CN116019064A - 一种湿热证慢性复发性溃疡性结肠炎小鼠模型的建立方法及其应用 - Google Patents
一种湿热证慢性复发性溃疡性结肠炎小鼠模型的建立方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种湿热证慢性复发性溃疡性结肠炎小鼠模型的建立方法及其应用。本发明初始让小鼠感受湿热之邪(置于温度33℃±2，相对湿度93％±2的人工气候箱)，饮食不节(予以高脂饲料和白酒灌胃)，而后给予不同浓度DSS多次诱导(贴近慢性复发型)，模型病位在肠，与脾胃关系密切，以大肠湿热为标，脾胃虚弱为本。本发明构建的模型不仅可以较好模拟中医临床中溃疡性结肠炎患者的症状，而且可以更好观察溃疡性结肠炎发展变化情况，以期达到模拟临床机体的变化，便于发展对溃疡性结肠炎中医药物治疗的研究，同时以软件技术将该动物模型的观爪尾色泽部分量化，使得评价更为客观严谨，评价结果更为精确。
Description
技术领域
本发明属于中医湿热证溃疡性结肠炎基础研究和实验动物学领域涉及动物模型的建立方法，特别涉及一种湿热证慢性复发性溃疡性结肠炎小鼠模型的建立方法及其应用。
背景技术
溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)是一种肠道非特异性炎症性疾病，其重要特征是肠道炎症和肠上皮结构破坏，临床表现为持续或反复发作的腹泻、黏液脓血便伴腹痛、里急后重和不同程度的全身症状，该病慢性反复迁延，治疗上缺乏特异性措施且容易复发和癌变，被世界卫生组织(World health organization，WHO)列为现代难治病种之一，UC是欧洲和北美的常见病，但近年随着我国生活水平的提高以及诊断技术的不断进步，UC在我国的增加趋势非常明显，我国目前的UC推测患病率约为11.6/10万，已成为消化系统常见病，给患者及其家庭带来巨大的经济和精神负担。溃疡性结肠炎具体的发病机制尚未清楚，当前研究认为其可能和家族遗传、环境、心理、饮食、情绪等多种因素相关。UC目前临床上尚无特效药治疗，治疗方法首选内科药物，但因UC病情反复迁延，长期用药也伴随着不良反应等问题。中药治疗UC具有副作用小，经济效益大等优势，因此开发UC防治效应的中药制剂具有重大意义。而对于UC的理解，学者们很大程度上只能依赖于贴近人类疾病或是概括人类疾病的动物模型。因此，在探究UC的发病机制和药物治疗方面，贴近临床的动物模型是必不可少的，这将有助于更好地针对疾病发病机制设计临床药物及治疗。据临床调查，湿热证是UC中医临床中最为常见的证型，因此在进行UC的中医药相关研究时，复制湿热证UC动物模型尤为重要。
查阅相关文献发现，当前实验性结肠炎以啮齿动物模型为主，葡聚糖硫酸钠(Dextran sodium sulfate，DSS)诱导的小鼠肠道炎症是应用最广泛的模型之一。DSS诱导的炎症发病及严重程度与DSS浓度及用药周期有关。但当前关于UC中医证候的动物模型都为急性，导致动物模型缺乏了UC作为人类慢性复发性疾病应有的疾病变化过程。同时，关于中医证候的动物模型造模文献资料虽有很多，但学术界仍然没有统一的标准及造模方法。判断中医证候动物模型最后成模的标准完全依赖于实验者的主观评价，仅以此来判断造模成功与否是具有局限性和缺乏严谨性的。这些不足一定程度上阻碍了湿热证慢性复发性UC基础研究、临床药物机制研究及新药开发。
发明内容
本发明的目的在于弥补现有技术的不足，基于现有湿热证动物模型和溃疡性结肠炎动物模型的造模方法，利用DSS溶液自由饮用多次诱导以贴近慢性复发性UC，加高脂饮食自由摄取、白酒灌胃模拟饮食不节、内生湿热，和人工气候箱模拟湿热环境联合复制，更好模拟湿热证慢性复发性溃疡性结肠炎发展变化的规律；同时结合人工智能颜色分析技术，增加中医证候诊断的严谨性，提供一种湿热证慢性复发性溃疡性结肠炎小鼠模型的建立方法。
本发明的另一目的在于，提供上述方法在中医症候评价中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种湿热证慢性复发性溃疡性结肠炎小鼠模型的建立方法，采用DSS(葡聚糖硫酸钠)和高脂饲料、白酒并人工气候箱联合诱导的湿热证慢性复发性UC模型，具体如下：
①高脂饲料处理：小鼠从第0天起，自由摄食高脂饲料，持续11天；
②DSS处理：小鼠从第6天起，将普通水改为DSS溶液自由饮用，该操作持续6±1天；
③人工气候箱处理：小鼠从6天起，每日放入温度33±2℃，相对湿度93±2％，光照1～2级的人工气候箱中8±1小时，该操作持续6±1天；
