CN106546754A - 伊木萨克片作用于异常黏液质证与阳痿病证模型靶点蛋白及其筛选方法 - Google Patents

伊木萨克片作用于异常黏液质证与阳痿病证模型靶点蛋白及其筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了伊木萨克片作用于异常黏液质证(证候)大鼠后的血清及作用于异常黏液质型阳痿病证大鼠后的血清和阴茎平滑肌组织药物靶点蛋白及其筛选方法，具体包括以下步骤1)正常对照组、证侯组、证候药物组、病证组与病证药物组；2)采集全血，分离血清与阴茎平滑肌组织；3)提取蛋白质；4)标记后纯化；5)质谱检测后得到指纹图谱，筛选后进行蛋白质组学分析，获得上述各组血清和阴茎平滑肌组织蛋白质；6)统计、比较、筛选得到伊木萨克片药物作用靶点蛋白质体系。本发明明确了维医异常黏液质型阳痿的对证维药伊木萨克片的作用靶点，为进一步揭示伊木萨克片作用机制，以及为基于维药伊木萨克片的新药开发及二次开发奠定基础。

Description

伊木萨克片作用于异常黏液质证与阳痿病证模型靶点蛋白及 其筛选方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及伊木萨克片作用于异常黏液质证与阳痿病证模型靶点蛋白及其筛选方法。
背景技术
维吾尔医(维医)学是祖国传统医学中重要组成部分，维医学体液论认为，人体由胆液质、血液质、黏液质和黑胆质4种体液质组成，上述4种体液质的动态平衡是机体健康的生理基础，而某一种体液质的量或/和质的变化，引起体液质平衡失调，产生一种异常体液质证(证候)，与多种疾病的发生存在因果关系。体液病理学(体液论)是维医理论根基，其认为4种体液中，黏液质体液属性湿寒，常易因生活、饮食与环境因素、工作压力、缺乏运动等原因导致体内体液平衡遭到破坏，黏液质体液发生改变，产生异常黏液质，致代谢水平降低，产物蓄积体内，进而导致病理性改变，引发相关疾病。临床研究证实，异常黏液质证(Abnormal Phlegm)在阳痿(阴茎勃起功能障碍)、早泄、少弱精症、卵巢早衰、不孕不育等生殖疾病、肥胖症、高脂血症等代谢性疾病和心血管疾病发生过程中，处于主导地位，可能也是肿瘤、糖尿病、高血压等复杂性疾病发生早期的主要证型。阴茎勃起功能障碍(erectiledysfunction，ED)，又称阳痿，是指男子阴茎不能勃起及不能维持勃起而完成满意的性生活，属于维医优势病种。
伊木萨克片作为针对异常黏液质型阳痿、早泄的国药准字号经典维药(批号Z65020144)，以显著的临床疗效著称，其具有800年的历史，且早已纳入维吾尔医学院校教材中，公认性与科学性强。其以维医辨证论治体系为指导，广泛用于维医临床，目前也已用于疆内外各大医院男科临床，但因其现代医学作用机制尚不清楚，作用靶点更是未见报道，导致其在现代医学(西医)医院使用中缺乏理论与使用指导，不能更好的服务于全国各族患者。
异常黏液质型阳痿病证并非是单一生殖器官即阴茎组织的的疾病，而是全身性疾病，因此需要我们用整体观念，从全身的视野思考、研究与防治。伊木萨克片作为与异常黏液质型阳痿病证对应的复方维药，在辩证的基础上使用，并通过发挥补肾壮阳，填精固真之功效实现治疗效果。
维医辨证分型的起点和核心是维医“体液论”，其出发点是人体内在体液动态变化的外在表现，而维医药学所推崇的辨证施治也是依据个体的整体水平上发生的体液表型差异，这与系统生物学整体研究思路不谋而合。故，本研究，本研究在建立异常黏液质证候与病证结合动物模型，并进行维药伊木萨克片治疗性干预基础上，开展了血清和阴茎平滑肌组织的蛋白质组学研究，建立了维药伊木萨克片治疗异常黏液质证与异常黏液质型阳痿病证大鼠相关血清药物靶点蛋白体系，为从维医和现代医学结合角度进一步揭示伊木萨克片作用机制，以及为基于维药伊木萨克片的新药开发及二次开发奠定基础，对于维医诊疗的标准化和现代化具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供伊木萨克片作用于异常黏液质阳痿病证大鼠后血清和阴茎平滑肌组织药物靶点蛋白及其筛选方法，通过采用iTRAQ技术获得的血清和阴茎平滑肌组织的所有差异蛋白，然后通过本专利丰富的维吾尔医学知识制定了候选差异蛋白的筛选方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了伊木萨克片药物靶点蛋白的筛选方法，包括以下步骤：
1)提供正常对照组(N组)、异常黏液质证候组(ZM组)，异常黏液质证候药物组(ZY组)、异常黏液质型病证组(BM组)和异常黏液质型病证药物组(BY组)，大鼠，对BY组和ZY组大鼠用伊木萨克片喂食2周，N组、ZM组和BM组大鼠喂食水；
2)采集所述步骤1)得到的五组大鼠的全血，分离后得到血清；
取所述步骤1)得到五组大鼠的阴茎平滑肌组织；
3)从所述步骤2)得到的血清和阴茎平滑肌组织中提取蛋白质，检测，得到已知浓度的蛋白质；
4)将所述步骤3)中得到的蛋白质用iTRAQ标记试剂盒标记后纯化，得到纯化后肽段；
5)将所述步骤4)得到的纯化后的肽段经质谱检测后得到指纹图谱，将所述指纹图谱在PD软件中筛选，将所述筛选后的谱图用Mascot搜索，根据得到的搜索结果和筛选后的谱图进行定量分析，将得到的分析数据在大鼠数据库中检索，获得大鼠血清差异蛋白质和阴茎平滑肌组织差异蛋白质；
6)将所述步骤5)中得到的血清差异蛋白质和阴茎平滑肌组织差异蛋白质进行伊木萨克片药物靶点蛋白的筛选。
优选的，所述伊木萨克片的药物活性成分的质量浓度为250mg/kg，
优选的，所述喂食伊木萨克片的频率为每日1～2次。
优选的，所述步骤1)中正常对照组大鼠在常规环境中饲养，喂食的环境温度为18～22℃，所述喂食环境的相对湿度为40～60％，造模组的喂食的环境温度为8～12℃，所述喂食环境的相对湿度70～80％；所述步骤1)中正常对照组为普通饲料，造模组喂食饲料为湿寒性饲料。
