CN115607692B - 使用热淋清颗粒治疗脓毒症的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及使用热淋清颗粒治疗脓毒症的方法。具体地说,本发明一方面涉及测定热淋清颗粒治疗脓毒症效果的方法,其包括如下步骤:通过给动物灌胃给予热淋清颗粒,给药完毕后次日建立脓毒症急性肺损伤模型;造模后,取血收集血清并摘取肺组织部分置于多聚甲醛中固定保存;测定如下项目的至少一种:测定大鼠肺组织的湿/干重比,HE染色检测肺组织病理学改变及损伤,ELISA检测血清中TNF‑α等水平含量,RT‑PCR检测肺组织;根据上述检测数据获得热淋清颗粒对脓毒症动物治疗作用的统计学结果。还涉及一种热淋清颗粒,以及它们的制药用途。本发明结果表明热淋清颗粒能够有效地治疗脓毒症或者能够减轻脓毒症相关的急性肺损伤。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,涉及一种中药制剂,尤其涉及一种以植物药材头花蓼制成的中药制剂热淋清颗粒,还涉及该中药制剂的制备方法以及它们的制药用途,尤其是,本发明涉及热淋清颗粒在制备用于治疗脓毒症的药物中的用途。本发明研究结果显示,热淋清颗粒对脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA及蛋白表达的影响是明显的。
背景技术
脓毒症是由宿主对感染的反应失调所引起的器官功能障碍,其中肺部是最易受感染的器官之一,约40%的脓毒症患者会出现急性肺损伤,病死率高达30%,是脓毒症患者死亡的主要原因之一[Singer M,Deutschman CS,Seymour CW,et al.The thirdinternational consensus definitions for sepsis and septic shock(Sepsis-3)[J].JAMA,2016,315(8):801-810;徐静媛,邱海波.脓毒症治疗的现状与展望[J].国际流行病学传染病学杂志,2021,48(4):259-262]。脓毒症急性肺损伤发生时肺组织内大量炎症细胞聚集、浸润,髓分化因子88(MyD88)依赖的Toll样受体4(TLR4)聚合从而激活下游核因子-κBp65(NF-κB p65)信号通路,刺激肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1α(IL-1α)、前列腺素E2(PGE2)等炎症因子释放,造成肺组织结构的破坏而形成脓毒症急性肺损伤[He W,QuT,Yu Q,et al.LPS induces IL-8 expression through TLR4,MyD88,NF-kappaB andMAPK pathways in human dental pulp stem cells[J].International endodonticjournal,2013,46(2):128-136;LIU S FMALIK A B.NFκB activation as a pathologicalmechanism of septic shock and inflammation[J].Am J Physiol Lung Cell MolPhysiol,2006,290(4):L622-L645]。
中医并无脓毒症概念,根据《伤寒论》和《温病学》的相关论述,将脓毒症归属于“热病”、“温病”等范畴,其多是从“毒瘀虚”阐述脓毒症的病因病机,治疗上多用清热解毒类药物[王今达,李志军,李银平.从“三证三法”辨证论治脓毒症[J].中国危重病急救医学,2006,18(11):643-644]。
热淋清颗粒是以贵州民族特色药头花蓼(Polygonum capitatum Buch.-Ham.exD.Don)为原料经现代工艺技术提炼精制而成的单方制剂,其具有清热泻火,利尿通淋的功效[王重洋,潘舒,吴亚利,等.热淋清颗粒药理作用实验研究[J].实用中医内科杂志,2012,26(03):12-14;国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[S].北京:中国医药科技出版社,2020];可用于治疗下焦湿热所致的热淋,症见尿频、尿急、尿痛;尿路感染、肾盂肾炎见上述证候者,临床上常用于治疗湿热蕴结下焦,机体气化不利所致诸症[梁斌,张丽艳,冉懋雄.中国苗药头花蓼[M].北京:中国中医药出版社,2014;王重洋,潘舒,吴亚利,等.热淋清颗粒药理作用实验研究[J].实用中医内科杂志,2012,26(03):12-14;南海峰,刘杰,吴丹,等.热淋清颗粒配合常规抗生素治疗淋病的临床效果及对血清炎症介质表达的影响[J].世界中西医结合杂志,2021,16(06):1103-1107;国家药典委员会.中华人民共和国药典2020年版(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2020]。
现代研究发现热淋清颗粒及头花蓼具有良好的抗炎、抗菌等作用[马风伟.热淋清颗粒的体内代谢动力学研究[D].贵州师范大学,2014]。
有文献研究通过盲肠结扎穿孔法制备大鼠脓毒症急性肺损伤模型[韩靖,杜玉明,袁聪俐,等.大鼠盲肠结扎与穿刺脓毒症模型的建立与分析[J].上海交通大学学报(农业科学版),2017,35(4):1-6],然而该模型是否适用于研究热淋清颗粒对脓毒症急性肺损伤的保护作用的效果,目前尚无业界尝试。
因此,本领域技术人员期待提供一种以TLR4/MyD88/NF-κB p65信号通路为切入点,探究热淋清颗粒对脓毒症急性肺损伤的保护作用及其机制的方法,和/或还期待提供一种热淋清颗粒,和/或还期待提供热淋清颗粒在制备治疗脓毒症或对脓毒症急性肺损伤的保护作用的药物中的用途。
发明内容
本发明的目的在于提供一种测定热淋清颗粒治疗脓毒症作用的方法,和/或还期待提供一种热淋清颗粒,和/或还期待提供热淋清颗粒在制备具有治疗脓毒症作用的药物中的用途。本发明以热淋清颗粒为研究对象,研究其对脓毒症急性肺损伤大鼠的对脓毒症的治疗效果。已经出人意料地发现,通过使用本发明方法可以有效地测定热淋清颗粒的对脓毒症的治疗作用。本发明基于此类发现而得以完成。
为此,本发明第一方面提供了一种测定热淋清颗粒治疗脓毒症效果的方法,或者通过测定血清TNF-α浓度考察热淋清颗粒治疗浓毒症效果的方法,其包括如下步骤:
通过给动物灌胃给予热淋清颗粒,给药完毕后次日建立脓毒症急性肺损伤模型;
造模24h后,取血收集血清并摘取肺组织部分置于4%多聚甲醛中固定保存;