④白酒处理：小鼠从第6天起，隔日给予白酒灌胃，共进行3～4次；
以①-④为一个循环，以此反复三个循环造模，每次循环以恢复期作为过渡，恢复期期间模型组暂停所有造模操作，普通水普通饲料自由饮用，恢复期持续6±1天。
优选地，在第1次和第2次循环中，②、③中所述的操作持续6天，在第3次循环中，②、③中所述的操作持续5天。
优选地，①中所述的高脂饲料为HF45。
优选地，②中所述的DSS溶液的浓度为1.5％～3％。
更优选的，在第1次和第2次循环中，②中所述的DSS溶液的浓度为1.5％，在第3次循环中，②中所述的DSS溶液的浓度为3％。
优选地，③中所述的白酒灌胃的用量为0.3mL/只，1次/天。
优选地，③中所述的白酒为29°九江双蒸酒。
优选地，所述的构建方法中采用的小鼠是7～8周龄，体重18～22g的SPF级BALB/C雄性小鼠。
优选地，所述的建立方法还包括如下步骤：
(1)通过观察小鼠各项体征变化，验证所述湿热证慢性复发性溃疡性结肠炎小鼠模型是否构建成功；
和/或，
(2)通过DAI(疾病活动指数，Disease Activity Index)评分细则、湿热评分细则、结肠组织宏观病理评分细则和结肠组织病理评分细则，分别计算小鼠DAI评分、湿热评分、结肠组织宏观病理评分和结肠组织病理评分，验证所述湿热证慢性复发性溃疡性结肠炎小鼠模型是否构建成功；
和/或，
(3)通过测定小鼠各项生物学指标表达量，验证所述湿热证慢性复发性溃疡性结肠炎小鼠模型是否构建成功；
和/或，
(4)通过比较不同药物治疗对模型的影响评分，验证所述湿热证慢性复发性溃疡性结肠炎小鼠模型是否构建成功，若中医经典的清热利湿方剂对模型的各项指标皆有显著治疗效果，而温中驱寒方剂没有，则表明模型正向验证成功，反之则没有；所述药物包括通过黄芩汤和理中汤。
更优选地，所述的DAI评分细则中，爪、尾的色泽部分的量化采用计算机软件图像分析实现，具体操作为：将小鼠放置在垫板上，人为固定抓住小鼠，让爪、尾被充分暴露，调整相机参数，保证每次拍照所有参数一致，然后拍照；使用软件对图片进行统一光源校准，而后对目标位置进行红色值提取，对结果使用进行统计分析。
更优选地，所述的软件为Mycolor软件。
更优选地，所述的生物学指标包括IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、血清总胆固醇TC、血清甘油三脂TG、水通道蛋白AQP1、水通道蛋白AQP3中的任意一种或多种。
一种通过上述方法制备得到的湿热证慢性复发性溃疡性结肠炎小鼠模型的用途，将该模型用于筛选或鉴定能够预防、缓解或者治疗湿热证溃疡性结肠炎的清热利湿类型中医药。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)采用长期接触低剂量DSS造成结肠粘膜损伤，并发持续性炎症，从而复制出慢性溃疡性结肠炎。
(2)根据中医理论复制湿热证小鼠模型，具有湿热症候群，如便溏、小便黄、爪尾偏红、舌苔腻、毛发不顺等表现。
(3)与现有技术相比，本发明方法构建的动物模型与溃疡性结肠炎中医临床症状和体征相似，并经重复建模经验，其重复性和稳定性好，适用于中医清热利湿法治疗溃疡性结肠炎的中药筛选，可为开展相关的新药研发提供实验依据。
(4)与现有技术相比，本发明方法构建的中医证候模型采取了与现代技术相结合的方式，相较于传统中医辨证的“望闻问切”，通过软件数据分析，使得“爪尾红”等中医症状体征量化，减少人为误差。
附图说明
图1为湿热证慢性复发性溃疡性结肠炎小鼠模型(DCM)的诱导过程示意图。
图2为实施例详情造模方法示意图。
图3为造模期间及结束后BALB/C小鼠基础情况及湿热评分、DAI评分示意图；其中A为不同天数小鼠的体重变化，分析小鼠的体重下降率；B为小鼠不同因素造模阶段平均饮水量，分析小鼠摄取的DSS量是否一致，减少实验误差；C为小鼠不同因素造模阶段平均摄食量，观察分析小鼠的高脂饲料进食情况；D为小鼠每次循环结束后的湿热评分，E为小鼠摄取DSS的3个阶段的DAI评分；
图4为小鼠造模结束后外观变化情况研究结果图；其中，A为各组别小鼠的尾巴代表图片展示；B为各组别小鼠前爪代表图片展示；C为各组别小鼠后爪代表图片展示；D为各组别小鼠肛门代表图片展示；E-G为使用软件对前爪、后爪、尾巴图片处理后的红色占比数值统计结果，分析小鼠表观是否有湿热证候差异表现；
图5为造模后小鼠结肠组织的变化情况及不同药物治疗对结肠长度影响研究结果图；其中A为各组别小鼠结肠代表图；B为各组别小鼠结肠长度统计结果；C为各组别小鼠宏观病理评分；