优选的，所述分离得到血清的方法具体是：将新鲜大鼠全血立即置4℃环境，30～40min后以3000～3500rpm的速度离心5～10min，将得到的上清液在4℃条件下，以3000～3500rpm的速度再次离心，得到血清；
所述得到阴茎平滑肌组织的方法具体是：从根部取阴茎平滑肌组织，洗去血渍，并除去残余皮肤、筋膜，取上段阴茎平滑肌组织，放置于冻存管中放置于-80℃超低温冰箱备用。
优选的，所述步骤3)中检测包括蛋白质的完整性和蛋白质的含量的测定。
优选的，所述伊木萨克片药物靶点蛋白包括异常黏液质证候组大鼠血清药物靶点蛋白。
优选的，所述伊木萨克片药物靶点蛋白包括异常黏液质病证组大鼠血清及阴茎平滑肌组织药物靶点蛋白。
优选的，所述异常黏液质证候组大鼠血清药物靶点蛋白的差异蛋白的筛选具体是：
将所述步骤6)中得到的BM组与N组蛋白质相比较，得到BM/N的差异蛋白质；将ZM组与N组的蛋白质相比较，得到ZM/N的差异蛋白质；将所述ZY组与ZM组的蛋白质相比较，得到ZY/ZM的差异蛋白，统计BM/N、ZM/N和ZY/ZM差异蛋白的同蛋白的种类和数量，得到伊木萨克片作用于异常黏液质证候组大鼠后的血清药物靶点蛋白。
优选的，所述异常黏液质病证组大鼠血清及阴茎平滑肌组织药物靶点蛋白的差异蛋白的筛选具体是：
将所述步骤6)中得到的BM组与ZM组蛋白质相比较，得到BM/ZM的差异蛋白质；将BM组与N组的蛋白质相比较，得到BM/N的差异蛋白质；将所述BY组与BM组的蛋白质相比较，得到BY/BM的差异蛋白，统计BM/ZM、BM/N和BY/BM差异蛋白的同蛋白的种类和数量，得到伊木萨克片作用于异常黏液质阳痿病证组大鼠后的血清和阴茎平滑肌组织药物靶点蛋白。
本发明提供了伊木萨克片药物作用于异常黏液质证候动物模型的血清的靶点蛋白，包括下列蛋白质种类：血管紧张素原、T-激肽原1、α-1-酸性糖蛋白、甲状腺素运载蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3L、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3K、α-2-巨球蛋白、羧酸酯酶1C、血清铁传递蛋白、α-1-3抑制剂、α-1-抗蛋白酶、血红素结合蛋白、血清淀粉样物质P、β-2-糖蛋白1、肌红蛋白-1、血小板白细胞c激酶底物、被控多泡体蛋白5、α-1-巨球蛋白、胎球蛋白-B、GRAM结构域的蛋白1A、N-乙酰神经氨酸-9-磷酸酶。
本发明提供了伊木萨克片药物作用于异常黏液质型病证动物模型的血清的靶点蛋白，包括下列蛋白质种类：T-激肽原1、α-1-酸性糖蛋白、T-激肽原2、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3N、血红素结合蛋白、N-乙酰神经氨酸-9-磷酸酶和血管生成素-1。
本发明提供了伊木萨克片药物作用于异常黏液质型病证动物模型的阴茎平滑肌组织的靶点蛋白，包括下列蛋白质种类：原肌球蛋白α-1链、乙醇脱氢酶类4mu/σ链、血红素、小清蛋白α、腺苷酸激酶同工酶1、乌头酸水合酶，线粒体、碳酸酐酶3、肽基脯氨酰顺反异构酶、醛缩酶A、苹果酸脱氢酶，线粒体、磷酸激酶1、磷酸丙糖异构酶、肌红蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、电压依赖性阴离子选择性通道蛋白1、补体成分C9、β烯醇化酶、α-1-酸性糖蛋白、T-激肽原-2、T-激肽原-1、G蛋白偶联受体4、60S核糖体蛋白L27、血小板反应蛋白4、血清白蛋白、髓鞘蛋白P0、双链蛋白聚糖、人软骨粘附素、肌球蛋白-11和谷胱甘肽S-转移酶α-3。
本发明提供了伊木萨克片药物靶点蛋白的筛选方法，得到上述药物作用于后的靶点蛋白，寻找伊木萨克片作用于异常黏液质引起的阳痿病证作用靶点蛋白，并为进一步研究伊木萨克片作用于异常黏液质阳痿病证大鼠的靶点蛋白的分子机制奠定基础，进而针对所述生物标记物进行药物治疗研究提供理论依据。
进一步的，得到维药伊木萨克片作用于异常黏液质阳痿病证大鼠中血清和阴茎平滑肌组织中差异蛋白后引起的蛋白上调或者下调表达，表明这些差异蛋白影响了大鼠的勃起功能，病证组上调表达蛋白在药物作用于组中下调表达，病证组中下调表达蛋白在药物作用组中上调表达，最终确定伊木萨克片的药物作用靶点蛋白，针对所述生物标记物进行药物基础研究。
附图说明
图1为异常黏液质证候及阳痿病证大鼠模型的复制流程图；
图2为异常黏液质证候及阳痿病证大鼠模型血清和组织的蛋白质组学流程图；
图3为实施例1中SDS-PAGE法检测大鼠血清中蛋白质凝胶电泳图；
图4为实施例1中SDS-PAGE法检测大鼠阴茎平滑肌组织中蛋白质凝胶电泳图；
图5为实施例2中各组大鼠血清中血管紧张素原含量；
图6为实施例2中各组大鼠血清中α-1-酸性糖蛋白含量；
图7为实施例2中各组大鼠血清中甲状腺素运载蛋白含量；
图8为实施例2中各组大鼠血清中血红素结合蛋白含量；
图9为实施例2中各组大鼠血清中β2-糖蛋白1含量；
图10为实施例2中各组大鼠血清中α-1-酸性糖蛋白含量；
图11为实施例2中各组大鼠血清中血红素结合蛋白含量；
图12为实施例2中各组大鼠血清中血管生成素-1含量。
具体实施方式
本发明提供了伊木萨克片作用于异常黏液质阳痿病证大鼠血清和组织后药物靶点蛋白及其筛选方法，包括以下步骤：
1)提供正常对照组(N组)、异常黏液质证候组(ZM组)，异常黏液质证候药物组(ZY组)、异常黏液质型病证组(BM组)和异常黏液质型病证药物组(BY组)大鼠，对BY组和ZY组大鼠用伊木萨克片喂食2周，BM组、ZM组和N组大鼠喂食水；
2)将步骤1)得到的五组大鼠采血，分离后得到血清，同时取五组大鼠阴茎平滑肌组织，得到大鼠阴茎平滑肌组织；
3)从步骤2)得到的血清和阴茎平滑肌组织中提取蛋白质，检测，得到已知浓度的蛋白质；
4)将上述步骤3)中得到的蛋白质用iTRAQ标记试剂盒标记，得到标记的蛋白质，经纯化，得到纯化后肽段；