测定如下项目的至少一种:测定大鼠肺组织的湿/干重比,HE染色检测肺组织病理学改变及损伤,ELISA检测血清中TNF-α、IL-1α、PGE2水平含量,RT-PCR检测肺组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA的相对表达量,Western-Blot检测肺组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相对表达量;
根据上述检测数据获得热淋清颗粒对脓毒症动物治疗作用的统计学结果。
根据本发明第一方面的方法,其中所述热淋清颗粒能够治疗脓毒症,例如能够减轻脓毒症动物急性肺损伤。
根据本发明第一方面的方法,其中所述热淋清颗粒能够抑制生物体血清TNF-α浓度升高例如能够抑制脓毒症动物急性肺损伤动物血清TNF-α浓度升高。
根据本发明第一方面的方法,其中所述热淋清颗粒能够抑制生物体血清IL-1浓度升高例如能够抑制脓毒症动物急性肺损伤动物血清IL-1浓度升高。
根据本发明第一方面的方法,其中所述热淋清颗粒能够抑制生物体血清PGE2浓度升高例如能够抑制脓毒症动物急性肺损伤动物血清PGE2浓度升高。
根据本发明第一方面的方法,其中所述动物是SD大鼠。
根据本发明第一方面的方法,其中采用盲肠结扎穿孔法制备脓毒症急性肺损伤模型。
根据本发明第一方面的方法,其中还设置假手术组,该组动物开腹后仅游离盲肠后关腹,不进行制备脓毒症急性肺损伤模型所述的结扎和穿孔。
根据本发明第一方面的方法,热淋清颗粒用水混悬/溶解后灌胃给予动物。
根据本发明第一方面的方法,造模后24h采集动物血液、摘取肺组织。
根据本发明第一方面的方法,采集的血液照如下方式处理:血液于室温处自然凝固30分钟,1000xg离心15分钟左右,收集血清上清,4℃保存待测。
根据本发明第一方面的方法,其中以如下方法进行模型的建立:末次给药后次日建立脓毒症急性肺损伤模型,模型组、热淋清颗粒组和阳性对照组大鼠采用盲肠结扎穿孔法制备脓毒症急性肺损伤模型,假手术组开腹后仅游离盲肠后关腹,不进行结扎和穿孔;造模后3~24h内,大鼠出现竖毛、腹胀和腹腔积液现象,皮毛杂乱无光泽,眼角出现血性分泌物等表现,则表明造模成功。
根据本发明第一方面的方法,其中动物取血后,摘取肺组织部分置于4%多聚甲醛中固定保存,用于HE染色,其余部分于-80℃冰箱冻存待测。
根据本发明第一方面的方法,其中照以下方式进行大鼠肺组织湿/干重比测定:将分离出的各组大鼠右肺中叶以吸水纸吸干肺组织表面水分后称定湿重,随后将肺组织放入60℃恒温干燥箱中烘干,48h后,称定干重,计算肺组织湿重量/干重量。
根据本发明第一方面的方法,其中照以下方式进行HE染色检测热淋清颗粒对脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织病理学改变及损伤评分:随机选取各组于4%多聚甲醛中固定48h后的大鼠肺组织3份,依次进行脱水、透明、包埋、切片、脱蜡、复水后HE染色、中性树胶封片,400倍光镜下观察大鼠肺组织病理变化并进行肺损伤评分:根据肺间质水肿、炎症细胞浸润、肺泡水肿、肺泡出血、肺不张、透明膜形成病变程度,按照正常、轻度、中度、重度分别按0~3分计分。
根据本发明第一方面的方法,其中照以下方式进行ELISA检测各组大鼠血清中TNF-α、IL-1α、PGE2水平含量:取各组大鼠血清,按照ELISA试剂盒说明书操作方法检测各组大鼠血清的IL-1α、PGE2水平;另外按照实施例2的方法对大鼠血清进行TNF-α指标检测。
根据本发明第一方面的方法,其中照以下方式进行RT-PCR检测各组大鼠肺组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA的相对表达量:取各组大鼠肺组织,用组织研磨器进行匀浆处理,加入TRIzon Reagent提取肺组织总RNA,光谱仪检测RNA纯度,并进行琼脂糖电泳检测RNA片段完整性;根据cDNA第一链合成试剂盒提供的反应体系要求设置,将提取的RNA逆转录为cDNA并置于-80℃保存;根据cDNA反转录试剂盒要求,取总RNA进行逆转录,逆转录条件为55℃孵育5min。以GAPDH为内参照;PCR反应体系为20μL,引物序列为TLR4上游引物序列5'-GCCATTGCTGCCAACATC-3',下游引物序列5'-TGCCAGAGCGGCTACTCA-3',扩增产物长度148bp;MyD88上游引物序列5'-CCTACGGTTCATCACTATCTG-3',下游引物序列5'-ACCTCAAGCAAGGCAAAA-3',扩增产物长度291bp;NF-κBp65上游引物序列5'-GAGGCACGAGGCTCCTTTTCT-3',下游引物序列5'-GTAGCTGCATGGAGACTCGAACA-3',扩增产物长度118bp;通过逆转录合成的cDNA进行PCR扩增;PCR反应条件为95℃预变性5min,95℃变性10s,60℃退火30s;循环次数为45次;根据原始数据Ct值,采用2-△△CT相对定量法计算各组mRNA相对表达水平。
根据本发明第一方面的方法,其中照以下方式进行Western-Blot检测各组大鼠肺组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相对表达量:取各组大鼠肺组织,加入组织蛋白抽提试剂,冰浴匀浆及超声破碎,冰上孵育20min后,10000rpm离心20min,收集上清,以BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度;将制备好的肺组织蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳,低温转膜30min,TLR4加入一抗(稀释比例为1:1000),NF-κBp65加入一抗(稀释比例为1:10000)4℃孵育过夜,MyD88加入一抗(稀释比例为1:1000)37℃孵育1h,洗涤缓冲液(TBST)洗膜,加入二抗(稀释比例为1:200),室温孵育5min,eECL发光显影;将胶片进行扫描,分析目的蛋白分子量和净光密度值;以GAPDH为内参照,采用Gel-Pro analyzer 4图像分析各个蛋白对应灰度值,计算蛋白的相对表达量。
根据本发明第一方面的方法,其包括如下步骤:
(1)分组与给药
将SD雄性大鼠随机分为6组:假手术组、模型组、热淋清颗粒组(例如分为高剂量组[4.8g/(kg·d)]、中剂量组[2.4g/(kg·d)]、低剂量组[1.2g/(kg·d)])、阳性对照组[地塞米松1.5mg/(kg·d)],每组10只;假手术组和模型组大鼠灌胃等体积生理盐水,其余各组大鼠均灌胃相应药物,1次/d,连续给药7d;
(2)模型建立