图6为显微镜下观察的结肠和舌头病理切片图；A为各组别小鼠造模后结肠黏膜苏木红伊染色后结肠粘膜病变代表图；B为各组别小鼠结肠H&E黏膜病理组织学评分结果；C为显微镜不同倍数下，各组别小鼠造模后舌组织苏木红伊染色后代表图；
图7为小鼠结肠组织炎症因子水平结果图；其中，A为ELASA测定结肠组织的IFN-γ水平；B-G为qRT-PCR技术测定的不同炎症因子mRNA水平；
图8为小鼠血清血脂变化图；其中A为试剂盒测定小鼠血清的总胆固醇(T-CHO)水平；B为试剂盒测定小鼠血清的甘油三脂(TG)水平；
图9为小鼠结肠组织水通道蛋白的表达测定结果图；其中A为AQP1各模型组的蛋白表达量；B为AQP3各模型组的蛋白表达量；C为AQP1模型组和药物治疗组的蛋白表达量；D为AQP3模型组和药物治疗组的蛋白表达量。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细的描述，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
实验药品及试剂：黄芩汤(黄芩9g、白芍9g、甘草9g、大枣49g)和理中汤(人参9g、白术9g、干姜9g、炙甘草9g)中药饮片均购自广州中医药大学第一附属医院；相关的PCR基因引物序列，均委托安徽通用生物股份有限公司进行设计并合成；
其他试剂如下表1所示：
表1.试剂及来源
实验材料：所用实验动物均购买自广东省医学实验动物中心，高脂喂养采用HF45高脂饲料(广东省医学实验动物中心采购)；复发操作阶段给予无菌自来水配置的1.5％DSS溶液或3％DSS溶液(DSS由美国MP Biomedicals公司提供)，而后放入智能人工气候箱(由杭州川一实验仪器有限公司提供，型号为PRX-150A)满8小时，白酒灌胃采用29°九江双蒸酒(广东九江双蒸酒旗舰店采购)，0.3ml/只，隔日进行；
其他实验仪器如下表2所示：
表2.实验仪器及来源
| 仪器 | 产商 | 产品型号 |
| 化学发光成像系统 | 上海天能科技 | 4200SF |
| 梯度PCR仪 | Thermo Fisher Scientific | 5020 |
| 实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | CFX96 |
| 洁净工作台 | 苏州安泰空气技术 | BCM-1000A |
| 垂直电泳仪 | Bio-Rad | 1658001 |
| 台式高冻冷速离心机 | 湖南湘立 | H1850R |
| 全波长酶标分析仪 | Thermo Fisher Scientific | Multiskan Go 1510 |
| 移液枪 | Thermo Fisher Scientific | 4701150N |
| 脱色摇床 | 北京六一生物科技 | WD-9405E |
实施例1：构建模型
1、实验动物及分组
48只SPF级BALB/C雄性小鼠，7～8周龄，体重18～22g，饲养于SPF级动物房内，适应性喂养一周，后将小鼠随机分为6组(n＝8)，分别为阴性对照组(Control组)、DSS对照组(CM组)、湿热对照组(DM)、湿热UC组(DCM组)、黄芩汤高剂量治疗组(HQD组)和理中汤高剂量治疗组(LZD组)，具体操作步骤如下：
DSS(葡聚糖硫酸钠)和高脂饲料、白酒并人工气候箱联合诱导的湿热证慢性复发性UC模型：
(a)DCM组：
①高脂饲料处理：小鼠从第0天起自由摄食高脂饲料，持续11天。
②DSS处理：灭菌自来水将DSS配制成1.5％浓度的饮用液，装入饮水瓶中代替饮用水，小鼠从第6天起自由饮用1.5％DSS溶液，持续6天。
③人工气候箱处理：小鼠从6天起每日放入温度33℃±2，相对湿度93％±2，光照一级的人工气候箱中满8小时，该操作持续6天。
④白酒处理：小鼠从第6天开始给予白酒灌胃，0.3ml/只，1次/天，隔日进行，该操作共进行3次。
以①-④为一个循环，以此反复三个循环造模，每次循环以恢复期作为过渡，恢复期期间模型组暂停所有造模操作，普通水普通饲料自由饮用，恢复期持续6日；
在第3次循环时，DSS溶液改为3％浓度，高脂饮食天数改为10天，②③的处理天数改为5天，该造模共持续44天。
(b)CM组：前5天正常饲养，第6天开始给予DSS溶液，方法同步骤(a)②)，无人工气候箱、高脂饲料和白酒处理(给予同等量的生理盐水及灌胃操作)，同步循环。
(c)DM组：高脂处理同(a)①，人工气候箱处理同(a)③，白酒处理同(a)④，无DSS处理，同步循环。