5)将步骤4)得到的纯化后的肽段经质谱检测后得到指纹图谱，将所述指纹图谱在PD软件中筛选，得到的筛选后的谱图用mascot搜索，得到搜索结果，根据所述搜索结果和筛选后的谱图定量分析，得到的分析数据在大鼠数据库中检索，获得伊木萨克片作用于异常黏液质证候大鼠血清以及伊木萨克片作用于异常黏液质型阳痿病证大鼠血清和阴茎平滑肌组织差异蛋白质；
6)将步骤5)中得到的血清和阴茎平滑肌组织差异蛋白质通过本专利发明人丰富的维吾尔医学专业理论知识，制定了筛选方法，最终获得伊木萨克片药物靶点蛋白。
本发明提供了伊木萨克片作用于异常黏液质阳痿病证大鼠血清和阴茎平滑肌组织后药物靶点蛋白及其筛选方法，得到伊木萨克片作用于异常黏液质大鼠后血清和阴茎平滑肌组织中的靶点蛋白，为进一步研究伊木萨克片药物靶点蛋白的作用机制，黏液质寻找异常黏液质引起的阳痿病证的生物标记物奠定基础，进而针对所述生物标记物进行药物基础研究。
获取N组、ZM组、ZY组、BM组和BY组大鼠，制备各组外周血与阴茎平滑肌组织样品，从外周血与阴茎平滑肌组织样品中得到血清蛋白质和组织蛋白质，对得到的蛋白质进行提取、分离和纯化，得到的蛋白质进行ITRAQ标记，标记后的蛋白质采用联合LC-MS-MS分析，获取PMF数据，将得到的数据在数据库检索得到差异蛋白，针对差异蛋白建立维医异常黏液质型阳痿病证特异性血清和组织蛋白标记物体系，从而明确伊木萨克片作用于异常黏液质型阳痿病证大鼠血清和阴茎平滑肌组织后的药物作用靶点蛋白。
本发明首先选取N组、ZM组、ZY组、BM组和BY组大鼠。
本发明对所述N组、ZM组、ZY组、BM组和BY组大鼠的获取方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的建立异常黏液质型动物模型的技术方案即可；在本发明中，优选具体包括以下步骤：
选择性成熟期雌鼠，去势手术后常规条件下饲养，将所述雌鼠在发情期与雄鼠进行交配实验和APO实验测试，得到有正常性功能的雄鼠。本发明对所述交配实验和APO实验的时间顺序没有特殊限制。所述交配实验和APO实验的对象为所述N组、ZM组、ZY组、BM组和BY组大鼠。
本发明中，所述性成熟期雌鼠的数量优选为25只。本发明中，所述性成熟期雌鼠的体重优选为180g。本发明对所述性成熟期雌鼠的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的性成熟期雌鼠即可。本发明实施例中所述性成熟期雌鼠的来源为由新疆医科大学实验动物中心提供。
本发明中，所述雄鼠优选为具有正常性能力的性成熟期SD雄性大鼠。所述的雄鼠的数量优选为50只。所述雄鼠的体重优选为200g。本发明对所述雄鼠的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的雄鼠即可。本发明实施例中所述雄鼠的来源为由新疆医科大学实验动物中心提供。
本发明对所述去势手术没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的去势手术即可。
在本发明中，所述正常对照组大鼠在常规环境中饲养，喂食的环境温度为18～22℃，所述喂食环境的相对湿度为40～60％，造模组的喂食的环境温度为8～12℃，所述喂食环境的相对湿度70～80％；所述步骤1)中正常对照组为普通饲料，造模组喂食饲料为湿寒性饲料。
在本发明中，所述饲养的时间优选为22～25周。
在本发明中，所述交配的具体步骤优选为将已进行发情期的雄鼠和雌鼠分别置于不同的观察箱中适应环境，10～15min后按雌雄比例1:2放入同一个观察箱中，观测1800s内雄性大鼠的爬背、插入和射精潜伏期以及爬背、插入和次数，若1800s内雄性大鼠未进行爬背，则该大鼠爬背潜伏期记为1800s，爬背次数记为0；插入与射精行为同理。
本发明根据所述交配的结果将具有正常交配能力的雄鼠纳入正常对照组和造模组，对无正常交配能力雄鼠进行淘汰。
在本发明中，所述APO实验具体步骤优选为将实验大鼠置于观察箱中10～15min适应环境，保持安静，调暗灯光，在大鼠颈项皮肤注射90μg/kg阿扑吗啡APO，注射后立刻观察，计时器计时，观测并记录1800s内大鼠的勃起潜伏期和勃起次数；所述勃起的标准为勃起时大鼠呈蹲踞位，阴茎体末端伸出，低头舔舐阴茎头；所述勃起潜伏期为注射后至第一次勃起的时间；所述勃起次数为注射后1800s内大鼠出现阴茎勃起的次数；若1800s内未见勃起，则该大鼠勃起次数记为0，勃起潜伏期记为1800s。
本发明实施例中根据所述APO测试的结果将具有正常阴茎勃起功能的雄鼠纳入正常对照组和造模组，对无正常阴茎勃起功能雄鼠进行淘汰。
在本发明中，所述90μg/kg阿扑吗啡溶液优选包括90μg阿朴吗啡、0.5mg/kg维生素C、体积浓度为5mL/kg生理盐水。
在本发明实施例中，所述正常对照组在常规环境中饲养，喂食的环境温度为18～22℃，所述喂食环境的相对湿度为40～60％；造模组的喂食的环境温度为8～12℃，所述喂食环境的相对湿度70～80％；正常对照组为普通饲料，造模组喂食饲料为湿寒性饲料。
在本发明实施例中，所述生物学表征观测是指定性和定量观测和记录。定性指标观测：所述定性指标观测为皮肤毛发在日光下观察，情绪反应以一笼内各大鼠相互反应为主观察30分钟，行为状态以此期间内的活动为主、安静环境下观察30分钟，兴奋程度以夹尾实验时的反应为主，舌象舌苔在日光下观察、记录并拍照，饮食水状态以各组同一时间喂饲观察饮食水状态，小便以各组大鼠当日正排尿时颜色为主，大便状态以当日正排大便时大便形态为主；定量指标为避免生理节奏的影响，每天固定于20:00-22:00收集各项资料，其中体重：每天按规定时间称重并记录，以每笼总体重除以该笼大鼠只数，得出平均体重，并按下述公式得出模型组各笼体重比值并记录，体重比值＝模型组平均体重-模型组初始体重/正常组平均体重-正常组初始体重；饮食量：每天20:00添加饲料300g，次日20:00称食物余量，根据下述公式得出100g体重相对应的饮食量并记录；饮水量：每天20:00给水500ml，次日20:00量剩余水量，计算得出100g体重相对应的饮水量并记录；尿量：造模第一天记录好给的干垫料重量，第二天按规定时间称含有尿液及大便的湿垫料的重量并记录，然后在恒温鼓风干燥箱100℃下2小时烘干后再次称重，计算各组尿量；大便量：计算100g体重相对应的大便量并记录。
