CN107137388A - 一种制备肠道粘膜损伤动物模型的方法及其用途 - Google Patents
一种制备肠道粘膜损伤动物模型的方法及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及医疗评价、检测技术领域，具体涉及一种制备肠道粘膜损伤动物模型的方法及其用途。本发明采用水溶性好，灌胃操作方便简单的药物L-MSO，方便稳定地诱导出小鼠肠道粘膜损伤，并引起相应组织病理学改变和炎性因子变化，本发明的制备方法从代谢损伤方向明显区别现有技术的诱导免疫损伤的造模方向制得肠道粘膜损伤动物模型，尤其，采用低浓度L-MSO制备一般损伤模型，其中，实验小鼠肠道粘膜轻-中度的损伤；采用高浓度L-MSO制备严重损伤模型，其中，实验小鼠肠道粘膜重度损伤；制得的肠道粘膜损伤模型对炎症性肠病的研究和实践具有重大价值。
Description
技术领域
本发明涉及医疗评价、检测技术领域，具体涉及一种制备肠道粘膜损伤动物模型的方法及其用途。
背景技术
资料显示，炎症性肠病(Inflammatory Bowel Diseases，IBD)是一种病因不明的慢性肠道疾病，包括溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis，UC)和克罗恩病(Crohn’s Diseases，CD)两种。研究显示，IBD好发于青壮年，往往是发作一缓解一复发的模式，严重影响病人的生活质量；其中UC主要发生在直肠和结肠，而CD的病变多见于末端回肠和邻近结肠。所述炎症性肠病的主要表现为腹泻、腹痛、体重下降及腹部包块等，其中UC常伴有脓血便，同时也是结肠癌的高危因素；而CD常有瘘管形成和肠梗阻。IBD在西方国家相当常见，患病率达100-200/10万，在我国基于多家医院病例统计推测，UC与CD的患病率分别为11.6/10万和1.4/10万，而近几年患病率呈逐年增加之势，由于疾病迁延不愈，给患者带来沉重的经济和心理负担，目前UC已成为严重危害国人健康的常见病、多发病。
炎症性肠病的发病机制不明，目前认为IBD是由环境、遗传、感染、代谢及免疫等多因素相互作用所致，氧化损伤可能是主要机制之一，在病理生理上IBD体现为粘膜损伤与粘膜修复的失代偿。目前用于研究IBD的常用动物模型主要分为两类：化学物质诱导模型如DSS、TNBS、乙酸和OXZ等；基因工程型动物模型如基因敲除或转基因动物模型。实践显示，前者诱导方式相对简便，但是造模的成功率与药物的实验浓度、培养环境以及实验动物的种属差异有关；后者造模成本较高，造模时间较长。然而目前化学诱导剂中主要是诱导炎症产生，但尚没有从代谢角度或粘膜干细胞损伤修复角度探讨肠道粘膜损伤的产生和肠道炎症发生的理想模型。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种制备肠道粘膜损伤动物模型的方法，通过建立合适的动物模型模仿炎症性肠病，用于研究炎症性肠病的病理发生和发展进程，帮助理解与炎症性肠病有关的病因学因素，建立临床上的诊断指标，为炎症性肠病的治疗提供实验依据，本发明将对治疗炎症性肠病药物的筛选具有重大意义。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种制备肠道粘膜损伤动物模型的方法以及制得用于研究炎症性肠病的动物模型，尤其从代谢损伤角度提供一种新型的L-MSO诱导的肠道粘膜损伤动物模型。本发明建立的新的简便稳定的代谢型肠道粘膜损伤的诱导动物模型对炎症性肠病的研究和实践具有重大价值。
本发明的进一步的目的是提供制得的动物模型在用于L-MSO在诱导小鼠肠道粘膜损伤中的应用，通过建立合适的动物模型模仿炎症性肠病。
本发明基于：谷氨酰胺(glutamine，Gln)是一种具有多种生物学作用的条件必需氨基酸，主要应用于改善机体的各种应激反应，维持机体免疫细胞正常功能；Gln已在临床实践中用于肠炎治疗，但其治疗机制尚不明确，目前认为Gln可减轻创伤、感染等多种应激反应对肠黏膜屏障功能的损伤，以及动物及临床实验研究显示肠内、肠外营养中适当地补充外源性Gln能加快肠黏膜上皮细胞的更新，增强肠黏膜细胞间的紧密连接，防止炎症所致的肠道通透性增加，进而起到恢复肠黏膜形态和功能完整性的作用，表明Gln通过维持结肠粘膜形态及屏障功能的完整、提高机体的抗氧化能力、缓解炎症反应对溃疡性结肠炎所致的结肠损伤起到修复作用，从而使溃疡性结肠炎造成的结肠粘膜损伤得到缓解等的研究基础；通过采用L-蛋氨酸砜亚胺(L-Methionine sulfoximine，L-MSO)诱导小鼠肠道粘膜损伤，建立合适的动物模型模仿炎症性肠病。