(d)黄芩汤组：1～3循环处理同DCM组，但造模到第3次循环时，除造模操作外，还经口灌服黄芩汤药物溶液(9.1g/kg)，每天1次，连续10天。
(e)理中汤组：1～3循环处理同DCM组，但造模到第3次循环时，除造模操作外，还经口灌服理中汤药物溶液(9.36g/kg)每天1次，连续10天。
(f)阴性对照组(Control组)：正常饲养，无各种处理。
具体操作示意图可见附图2。
分别按照上述操作建模，建模完成后牺牲小鼠取样进行后续实验。
对比例1：构建模型
30只SPF级BALB/C雄性小鼠，7～8周龄，体重18～22g，饲养于SPF级动物房内，适应性喂养一周，后将小鼠随机分为3组(n＝10)，分别为阴性对照组(Control组)、DSS对照组(CM组)、湿热UC组(DCM组)，操作步骤如下：
DCM组：(1)HF45高脂饲料自由摄食，每日放入温度33℃±2，相对湿度93％±2，光照一级的人工气候箱中满8小时，隔日灌胃白酒0.3ml/只，连续42天；(2)第1天至第7天给予1.5％DSS溶液，第8天至第21天改为无菌水自由饮用；该操作重复两个循环。
CM组：全程采用普通饲料喂养，第1天至第7天给予1.5％DSS溶液，第8天至第21天改为无菌水自由饮用；该操作重复两个循环。
Control组：正常饲养无处理。
结果：DCM组第10天开始有小鼠死亡，至造模结束仅剩存4只小鼠，该模型方案死亡率过高，不适合造模。
对比例2：构建模型
25只SPF级BALB/C雄性小鼠，7～8周龄，体重18～22g，饲养于SPF级动物房内，适应性喂养一周，后将小鼠随机分为5组(n＝5)，分别为阴性对照组(Control组)、DSS急性对照组(AM组)、湿热急性UC组(DAM组)，湿热UC组(DCM组)，操作步骤如下：
DCM组：(1)第1天至第5天给予1.5％DSS溶液，HF45高脂饲料自由摄食，每日放入温度33℃±2，相对湿度93％±2，光照一级的人工气候箱中满8小时，隔日灌胃白酒0.3ml/只；(2)第6天至第15天暂停所有造模操作；(1)-(2)为一个循环，重复两个循环，造模共持续35天。
AM组：全程采用普通饲料喂养，实验最后7天将无菌水自由饮用改为3％DSS溶液。
DAM1组：(1)HF45高脂饲料自由摄食，每日放入温度33℃±2，相对湿度93％±2，光照一级的人工气候箱中满8小时，灌胃白酒0.3ml/只，连续42天；(2)实验最后7天将无菌水自由饮用改为3％DSS溶液。
DAM2组：(1)HF45高脂饲料自由摄食，每日放入温度33℃±2，相对湿度93％±2，光照一级的人工气候箱中满8小时，灌胃白酒0.3ml/只，连续42天；(2)实验最后7天将无菌水自由饮用改为1.5％DSS溶液。
Control组：正常饲养无处理。
结果与讨论：(1)与之前的实验相比，DCM组增设恢复期，未出现小鼠死亡现象；
(2)与已有的湿热急性UC(DAM组)对比，DCM组小鼠结肠长度虽有变化，但结肠充血、水肿、粘连均不明显；DAM1组结肠长度短于AM组、DCM组和DAM2组，结肠充血、水肿、粘连与结肠长度变化相对应；推测由于DSS造模的弊端性(DSS诱导的炎症发病及严重程度与DSS浓度及用药周期有关)，10天的恢复期过长，影响小鼠UC造模的成功；
(3)AM组与DAM组相比较，DAM组的腹泻和便血程度更为严重，其中DAM1出现腹泻便血早于DAM2组；推测长期的湿热因素干扰，对于UC的发展变化有影响，且前期一定时间的湿热因素叠加，使得后续UC造模效果更明显。
效果实施例1：湿热证的评价鉴定方法
1、湿热评分
基于中医辨证“望闻问切”方法，通过记录小鼠各项体征包含表征(记录形体变化、爪尾色泽变化情况)，嗜睡懒动腹痛(观察精神状况、蜷缩竖毛、活动量等状态)，口渴(记录饮水量)，纳呆(记录摄食量)，腹泻(记录肛周洁净、大便情况)，尿液(记录小便情况)，舌苔厚腻(舌组织HE)对小鼠湿热模型进行评价，并对小鼠进行湿热评分记录，具体评分量表如表3所示。
表3.湿热评分细则
湿热评分＝精神状况+活动度+形体+被毛+肛门+爪尾+大便+小便。
2、爪尾色素提取
为了更准确的量化小鼠的湿热评分，表3的量表中爪、尾的评分采用计算机软件图像分析来确定，具体步骤为：
(1)拍照
每次循环结束后一天，对小鼠进行湿热评分并记录爪尾变化。1)组装小鼠拍照装置：将支架固定于绿色底板上方，使得每次检测小鼠保持在同一位置上。2)增加光源，使得被拍摄部位充分暴露于光源下，并且尽量做到底部无光照阴影。3)拍照者手持数码照相机或者手机原相机模式，使得视野达到最清晰状态，进行白平衡。白平衡后将曝光锁定在同一水平，以保证每只小鼠曝光指数一致。4)拍照者站在拍摄装置的中间位置，引导小鼠爪尾暴露者站在拍摄者的旁侧，同时将色卡放置于视野所见区域。5)当数码相机显示屏或者手机屏幕上见小鼠爪尾清晰图像和色卡完整图像时，预对焦后按下快门，即可拍摄到小鼠爪尾的照片，随后依次拍摄其余小鼠爪尾图像。