得到有正常性功能(正常交配能力和阴茎勃起功能)的雄鼠后，本发明将得到的有正常性能的雄鼠分为正常对照组和造模组，所述正常对照组在常规环境下饲养，所述造模组以湿寒性饲料喂养，在湿寒环境中饲养，观察并记录正常组和造模组的生物学表征观。包括定性指标和定量指标。定性指标观测所有组大鼠的皮肤毛发、情绪反应、兴奋程度、睡眠状态、饮水状态、尿量性质、大便状态和舌象舌苔。定量指标为记录所有组大鼠的体重、饮食量、饮水量、尿量和大便量。在造模过程中发现大鼠皮肤毛发稍暗淡，无光泽；倦怠，蜷卧少动；对刺激敏感，喜扎堆，倦怠嗜睡；无争水现象；尿量清，色淡，量多；大便时软时溏；舌苔暗，舌苔白腻。且随着造模时间的延长，造模组体重增长缓慢，饮食量增加，饮水量减少，大小便量显著增多，上述生物学表征符合维医临床证侯特点，从而获得了异常黏液质证侯大鼠模型，且该模型具有良好的科学性、可靠性和稳定性。通过APO和交配实验从证候模型组中筛选出异常黏液质型阳痿病证结合模型(阴茎勃起功能障碍和无交配能力)，从而获得异常黏液质病证动物模型，余为异常黏液质证候动物模型，异常黏液质病证动物模型均衡性的又分为BM组和BY组，异常黏液质证候动物模型均衡性的又分为ZM组和ZY组。本发明对所述证候成模率达100％，病证模型成模率达到50％以上，病证模型的周期优选为22～25周。
在本发明中，所述N组的大鼠数量优选为10只。
在本发明中，所述常规环境下饲养的方法同上步骤中的常规环境饲养方法。本发明中，所述N组的喂养量优选为每日300g的普通饲料。所述普通饲料为包括500ml水和80g垫料。本发明对所述垫料没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的垫料即可。
本发明中，所述的实验组的大鼠的数量优选为40只。
本发明中，所述的湿寒性饲料为菠菜实和芫荽实与常规饲料的混合物。在本发明中，所述湿寒性饲料优选为：每1kg常规饲料中包括100～200g芫荽实和100～200g菠菜实，更优选每1kg常规饲料中包括150g芫荽实和150g菠菜实。本发明对常规饲料没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的用于饲养大鼠的饲料均可。本发明对所述菜实与芫荽实的来源也没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的菜实与芫荽实即可。在本发明实施例中，所述菜实与芫荽实的来源购自于新疆维吾尔自治区维吾尔医院草药房。
本发明中，所述的湿寒性饲料的喂养量优选为每日300g。
本发明中，所述湿寒环境的温度优选为8～12℃，所述湿寒环境的湿度优选为70～80％。本发明对提供所述湿寒环境的设施没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的提供湿寒环境的设施即可。本发明中实例中，提供湿寒环境的设施为人工气候箱。
本发明中，所述湿寒性饲料喂养的时间优选为于北京时间09:00至21:00放入，其它时间放置于对照大鼠相同的饲养环境中饲养。
本发明中，所述APO实验和交配实验的方法和验证结果同上述APO实验和交配实验的方法和验证结果。
本发明中，所述N组、ZM组、ZY组、BM组和BY组大鼠数量优选不少于10只。
得到分组后大鼠模型后，本发明对所述BY组和ZY组大鼠用伊木萨克片喂食2周，BM组、ZM组和N组大鼠喂食水。
本发明中，所述喂食的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的对大鼠给药的方法即可。本发明中对所述处理的方法优选为灌胃或向饲料中添加。
本发明中，所述伊木萨克片中药物活性成分的质量浓度优选为200～300mg/kg，更优选为250mg/kg。
本发明中，所述伊木萨克片的喂食频率优选为1～2次/天。
本发明中，所述正常对照组在常规环境中饲养，喂食的环境温度为18～22℃，所述喂食环境的相对湿度为40～60％；造模组的喂食的环境温度为8～12℃，所述喂食环境的相对湿度70～80％；正常对照组为普通饲料，造模组喂食饲料为湿寒性饲料。
得到所有组的大鼠后，本发明对五组大鼠进行采血，分离血清，同时取阴茎平滑肌组织样本。
本发明对所述采血前优选对大鼠进行麻醉。本发明对所述麻醉的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的麻醉方法即可。本发明实施例中，所述的麻醉方法为腹腔注射。本发明对所述麻醉过程中使用的麻醉剂优选为戊巴比妥钠。所述的戊巴比妥钠的来源购自和田维吾尔药业有限责任公司。
在本发明中，所述采集外周血的具体方法优选为将麻醉后的大鼠快速从腹主动脉取血。
在本发明中，所述分离血清的方法优选为将新鲜大鼠全血立即置4℃环境，30～40min后以3000～3500rpm的速度离心5～10min，将得到的上清液在4℃条件下，以3000～3500rpm的速度再次离心，得到血清。所述的4℃环境优选为4℃冰箱。从根部取阴茎平滑肌组织，洗去血渍，并除去残余皮肤、筋膜，取上段阴茎平滑肌组织，放置于冻存管中放置于-80℃超低温冰箱备用。
得到血清和阴茎平滑肌组织后，本发明分别对血清和阴茎平滑肌组织中提取蛋白质，检测，得到已知浓度的蛋白质。
本发明中，在提取蛋白前优选按照组别分别进行混样，得到五组血清样品和五组阴茎平滑肌组织样品。
本发明中，所述五组血清样品和五组阴茎平滑肌组织样品优选送交北京华大蛋白质研发中心有限公司进行后期工作。
本发明对所述提取蛋白质的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的提取蛋白质的方法即可。本发明实施例中，所述提取蛋白质的方法为将同组大鼠血清和组织等重量混合，构建代表同一组大鼠的血清和组织样品分别为1000μL和500μg。利用低丰度蛋白富集试剂盒(多肽配体亲和层析柱)特异性吸附并制备血清和组织低丰度蛋白组，测定总蛋白含量。