具体的，本发明提供了一种制备肠道粘膜损伤动物模型的方法，采用药物L-蛋氨酸砜亚胺L-MSO从代谢损伤角度诱导制备肠道粘膜损伤动物模型，其包括步骤：
1)使用SPF级C56BL/6的6-8周龄小鼠为实验动物，设L-MSO高浓度组和L-MSO低浓度组；
2)L-MSO高浓度组诱导肠道严重的持续性损伤，工作浓度为100mg/kg，每隔一天灌胃给药，给药持续一周；
3)L-MSO低浓度组诱导肠道轻中度的损伤，工作浓度为25mg/kg，每隔一天灌胃给药，给药持续一周；
4)实验期间，每天观察小鼠的应激、活动减少的大体情况，并按所规定的指标观察，同时进行疾病活动度(DAI)评分；
表1 DAI评分标准
5)动物肠道评价及组织样本收集；
6)HE染色和组织病理学评分；
7)EILISA
检测小鼠结肠组织匀浆中的炎性因子表达水平，并使用总蛋白BCA蛋白定量作为调平依据；
8)内源性谷氨酰胺和谷氨酰胺合成酶检测
检测小鼠结肠粘膜提取物中的谷氨酰胺及谷氨酰胺合成酶的表达水平；
9)MPO检测
邻联二茴香胺氧化法测定MPO活性。
本发明中，动物肠道评价及组织样本的收集包括：
常规处理小鼠后，迅速在预冷环境解剖采样；小鼠固定，用棉签沾碘伏或生理盐水润湿腹部毛发，防止黏附肠道组织；工字切口，暴露腹腔脏器，拍摄脏器大体图。使用润湿的棉签和镊、剪分离肠道组织，截取一部分回肠到肛门口的肠道组织(回肠部预留6厘米以上)。从回盲部分离回肠，取盲肠及以下组织，回肠置遇冷环境备用。摊直肠道样本，置于白纸上，用记号笔标记样本号。放置直尺，作为标准。以三个一组(如ctrl组3只，L-MSO组3只，对比放置)的方式，拍摄肠道长度直观图，并记录长度。
在组织样本采集前，需事先标记好相应的1.5mlEP管(4％多聚甲醛固定)或冻存管(液氮组织冻存用于之后的ELISA和谷氨酰胺检测)并预冷。取结肠组织6cm，纵行剪开肠道，用生理盐水、棉签等清除里面的粪便，将肠道组织摊于润湿的白色滤纸上，并用棉签小心将肠粘膜摊平。再盖上一层润湿的白色滤纸，形成三明治结构。剪取1cm，用事先编号的固定夹夹好，投入4％的多聚甲醛，4度过夜。余下组织去滤纸，装入冻存管，冻存于液氮；
本发明中，HE染色和组织病理学评分包括：
将4％多聚甲醛固定4度固定24h的结肠样本送上海威奥生物科技有限公司进行后续的包埋、固定和HE染色；对肠道组织病理进行评分；
表2组织学损伤评分标准
本发明中，EILISA使用达科为的Mouse ELISA试剂盒检测小鼠结肠组织匀浆中的炎性因子表达水平，并使用总蛋白BCA蛋白定量作为调平依据；
本发明中，使用谷氨酰胺测定试剂盒检测小鼠结肠粘膜提取物中的谷氨酰胺及谷氨酰胺合成酶的表达水平；
本发明中，使用髓过氧化物酶(MPO)测定试剂盒以邻联二茴香胺氧化法测定MPO活性。
本发明中，实验结果采用三次独立实验的平均值和标准差表示，用t检验比较差异。P＜0.05认为有统计学差异。所有统计采用SPSS20.0软件。
本发明中，采用低浓度L-MSO制备一般损伤模型，其中，实验小鼠肠道粘膜轻-中度的损伤；
本发明中，采用高浓度L-MSO制备严重损伤模型，其中，实验小鼠肠道粘膜重度损伤。
本发明提供了从代谢损伤角度提供了一种新型的L-MSO诱导的肠道粘膜损伤动物模型的制备方法以及制得用于研究炎症性肠病的动物模型，尤其通过使用水溶性好，灌胃操作方便简单得药物L-MSO，可以方便稳定地诱导出小鼠肠道粘膜损伤，并引起相应组织病理学改变和炎性因子变化，本发明的制备方法从代谢损伤方向明显区别现有技术的诱导免疫损伤的造模方向制得肠道粘膜损伤动物模型，其对炎症性肠病的研究和实践具有重大价值。
附图说明
图1显示了实验动物体重下降结果。
图2显示了药物对实验动物结肠长度缩短的影响。
图3，图4显示了组织病理学评分发现肠道粘膜损伤(HE染色)。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
(一)试剂