(2)图像分析
本发明采用课题组自行编写的软件Mycolor对小鼠爪尾的湿热评分进行量化分析，该软件获取链接为https://gitee.com/sunzejia/system，该软件是基于python3.8+opencv4.5来进行开发的。首先，软件使用色卡软件来标准化光源；其次，软件将选取的图片读入并显示为一个GUI界面，根据鼠标响应事件来对图片中需要的部分进行操作，这部分是使用opencv的鼠标事件来实现的，鼠标左键每一次点击会选取一个点，鼠标右键每一次点击会取消最近一次选取的点，鼠标右键双击会取消所有选取的点，在使用鼠标滚轮点击后会根据所有鼠标左键点击选取的点来绘制多边形，绘制完毕后将会把多边形以外的区域删除得到新的图片，图片中就是我们需要的部分，比如老鼠爪子，老鼠尾巴；这里是使用列表来存放选取的点在图像中的坐标，从而绘制多边形得到掩膜，使用opencv中的bitwise_and方法将掩膜与原图像结合得到我们需要的部分；得到的新图片中除了我们需要的部分如老鼠尾巴，爪子外，还会存在图片的背景；因此，需要通过设定hsv阈值范围来去除图片的背景，由于图片大多背景为绿色与青色，所以设定hsv阈值为绿色与青色的范围，然后将颜色阈值以外的一致去除，得到只剩下部位的去除背景后的图像；最后，将对图片的每个像素点进行遍历，使用r/(r^2+g^2+b^2)^0.5归一化公式来得到归一化后的红色像素比例，其中r表示为红色像素值，g表示为绿色像素值，b表示为蓝色像素值；得到每一像素点的红色比例后将所有像素点的红色比例取平均即得到最终的老鼠部位红色比例。
将取得红色比例与正常组老鼠做对比，以正常组平均值为基数，将数值进行归一化处理，通过比较红色数值的增长率对应到湿热评分表中进行相对应的评分，评分标准如下表4所示：
表4.评分标准
| 爪、尾 | 增长率 | 评分 |
| 大小适中，红润饱满，有光泽 | ±1％ | 0 |
| 偏红/无光泽 | 1％-5％/<-1％ | 1 |
| 红，肿胀 | 5％-9％ | 2 |
| 绛，污秽 | >9％ | 3 |
效果实施例2：舌头组织病理切片染色观察
取0.5*0.5cm大小的新鲜的舌头组织块放入4％多聚甲醛中固定24h以上，常规脱水(梯度酒精:70％、85％、95％、无水乙醇)→透明(二甲苯)→浸蜡后，用石蜡包埋切片→石蜡切片脱蜡至水(二甲苯脱蜡，梯度酒精水化)→苏木素染色(苏木素染色3-5min,分化液分化,返蓝液返蓝)→伊红染色(梯度酒精脱水5min，伊红染色5min)→脱水封片(梯度酒精脱水，中性树胶封片)→显微镜观察。
效果实施例3：溃疡性结肠炎的评价
(1)DAI评分：给予DSS造模期间，每日称取小鼠体重，观察其变化情况观察小鼠肛周情况，查看是否干净，观察有无血液，观察粪便性状，并依照表5中DAI评分表所示进行评分记录。
表5.DAI评分细则
DAI评分结果＝(体重下降分数+大便性状分数+血便性状分数)/3
(2)结肠形态结构分析
结肠长度：造模结束后，禁食不禁水，12h后眼眶静脉从取血，颈椎脱臼处死，剖取结肠，并测量记录长度。
(3)结肠黏膜损伤指数：剖取结肠，观察结肠有无水肿、充血和粘连等病理特征，并在冰上除去盲肠段，纵向剖开结肠，观察并统计结肠的溃疡点，根据表6的结肠组织宏观病理评分标准对结肠病理变化进行宏观病理评分。
表6.结肠组织宏观病理评分细则
(4)病理切片染色观察：取距离肛门端0.5cm长度的新鲜的结肠组织放入4％多聚甲醛中固定24h以上，常规脱水(梯度酒精：70％、85％、95％、无水乙醇)→透明(二甲苯)→浸蜡后，用石蜡包埋切片→石蜡切片脱蜡至水(二甲苯脱蜡，梯度酒精水化)→苏木素染色(苏木素染色3-5min，分化液分化，返蓝液返蓝)→伊红染色(梯度酒精脱水5min，伊红染色5min)→脱水封片(梯度酒精脱水，中性树胶封片)→显微镜观察。根据表7对结肠组织炎症状态进行量化评价，作为组织学评分。
表7.结肠组织病理评分
效果实施例4：
(1)IFN-γ的测定
ELISA法测定结肠组织中IFN-γ的含量：结肠组织精密称重并装入预冷的2ml EP管中，按照组织的质量加入相应体积的预冷PBS缓冲液(m:v＝1:9)，放入已经设定好的高通量组织研磨机进行匀浆。取出匀浆好的EP样品管，放入冷冻离心机，在4℃的条件下以2000～3000rpm/m下冷冻离心20min后提取上清液，分别按照ELISA试剂盒说明测定组织中IFN-γ含量。
