CN115887441A - Egcg在防治急性溃疡性结肠炎中的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种EGCG在预防和/或治疗急性溃疡性结肠炎中的新用途。本发明为预防和/或治疗急性溃疡性结肠炎提供了一种新的方式。

Description

EGCG在防治急性溃疡性结肠炎中的新用途

技术领域

本发明属于药物新用途技术领域，具体的说，涉及一种EGCG在急性溃疡性结肠炎中的新用途。

背景技术

溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）是一种常见的慢性、非特异性肠道炎症，是一种以局部溃疡和结肠慢性炎症为主要病理特征的难治性肠道疾病，与克罗恩病（Crohn's disease，CD）统称炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）；UC 患者的肠道炎症损伤主要从直肠开始，以一种连续弥散的模式向近端延伸，可致结肠 粘膜和粘膜下组织的崩解，炎症细胞的浸润；当组织损伤严重时，UC 患者呈现血性 腹泻、里急后重、腹痛以及体重减轻等，严重时也可出现全身性反应，如发热、水 电解质平衡紊乱等当前，UC仍是一个重大的公共卫生问题，会导致相当大的人力、财力损失和昂 贵的医疗成本。此外，UC 及其他原因相关的肠道炎症也被认为是结肠肿瘤形成的重要基础，这是 UC患者死亡的主要原因。

绿茶原产于中国，被认为是世界上最健康的饮料之一，绿茶中富含儿茶素（类黄酮的一种），其中，主要含有 4 种儿茶素：表儿茶素（Epicatechin，EC）、表没食子儿茶素（Epigallocatechin，EGC）、表儿茶素-3-没食子酸酯（Epicatechin-3-gallate，ECG）和表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（Epigallocatechin-3-gallate，EGCG），儿茶素含量最丰富的是EGCG，占总含量的 50-80%，是一种强大的抗氧化剂和活性氧清除剂。因此，绿茶对健康的益处通常被称为 EGCG 的影响，EGCG是医学研究应用最广泛的茶多酚。由于其独特的抗氧化性能，EGCG 在多种过氧化应激相关疾病中的保护作用已被广泛研究，包括癌症、心血管疾病、代谢综合征、糖尿病、缺血性脑卒中、肺部疾病和神经退行性疾病等。

但是未见EGCG用于防治急性溃疡性结肠炎的报道。

发明内容

为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一种EGCG在防治急性溃疡性结肠炎中的新用途。

本发明还提供了一种预防和/或治疗急性溃疡性结肠炎的药物，其特征在于，其中含有EGCG和药学上可接受的药物载体。

进一步的，所述的药物载体包括：表面活性剂、润滑剂、吸收促进剂、稀释剂。

进一步的，所述的药物剂型为片剂、散剂、汤剂、丸剂或胶囊剂

本发明的有益效果：本发明发现了EGCG可用于预防和/或治疗急性溃疡性结肠炎。

附图说明

图1是本发明中EGCG 对 Caco-2 细胞活力影响的柱状图；

图2为EGCG 抑制LPS刺激的 Caco-2 细胞中促炎介质的分泌和COX-2 蛋白水平图；

图3为EGCG 对LPS处理的Caco-2细胞有抑制细胞凋亡和促进增殖作用图；

图4为EGCG 对 LPS 诱导 Caco-2 细胞表达 Notch 相关蛋白的影响图；

图5为EGCG 治疗对小鼠体重变化率的影响图；

图6为EGCG 治疗对小鼠 DAI 评分的影响图；

图7 为EGCG 治疗对小鼠脾胀指数和结肠长度的影响图；

图8为EGCG 治疗对小鼠结肠组织病理形态学和组织病理学评分的影响图；

图9为EGCG 抑制肠道组织中促炎因子的分泌图；

图10 为EGCG 抑制肠道组织中促炎介质的表达图；

图11 为EGCG 对结肠组织中巨噬细胞数量的影响图；

图12为 EGCG 可抑制结肠组织中 M1 型巨噬细胞的数量图；

图13为EGCG 对 DSS 处理的小鼠结肠有抑制细胞凋亡和促进增殖作用图；

图14为 EGCG 对 DSS 处理的小鼠结肠上皮细胞促进增殖作用图；

图15为EGCG 通过增强机械屏障功能减弱 DSS 诱导的上皮通透性图；

图16为EGCG 通过增强黏液层屏障功能减弱 DSS 诱导的上皮通透性图；

图17为EGCG 抑制 DSS 处理小鼠结肠中的 Notch 信号通路图；

图18为EGCG 抑制 DSS 处理小鼠结肠中的 Notch 信号通路蛋白表达图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。