本发明中，所述检测优选包括对蛋白质含量的检测和对蛋白质完整性的检测。本发明中，所述对蛋白质含量的检测方法优选为Bradford法，所述对蛋白质完整性的检测方法优选为SDS-PAGE法。
得到已知浓度的蛋白质后，本发明对所述蛋白质用iTRAQ标记试剂盒标记，得到标记的蛋白质，经纯化，得到纯化后肽段。
在本发明中，在所述标记前优选将得到的已知浓度的蛋白质进行消化。本发明对所述消化的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的蛋白质消化方法即可。在本发明所述消化具体每个样品取50ug蛋白体积，用含0.1％SDS的TEAB补齐所有样品体积。加入1ug/ul的Trypsin酶1ul，37度水浴24h，然后补加Trypsin 1ug，37℃12h，冻干消化液，然后使用TEAB(水：TEAB＝1:1)每管30ul复溶肽段。
本发明对所述iTRAQ标记试剂盒的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的iTRAQ标记试剂盒的市售商品即可。
在本发明中，所述纯化优选采用HPLC进行肽段的纯化。所述纯化的仪器采用强阳离子交换色谱的安捷伦常规液相。所述HPLC过程中所需要设定的参数以及条件如下：
A液：25％ACN，10mM KH2PO4，用磷酸调pH值至3.0
B液：25％ACN，2M KCL，10mM KH2PO4，用磷酸调pH值至3.0
得到纯化肽段后，本发明对所述纯化的肽段经质谱检测后得到指纹图谱，将所述指纹图谱在PD软件中筛选，得到的筛选后的谱图用mascot搜索，得到搜索结果，根据所述搜索结果和筛选后的谱图定量分析，得到的分析数据在大鼠数据库中检索，获得大鼠血清蛋白质和大鼠阴茎平滑肌组织蛋白质。
在本发明中，所述质谱检测的仪器采用型号为Thermo fisher Q-Exactive的质谱仪。
在本发明中，所述PD软件的版本为Proteome Discoverer 1.3，购自美国thermo公司。
得到的五组蛋白质后，本发明对所述五组蛋白质进行伊木萨克片药物靶点蛋白的筛选。本发明中，所述伊木萨克片靶点蛋白优选包括异常黏液质证候组大鼠血清药物靶点蛋白以及异常黏液质病证组大鼠血清和阴茎平滑肌组织的药物靶点蛋白。
本发明对所述伊木萨克片作用于异常黏液质证候组大鼠后的血清药物靶点蛋白的候选蛋白的筛选方法具体是：
BM组与N组蛋白质相比较，得到BM/N的差异蛋白质；将ZM组与N组的蛋白质相比较，得到ZM/N的差异蛋白质；将所述ZY组与ZM组的蛋白质相比较，得到ZY/ZM的差异蛋白，统计BM/N、ZM/N和ZY/ZM差异蛋白的同蛋白的种类和数量，得到伊木萨克片作用于异常黏液质证候组大鼠后的血清药物靶点蛋白。
本发明对所述伊木萨克片作用于异常黏液质型阳痿病证组大鼠后的血清和阴茎平滑肌组织药物靶点蛋白的候选蛋白的筛选方法具体是：
BM组与ZM组蛋白质相比较，得到BM/ZM的差异蛋白质；将BM组与N组的蛋白质相比较，得到BM/N的差异蛋白质；将所述BY组与BM组的蛋白质相比较，得到BY/BM的差异蛋白，统计BM/ZM、BM/N和BY/BM差异蛋白的同蛋白的种类和数量，得到伊木萨克片作用于异常黏液质阳痿病证组大鼠后的血清和阴茎平滑肌组织药物靶点蛋白。
本发明还提供了伊木萨克片药物作用于异常黏液质证候动物模型的血清的靶点蛋白，包括下列蛋白质种类：血管紧张素原、T-激肽原1、α-1-酸性糖蛋白、甲状腺素运载蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3L、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3K、α-2-巨球蛋白、羧酸酯酶1C、血清铁传递蛋白、α-1-3抑制剂、α-1-抗蛋白酶、血红素结合蛋白、血清淀粉样物质P、β-2-糖蛋白1、肌红蛋白-1、血小板白细胞c激酶底物、被控多泡体蛋白5、α-1-巨球蛋白、胎球蛋白-B、GRAM结构域的蛋白1A、N-乙酰神经氨酸-9-磷酸酶。
本发明还提供了伊木萨克片药物作用于异常黏液质型阳痿病证动物模型的血清的靶点蛋白，包括下列蛋白质种类：T-激肽原1、α-1-酸性糖蛋白、T-激肽原2、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3N、血红素结合蛋白、N-乙酰神经氨酸-9-磷酸酶和血管生成素-1。
本发明还提供了伊木萨克片药物作用于异常黏液质型阳痿病证动物模型的组织的靶点蛋白阴茎平滑肌组织，包括下列蛋白质种类：原肌球蛋白α-1链、乙醇脱氢酶类4mu/σ链、血红素、小清蛋白α、腺苷酸激酶同工酶1、乌头酸水合酶，线粒体、碳酸酐酶3、肽基脯氨酰顺反异构酶、醛缩酶A、苹果酸脱氢酶，线粒体、磷酸激酶1、磷酸丙糖异构酶、肌红蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、电压依赖性阴离子选择性通道蛋白1、补体成分C9、β烯醇化酶、α-1-酸性糖蛋白、T-激肽原-2、T-激肽原-1、G蛋白偶联受体4、60S核糖体蛋白L27、血小板反应蛋白4、血清白蛋白、髓鞘蛋白P0、双链蛋白聚糖、人软骨粘附素、肌球蛋白-11和谷胱甘肽S-转移酶α-3。
下面结合实施例对本发明提供的伊木萨克片药物靶点蛋白及其筛选方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、造模与分组