末次给药后次日建立脓毒症急性肺损伤模型,模型组、热淋清颗粒组(例如包括高、中、低剂量组)和阳性对照组大鼠采用盲肠结扎穿孔法制备脓毒症急性肺损伤模型,假手术组开腹后仅游离盲肠后关腹,不进行结扎和穿孔。造模后3~24h内,大鼠出现竖毛、腹胀和腹腔积液现象,皮毛杂乱无光泽,眼角出现血性分泌物等表现,则表明造模成功;
造模24h后,腹主动脉取血,血液于室温处自然凝固30分钟,1000xg离心15分钟左右,收集血清上清,4℃保存待测(或-80℃冰箱冻存);
摘取肺组织部分置于4%多聚甲醛中固定保存,用于HE染色,其余部分于-80℃冰箱冻存待测;
(3)检测和数据处理
大鼠肺组织湿/干重比测定:将分离出的各组大鼠右肺中叶以吸水纸吸干肺组织表面水分后称定湿重,随后将肺组织放入60℃恒温干燥箱中烘干,48h后,称定干重,计算肺组织湿重量/干重量;
HE染色检测热淋清颗粒对脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织病理学改变及损伤评分:随机选取各组于4%多聚甲醛中固定48h后的大鼠肺组织3份,依次进行脱水、透明、包埋、切片、脱蜡、复水后HE染色、中性树胶封片,400倍光镜下观察大鼠肺组织病理变化并进行肺损伤评分:根据肺间质水肿、炎症细胞浸润、肺泡水肿、肺泡出血、肺不张、透明膜形成病变程度,按照正常、轻度、中度、重度分别按0~3分计分;
ELISA检测各组大鼠血清中TNF-α、IL-1α、PGE2水平含量:取各组大鼠血清,按照ELISA试剂盒说明书操作方法检测各组大鼠血清的TNF-α、IL-1α、PGE2水平;
RT-PCR检测各组大鼠肺组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA的相对表达量:取各组大鼠肺组织,用组织研磨器进行匀浆处理,加入TRIzon Reagent提取肺组织总RNA,光谱仪检测RNA纯度,并进行琼脂糖电泳检测RNA片段完整性;根据cDNA第一链合成试剂盒提供的反应体系要求设置,将提取的RNA逆转录为cDNA并置于-80℃保存;根据cDNA反转录试剂盒要求,取总RNA进行逆转录,逆转录条件为55℃孵育5min。以GAPDH为内参照;PCR反应体系为20μL,引物序列为TLR4上游引物序列5'-GCCATTGCTGCCAACATC-3',下游引物序列5'-TGCCAGAGCGGCTACTCA-3',扩增产物长度148bp;MyD88上游引物序列5'-CCTACGGTTCATCACTATCTG-3',下游引物序列5'-ACCTCAAGCAAGGCAAAA-3',扩增产物长度291bp;NF-κBp65上游引物序列5'-GAGGCACGAGGCTCCTTTTCT-3',下游引物序列5'-GTAGCTGCATGGAGACTCGAACA-3',扩增产物长度118bp;通过逆转录合成的cDNA进行PCR扩增;PCR反应条件为95℃预变性5min,95℃变性10s,60℃退火30s;循环次数为45次;根据原始数据Ct值,采用2-△△CT相对定量法计算各组mRNA相对表达水平;
Western-Blot检测各组大鼠肺组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相对表达量:取各组大鼠肺组织,加入组织蛋白抽提试剂,冰浴匀浆及超声破碎,冰上孵育20min后,10000rpm离心20min,收集上清,以BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度;将制备好的肺组织蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳,低温转膜30min,TLR4加入一抗(稀释比例为1:1000),NF-κBp65加入一抗(稀释比例为1:10000)4℃孵育过夜,MyD88加入一抗(稀释比例为1:1000)37℃孵育1h,洗涤缓冲液(TBST)洗膜,加入二抗(稀释比例为1:200),室温孵育5min,eECL发光显影;将胶片进行扫描,分析目的蛋白分子量和净光密度值;以GAPDH为内参照,采用Gel-Pro analyzer 4图像分析各个蛋白对应灰度值,计算蛋白的相对表达量;
所得实验数据均以来表示,使用(SPSS26.0)统计软件对数据进行分析,多组间比较满足正态分布及方差齐性时,采用单因素方差法(One-way ANOVA)分析,P<0.05认为结果具有统计学差异;
根据上述检测数据获得热淋清颗粒对脓毒症大鼠的治疗作用的统计学结果。
根据本发明第一方面的方法,其中使用TNF-αELISA试剂盒测定TNF-α浓度,包括如下步骤:
a.标准品的稀释和加样:取小试管6支,依次编号,先在各小试管中加入标准品稀释液100μl,然后取原浓度标准品100μl加至第一支试管中,充分混匀;再在该试管中取100μl加至第二支试管中,充分混匀;再在该试管中取100μl加至第三支试管中,充分混匀;再在该试管中取100μl加至第四支试管中,充分混匀;再在该试管中取100μl加至第五支试管中,充分混匀;然后在该试管中取100μl,弃掉;第六只试管作为0号标准品,稀释后各管浓度分别是:640pg/ml、320pg/ml、160pg/ml、80pg/ml、40pg/ml、0pg/ml;在酶标板上设标准品孔,依次加入不同浓度的标准品50μl,每个浓度做5个平行孔;
b.待测样品配制和加样:用采血管收集血液,血液于室温处自然凝固30分钟,1000xg离心15分钟左右,收集上清(血清),将该上清与附加液以体积比9:1混合均匀,得到血清待测样品;分别设置待测样品孔、空白对照孔(空白对照孔不加样品、酶标试剂及生物素标记的抗TNF-α抗体,其余各步操作与待测样品孔相同);在酶标板上待测样品孔中先加样品40μl,然后再加生物素标记的抗TNF-α抗体10μl;加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀;所述附加液是含有1.25%甘氨酸和0.25%氯化锌的水溶液;
c.温育:每孔加入酶标试剂50μl,空白对照孔除外;用封板膜封板后将酶标板置37℃温育30分钟;
d.洗涤:将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释30倍得到洗涤液;小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干;
d.显色:每孔先加入50μl显色剂A,再加入50μl显色剂B,轻轻震荡混匀,37℃避光显色10分钟;接着每孔加终止液50μl以终止反应,此时蓝色转为黄色;
e.测定和计算:在加终止液后15分钟以内,以空白对照孔调零,用酶标仪在450nm波长下依序测量各孔的吸光度OD值;用标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的线性回归方程,用样品OD值算得样品浓度。