实施例

、实验研究方法

1.1实验动物

采用健康雄性 C57BL/6 小鼠，鼠龄 7~8 周，体质量 18~21g，无特殊病原体(SPF)级，购自中国常州CAVENS实验室动物有限公司，休息 2 周。所有小鼠均维持在受控环境中(12 h光/12 h暗循环；相对湿度60%；环境温度24±1℃)，随机给予实验室标准食品(ShooBree R Rat food，中国南京)和水。所有小鼠实验均按照机构指导原则在动物设施中进行，并经云南农业大学机构动物护理和使用委员会批准。未观察到不良事件。

实验动物分组和构建模型

随机分为 4 组(每组 8 只)，包括正常组(给予水)、DSS 组(第 1 d 开始给予 3%DSS)、 DSS+LE 组(给予 10 mg/kg/d EGCG，第 1 d 开始给予 3% DSS)、DSS+HE 组(小鼠从第 1 d 开始给予 EGCG 20 mg/kg/d，DSS 为 3%)，正常组小鼠自由饮水，其余组给予 DSS为 3%，饮水 8 d。实验期间保持饲养环境清洁，正常提供食物颗粒；每天记录小鼠体重、大便稠度和直肠出血情况。第 9 d 对各处理组小鼠眼球取血，然后用颈椎脱位法处死小鼠，取出小鼠脾脏，称其质量并计算脏器指数，测量结肠从直肠到盲肠的长度并拍照保留，肉眼观察病变情况。

宏观指标（小鼠体重、DAI 评分、结肠长度和脾脏指数）

实验期间需记录小鼠的精神状态、活动情况，记录小鼠体重、大便连续性以及有EGCG 靶向 Notch 改善 DSS 诱导的急性溃疡性结肠炎及分子机制研究 15 无便血。每日临床疾病评分是基于体重减轻、大便稠度和有无大便带血的特殊组合来 评估的[107,108]。体重减轻是通过计算出小鼠最初体重（第 0 天）与任何特定的日子之 间差值的百分比。第 9 d 小鼠解剖取出结肠组织时，立即测量结肠组织的长度。取各 组小鼠全脾，测定湿重。脾脏指数=脾脏湿重（mg）×10/体重（mg）。疾病活动指 数评分细节见表1。

表1疾病活动指数评分表（DAI）

Table 1Assessment of disease activity index (DAI)

1.4石蜡包埋组织

参照以下具体步骤包埋肠道组织：

（1）从保存于福尔马林的离心管中，使用小剪刀、镊子取长度为 1cm 左右形态 完整的结肠组织，对应放入编号的带孔冲洗盒子中，再将盒子放入透明烧杯中，小流 水冲洗4h 以除去组织中的福尔马林；

（2）利用乙醇溶于水将组织中的水置换出来，把冲完的组织取到编号的 50mL 离心管，倒入配制好的稀释乙醇依次脱水，65%（1h）→75%（1h）→85%（0.5h） →95%（10min）→无水乙醇（两次,每次 5min）；

（3）把乙醇换为二甲苯，目的是为了将组织中的乙醇置换出来，透明组织。乙 EGCG靶向 Notch 改善 DSS 诱导的急性溃疡性结肠炎及分子机制研究 16 醇二甲苯（1min）→二甲苯 I（1min）→二甲苯 II（1min），注意随时观察透明情况， 完全透明后终止；

（4）提前用烧杯在 65℃烘箱把蜡块溶解为液体，过滤除杂，分装至置于 65℃的编号离心管中，将透明好的组织夹到管中，浸蜡 1h（第一步）→浸蜡 1h（第二步）， 主要目的是为了除去上一步骤的二甲苯；

（5）准备一个冰板，将提前洗净预冷的包埋盒置于冰板上，再准备一个酒精灯， 先快速拿出 65℃已过滤好的蜡倒入包埋盒，再用加热的镊子夹取管中的组织放入包 埋盒的一侧，距离适中，最后将样品编号贴到蜡块表面的另一侧，待包埋盒表面的石 蜡开始凝固时将包埋盒水平放入加冰凉水中，使石蜡快速凝固，30min 后，从水中取 出蜡块密封袋保存于 4℃或-20℃；

（6）用石蜡切片机将包埋好的蜡块四周修整齐，将石蜡切片机换上新刀片，设 置切片厚底为 3 微米，有组织的一侧朝外，把蜡块切成连续的蜡带；

（7）使用电磁炉加热一锅温度为 40-42℃的热水，用镊子将切下来的蜡带，轻轻放在水面上，再用弯镊将蜡带分成分别带一个组织的短蜡片，借用水的浮力贴在编号 载玻片上，每个载玻片上贴 3-4 个完整的组织，最后把贴片完的载玻片插在架子上， 置于 65℃烘箱中烘干后储存于 4℃或-20℃备用。