(2)TNF-α、IL-1β和IL-6的测定
利用RT-qPCR法检测结肠组织中的相关mRNA表达：将浸于Trizol的结肠组织小块用氯仿和异丙醇提取出总RNA，在微量分光光度计中测定所提RNA的纯度和含量，按cDNA逆转录试剂盒说明操作，将RNA逆转录为cDNA。然后按iTaqTM Universal
GreenSupermix试剂盒的操作，在微孔板上加入试剂、引物、cDNA，放置于实时定量PCR仪器中检测以上各指标的mRNA的表达。所述基因上下游引物如下：
IL-6-R：AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG
IL-6-F：CTGCAAGAGACTTCCATCCAG
IL-1β-R：TGGATGCTCTCATCAGGACAG
IL-1β-F：GAAATGCCACCTTTTGACAGTG
TNF-α-R：CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG
TNF-α-F：CAGGCGGTGCCTATGTCTC
GAPDH-R：TCTGGGATGGAAACTGGAA
GAPDH-F：AAGGAGTAAGAGCCCCTGGA
根据上述CT值计算各检测样本炎症因子基因的相对表达量和相对表达倍数。所述实时荧光定量PCR扩增体系如下：
样本RNA，5μl；
One Step SYBR Qpcr Master Mix，10μl；
Forward引物液(10μmol)：Reverse引物液(10μmol)：DEPC水＝1：1：3，取混合液5μl；
所述扩增体系反应体积为20μl。
所述实时荧光PCR的扩增程序如下：
预变性，95℃反应30s，1个循环；
PCR反应，95℃反应10s，60℃反应30s，40个循环；
溶解曲线，95℃反应15s，65℃反应5s，95℃∞，1个循环。
扩增结束后，以GAPDH作为内参，循环次数Ct值作为定量参考分析mRNA的相对表达量。计算公式为：mRNA Target扩增倍数＝2-ΔΔCt。
(3)血清T-CHO和TG的测定
将采集的血液于室温放置2h，后4℃下3000rpm离心10min，取上清液，分别按照试剂盒说明书测定血清中TG和TC含量，剩余上清液于-80℃冰箱保存。
(4)水通道蛋白AQP1和AQP3的测定
称取100mg结肠组织，加入1mL裂解液，于冰上用匀浆机研磨充分，使其充分裂解，然后于4℃、12000g离心3min，收集上清备用，随后采用BCA法测定组织蛋白质含量。调至统一蛋白浓度，取蛋白样品800μL，与5×上样缓冲液4:1体积混合，100℃加热5min使蛋白变性。将处理后的蛋白样品慢慢加入加样孔中，并在其中一个泳道加5μL预染蛋白分子量Marker。80V恒压电泳，当蛋白样品电泳至浓缩胶与分离胶交界处时，改为120V恒压电泳。待溴酚蓝线泳至距胶边缘处时，停止电泳。参照分子量Marker，切下分离胶所需部分，浸入转膜液备用。取下PVDF膜，将PVDF膜浸于5％脱脂奶粉中，室温封闭1h。将PVDF膜浸于TBST中，洗膜3次，每次10min。取出PVDF膜，浸入用一抗稀释液稀释的一抗，4℃孵育过夜。将PVDF膜浸于TBST中，洗膜3次，每次10min。加入各抗体对应的二抗，室温孵育1h。将PVDF膜浸于TBST中，洗膜3次，每次10min。化学发光，显影，定影。条带分析，使用Image J软件分析目的条带灰度值，比较各组蛋白表达差异。
效果实施例5：统计学方法
实验数据采用Graphpad Prism v8.4软件进行制图，采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。当实验数据满足正态分布时，采用单因素方差(One-Way ANOVA)分析，此时若方差齐，则采用LSD法进行组间多重比较；若方差不齐，则采用Dunnet’s T3检验进行组间多重比较。数据用均数±标准差
表示，P<0.05表示差异具有统计学意义。当实验数据不满足正态分布时，采用非参数检验的Kruskal-Wallis H检验进行组间多重比较，并在校正后进行分析。数据采用M(P25-P75)表示，P<0.05存在统计学差异。
效果实施例6：结果分析
(1)建模期间小鼠基本状况差异
结果见图3，与Control组相比，叠加湿热因素造模的组别小鼠摄食量、饮水量皆明显减少；高脂喂养期间，模型组小鼠体重与Control组相比，大幅度上升，而至后期CM组、DCM组小鼠体重下降明显，尤其DCM组下降趋势更大，而服用不同药物治疗后，与DCM组相比，可见HQD组体重下降趋势有控制，而LZD组比DCM组下降更为严重。