根据本发明第一方面的方法,其中所用各种材料为常规材料。
根据本发明第一方面的方法,其中所用ELISA试剂盒如实施例中述。
进一步的,本发明第二方面涉及一种热淋清颗粒,其是以头花蓼(Polygonumcapitatum Buch.-Ham.ex D.Don)为原料制成的颗粒剂。
根据本发明第二方面的热淋清颗粒,其能够治疗脓毒症,例如能够减轻脓毒症动物急性肺损伤。
根据本发明第二方面的热淋清颗粒,其能够抑制生物体血清TNF-α浓度升高例如能够抑制脓毒症动物急性肺损伤(模型动物)血清TNF-α浓度升高。
根据本发明第二方面的热淋清颗粒,其是按照如下方法制备得到的:取头花蓼1250g,加水煎煮二次,每次1.5小时,煎液滤过,滤液合并,浓缩至适量,滤过,喷雾干燥,与适量的可溶性淀粉混匀,制成颗粒,干燥,制成500g,即得。
进一步的,本发明第三方面涉及一种具有能够治疗脓毒症,例如能够减轻脓毒症动物急性肺损伤的热淋清颗粒,其如本发明第二方面任一项所述。
进一步的,本发明第四方面涉及本发明第二方面任一项所述热淋清颗粒在制备用于治疗脓毒症,例如减轻脓毒症动物急性肺损伤的药物中的用途。
本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案,只要它们不会相互矛盾,当然在相互之间适用时,必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献,它们的全部内容通过引用并入本文,并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时,以本发明的表述为准。此外,本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义,即便如此,本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释,提及的术语和短语如有与公知含义不一致的,以本发明所表述的含义为准。
头花蓼(Polygonum capitatum Buch-Ham ex D.Don)为蓼科蓼属多年生草本植物。具有清热利湿、利尿通淋之功效,在临床上治疗泌尿系统感染有着显著的效果。以其为原料制成的中成药制剂“热淋清颗粒”2004年进入国家基本医疗保险目录,2012年进入贵州省基本药物目录。
头花蓼是少数民族地区的常用药,主要用于肾盂肾炎、尿道感染、利尿通淋等症。相关的药理学研究少见,目前仅有任光友等几篇报道。任光友采用大鼠细菌性肾盂肾炎模型进行实验,结果头花蓼水提取物组大鼠尿液中的WBC和BLD与对照组比较明显减少,显示头花蓼水提物对肾盂肾炎具有一定的抗炎作用。任光友等以小鼠腹腔注射大肠杆菌菌液观察5天内小鼠死亡情况,结果对照组死亡率为100%,头花蓼组死亡率分别为20%和50%,显示头花蓼水提物能够对抗大肠杆菌引起的感染。任光友等以头花蓼水提物灌胃给药予家兔,结果,头花蓼水提物组与对照组比较,体温无显著性差异,但能降低静脉注射伤寒副伤寒菌苗引起的家兔的发热体温。任光友等,以头花蓼水提物分别灌胃给药家兔、大鼠,与空白组和速尿对照组比较尿量。结果显示头花蓼水提物对家兔和大鼠无明显利尿作用。徐英春等人采用琼脂稀释法检测了头花蓼对10株淋病奈瑟球菌(淋球菌)的体外抑菌活性,结果头花蓼对淋球菌有抑菌活性。其对10株淋球菌的最小抑菌浓度范围为8~32g/L,平均值为11.2g/L。
本发明方法能够呈现一种或多种优异效果。
附图说明
图1:热淋清颗粒对脓毒症急性肺损伤模型大鼠肺组织病理学改变的影响(×400)。
图2:各组大鼠肺组织TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白印迹图(注:A:假手术组;B:模型组;C:阳性对照组;D:热淋清颗粒高剂量组;E:热淋清颗粒中剂量组;F:热淋清颗粒低剂量组)。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述,然而,本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解,在不背离本发明的精神和范围的前提下,可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的,但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,所用原材料均为市售商品。
在本发明中,如未另外说明,所用热淋清颗粒是按照如下方法制备得到的:取头花蓼1250g,加水煎煮二次,每次1.5小时,煎液滤过,滤液合并,浓缩至适量,滤过,喷雾干燥,与适量的可溶性淀粉混匀,制成颗粒,干燥,制成500g,即得。当然,本发明也可使用含糖型的热淋清颗粒。这些热淋清颗粒符合2020年版中国药典一部所载同名品种的规定。
实施例1:热淋清颗粒对脓毒症的治疗作用
本实施例通过考察热淋清颗粒对脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA及蛋白表达的影响,以确定热淋清颗粒对脓毒症的治疗作用。
1.实验材料
(1)实验动物:
选取SPF级SD雄性大鼠(180~220g),购于长沙市天勤生物技术有限公司,许可证号:SCXK(湘)2019-0014,所有大鼠实验前均适应性饲养1周[室温(25±1)℃、相对湿度(55±5)%],每日12h光照黑暗交替,大鼠自由饮食饮水。
(2)药物:
热淋清颗粒(贵州威门药业股份有限公司,批号:210602)、醋酸地塞米松片(浙江仙珺制药股份有限公司,批号:210113)。
(3)主要试剂与仪器:
TNF-αELISA试剂盒(Bioswamp,货号/批号:RA20035/20211210),
IL-1αELISA试剂盒(Bioswamp,货号/批号:RA20610/20220110),
PGE2 ELISA试剂盒(Bioswamp,货号/批号:RA20013/20211210),
超纯RNA提取试剂盒(DNase I,康为世纪公司,货号/批号:CW0597/50250);
HiScript II One Step qRT-PCR SYBR Green Kit(以RNA为模板的染料法qRT-PCR试剂盒,Vazyme公司,货号/批号:Q221-01/7E220E8);
蛋白酶抑制剂混合物(Protease Inhibitor Cocktail(100x),康为世纪公司,货号/批号:CW2200/01392);
BCA蛋白定量试剂盒(康为世纪有限公司,货号/批号:CW0014/32521);
MyD88多克隆抗体(Bioswamp公司,货号/批号:PAB47936/20211210);
