随着OA的发展进程伴随着Col2的丢失，跑轮时间的延长会加重Col2丢失。
4、血清炎性因子TNF-α检测
通过对小鼠血清样本中TNF-α因子进行检测发现，结果如图8所示，高脂运动2周的小鼠TNF-α表达水平与正常组没有显著性差异，但是高脂运动4周及8周的小鼠炎性因子的表达水平增加，表明了骨关节炎的发生可能会造成全身出现炎症情况，随着骨关节炎的加重，全身炎症情况也会随之加重。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种模拟肥胖人群膝骨关节炎动物模型的建立方法，其特征在于，先高脂饲养模型动物，使其体重至少高于正常饲养的模型动物体重20%，为肥胖造模成功，然后进行上坡运动，第一周为适应性运动周，每次运动时间为60~80分钟；适应性运动结束后进行正式运动周，正式运动周为2~8周，每次运动时间为60~80分钟；
所述适应性运动周和正式运动周连续进行五天的上坡运动，剩下的时间不进行上坡运动；
所述适应性运动周的运动速度从0转/分钟以每日增加5转/分钟逐渐递增到25转/分钟；
所述正式运动周的上坡运动包括准备活动和匀速运动；所述准备活动持续20分钟，速度从5转/分钟逐渐递增到25转/分钟，所述匀速运动持续60分钟，速度为25转/分钟；所述上坡运动为转轮运动；
所述运动周周数为2时，为骨关节炎早期模型；
所述运动周周数为4时，为骨关节炎中期模型；
所述运动周周数为8时，为骨关节炎晚期模型；
所述模型动物为小鼠；所述模型动物为4~8周龄。
2.根据权利要求1所述建立方法，其特征在于，所述高脂饲养的时间为8~12周。
3.权利要求1或2所述建立方法在构建模拟肥胖人群膝骨关节炎动物模型中的应用。
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