选用性成熟期雌鼠25只，去势手术后正常条件下饲养，交配实验备用。将雄性大鼠经与发情期雌鼠进行交配试验并结合APO勃起实验证实其具有正常性功能(无正常性功能者淘汰)，取50只进入实验，从中再随机抽取10只大鼠设为正常对照组，饲养于常规环境下，温度18～22℃，温度喂养，环境相对湿度40～60％，余40只为造模组，以湿寒性饲料喂养，按维吾尔医学对环境的看法采用人工气候箱进行造模，设置温度：8～12℃，湿度为70～80％，12/12小时昼夜交替饲养，其它时间放置于正常组大鼠相同的饲养环境中饲养。当造模组鼠出现皮肤毛发稍暗淡，无光泽；倦怠，蜷卧少动；对刺激敏感，喜扎堆，倦怠嗜睡；无争水现象；尿量清，色淡，量多；大便时软时溏；舌苔暗，舌苔白腻。且随着造模时间的延长，与对照组相比，造模组体重增长缓慢，饮食量增加，饮水量减少，大小便量显著增多，上述生物学表征符合维医临床证侯特点，从而获得了异常黏液质证侯大鼠模型，且该模型具有良好的科学性、可靠性和稳定性。通过APO和交配实验从证候模型组中筛选出无阴茎勃起功能和交配能力雄性大鼠，获得异常黏液质型阳痿病证动物模型。余为异常黏液质证候动物模型，本发明对所述模率达到50％,以上病证模型的周期优选为22～25周。从造模第一周开始每周记录大鼠的生物学表征，根据生物学表征确定异常黏液质证(证候)模型成模情况，本发明对所述证候模率达到100％的周期优选为8-10周。并在此基础上，每月进行一次APO实验及交配实验，APO实验通过统计勃起的次数和勃起潜伏期，判断阴茎勃起功能，交配实验通过统计爬被潜伏期/次数、插入潜伏期/次数和射精潜伏期/次数这几项指标判断大鼠的交配能力，当出现阴茎勃起功能障碍和交配能力障碍，即阳痿病证成模率达到50％以后，从异常黏液质证(证候)模型组中通过APO实验及交配实验筛选阳痿病证大鼠，并纳入异常黏液质病证组，余为异常黏液质证候组，异常黏液质病证组均衡性的又分为BM组和BY组，异常黏液质证候组均衡性的又分为ZM组和ZY组。
2、外周血采集、组织样品取材与保存：戊巴比妥钠腹腔麻醉后，快速从腹主动脉取血，将新鲜大鼠全血立即置4℃冰箱，30分钟后以3000rpm的速度离心5min，吸取上清液，再置高速低温离心机，在4℃条件下，以3000rpm的速度离心再吸取上清液后，分装置-80℃低温冰箱保存备用。从根部取阴茎平滑肌组织，洗去血渍，并除去残余皮肤、筋膜，取上段阴茎平滑肌组织，放置于冻存管中放置于-80℃超低温冰箱备用。
3、蛋白质组样品的制备
蛋白质提取方法采用TCA-冰丙酮提取。
4、iTRAQ标记及HPLC
(1)iTRAQ标记：取各组大鼠血清，按组别混样后，提取各组蛋白质，通过SDS检测蛋白的完整性及使用Bradford法对蛋白进行定量。
蛋白质经Trypsin消化后用ITRAQ标记试剂盒(Reagent-8PlexMultiplex Kit(Applied Biosystem))进行标记，后经HPLC(安捷伦常规液相)进行肽段的纯化；五组大鼠的血清和阴茎平滑肌组织蛋白质的浓度如表1和表2所示。从附图3和附图4中SDS-PAGE凝胶电泳图片来看，提取的五组蛋白质完整性较好，可以用于下游实验。
表1 Bradford法对大鼠血清蛋白质进行定量结果
样品名称 N BM BY ZM ZY
浓度(μg/μL) 0.26 0.39 0.37 0.42 0.33
表2 Bradford法对大鼠阴茎平滑肌组织蛋白质进行定量结果
样品名称 N BM BY ZM ZY
浓度(μg/μL) 1.75 1.29 1.32 1.46 1.55
经过生物学软件分析后，最后检索大鼠数据库获得最终鉴定到大鼠血清318种蛋白，大鼠阴茎平滑肌组织844种蛋白。
1)血清药物靶点候选差异蛋白的筛选方法
异常黏液质证候组血清药物靶点候选蛋白
经分析共同蛋白有21种，其中病证组上调表达，经药物作用后下调表达蛋白19种；病证组下调表达，经药物作用后上调表达蛋白2种，具体异常黏液质证候组大鼠血清药物靶点候选差异蛋白种类及差异倍数见表3。
表3异常黏液质证候组大鼠血清药物靶点差异蛋白种类及差异倍数
异常黏液质病证组血清药物靶点候选蛋白
经分析共同蛋白有7种，其中病证组上调表达，经药物作用后下调表达蛋白5种；病证组下调表达，经药物作用后上调表达蛋白2种，具体异常黏液质型阳痿病证大鼠血清药物靶点候选差异蛋白种类及差异倍数见表4。
表4异常黏液质型阳痿病证组大鼠血清药物靶点差异蛋白种类及差异倍数
序号 Accession 蛋白名称 差异倍数 所在组
1 P01048 T-激肽原1 1.81 BM/ZM
1 P01048 T-激肽原1 4.615 BM/N
1 P01048 T-激肽原1 0.621 BY/BM
2 P02764 α-1-酸性糖蛋白 2.221 BM/ZM
2 P02764 α-1-酸性糖蛋白 7.086 BM/N
2 P02764 α-1-酸性糖蛋白 0.352 BY/BM
3 P08932 T-激肽原2 1.682 BM/ZM
3 P08932 T-激肽原2 3.099 BM/N
3 P08932 T-激肽原2 0.566 BY/BM
4 P09006 丝氨酸蛋白酶抑制剂A3N 1.344 BM/ZM
4 P09006 丝氨酸蛋白酶抑制剂A3N 1.942 BM/N
4 P09006 丝氨酸蛋白酶抑制剂A3N 0.685 BY/BM
5 P20059 血红素结合蛋白 1.933 BM/ZM
5 P20059 血红素结合蛋白 4.563 BM/N
5 P20059 血红素结合蛋白 0.798 BY/BM
6 Q5M969 N-乙酰神经氨酸-9-磷酸酶 0.787 BM/ZM
6 Q5M969 N-乙酰神经氨酸-9-磷酸酶 0.401 BM/N
6 Q5M969 N-乙酰神经氨酸-9-磷酸酶 2.218 BY/BM
7 O35460 血管生成素-1 0.787 BM/ZM
7 O35460 血管生成素-1 0.713 BM/N
7 O35460 血管生成素-1 1.257 BY/BM
2)阴茎平滑肌组织候选差异蛋白的筛选方法
异常黏液质病证组阴茎平滑肌组织织药物靶点候选蛋白
经分析共同蛋白有29种，其中病证组上调，药物作用后下调的有22种；病证组下调，药物作用后上调的有7种；具体异常黏液质型阳痿病证大鼠阴茎平滑肌组织药物靶点候选差异蛋白种类及差异倍数见表5。
表5异常黏液质型阳痿病证大鼠阴茎平滑肌组织药物靶点候选差异蛋白种类及差异情况