苏木精-伊红染色（H&E 染色）和组织病理学评分

1.51苏木精-伊红染色（H&E 染色）

主要目的是用于观察上述分组实验小鼠的结肠组织肠道损伤，如结肠结构、肠道隐窝破坏和肠道上皮细胞损坏，参照以下具体步骤进行：

（1）选取以上保存的切片，先拿出室温恢复一段时间后，使用烤片机进行烤片 1h左右（温度 65℃）；

（2）用二甲苯把组织中的石蜡置换出来，提前用水浴锅 65℃预热二甲苯 I，再 把烤好的切片置于架子上放入水浴 20min，然后换到二甲苯Ⅱ室温 15min；

（3）按乙醇二甲苯→100%乙醇→95%乙醇→85%乙醇→75%乙醇→65%乙醇（每 级1min）进行水化；

（4）先用 RO 水洗 1min，放入苏木精染液染细胞核，染色 1min，再水洗 1min 去色； EGCG 靶向 Notch 改善 DSS 诱导的急性溃疡性结肠炎及分子机制研究 17

（5）采用配制好的 1%盐酸乙醇分化 10s，再用配制的 5%氨水返蓝 10s；

（6）使用自来水冲洗切片 10min，让细胞核以外的着色区域脱色；

（7）65%乙醇→75%乙醇→85%乙醇→95%乙醇依次脱水；

（8）伊红染色液染细胞质 1min；

（9）按 95%乙醇→100%乙醇 I→100%乙醇 II→乙醇二甲苯→二甲苯 I→二甲苯II 进行脱水和透明；

（10）封片和烤片，用插了枪头的镊子蘸取少量中性树胶滴至组织周围，从一端 至令一端盖上盖玻片，用 1mL 枪头轻压以排出气泡，夹取润湿了二甲苯的棉花球擦 拭封好的片，以除去片子外的树胶，65℃条件下烤片至树脂凝固，收取烤完的切片；

（11）将切片放到显微镜下，用 20×物镜视野进行拍照，观察结肠组织切片形态学上的变化及差异，主要体现在组织切片中结肠组织结构破环程度，炎症细胞浸润程 度以及杯状细胞和隐窝数量的对比差异。

1.52 组织病理学评分

根据 Santucci et al公布的标准，由两名对实验条件不知情的独立观察员在苏木精和伊红染色的切片上评估结肠炎的严重程度。H&E染色结肠切片组织学评价如表2所示。病理评分通过将上述参数的所有评分相加取平均值得到。上述病理学评分由两位病理学学者采用双盲法进行。

表2H&E 染色结肠组织学评价表

Table 2Histological evaluation of colon by H&E staining

1.6免疫组化染色（IHC 染色）

利用抗体与抗原结合，过氧化物酶底物显色的原理呈现结肠组织切片中所需检测的相关蛋白的表达水平，参照以下具体步骤执行：

步骤（1）-（4）同以上 H&E 染色方法一致；

（5）将切片换到 PBS 中 5min，再更换到 up 水中 5min，让组织水化；

（6）修复组织中的抗原，主要目的是因为福尔马林浸泡过的组织会使组织中的 抗原内陷，抗体和抗原的结合会减少，通过柠檬酸钠缓冲溶液的修复使抗原结合点更 多的暴露出来，以便与抗体结合。用（pH6.0；0.01M）柠檬酸钠缓冲溶液作为抗原修 复液，微波高火修复时间：第一次（1min 40s）→第二次（35s）→第三次（25s）→ 第四次（20s），注意中间置于室温 8 min 后再进行下一次，完成后盖上盖子用流水 冷却至室温；

（7）PBS洗3 遍，每次3min，用免疫组化笔在切片上把组织画在圈内，圈的边 缘与组织的距离要求适中；

（8）使用 sp-6000过氧化物酶阻断剂滴到圈内，37℃孵化箱孵育 20 min，以消 除内源性过氧化物酶活性；

（9）倾去上液，PBS 中洗 5 min，使用 ABC 试剂盒中的血清封闭非特异性抗原（血清配制：3 滴浓缩液，10 mL PBS，混匀），37℃孵化箱孵育 20 min；

（10）完成上一步骤后倾去上液不用洗，从抗体库选择我们实验所需的抗体，按IHC 说明书要求提前配制，用移液枪移取配制的抗体滴至组织处，切片放置于保湿盒 后置于 4℃过夜；

（11）拿出保湿盒，室温恢复 30 min 后用移液枪回收对应的抗体，PBS 洗 3 次；

（12）按一抗的来源（鼠或兔源）选择对应的 IHC 试剂盒配制二抗，3 滴血清储 存液，10 mL PBS，1 滴二抗储存液，混匀备用，二抗滴至圈内，37℃孵育 30 min， PBS 洗 3遍；

（13）提前 30 min 配制 ABC 工作液（2 滴 A 液，5 mL PBS，2 滴 B 液，混匀静置），滴 ABC 溶液 37℃孵育 30 min，PBS 洗 3 次；