TLR4抗体(Bioswamp公司,货号/批号:PAB47910/20211210);
NF-κB p65抗体(Abcam公司,货号/批号:GR3275776-10/211110);
GAPDH(Abcam公司,货号/批号:GR3316865-11/211016);
eECL高灵敏度化学发光检测试剂盒(eECL Western Blot Kit,康为世纪公司,货号/批号:CW0049/35521);
转轮式切片机(德国徕卡,徕卡-2016);
全自动染色机(常州派斯杰医疗设备有限公司,RS36);
病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪器有限公司,PHY-Ⅲ);
自动酶标仪(BIOBASE,EL10A);
实时荧光定量(qRT-PCR)仪(美国Applied Biosystems公司,QuantStudio 1);
电泳仪(Tanon,EPS-300);
蛋白转印系统(BIO-RAD,Mini Trans-Blot);
成像系统(德国徕卡,MC170HD)。
2.实验方法
(1)分组与给药
将SD雄性大鼠随机分为6组:假手术组、模型组、热淋清颗粒高剂量组[4.8g/kg/d]、热淋清颗粒中剂量组[2.4g/kg/d]、热淋清颗粒低剂量组[1.2g/kg/d]、阳性对照组[醋酸地塞米松片以地塞米松计1.5mg/kg/d],每组10只;假手术组和模型组大鼠灌胃等体积生理盐水,其余各组大鼠均灌胃相应药物,1次/d,连续给药7d;
(2)模型建立
末次给药后次日建立脓毒症急性肺损伤模型,模型组、热淋清颗粒高、中、低剂量组和阳性对照组大鼠采用盲肠结扎穿孔法制备脓毒症急性肺损伤模型,假手术组开腹后仅游离盲肠后关腹,不进行结扎和穿孔。造模后3~24h内,大鼠出现竖毛、腹胀和腹腔积液现象,皮毛杂乱无光泽,眼角出现血性分泌物等表现,则表明造模成功。
经观察,各组大鼠均造模成功,24h内未出现死亡大鼠。
造模24h后,腹主动脉取血,血液于室温处自然凝固30分钟,1000xg离心15分钟左右,收集血清上清,4℃保存待测(或-80℃冰箱冻存);
摘取肺组织部分置于4%多聚甲醛中固定保存,用于HE染色,其余部分于-80℃冰箱冻存待测;
(3)检测和数据处理
大鼠肺组织湿/干重比测定:将分离出的各组大鼠右肺中叶以吸水纸吸干肺组织表面水分后称定湿重,随后将肺组织放入60℃恒温干燥箱中烘干,48h后,称定干重,计算肺组织湿重量/干重量;
HE染色检测热淋清颗粒对脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织病理学改变及损伤评分:随机选取各组于4%多聚甲醛中固定48h后的大鼠肺组织3份,依次进行脱水、修剪、包埋、切片、脱蜡、复水后HE染色、中性树胶封片,400倍光镜下观察大鼠肺组织病理变化并进行肺损伤评分:根据肺间质水肿、炎症细胞浸润、肺泡水肿、肺泡出血、肺不张、透明膜形成病变程度,按照正常、轻度、中度、重度分别按0~3分计分;
ELISA检测各组大鼠血清中TNF-α、IL-1α、PGE2水平含量:取各组大鼠血清,按照ELISA试剂盒说明书操作方法检测各组大鼠血清的IL-1α、PGE2水平;另外按照实施例2的方法对大鼠血清进行TNF-α指标检测;
RT-PCR检测各组大鼠肺组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA的相对表达量:取各组大鼠肺组织,用组织研磨器进行匀浆处理,加入TRIzon Reagent提取肺组织总RNA,光谱仪检测RNA纯度,并进行琼脂糖电泳检测RNA片段完整性;根据cDNA第一链合成试剂盒提供的反应体系要求设置,将提取的RNA逆转录为cDNA并置于-80℃保存;根据cDNA反转录试剂盒要求,取总RNA进行逆转录,逆转录条件为55℃孵育5min。以GAPDH为内参照;PCR反应体系为20μL,引物序列为TLR4上游引物序列5'-GCCATTGCTGCCAACATC-3',下游引物序列5'-TGCCAGAGCGGCTACTCA-3',扩增产物长度148bp;MyD88上游引物序列5'-CCTACGGTTCATCACTATCTG-3',下游引物序列5'-ACCTCAAGCAAGGCAAAA-3',扩增产物长度291bp;NF-κBp65上游引物序列5'-GAGGCACGAGGCTCCTTTTCT-3',下游引物序列5'-GTAGCTGCATGGAGACTCGAACA-3',扩增产物长度118bp;通过逆转录合成的cDNA进行PCR扩增;PCR反应条件为95℃预变性5min,95℃变性10s,60℃退火30s;循环次数为45次;根据原始数据Ct值,采用2-△△CT相对定量法计算各组mRNA相对表达水平;
Western-Blot检测各组大鼠肺组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相对表达量:取各组大鼠肺组织,加入组织蛋白抽提试剂,冰浴匀浆及超声破碎,冰上孵育20min后,10000rpm离心20min,收集上清,以BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度;将制备好的肺组织蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳,低温转膜30min,TLR4加入一抗(稀释比例为1:1000),NF-κBp65加入一抗(稀释比例为1:10000)4℃孵育过夜,MyD88加入一抗(稀释比例为1:1000)37℃孵育1h,洗涤缓冲液(TBST)洗膜,加入二抗(稀释比例为1:200),室温孵育5min,eECL发光显影;将胶片进行扫描,分析目的蛋白分子量和净光密度值;以GAPDH为内参照,采用Gel-Pro analyzer 4图像分析各个蛋白对应灰度值,计算蛋白的相对表达量;
所得实验数据均以来表示,使用(SPSS26.0)统计软件对数据进行分析,多组间比较满足正态分布及方差齐性时,采用单因素方差法(One-way ANOVA)分析,P<0.05认为结果具有统计学差异;
根据上述检测数据获得热淋清颗粒对脓毒症大鼠的治疗作用的统计学结果。
3.实验结果
(1)热淋清颗粒对脓毒症急性肺损伤模型大鼠一般情况的影响
造模后模型组、阳性对照组和热淋清颗粒高、中、低剂量组大鼠均出现竖毛、腹胀或腹腔积液现象,皮毛杂乱无光泽,眼角出现血性分泌物,表明造模成功。假手术组无竖毛反应,无明显腹部胀气或积液。24h时,热淋清颗粒高、中剂量组及阳性对照组大鼠竖毛、腹胀或腹腔积液情况明显改善,皮毛恢复光泽,眼角血性分泌物减少;而热淋清颗粒低剂量组大鼠仍存在皮毛杂乱无光泽、腹胀或腹腔积液等体征,眼角仍可见明显的血性分泌物。⑦组和⑧组动物与热淋清颗粒高剂量组动物表现基本相同。