由以上实施例可知，本发明提供了伊木萨克片在异常黏液质证候血清和伊木萨克片在异常黏液质阳痿病证动物模型血清和阴茎平滑肌组织中药物靶点蛋白的筛选方法，得到伊木萨克片作用于异常黏液质证候和阳痿病证大鼠血清和阴茎平滑肌组织中的靶点蛋白，血清中证候组动物模型伊木萨克片药物靶点候选差异蛋白为21种，血清中阳痿病证组动物模型伊木萨克片药物靶点候选差异蛋白为7种，阳痿病证组动物模型阴茎平滑肌组织中伊木萨克片药物靶点候选差异蛋白为29种。本发明为进一步研究伊木萨克片对药物靶点蛋白的作用机制，寻找异常黏液质引起的证候相关疾病以及异常黏液质阳痿病证的生物标记物奠定基础，进而针对所述生物标记物进行药物基础研究。
实施例2
伊木萨克片药物靶点蛋白的ELISA检测
1)伊木萨克片作用于异常黏液质证候大鼠模型血清候选蛋白的ELISA检测
随机选择5种血清候选差异蛋白，对正常对照组、证候组及证候药物组大鼠模型血清进行ELISA检测，以验证本发明血清候选差异蛋白是否可以作为伊木萨克片对异常黏黏液质证候大鼠的药物靶点标志物：
即随机选择检测第1号蛋白P01015(血管紧张素原)；第3号蛋白P02764(α-1-酸性糖蛋白)；第4号蛋白P02767(甲状腺素运载蛋白)；第12号蛋白P20059(血红素结合蛋白)和第14号蛋白P26644(β2糖蛋白1)。分别使用双抗夹心ELISA试剂盒(大鼠血管紧张素原(AGT)双抗夹心试剂盒：武汉优尔生商贸有限公司；大鼠α1酸性糖蛋白(α1AG)双抗夹心试剂盒：Abcam艾博抗(上海)贸易有限公司；大鼠甲状腺素运载蛋白(TTR)双抗夹心试剂盒：Abnova亚诺法生技股份有限公司；大鼠血红素结合蛋白(Hpx)双抗夹心试剂盒：Abcam艾博抗(上海)贸易有限公司；大鼠β2糖蛋白1(APOH)双抗夹心试剂盒：武汉优尔生商贸有限公司；按照试剂盒说明书对正常对照组、证候组以及证候药物组大鼠血清进行ELISA检测。
伊木萨克片作用于异常黏液质证候大鼠模型血清候选蛋白的ELISA检测数据如表6所示，各组大鼠血清中不同种类蛋白含量的变化情况如图5～9所示。
测定结果如图5～9所示，由图5～9可知，各个异常黏液质证候大鼠模型血清中该蛋白较正常对照组上调表达，药物干预后其蛋白表达量下降，这与iTRAQ结果相符，说明本发明方法获得的蛋白标志物可以作为伊木萨克片作用于异常黏液质证候大鼠模型血清的药物靶点候选标志物。
表6各组大鼠血清中蛋白含量
与正常组组相比*P<0.05 与证候模型组相比#P<0.05
2)伊木萨克片作用于异常黏液质型阳痿病证大鼠模型血清候选蛋白的ELISA检测
随机选择3种血清候选差异蛋白，对正常对照组、病证组及病证药物组大鼠模型血清进行ELISA检测，以验证本发明血清候选差异蛋白是否可以作为伊木萨克片对异常黏黏液质型阳痿病证大鼠的药物靶点标志物：
即随机选择检测第2号蛋白P02764(α-1-酸性糖蛋白)；第5号蛋白P20059(血红素结合蛋白)；第7号蛋白O35460(血管生成素-1)。
分别使用双抗夹心ELISA试剂盒(大鼠α1酸性糖蛋白(α1-AGP)双抗夹心试剂盒：Abcam艾博抗(上海)贸易有限公司；大鼠血红素结合蛋白双抗夹心试剂盒：Abcam艾博抗(上海)贸易有限公司；大鼠血管生成素-1双抗夹心试剂盒：Raybiotech瑞博奥(广州)生物科技有限公司。按照试剂盒说明书对正常对照组、病证组以及病证药物组大鼠血清进行ELSA检测。
伊木萨克片作用于异常黏液质型阳痿病证大鼠模型血清候选蛋白的ELISA检测数据如表7所示，各组大鼠血清中不同种类蛋白含量的变化情况如图10～12所示。
表7各组大鼠血清中蛋白含量
与正常组组相比*P<0.05 与病证模型组相比▼P<0.05
测定结果如图10～12所示，由图10～12可知，异常黏液质型阳痿病证大鼠模型血清中α1酸性糖蛋白和血红素结合蛋白较正常对照组上调表达，药物干预后其蛋白表达量下降，血管生成素-1较正常对照组下调表达，药物干预后期表达量上调，这与iTRAQ结果相符，说明本发明方法获得的蛋白标志物可以作为伊木萨克片作用于异常黏液质型阳痿病证大鼠模型血清的药物靶点候选标志物。
实施例3
伊木萨克片药物靶点蛋白的免疫组织化学检测
随机选择4种阴茎平滑肌组织候选差异蛋白，对异常黏液质型阳痿病证大鼠、病证药物组大鼠与正常对照组大鼠的阴茎平滑肌进行免疫组织化学检测，以验证本发明组织中的候选差异蛋白是否可以作为伊木萨克片对异常黏黏液质型阳痿病证大鼠阴茎平滑肌组织的药物靶点标志物：
即随机选择检测第4号蛋白P02625(小清蛋白α)；第15号蛋白Q9Z2L0(电压依赖性阴离子选择性通道蛋白1)；第26号蛋白P47853(双链蛋白聚糖)和第29号蛋白P04904(谷胱甘肽S-转移酶α-3)；分别使用上述蛋白的抗体(所有抗体均购置于Abcam(上海)贸易有限公司)，按照抗体说明书对正常对照组、病证组和病证药物组大鼠阴茎平滑肌组织进行检测。运用光学显微镜观察并统计结果。照片放大倍数为物镜倍数×目镜倍数。染色结果计数方法如下：在放大倍数为400的情况下，每个样本随机选择6-10个视野，各视野之间完全不重叠，计数阳性细胞，每组一般为6-10个不同样本，随后进行组间的比较。评分方法分为两个方面，即阳性范围和着色强度。其中阳性细胞所占视野中的百分比为阳性范围5％-100％；阳性细胞染色的深浅为着色强度，分为4个等级，即0(几乎不着色或者稍微有一点着色)、1(有着色，但比较浅)、2(有着色，比较深)、3(有着色，非常深)；最终结果为阳性范围×着色强度/视野个数。
测定结果如表8所示，由表8可知，各个异常黏液质型阳痿病证大鼠模型的阴茎平滑肌组织候选蛋白中电压依赖性阴离子选择性通道蛋白1和小清蛋白α的含量显著高于正常对照组，经药物干预后其表达量下降，谷胱甘肽S-转移酶α-3和双链蛋白聚糖的含量显著低于正常对照组，经药物干预后其表达量上调，这与iTRAQ结果相符，说明本发明方法获得蛋白标志物可以伊木萨克片对异常黏黏液质型阳痿病证大鼠阴茎平滑肌组织的药物靶点标志物。
表8各组大鼠阴茎组织中蛋白表达结果
*与N比较<0.05 ▼与BM比较<0.05