（14）专用 DAB（过氧化物酶底物）染色 5 min，染液即用即配，注意显微镜下 观察背景颜色，出现褐色马上入 PBS 中洗，终止染色，以上步骤（7）-（14）在保湿 盒中操作；

（15）UP 水洗 1 次，更换到苏木精染液中（染细胞核），染色约 5min；

（16）同以上 H&E 染色方法一致进行返蓝，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，封片和烤片；

（17）显微镜下观察染色结果，对比分组实验小鼠的组织切片中的褐色区域，拍照记录。

培养 Caco-2 细胞系

（1）复苏实验所需细胞 Caco-2（人克隆结肠腺癌细胞系）：带上专用棉手套， 从-150℃的冰箱里取出装有 Caco-2 细胞的冻存管，用 37℃恒温水浴锅水流在管壁周 围，加快细胞的溶解，冻存管内的细胞溶解至 80%左右即可。为了除去细胞冻存液中 的 DMSO，用移液枪将其取出至 50mL 离心管中，再加入 10mL 预热过的 PBS，移液 枪吹打使细胞混匀之后，把离心管盖上盖子放入离心机中（1500r/min），离心 3min， 离心结束后将离心管喷洒酒精之后拿至超净台抽弃上清液，加入 10mL 预热的完全培 养基（10%胎牛血清+1%青链霉素混合液 DMEM 培养基，混匀）重悬细胞，混匀， 全部取出至标记好名称、代数的培养皿内，紧贴超净台的台面进行画圈、十字法轻轻 摇晃，使细胞均匀分布在培养皿内，放入含5%CO2 的 37℃恒温培养箱内进行培养。

（2）Caco-2 细胞系传代：第二天把复苏的细胞从 37℃恒温培养箱取出，在显微镜下观察细胞状态，确认细胞状态良好，若细胞长满至 70%左右就将其进行传代，弃 去培养液，预热 PBS 洗一遍，再加入8mL预热培养基吹打吹匀细胞，平分为 2板细胞进行传代，下次也是按照一板细胞分为2板细胞的原则传代，后续等到细胞状态稳 定，达到实验分组处理所需细胞数，就可以分板处理进行相关实验。

（3）Caco-2 细胞冻存：注意将多余细胞进行冻存，用于后续实验，按照胎牛血 清：DMSO﹦9：1 比例配制所需冻存液，在超净台内抽弃原有培养基，PBS洗一遍， 然后在每个培养皿内加入适量完全培养基，用移液枪反复吹打培养皿底部细胞，待细胞完全脱落，将其转移入 50mL 的离心管内，吹打混匀，离心，去上清，一般按一板细胞冻存一株细胞的原则加入所需的冻存液，细胞重悬之后转移至冻存管内。将冻存 管命名放入装有异丙醇的冻存盒内，置于-80℃的冰箱 48h，再将冻存盒内的冻存管转 移至-150℃的冰箱冻存。

诱导 Caco-2 细胞损伤实验

将 LPS 和 EGCG 溶于无菌蒸馏水分别配置成 10 mg/ml 和 20 mg/ml 的浓度后放 入-20℃冰箱待用。取处于对数期，生长状态良好的细胞进行实验。将 Caco-2 细胞随机分为 4 组：正常对照组，25ug/ml LPS 模型组，LPS+10ug/ml EGCG组，LPS+30ug/ml EGCG组。按 300 万/小皿细胞提前一天接入， 第二天晚上 9 点饥饿细胞，第三天早上 9 点加药。EGCG 组预先处理 1 h，然后分别 加入 LPS 处理 24 h 后收集细胞。

细胞活性测定

采用 MTT 法评估 EGCG 对细胞活力的影响：

（1）接板：以 104 个/孔的密度将细胞接种到 96 孔细胞培养板中培养 24 h（目的： 使细胞处于贴壁状态）；96 孔板每孔加 200ul

（2）加药：用无血清高糖培养基配成不同浓度的 EGCG（0，5，10，20，30， 40，50ug/ml）处理细胞 24 h；

（3）加 MTT：用预加热的 PBS 洗涤细胞，对照组、处理组均避光加入 20ul/孔 MTT（0.5 mg/mL）孵育 4 h；

（4）加二甲基亚砜（DMSO）溶液：吸走空白组的 PBS，对照组的培养基和处 理组带药的培养基，用预热 PBS 洗一次，每孔加入 200ul DMSO 溶液；

（5）摇 10 min 后，在 490 nm 处测吸光值。细胞活力以未处理对照细胞(阴性对照，NC)的百分比表示。每个实验条件都进行了 6 次重复测试。

检测结肠组织和细胞上清中炎症因子含量

将各处理组小鼠结肠组织分别配制成 10%匀浆溶液，5000 r/min 离心 10min，取上清。采用 ELISA 检测试剂盒分别检测小鼠结肠组织中 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 MCP-1 水平，具体操作步骤如下： 收集各处理组细胞培养液，分别对各处理组细胞培养液进行 3000r/min 离心 15 min，获得上清液。采用 ELISA 检测试剂盒检测细胞培养液中 TNF-α 水平，具体操 作步骤如下：