(2)热淋清颗粒对脓毒症急性肺损伤模型大鼠肺组织湿/干重比的影响
造模后,各组大鼠体重未见显著差异(P>0.05)。与假手术组比较,模型组肺组织湿/干重比显著升高(P<0.01);与模型组比较,热淋清颗粒高、中剂量组和阳性对照组大鼠肺组织湿/干重比显著下降(P<0.01)。见表1。
表1:热淋清颗粒对脓毒症急性肺损伤模型大鼠肺组织湿/干重比的影响(n=10)
注:与假手术组比较:**P<0.01,*P<0.05;与模型组比较:##P<0.01,#P<0.05
(3)热淋清颗粒对脓毒症急性肺损伤模型大鼠肺组织病理学改变和损伤评分的影响
HE染色显示,假手术组大鼠肺组织结构正常,胸膜无明显增厚;胸膜下各级支气管分支结构完整,偶见少量支气管上皮细胞脱落于支气管腔内;肺泡结构正常,肺泡腔体积大小较为均一,肺泡壁薄,未见炎性浸润,Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮细胞形态正常,胞质染色均匀,胞核清晰;模型组可见肺泡腔断裂融合形成肺大泡,小片状肺出血,肺泡呈实变状,周围肺组织代偿性肺气肿,大量炎症细胞浸润等病理学改变;与模型组比较,热淋清颗粒各剂量组和阳性对照组大鼠肺组织上述病理学改变明显减轻,以热淋清颗粒高剂量组最轻。结果见图1。
与假手术组比较,模型组肺组织肺损伤评分显著升高(P<0.01);与模型组比较,热淋清颗粒高剂量组和阳性对照组大鼠肺损伤评分显著下降(P<0.05)。结果见表2。
表2:热淋清颗粒对脓毒症急性肺损伤模型大鼠肺组织损伤评分的影响(n=10)
组别 | 损伤评分 |
①假手术组 | 0.00±0.00 |
②模型组 | 2.67±0.51** |
③阳性对照组 | 1.37±0.58# |
④热淋清颗粒高剂量组 | 1.33±0.64# |
⑤热淋清颗粒中剂量组 | 1.67±0.47 |
⑥热淋清颗粒低剂量组 | 2.00±1.00 |
⑦组 | 1.41±0.53# |
⑧组 | 1.45±0.67# |
注:与假手术组比较:**P<0.01,*P<0.05;与模型组比较:##P<0.01,#P<0.05
(4)热淋清颗粒对脓毒症急性肺损伤模型大鼠肺组织中TNF-α、IL-1α、PGE2含量的影响
ELISA检测结果显示,与假手术组比较,模型组大鼠血清TNF-α、IL-1α、PGE2含量显著升高(P<0.01);与模型组比较,热淋清颗粒高、中剂量组和阳性对照组血清TNF-α、IL-1α、PGE2含量显著下降(P<0.01),热淋清颗粒低剂量组大鼠血清TNF-α、IL-1α、PGE2含量亦有不同程度下降。见表3。
表3:热淋清颗粒对脓毒症急性肺损伤模型大鼠血清TNF-α、IL-1α、PGE2含量的影响(n=10)
组别 | TNF-α(ng/L) | IL-1(ng/L) | PGE2(ng/L) |
①假手术组 | 67.51±5.08 | 54.35±5.24 | 217.11±15.80 |
②模型组 | 114.55±5.47** | 122.99±24.30** | 301.89±34.44** |
③阳性对照组 | 74.85±7.42## | 75.15±13.77## | 252.51±11.82## |
④热淋清颗粒高剂量组 | 70.58±4.84## | 69.71±16.17## | 237.17±9.90## |
⑤热淋清颗粒中剂量组 | 76.12±7.86## | 87.02±5.32## | 253.88±11.41## |
⑥热淋清颗粒低剂量组 | 96.40±7.61## | 113.06±15.45 | 277.18±20.31 |
⑦组 | 72.43±4.58## | 76.44±13.46## | 240.38±12.93## |
⑧组 | 79.58±6.81## | 80.26±11.21## | 251.24±9.86## |
注:与假手术组比较:**P<0.01,*P<0.05;与模型组比较:##P<0.01,#P<0.05;
(5)热淋清颗粒对脓毒症急性肺损伤模型大鼠肺组织中TLR4、MyD88、NF-kB p65mRNA表达的影响
RT-PCR检测结果显示,与正常组比较,模型组大鼠肺组织中TLR4、MyD88、NF-κBp65 mRNA相对表达量显著升高(P<0.01);与模型组比较,热淋清颗粒高、中剂量组和阳性对照组大鼠肺组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA相对表达量显著下降(P<0.01),热淋清颗粒低剂量组大鼠肺组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA相对表达量亦有不同程度下降(P<0.05)。见表4。
表4:热淋清颗粒对脓毒症急性肺损伤模型大鼠肺组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65mRNA相对表达量的影响(n=10)
注:与假手术组比较:**P<0.01,*P<0.05;与模型组比较:##P<0.01,#P<0.05;
(6)热淋清颗粒对脓毒症急性肺损伤模型大鼠肺组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相对表达量的影响
Western-Blot检测结果显示,与假手术组比较,模型组大鼠肺组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相对表达量显著升高(P<0.01);与模型组比较,热淋清颗粒高剂量组大鼠肺组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相对表达量显著下降(P<0.01),热淋清颗粒中剂量组和阳性对照组大鼠肺组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相对表达量亦有不同程度下降(P<0.05)。结果见表5和图2。
表5:热淋清颗粒对脓毒症急性肺损伤模型大鼠肺组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达的影响(n=10)
组别 | TLR4 | MyD88 | NF-κBp65 |
①假手术组 | 0.112±0.026 | 0.150±0.008 | 0.092±0.020 |
②模型组 | 0.427±0.044** | 0.633±0.109** | 0.304±0.068** |
③阳性对照组 | 0.291±0.036## | 0.317±0.051# | 0.167±0.032## |