L-蛋氨酸砜亚胺(L-Methionine sulfoximine，L-MSO)购自Sigma-Aldrich公司(货号：M5379)，使用ddH2O溶解，L-MSO在使用前需要新鲜配置。ELISA试剂盒购自深圳市达科为生物技术有限公司，所使用的ELISA试剂盒和货号分别如下：Mouse IL-6(DKW12-2060)、Mouse IL-10(DKW12-2100)、Mouse-17A(DKW12-2170)Mouse IL-1β(DKW12-2012)和Mouse IL-12/IL-23p40(DKW12-2123)。谷氨酰胺测定试剂盒(A073)、谷氨酰胺合成酶(GS)测定试剂盒(A047)和髓过氧化物酶(MPO)测定试剂盒(A044)购于南京建成生物科技研究所。
(二)动物实验
SPF级C57BL/6小鼠，6-8周龄(体重20-25g左右)，雄性，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2012-0002。小鼠饲养和动物实验在复旦大学实验动物科学部进行，饲养环境应为IVC级动物培养室，温度在20～26℃，相对湿度40～70％。噪音60分贝以下，氨浓度14/(mg/m3)以下.通风换气大于等于15次/小时。光照循环条件是是12小时明/12小时暗；其实验动物使用许可证号：SYXK(沪)2014-0029；
动物入驻动物房后，先打耳钉编号和称首次体重，并记录数据，待实验动物适应动物房环境一周后，随机分为三组：高浓度L-MSO组：剂量100mg/kg，每隔一天灌胃给药，给药持续一周，更优的，给药持续2周：该高浓度L-MSO造成小鼠肠道粘膜重度损伤；低浓度L-MSO组，剂量25mg/kg，每隔一天灌胃给药，给药持续一周；更优的，给药持续2周；该低浓度L-MSO造成小鼠肠道粘膜轻-中度的损伤；对照组：给予同等体积的ddH2O，每隔一天灌胃，持续一周；
实验期间，每天观察小鼠的大体情况(有无应激、活动减少以及体重、粪便等)，并按照以下指标对小鼠进行观察，若小鼠体重下降10％，继续以隔1天灌胃造模；若小鼠体重下降11-25％，给药改为隔2天灌胃；若小鼠体重下降26-50％，给药改为隔4天灌胃；若小鼠体重下降>50％，停止给药；并拍摄小鼠肛门口情况和新鲜粪便照片留底，同时进行疾病活动度(DAI)评分，具体评分方法见下表。
DAI评分标准
(三)动物肠道评价及组织样本的收集
常规处理小鼠后，应迅速在预冷环境解剖采样；小鼠固定，用棉签沾碘伏或生理盐水润湿腹部毛发，防止黏附肠道组织。工字切口，暴露腹腔脏器，拍摄脏器大体图。使用润湿的棉签和镊、剪分离肠道组织，截取一部分回肠到肛门口的肠道组织(回肠部预留6厘米以上)。从回盲部分离回肠，取盲肠及以下组织，回肠置遇冷环境备用。摊直肠道样本，置于白纸上，用记号笔标记样本号。放置直尺，作为标准。以三个一组(如ctrl组3只，L-MSO组3只，对比放置)的方式，拍摄肠道长度直观图，并记录长度；
在组织样本采集前，需事先标记好相应的1.5mlEP管(4％多聚甲醛固定)或冻存管(液氮组织冻存用于之后的ELISA和谷氨酰胺检测)并预冷；取结肠组织6cm，纵行剪开肠道，用生理盐水、棉签等清除里面的粪便，将肠道组织摊于润湿的白色滤纸上，并用棉签小心将肠粘膜摊平。再盖上一层润湿的白色滤纸，形成三明治结构。剪取1cm，用事先编号的固定夹夹好，投入4％的多聚甲醛，4度过夜。余下组织去滤纸，装入冻存管，冻存于液氮；
(四)HE染色和组织病理学评分
将4％多聚甲醛固定4度固定24h的结肠样本送上海威奥生物科技有限公司进行后续的包埋、固定和HE染色；邀请资深病理学专家对肠道组织病理进行评分。
组织学损伤评分标准
(五)EILISA
使用达科为的Mouse ELISA试剂盒检测小鼠结肠组织匀浆中的炎性因子表达水平，并使用总蛋白BCA蛋白定量作为调平依据；
(六)内源性谷氨酰胺和谷氨酰胺合成酶检测
使用谷氨酰胺测定试剂盒检测小鼠结肠粘膜提取物中的谷氨酰胺及谷氨酰胺合成酶的表达水平；
(七)MPO检测
使用髓过氧化物酶(MPO)测定试剂盒以邻联二茴香胺氧化法测定MPO活性；
(八)统计分析
实验结果采用三次独立实验的平均值和标准差表示，用t检验比较差异。P＜0.05认为有统计学差异。所有统计采用SPSS20.0软件。
实验结果显示，本发明采用水溶性好，灌胃操作方便简单的药物L-MSO，可以方便稳定地诱导出小鼠肠道粘膜损伤，并引起相应组织病理学改变和炎性因子变化，本发明的制备方法从代谢损伤方向明显区别现有技术的诱导免疫损伤的造模方向制得肠道粘膜损伤动物模型，尤其，采用低浓度L-MSO制备一般损伤模型，其中，实验小鼠肠道粘膜轻-中度的损伤；采用高浓度L-MSO制备严重损伤模型，其中，实验小鼠肠道粘膜重度损伤；制得的肠道粘膜损伤模型对炎症性肠病的研究和实践具有重大价值。