（1）预先计算好所需的板条数，实验前 30 min，拿出试剂盒，恢复至室温。

（2）每个反应孔中加入 100μl 标准品工作液及检测样本（若样本浓度高于检测范围，需用标准品&样本稀释液稀释后取样），标准品需做复孔。

（3）加检测抗体：每个反应孔中加入 50μl 抗体工作液，封板后于室温孵育 3 h。提示：加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，避免产生气泡。加样时间控制在 10 min 内。

（4）洗涤：弃去液体，甩干，每个反应孔中加入 250 μl 洗涤液，浸泡 1-2 min， 甩干洗涤液。重复 3 次，每次在滤纸上扣干。

（5）加酶：每个反应孔中加入 100 μl HRP 工作液至反应孔中，封板后于室温孵育 20 min。

（6）洗涤：每个反应孔中加入 250 μl 洗涤液，间隔 1 min，甩干洗涤液。重复 4次。

（7）显色：每个反应孔中加入 90 μl 显色剂 TMB（避光）至反应孔中，封板后 于室温避光孵育 20 min 左右。提示：根据孔内颜色的深浅（深蓝色）来判定终止反 应。

（8）每个反应孔中加入 100 μl 终止液，即刻用酶标仪 450 nm 波长下测量 OD值 （5 min 内）。

（9）用酶标仪 450 nm 波长测定 OD 值。

（10）计算标准品、样品的平均 OD 值：每个标准品和样本的 OD 值应减去零孔 的OD 值。

（11）以标准品浓度为横坐标，吸光度 OD 值为纵坐标，用软件绘制标准曲线。 （作图时去掉空白组的值）。

（12）若样本 OD 值高于标准曲线上限，应做适当稀释后重新检测，计算浓度时 再乘以稀释倍数。上述每个标品和样品孔均为3组平行实验，并每个实验条件都进行了3次重复测试。

组织和细胞的蛋白免疫印迹

（1）提取组织蛋白样品

取保存于-80℃冰箱中的小鼠结肠组织样品，用干净的小剪刀剪取 20~30 mg 的组 织置于 2mL EP 管中，放于冰盒上，加入配平专用的钢珠，按 1:15 的比例加入高效组织裂解液（RIPA：PMSF=100：1，现配现用），采用组织破碎仪进行破碎和匀浆，取出钢珠后把样品管置于冰上裂解 30 min，使用 4℃离心机，15000*g 的转速离心 10 min，重复两遍，收集上清于 1.5 mL EP管中，放置于冰盒上或储存于-80℃备用。

（2）提取细胞蛋白样品

观察细胞状态，将培养 Caco-2 细胞的高糖培养基吸走，PBS 洗一遍，分别用新的高糖（25mM glucose）完全培养基将贴在培养皿底部的细胞吹打下来，计数，离心，重悬，按照 3×106个细胞每板的量接种在 60 mm 的培养皿中，分为对照组，LPS 组，LPS+LE组和LPS+HE 组。培养 24h后（待细胞完全贴壁），将培养基吸走， 预热 PBS 洗一次后换上无血清的高糖培养基进行 12 h的饥饿处理，然后进行加药处理，弃掉原有培养基，用预热 PBS洗一遍，分别加入无血清的高糖培养基，实验前期研究已确定 EGCG 对细胞存活率无影响且选择有效的剂量浓度为 10，30 µg/mL， 以此为依据进行细胞药物处理，用移液枪按照EGCG药物浓度（10，30 µg/mL）加 入EGCG组，放入培养箱中培养 1 h 后，再加入 25 µg/mLLPS培养 24 h 后，弃上清液，冰 PBS 洗一遍，每皿加入200μL 裂解液，摇匀使裂解液铺满整个皿，平放至冰上，裂解 30 min 后用干净枪头进行刮板，收集含细胞的裂解液到 1.5mL EP管中，4℃ 小离心机中使用 15000*g 的转速离心 10 min，重复两遍，收集上清液于1.5mL离心 管中置于冰盒上备用。