结果见图4中的D，DCM组、LZD组小鼠身形瘦弱，腹泻便血严重，肛周聚有较多血凝块，耳色色白，呼吸幅度增大；单纯DSS造模组小鼠精神状况尚可，毛发偶尔几只脏乱无光泽，造模后期体重整体呈下降趋势，开始有腹泻便血情况；单纯湿热组小鼠精神活动有萎靡趋势，毛发无光泽，有些许疏松粗糙，无便血情况，但便质明显变软；正常组无上述症状，与DCM组相比，HQD组有较大改善，理中汤组无明显改善。
(2)建模后小鼠表观的差异
结果见图4中的A、B、C、E、F、G，正常组小鼠爪尾适中，红润饱满有光泽，肛门洁净，大便饱满呈麦粒状；DCM组和DM组小鼠爪偏红，尾部颜色变淡；DM组小鼠大便肛门洁净大便偏软，CM组小鼠肛门污浊，便溏；DCM组小鼠肛门污秽，周遭有血凝块；黄芩汤组可改善DCM组上述大体改变，而理中汤组则无明显改善。
(3)建模期间小鼠湿热情况
结果见图3中的D，造模期间DM组和DCM组湿热评分显著增加，其中DCM组增加趋势更加明显，中药治疗后可以看到黄芩汤组湿热评分显著降低，而理中汤组无明显改善。正常组和CM组无上述症状及改变。
(4)舌组织切片染色观察
结果见图6中的C，Control组小鼠舌黏膜组织结构清晰，丝状乳头密度适中、排列整齐，角质层、固有层厚度适中；与Control组小鼠相比，DCM组、DM组有过明显的角质化突起，CM组和DCM组乳头排列不齐、松散；黄芩汤和理中汤干预后可以看到，黄芩汤组乳头角质化减少趋向于正常组，而理中汤组变化趋向于DM组。
(5)建模期间小鼠DAI评分
结果见图3中的E，与正常组相比，造模期间DCM组DAI评分随着每次造模次数增加而评分逐渐显著增高(P<0.01)，CM组虽有波动，但直至后期才与正常组有较明显差异性，服用药物治疗后，可以见到黄芩汤可降低评分(P<0.01)，理中汤差异不大。
(6)建模后小鼠结肠的变化
结肠长度：结果见图5中的A和B，可以看到，CM组、DM组和DCM组小鼠结肠长度明显缩短，皆与正常组有差异性，其中DCM组差异性尤为显著(P<0.01)。药物治疗后可以看到黄芩汤药效显著，结肠长度与DCM组相比，明显回升(P<0.01)，而理中汤效果弱；
结肠黏膜损伤指数：结果见图5中的C，可以看到造模结束后，与正常组小鼠相比，各组别小鼠皆有不同程度的水肿、充血、粘连和溃疡情况，其中DCM组最为显著(P<0.01)。而给予高剂量黄芩汤治疗后，结肠的宏观病理评分显著下降(P<0.01)，理中汤没有统计学差异；
病理切片染色观察：结果见图6中的A，Control组小鼠结肠组织结构完整，肠绒毛和腺体排列整齐，可见少量淋巴细胞，黏膜下层未见有炎性浸润现象；CM、DM及DCM组小鼠结肠结构皆出现损伤，其中DCM组肠绒毛脱落，肠隐窝模糊甚至消失，黏膜下层和肌层出现明显水肿等特征，黏膜及黏膜下层出现大量炎性细胞浸润，肌层肥大增厚，伴有穿壁性炎症；与DCM组相比较下，DM组虽有出现大量炎细胞，但肠绒毛较完整，肠腺体清晰可见且排列整齐；而CM组炎症损伤程度弱于DCM组强于DM组；给予DCM小鼠黄芩汤和理中汤后，与DCM组相比，黄芩汤组小鼠结肠绒毛较完整，肠腺体清晰可见且排列整齐，肠隐窝的分支明显，肌层及黏膜下层没有明显水肿现象，HS评分明显低于DCM组(P<0.05)，而理中汤仍有大量炎性细胞浸润，大部分隐窝仍为模糊不可见；以上结果表明，黄芩汤对UC小鼠的结肠组织损伤有明显的修复作用，而理中汤效果不显著；
(7)建模后小鼠炎症因子水平差异
结果见图7，与正常组相比，各组别小鼠炎症因子皆为上升趋势，出现高水平的炎症情况(P<0.01)，给予DCM小鼠黄芩汤和理中汤后，理中汤组IFN-γ水平更为上升(P<0.01)、IL-6水平无统计学差异，而黄芩汤组则显著降低，趋向于正常水平(P<0.05)；虽然理中汤组可降低DCM小鼠TNF-α、IL-1β水平，但黄芩汤效果更为显著且趋近正常水平(P<0.01)；
(8)建模后小鼠血脂水平差异
结果见图8，与正常组相比，DM组TC、TG水平皆明显升高(P<0.05)，DCM组水平差异更为显著(P<0.01)；给予药物干扰后，黄芩汤显著纠正血脂异常(P<0.01)，而理中汤虽可纠正TG异常，但对TC效果微弱。
(9)建模后小鼠水通道蛋白表达量差异
结果见图9，与正常组相比，各模型组小鼠水通道蛋白皆为下降趋势，其中DCM组水平差异最为显著(P<0.01)；给予黄芩汤药物干扰的组别，AQP表达量相较于DCM组有明显的回升趋势(P<0.05)，而给予理中汤干扰的组别无明显差异性。