Claims (8)
1.一种制备肠道粘膜损伤动物模型的方法，其特征在于，采用药物L-蛋氨酸砜亚胺L-MSO从代谢损伤角度诱导制备肠道粘膜损伤动物模型，其包括步骤：
1)使用SPF级C56BL/6的6-8周龄小鼠为实验动物，设L-MSO高浓度组和L-MSO低浓度组；
2)L-MSO高浓度组诱导肠道严重的持续性损伤，工作浓度为100mg/kg，每隔一天灌胃给药，给药持续一周；
3)L-MSO低浓度组诱导肠道轻中度的损伤，工作浓度为25mg/kg，每隔一天灌胃给药，给药持续一周；
4)实验期间，每天观察小鼠的应激、活动减少的大体情况，并按所规定的指标观察，同时进行疾病活动度(DAI)评分；
5)动物肠道评价及组织样本收集；
6)HE染色和组织病理学评分；
7)EILISA
检测小鼠结肠组织匀浆中的炎性因子表达水平，并使用总蛋白BCA蛋白定量作为调平依据；
8)内源性谷氨酰胺和谷氨酰胺合成酶检测
检测小鼠结肠粘膜提取物中的谷氨酰胺及谷氨酰胺合成酶的表达水平；
9)MPO检测
邻联二茴香胺氧化法测定MPO活性。
2.按权利要求1所述的制备肠道粘膜损伤动物模型的方法，其特征在于，所述的L-MSO高浓度组其工作浓度为100mg/kg，每隔一天灌胃给药，给药持续一周。
3.按权利要求1所述的制备肠道粘膜损伤动物模型的方法，其特征在于，所述的L-MSO低浓度组其工作浓度为25mg/kg，每隔一天灌胃给药，给药持续一周。
4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，制备的肠道粘膜损伤动物模型为一般损伤模型，和，严重损伤模型。
5.按权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的制备的一般损伤模型，其中，实验小鼠肠道粘膜轻-中度的损伤。
6.按权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的制备的严重损伤模型，其中，实验小鼠肠道粘膜重度损伤。
7.权利要求1的方法制备的肠道粘膜损伤动物模型在用于研究炎症性肠病中的用途。
8.权利要求1的方法制备的肠道粘膜损伤动物模型在用于制备治疗炎症性肠病干预方案中的用途。
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| CN (1) | CN107137388A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108112538A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-06-05 | 武汉轻工大学 | 一种诱导猪肠道自噬模型的构建方法 |
| CN108410874A (zh) * | 2018-03-14 | 2018-08-17 | 孙勇 | 严重烧伤后肠道组织标志物lncRNA H19及其应用 |
| CN110664493A (zh) * | 2019-09-23 | 2020-01-10 | 复旦大学附属华山医院 | 一种获取评估消化道损伤模型腹胀指数的方法 |
| CN112970670A (zh) * | 2021-02-06 | 2021-06-18 | 澎立生物医药技术（上海）有限公司 | 一种肠粘膜炎动物模型的构建方法 |
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2016
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| POTSIC B等: "Glutamine supplementation and deprivation: Effect on artificially reared rat small intestinal morphology", 《PEDIATRIC RESEARCH》 * |
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| CN112970670A (zh) * | 2021-02-06 | 2021-06-18 | 澎立生物医药技术（上海）有限公司 | 一种肠粘膜炎动物模型的构建方法 |
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