（3）蛋白质含量测定

利用 BCA 定量法测定蛋白质样品浓度，为避免蛋白在室温下降解，整个操作过程需在冰上进行。准备好稀释板，定量板，移液枪，冰板，PBS稀释液，取出配好的 1mg/mL 的BSA 标准蛋白，放冰上溶解并离心备用。用 PBS将提前离心好的 BSA 标 准蛋白在稀释板中进行梯度稀释，依次稀释成的蛋白标品浓度为 0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL、0.03125 mg/mL，将提取的蛋白样品用 PBS 稀释35倍，用移液枪混合均匀，之后每孔 20μL 的量将蛋白标品和样品转移至定量 板中，每组三个平行，之后每个标品和样品孔中加 200 μL 配制混匀的 BCA 工作液（A 液：B 液=50：1，现配现用），排枪混匀。定量板放入 37℃恒温箱孵育 30 min，酶 标仪中测量其 OD 值（条件：设置单孔空白孔，560nm、630 nm 双波长）。根据所 得标准品 OD 值数据和标品浓度值建立标准曲线图，根据所得标准曲线，将样品的 OD 值代入其中得出相应蛋白样品浓度，按 60μg 的蛋白上样总量计算对应样品的上 样体积。

（4）制备蛋白样品

在小 EP 管中加 5μL 还原型载样液以及相应的蛋白样品上样体积，掌上离心机离 心制好的样品，且用200μL 枪头弹、混匀，离心3次，混 3次，离心样品，之后煮样器 95℃煮样 10 min（可当天使用或放入-80°C 冰箱备用）。

（5）Westernblot 具体步骤：

配胶：将洗净晾干的薄板和厚板合在一起卡入卡槽内夹紧，再固定于放有胶条的胶板架上。按 8%分离胶配方配制分离胶，现用现配，用移液枪取 3.5 mL 分离胶加入 两板中间，用 200 μL 移液枪缓缓的在上层加 UP 水，以保证分离胶的平直，凝胶 30 min 后，用吸水纸吸干上层水，注意吸水的过程不要触碰到分离胶。按 4%浓缩胶配方配 制浓缩胶，将配好的浓缩胶加到分离胶的上层，并立即将 10 孔梳子插入浓缩胶中， 凝胶 20 min 后收胶，将其放入有 UP 水的小盒中，于 4℃冰箱保存备用。

电泳：按照 900 mL UP 水加上 100 mL 电泳液母液配制所需电泳液。将配好的胶板准确卡入电泳卡槽内，电泳液倒入胶板槽和电泳槽，平整拔出梳子，左边第一孔先 上 3μL 预染 marker，再用 10 μL 或 20 μL 移液枪从左至右的顺序上样（蛋白样品）， 记录好分组处理样品的上样顺序，样品上完后，将卡槽内的电泳液补满，盖上电泳盖， 设置电泳仪条件（第一程序 50 v/30 min，第二程序 120 v/90 min）进行电泳实验。

转膜：转膜液中有甲醇，容易产热，不利于转模，因此提前配制好转膜液，放置 于4℃冰箱预冷，按 720 mL UP 水和 80 mL 转膜液母液再加上 200 mL 甲醇混匀配制 所需转膜液。转膜的操作过程在倒有转膜液的盒子里进行，提前把滤纸放入倒有转膜 液的盒子内，甲醇激活 PVDF 膜大约 15-30 s 后取出移至盒子，4 层滤纸+胶+0.45 mm 的 PVDF 膜+4 层滤纸的顺序夹紧膜（胶紧挨黑色面，膜紧挨白色面夹子），把夹好 的夹子放入转膜槽中，一侧装入冰板，补满转膜液，盖上转膜盖，转模过程中会产热， 把转膜槽置于铺满碎冰的泡沫盒中，设置恒流条件（200 mA/60 min）进行转模。

封闭和铺抗体：按配方提前配制 5%脱脂奶粉封闭液置于 4℃备用，用镊子将转膜结束的 PVDF 膜取出放入倒有 20 mL 封闭液的盒子中，套上一次性手套，室温摇 床封闭 60 min 后，回收封闭液，再用 1×TBST 洗 2 次，注意摇床慢洗 5 min。再将提 前配制抗体（用配制的 5%BSA 溶液按抗体说明书的比例稀释抗体，混匀备用）。倒 入抗体孵育盒，4℃冰箱过夜孵育。

洗膜和曝光显影：回收一抗，用 1×TBST 洗膜3次，每次 5 min。之后用回收的 脱脂奶粉封闭液配制二抗（鼠源/兔源的二抗），倒入盒内，室温摇床孵育 1 h，再回 收二抗，用 1×TBST 在摇床上洗 3 遍，每遍 5 min。按照 A 液：B 液=1：1 比例在 15 mL 外部包有锡箔纸的离心管中配制曝光液（现配现用）。用移液枪取 1 mL 曝光液放入曝光机内，膜的正反两面均接触曝光液后将膜放规整，底部无气泡，关上曝光机 曝光，命名保存结果。

、数据处理

所有数据均采用 SPSS20.0（IBMCorp，Chicago，IL，USA）和 GraphPad Prism5（GraphPad Software，Inc，LaJolla，CA，USA）软件来进行统计学分析和数据作图， 样本的每个实验组间采用平均值±标准差（mean±SEM）进行表示。单因素方差分析 和 Tukey’stest 被采用进行每个组间的数据分析，p <0.05代表差异具有统计学意义。