结论：上述实验结果表明，以BALB/C雄性小鼠为实验动物，采用本发明所建立的湿热证慢性复发性溃疡性结肠炎小鼠模型是成功的，具体表现在DAI评分的增加、结肠表观变化包含长度缩短、水肿粘连充血溃疡点的发生、结肠肠绒毛脱落隐窝消失、结肠黏膜及上皮大量炎性细胞浸润，结肠组织各项炎症细胞因子的上升。本实施例还通过湿热评分的增加、软件分析爪尾颜色变化、舌乳头的变化、血脂改变、AQP蛋白表达量以及采用清热利湿的黄芩汤和温中大热的理中汤进行治疗药效对比，正反验证了湿热证模型的存在，增加了中医证候模型评判的客观性和严谨性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种湿热证慢性复发性溃疡性结肠炎小鼠模型的建立方法，其特征在于：包括如下步骤：
①高脂饲料处理：小鼠从第0天起，自由摄食高脂饲料，持续11天；
②DSS处理：小鼠从第6天起，将普通水改为DSS溶液自由饮用，该操作持续6±1天；
③人工气候箱处理：小鼠从6天起，每日放入温度33±2℃，相对湿度93±2％，光照1～2级的人工气候箱中8±1小时，该操作持续6±1天；
④白酒处理：小鼠从第6天起，隔日给予白酒灌胃，共进行3～4次；
以①-④为一个循环，以此反复三个循环造模，每次循环以恢复期作为过渡，恢复期期间模型组暂停所有造模操作，普通水普通饲料自由饮用，恢复期持续6±1天。
2.根据权利要求1所述的湿热证慢性复发性溃疡性结肠炎小鼠模型的建立方法，其特征在于：
②中所述的DSS溶液的浓度为1.5％～3％；
③中所述的白酒灌胃的用量为0.3mL/只，1次/天。
3.根据权利要求2所述的湿热证慢性复发性溃疡性结肠炎小鼠模型的建立方法，其特征在于：
在第1次和第2次循环中，②中所述的DSS溶液的浓度为1.5％，在第3次循环中，②中所述的DSS溶液的浓度为3％。
4.根据权利要求1所述的湿热证慢性复发性溃疡性结肠炎小鼠模型的建立方法，其特征在于：
在第1次和第2次循环中，②、③中所述的操作持续6天，在第3次循环中，②、③中所述的操作持续5天。
5.根据权利要求1所述的湿热证慢性复发性溃疡性结肠炎小鼠模型的建立方法，其特征在于：
①中所述高脂饲料为HF45；
③中所述的白酒为29°九江双蒸酒；
所述的方法中采用的小鼠是7～8周龄，体重18～22g的SPF级BALB/C雄性小鼠。
6.根据权利要求1-5任一项所述的湿热证慢性复发性溃疡性结肠炎小鼠模型的建立方法，其特征在于：
所述的建立方法还包括如下步骤：
(1)通过观察小鼠各项体征变化，验证所述湿热证慢性复发性溃疡性结肠炎小鼠模型否构建成功；
和/或，
(2)通过DAI评分细则、湿热评分细则、结肠组织宏观病理评分细则和结肠组织病理评分细则，分别计算小鼠DAI评分、湿热评分、结肠组织宏观病理评分和结肠组织病理评分，验证所述湿热证慢性复发性溃疡性结肠炎小鼠模型否构建成功；
和/或，
(3)通过测定小鼠各项生物学指标表达量，验证所述湿热证慢性复发性溃疡性结肠炎小鼠模型否构建成功；
和/或，
(4)通过比较不同药物治疗对模型的影响评分，验证所述湿热证慢性复发性溃疡性结肠炎小鼠模型否构建成功，若中医经典的清热利湿方剂对模型的各项指标皆有显著治疗效果，而温中驱寒方剂没有，则表明模型正向验证成功，反之则没有；所述药物包括通过黄芩汤和理中汤。
7.根据权利要求6所述的湿热证慢性复发性溃疡性结肠炎小鼠模型的建立方法，其特征在于：
所述的DAI评分细则中，爪、尾的色泽部分的量化采用计算机软件图像分析实现，具体操作为：将小鼠放置在垫板上，人为固定住小鼠，让爪、尾被充分暴露，调整相机参数，保证每次拍照所有参数一致，然后拍照；使用软件对图片进行统一光源校准，而后对目标位置进行红色值提取，对结果使用进行统计分析。
8.根据权利要求7所述的湿热证慢性复发性溃疡性结肠炎小鼠模型的建立方法，其特征在于：
所述的软件为mycolor软件。
9.根据权利要求6所述的湿热证慢性复发性溃疡性结肠炎小鼠模型的建立方法，其特征在于：
所述的生物学指标包括IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、血清总胆固醇TC、血清甘油三脂TG、水水通道蛋白AQP1、水通道蛋白AQP3中的任意一种或多种。
10.一种通过权利要求1-9任一项中所述的方法制备得到的湿热证慢性复发性溃疡性结肠炎小鼠模型的用途，其特征在于：
将该模型用于筛选或鉴定能够预防、缓解和/或治疗湿热证溃疡性结肠炎的清热利湿类药物。
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