④热淋清颗粒高剂量组 | 0.147±0.033## | 0.238±0.035## | 0.145±0.027## |
⑤热淋清颗粒中剂量组 | 0.247±0.025## | 0.328±0.073# | 0.191±0.041## |
⑥热淋清颗粒低剂量组 | 0.372±0.074 | 0.537±0.117 | 0.255±0.051 |
注:与假手术组比较:**P<0.01,*P<0.05;与模型组比较:##P<0.01,#P<0.05;
实施例2:使用TNF-αELISA试剂盒检测大鼠血清中的TNF-α浓度
本文所用TNF-αELISA试剂盒为市售的RA20035型大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒,该TNF-αELISA试剂盒可用于体外定量检测大鼠血清、血浆、组织、细胞上清及相关液体样本中肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量。TNF-αELISA试剂盒的特异性是可检测样本中的大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α),且与其它相关蛋白无明显交叉反应;TNF-αELISA试剂盒的重复性为,板内变异系数≤9%(通常板内变异系数≤3%是优选的),板间变异系数≤11%(通常板间变异系数≤5%是优选的),该试剂盒的检测范围为8pg/ml-640pg/ml,方法灵敏度≤1.6pg/ml。
TNF-αELISA试剂盒的实验原理为,应用双抗体夹心法测定标本中大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;用纯化的大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入肿瘤坏死因子α(TNF-α),再与HRP标记的肿瘤坏死因子α(TNF-α)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色;TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色;颜色的深浅和样品中的肿瘤坏死因子α(TNF-α)呈正相关;用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)浓度。
所述TNF-αELISA试剂盒组成如下:说明书1份、封板膜2片(96)、酶标板(96孔,12孔×8条)1×96、检测抗体(Detection Antibody,生物素标记的抗TNF-α抗体)1.5ml×1瓶、酶标试剂(Enzyme Reagent)6ml×1瓶、标准品(Standards,1280pg/ml)0.6ml×1瓶、标准品稀释液/测定稀释剂(Assay Diluent)2ml×1瓶、显色剂A液(Substrate Solution A)6ml×1瓶、显色剂B液(Substrate Solution B)6ml×1瓶、终止液(Stop Solution)6ml×1瓶、浓缩洗涤液(Wash Buffer)(20ml×30倍)×1瓶。
使用本文所述TNF-αELISA试剂盒处理样本有一般要求。对于血清而言:用采血管收集血液,血液于室温处自然凝固30分钟,1000xg离心15分钟左右,收集血清上清,4℃保存待测,或者分装后-20℃或-80℃保存;对于血浆而言:收集好的血浆根据要求选择EDTA或者柠檬酸钠作为抗凝剂,2-8℃1000xg离心15分钟左右,30分钟内收集好,-20℃或-80℃保存,避免反复冻融;对于细胞上清及相关液体而言:收集好的样本离心后应尽快实验,或者分装后-20℃或-80℃保存,避免反复冻融。
本实施例2使用TNF-αELISA试剂盒检测大鼠血清中的TNF-α浓度,操作步骤如下:
a.标准品的稀释和加样:取小试管6支,依次编号,先在各小试管中加入标准品稀释液100μl,然后取原浓度标准品100μl加至第一支试管中,充分混匀;再在该试管中取100μl加至第二支试管中,充分混匀;再在该试管中取100μl加至第三支试管中,充分混匀;再在该试管中取100μl加至第四支试管中,充分混匀;再在该试管中取100μl加至第五支试管中,充分混匀;然后在该试管中取100μl,弃掉;第六只试管作为0号标准品,稀释后各管浓度分别是:640pg/ml、320pg/ml、160pg/ml、80pg/ml、40pg/ml、0pg/ml;在酶标板上设标准品孔,依次加入不同浓度的标准品50μl,每个浓度做5个平行孔;
b.待测样品配制和加样:用采血管收集血液,血液于室温处自然凝固30分钟,1000xg离心15分钟左右,收集上清(血清),将该上清与附加液以体积比9:1混合均匀,得到血清待测样品;分别设置待测样品孔、空白对照孔(空白对照孔不加样品、酶标试剂及生物素标记的抗TNF-α抗体,其余各步操作与待测样品孔相同);在酶标板上待测样品孔中先加样品40μl,然后再加生物素标记的抗TNF-α抗体10μl;加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀;所述附加液是含有1.25%甘氨酸和0.25%氯化锌的水溶液;
c.温育:每孔加入酶标试剂50μl,空白对照孔除外;用封板膜封板后将酶标板置37℃温育30分钟;
d.洗涤:将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释30倍得到洗涤液;小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干;
d.显色:每孔先加入50μl显色剂A,再加入50μl显色剂B,轻轻震荡混匀,37℃避光显色10分钟;接着每孔加终止液50μl以终止反应,此时蓝色转为黄色;
e.测定和计算:在加终止液后15分钟以内,以空白对照孔调零,用酶标仪在450nm波长下依序测量各孔的吸光度OD值;用标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的线性回归方程,用样品OD值算得样品浓度。需要注意的是,计算血清样品中的TNF-α浓度时应考虑与附加液稀释的倍数。