、实验结果

3.1EGCG 对 Caco-2 细胞活性的影响

为了探究 EGCG 对 Caco-2 细胞生长的影响，使用 MTT 法检测细胞的活力。如图1 所示，与对照组相比，用 EGCG（0-50 ug/mL）处理 24 h 后，细胞活力无显著性差异。因此，选择 EGCG 的浓度为 10、30 ug/mL， 进行下一步实验。

对 LPS 诱导的炎性细胞因子的影响

LPS 是肠上皮细胞各种潜在刺激中最重要的因素之一，可通过多种途径引起肠上皮细胞损伤，严重影响肠上皮细胞的功能。因此，利用 LPS 刺激 Caco-2 细胞，模拟体内炎症环境，探讨 EGCG 对炎症环境下炎症因子的影响。如图 2中A所示，用 EGCG 预处理Caco-2 细胞 1 h 后，再用 LPS 刺激 24 h，发现 EGCG 能够明显抑制 LPS 诱导。

对 LPS 诱导的细胞凋亡的影响

研究了 EGCG 在炎症环境下对肠道上皮细胞增殖和凋亡 的影响。如图 3中A-F所示，与模型组相比，EGCG 治疗后 Bax、Cleaved-caspase-3活性表达显著降低（P<0.05）。所以， 推测 EGCG 可能通过诱导细胞增殖，降低凋亡率，提高结肠上皮细胞的增殖修复损伤能力，进而促进受损上皮细胞的恢复。

对 LPS 诱导的 Caco-2 细胞表达 Notch 相关蛋白的影响

Notch 是 EGCG 的 受体靶点，为了进一步阐明 EGCG 通过降低 LPS 诱导的Notch 信号通路的高表达进而抑制相关炎症响应来改善溃疡性结肠炎的机制，接下来评估了 Caco-2 细胞中 Notch 信号通路蛋白水平。 如图 4 中A-E 所示，与模型组相比，EGCG处理后显著降低了 Notch1、Hes1 和 Cleaved-Notch1 蛋白的表达（P<0.001）证实了 EGCG是通过降低 LPS 诱导的 Notch 信号通路的高表达，进而降低肠道炎症响应改善溃疡性结肠炎。

治疗减缓了 DSS 诱导的小鼠急性溃疡性结肠炎

目前，已经从细胞水平获得了 EGCG 通过抑制 LPS 诱导的 Notch 信号通路的高表达进而降低肠道炎症响应，从而改善溃疡性结肠炎的结论。接下来，构建小鼠急性溃疡性结肠炎模型进行验证在细胞水平上得到的结论。首先，为了明确 EGCG 治疗对 DSS诱导的小鼠急性溃疡性结肠炎的保护作用，监测了小鼠的体重变化、粪便情况和疾病活动指数（DAI）。

如图 5所示，与对照组相比，DSS模型组小鼠的体重在第 6 d 时显著减轻，而EGCG 高剂量治疗组小鼠的体重显著增加（P < 0.05）。同时，如图 6所示，EGCG 治疗组 DAI评分明显降低（P < 0.05 ）。

如图7所示，如图中B、C 所示，测量了小鼠结肠长度，发现 DSS 模型小鼠结肠平均长度较 短，且粪便中可见潜血，而用高剂量的 EGCG 治疗小鼠后，结肠炎的症状得到了明显缓解（p < 0.01）。此外，如图中A所示，DSS 治疗组的脾脏重量明显比空白组的多， 而EGCG 治疗后，脾脏重量显著下降（p < 0.01）。这说明 EGCG 能够有效抑制脾脏肥大。据报道，脾脏是主要免疫器官之一，并且有文献报道在 DSS 诱导的结肠炎中，脾脏会变得肥厚。这与本研究结论相似。

如图8所示，为了更好地了解 EGCG 降低 DSS 诱导的结肠炎模型小鼠疾病严 重程度的能力，对不同处理组小鼠的结肠组织标本进行 HE 染色。相对于对照组和 EGCG 处理的小鼠，DSS 处理的模型小鼠表现出广泛的结肠损伤，表现为炎症细胞浸润，严重粘膜下水肿，正常结肠结构破坏，杯状细胞和隐窝数量显著减少。同时，如 图 3-8B 中的组织学评分结果和 HE 染色结果一致。由此说明，EGCG 治疗可以显著缓解 DSS 诱导的结肠炎症状。

如图9所示，与对照组相比，DSS 模型组小鼠结肠组织中IL-1β、IL-6、TNF-α 和MCP-1 蛋白水平显著升高，而 EGCG 治疗后可显著抑制这些促炎细胞因子的分泌水平（p <0.001）。由此说明，EGCG 可以抑制结肠组织 中 DSS 诱导的炎症因子的分泌。