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.伊木萨克片药物靶点蛋白的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提供正常对照组(N组)、异常黏液质证候组(ZM组)、异常黏液质证候药物组(ZY组)、异常黏液质型病证组(BM组)和异常黏液质型病证药物组(BY组)，N大鼠，对BY组和ZY组大鼠用伊木萨克片喂食2周，BM组、ZM组和N组大鼠喂食水；
2)采集所述步骤1)得到的五组大鼠的全血，分离后得到血清；
取所述步骤1)得到五组大鼠的阴茎平滑肌组织；
3)从所述步骤2)得到的血清和阴茎平滑肌组织中提取蛋白质，检测，得到已知浓度的蛋白质；
4)将所述步骤3)中得到的蛋白质用iTRAQ标记试剂盒标记后纯化，得到纯化后肽段；
5)将所述步骤4)得到的纯化后的肽段经质谱检测后得到指纹图谱，将所述指纹图谱在PD软件中筛选，将所述筛选后的谱图用mascot搜索，根据得到的搜索结果和筛选后的谱图进行定量分析，将得到的分析数据在大鼠数据库中检索，获得大鼠血清差异蛋白质和大鼠阴茎平滑肌组织差异蛋白质；
6)将所述步骤5)中得到的血清差异蛋白质和阴茎平滑肌组织差异蛋白质进行伊木萨克片药物靶点蛋白的筛选。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述伊木萨克片中药物活性成分的质量浓度为250mg/kg，所述喂食伊木萨克片的频率为每日1～2次。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤1)中正常对照组在常规环境中饲养，喂食的环境温度为18～22℃，所述喂食环境的相对湿度为40～60％；造模组的喂食的环境温度为8～12℃，所述喂食环境的相对湿度70～80％；所述步骤1)中正常对照组为普通饲料，造模组喂食饲料为湿寒性饲料。
4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤2)中分离得到血清的方法具体是：将新鲜大鼠全血立即置4℃环境，30～40min后以3000～3500rpm的速度离心5～10min，将得到的上清液在4℃条件下，以3000～3500rpm的速度再次离心，得到血清；所述步骤2)得到阴茎平滑肌组织的方法具体是：从根部取阴茎平滑肌组织，洗去血渍，并除去残余皮肤、筋膜，取上段阴茎平滑肌组织，放置于冻存管中放置于-80℃超低温冰箱备用。
5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤3)中检测包括蛋白质的完整性和蛋白质的含量的测定。
6.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述伊木萨克片靶点蛋白包括异常黏液质大鼠证候组的血清药物靶点蛋白、异常黏液质大鼠血清和阴茎平滑肌组织病证组药物靶点蛋白。
7.根据权利要求7所述的筛选方法，其特征在于，所述异常黏液质血清和阴茎平滑肌组织病证组药物靶点蛋白的差异蛋白的筛选具体是：
将所述步骤6)中得到的BM组与N组蛋白质相比较，得到BM/N的差异蛋白质；将ZM组与N组的蛋白质相比较，得到ZM/N的差异蛋白质；将所述ZY组与ZM组的蛋白质相比较，得到ZY/ZM的差异蛋白，统计BM/N、ZM/N和ZY/ZM差异蛋白的同蛋白的种类和数量，得到伊木萨克片作用于异常黏液质证候组大鼠后的血清药物靶点蛋白。
将所述步骤6)中得到的BM组与ZM组蛋白质相比较，得到BM/ZM的差异蛋白质；将BM组与N组的蛋白质相比较，得到BM/N的差异蛋白质；将所述BY组与BM组的蛋白质相比较，得到BY/BM的差异蛋白，统计BM/ZM、BM/N和BY/BM差异蛋白的同蛋白的种类和数量，得到伊木萨克片作用于异常黏液质型阳痿病证组大鼠后的血清和阴茎平滑肌组织药物靶点蛋白。
8.伊木萨克片药物作用于异常黏液质证候动物模型的血清的靶点蛋白，其特征在于，包括下列蛋白质种类：血管紧张素原、T-激肽原1、α-1-酸性糖蛋白、甲状腺素运载蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3L、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3K、α-2-巨球蛋白、羧酸酯酶1C、血清铁传递蛋白、α-1-3抑制剂、α-1-抗蛋白酶、血红素结合蛋白、血清淀粉样物质P、β-2-糖蛋白1、肌红蛋白-1、血小板白细胞c激酶底物、被控多泡体蛋白5、α-1-巨球蛋白、胎球蛋白-B、GRAM结构域的蛋白1A、N-乙酰神经氨酸-9-磷酸酶。
9.伊木萨克片药物作用于异常黏液质型阳痿病证动物模型的血清的靶点蛋白，其特征在于，包括下列蛋白质种类：T-激肽原1、α-1-酸性糖蛋白、T-激肽原2、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3N、血红素结合蛋白、N-乙酰神经氨酸-9-磷酸酶和血管生成素-1。
10.伊木萨克片药物作用于异常黏液质型病动物模型的阴茎平滑肌组织的靶点蛋白，其特征在于，包括下列蛋白质种类：原肌球蛋白α-1链、乙醇脱氢酶类4mu/σ链、血红素、小清蛋白α、腺苷酸激酶同工酶1、乌头酸水合酶，线粒体、碳酸酐酶3、肽基脯氨酰顺反异构酶、醛缩酶A、苹果酸脱氢酶，线粒体、磷酸激酶1、磷酸丙糖异构酶、肌红蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、电压依赖性阴离子选择性通道蛋白1、补体成分C9、β烯醇化酶、α-1-酸性糖蛋白、T-激肽原-2、T-激肽原-1、G蛋白偶联受体4、60S核糖体蛋白L27、血小板反应蛋白4、血清白蛋白、髓鞘蛋白P0、双链蛋白聚糖、人软骨粘附素、肌球蛋白-11和谷胱甘肽S-转移酶α-3。
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