如图10所示，通过 WB 检测了小鼠结肠组织中促炎因子 TNF-α 和 IL-1β 的表达情况。观察到模型组中 TNF-α 和 IL-1β 的蛋白表达水平呈上升趋势，而 EGCG 治疗后可显著抑制 TNF-α 和 IL-1β 的表达水平（p < 0.001），这细胞实验结果一致，表明了 EGCG可以抑制结肠组织中 DSS 引起的促炎因子的表达水平，EGCG 能够治疗UC。

如图11所示，EGCG 可显著减少DSS诱导小鼠结肠组织中 F4/80 和 M1型巨噬细胞的数量，这表明，EGCG 能够抑制 M1型巨噬细胞数量，调节结肠 M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的分泌水平。

如图12所示，与 DSS 组小鼠相比，EGCG 处理后显著降低了结肠组织中 iNOS 蛋白的表达水平 （p < 0.001），这与 IHC 染色分析的结果一致。由此可知，EGCG 能够缓解结肠炎症， 加速创面愈合，促进了受损上皮细胞的恢复。

如图13中A-E所示，采用 WB 检测结肠中 Bax、Bcl-2、Caspase-3 和 Cleaved-caspase-3 蛋白的表达水平。与模型组相比，EGCG 治疗后 Bax、Cleaved-caspase-3 蛋白表达显著降低（p < 0.001）， 而 Bcl-2 的表达水平显著升高（p < 0.001），证明了 EGCG能够抑制结肠细胞的凋亡和促进结肠细胞的增殖。

如图14所示，可以观察到模型组 Ki-67 阳性细胞数量减少，且 主要集中分布在结肠隐窝下部，而 EGCG 处理后明显有益 Ki-67 阳性细胞的恢复。这 表明 EGCG 可能通过调控 DSS 诱导的结肠炎细胞凋亡和增殖，降低凋亡率，促进受 损上皮细胞的恢复来维持肠上皮屏障。

如图15所示，通过 WB 检测分析 Occludin、ZO-1 的表达水平。结果显示，对 照组小鼠结肠中 Occludin、ZO-1 蛋白表达量较高，但 DSS 处理小鼠结肠中 Occludin、 ZO-1蛋白表达量明显降低（p < 0.001）。而在给予 EGCG 治疗的小鼠中 Occludin、 EGCG 靶向Notch 改善 DSS 诱导的急性溃疡性结肠炎及分子机制研究 35 ZO-1 蛋白的表达水平显著高于模型小鼠（p < 0.001），这表明 EGCG 可以促进小鼠 结肠上皮细胞屏障缺陷的恢复，从而调节肠道通透性。

如图16所示，IHC 染色 MUC2 结果显示，与模型组相比，给予 EGCG 治疗的小鼠中 MUC2 表达显著升高，这表明了 EGCG 能够调节粘液的分泌，促进黏膜屏障功能 的恢复缓解结肠炎。

如图17所示，WB 检测显示 Notch1 和 Hes1、Cleaved-Notch1 蛋白表达明 显升高，这表明模型组小鼠结肠组织中 Notch 信号通路被激活。与模型组相比，EGCG 处理后，Notch1 和 Hes1、Cleaved-Notch1 表达明显降低（p < 0.001）。

如图18所示，IHC 染色 Notch-1 和 Hes-1 结果显示，与对照组相比，模型组结肠组织中 Notch-1 和 Hes-1 蛋白表达明显增多，给予 EGCG 治疗后，小鼠结肠组织中Notch-1 和 Hes-1 蛋白表达显著降低。EGCG 主要通过抑制 Notch 信号通路的过度活化，使肠道炎症响应改善和肠道通透性降低，最终起到缓解急性溃疡性结 肠炎的作用。

综上所述，本发明的实验结果再次证实了 EGCG 在 DSS 诱导的小鼠 UC 模型中能够 减轻临床症状，减轻结肠炎症,恢复肠道通透性，其治疗作用机制是由于抑制了结肠组织中 Notch 信号通路的过度活化，缓解了肠道炎症响应。使用 EGCG 或含有 EGCG 的天然成分可治疗 UC。

最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (4)

1.EGCG在预防和/或治疗急性溃疡性结肠炎中的新用途。

2.一种预防和/或治疗急性溃疡性结肠炎的药物，其特征在于，其中含有EGCG和药学上可接受的药物载体。

3.根据权利要求2所述的一种预防和/或治疗急性溃疡性结肠炎的药物，其特征在于：所述的药物载体包括：表面活性剂、润滑剂、吸收促进剂、稀释剂。

4.根据权利要求2或3任一项所述的一种预防和/或治疗急性溃疡性结肠炎的药物，其特征在于：所述的药物剂型为片剂、散剂、汤剂、丸剂或胶囊剂。

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