使用本实施例2方法测定实施例1之脓毒症急性肺损伤大鼠血清TNF-α浓度的结果见上文表3(每组结果为10只动物的结果)。另外,在以上表3使用实施例2方法测定TNF-α时,每个组别10只动物血清等比例混合得到混合血清(其在本文中可称为混合血清X),以此混合血清使用实施例2方法TNF-αELISA试剂盒测定,以考察板内变异系数(板内CV,板内平行试验5道统计,下同)和板间变异系数(板间CV,板间平行试验5板统计,下同)表征的重复性,结果,①~⑥之6个组别的板内CV分别为:2.53%、2.71%、2.04%、2.79%、2.42%、1.97%,①~⑥之6个组别的板间CV分别为:3.84%、2.77%、3.43%、4.87%、4.06%、4.24%;各组均显示出优良的测定结果重复性。然而已经发现,当未使上述附加液与血清预混合时,TNF-αELISA测试对于给予热淋清动物血清呈现CV显著变差的结果而不符合一般ELISA的测定要求,这种结果在下文实施例3等处得以呈现。需要说明的是,在本发明中使用其它ELISA试剂盒测定其它指标时未发现这种仅在热淋清动物血清中才呈现的TNF-α之CV结果差的现象。
实施例3:参考实施例1和实施例2,使用同样的TNF-αELISA试剂盒检测大鼠混合血清X在同样方法中的板内和板间变异系数,不同的仅是实施例2之步骤“b.待测样品配制和加样”中所用附加液是含有1.25%甘氨酸的水溶液;结果,①~⑥之6个组别的板内CV分别为:3.04%、2.98%、3.18%、13.72%、11.24%、9.86%,①~⑥之6个组别的板间CV分别为:3.53%、3.14%、3.84%、15.06%、11.85%、12.71%,显示给予热淋清的大鼠血清在此ELISA法中CV表征的重复性不理想。
实施例4:参考实施例1和实施例2,使用同样的TNF-αELISA试剂盒检测大鼠混合血清X在同样方法中的板内和板间变异系数,不同的仅是实施例2之步骤“b.待测样品配制和加样”中所用附加液是含有0.25%氯化锌的水溶液;结果,①~⑥之6个组别的板内CV分别为:3.02%、3.27%、2.96%、10.84%、9.98%、9.67%,①~⑥之6个组别的板间CV分别为:3.37%、3.84%、3.51%、14.46%、12.24%、10.86%,显示给予热淋清的大鼠血清在此ELISA法中CV表征的重复性不理想。
实施例5:参考实施例1和实施例2,使用同样的TNF-αELISA试剂盒检测大鼠混合血清X在同样方法中的板内和板间变异系数,不同的仅是步骤“b.待测样品配制和加样”中混合血清X直接测定而不与附加液混合;结果,①~⑥之6个组别的板内CV分别为:3.51%、3.12%、3.06%、14.42%、13.13%、11.24%,①~⑥之6个组别的板间CV分别为:3.84%、3.36%、3.11%、15.57%、14.41%、11.05%,显示给予热淋清的大鼠血清在此ELISA法中CV表征的重复性不理想。
实施例6:热淋清颗粒治疗脓毒症的效果
本发明实施例1考察并显示了热淋清颗粒对相关疾病的优良治疗效果,本实施例6对这种治疗效果作拓展性研究。
本实施例6是在实施例1试验中平行执行并增加的试验组(这些试验组未记载在实施例1中,而是在本实施例6进行补充说明),即增加以下编号为的⑦和⑧的2个热淋清颗粒试验组:
⑦热淋清颗粒中剂量组:热淋清颗粒2.4g/kg+葡萄糖酸亚铁50mg/kg,
⑧热淋清颗粒低剂量组:热淋清颗粒1.2g/kg+葡萄糖酸亚铁25mg/kg。
试验所用葡萄糖酸亚铁为国药准字H41023259的片剂(康诺药业),试验时药品在有效期内,葡萄糖酸亚铁片与热淋清颗粒一起按比例混配制成给药的药液。
⑦组和⑧组的结果参见实施例1所记载的。另外在实施例2测定TNF-α时,⑦组和⑧组的板内CV分别为2.67%和2.26%、板间CV分别为4.17%和3.94%,显示呈现优良的方法学特征。
本实施例结果表明通过使热淋清颗粒/葡萄糖酸亚铁以2.4g/50mg比例组合给药时,葡萄糖酸亚铁能够提高热淋清颗粒的治疗效果,特别是以TNF-α血清浓度表征的治疗效果。
因此,在本发明任一方面的任一实施方案中,在给生物体施用热淋清颗粒的同时还施用葡萄糖酸亚铁,热淋清颗粒和葡萄糖酸亚铁的重量比为48~52:1例如重量比为48:1;例如,在本发明的制药用途方面,用于治疗相应疾病的药物中还包含上述比例量的葡萄糖酸亚铁。
头花蓼是热淋清颗粒的主要原料,为蓼科植物头花蓼的全草,文献记载其味苦辛,性温平,清热解毒治热淋[广西壮族自治区革命委员会卫生管理服务站编.广西中草药,第2册[M].南宁:广西人民出版社.1970]。目前对热淋清颗粒的研究主要集中于其对泌尿系统感染等,大量的动物实验及临床研究已证明热淋清颗粒疗效显著并成为临床治疗泌尿系统感染的首选药之一。现代研究发现其对胃炎、肾炎等多种炎症也有一定的治疗作用,而炎症多会引起机体发热的症状。中医认为,发热是外邪入侵后、邪气与正气相争的结果,多用清上焦蕴热药物缓解机体发热。治疗下焦热淋症的中药多具有“清上达下”的作用[康开彪,柳树英,李淑玲,等.王自立教授运用清上达下法辨治热淋经验[J].西部中医药,2021,34(02):62-63],因此推测热淋清颗粒具有清上焦蕴热的作用。2020年热淋清颗粒已被贵州省中医药管理局纳入《贵州省新冠肺炎中医康复方案》中,因此本课题组拟观察热淋清颗粒的解热作用探讨其作用机理,为临床提供更多选择。
脓毒症是感染反应失调导致的器官功能障碍综合征,具多种复杂病理生理反应,包括多个途径的激活和改变,如促炎途径、先天性免疫途径、适应性免疫途径等[PrescottH C,Angus D C.Enhancing recovery from sepsis:A Review[J].JAMA,2018,319(1):62-75;程燕,陈志明,李莉,等.黄芪多糖对脓毒症大鼠心脏功能及炎症因子水平的影响[J].浙江中医药大学学报,2018,42(5):354-359]。脓毒症病程中机体炎症细胞因子相互作用,释放TNF-α等多种炎症相关细胞因子。TNF-α在脓毒症发展起主要作用,能够刺激IL-1α、PGE2等炎症因子的分泌和释放,诱发炎症级联反应,引起急性肺损伤,加重患者病情,甚至导致患者死亡[孙鹏,陈敏,张细六,等.虎杖苷通过调控HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路对脓毒症急性肺损伤的保护作用[J].浙江中医药大学学报,2021,45(07):691-699;Sinha P,DelucchiK L,Thompson B T,et al.Latent classanalysis of ARDS subphenotypes:A secondaryanalysis of the statins for acutely injured lungs from sepsis(SAILS)study[J].Intensive Care Med,2018,44(11):1859-1869;占利民,方林森,胡德林,等.脓毒症相关性急性肺损伤发病机制研究进展[J].安徽医药,2010,14(06):722-723]。研究表明调节TLR4/MyD88/NF-κB p65信号通路可减轻大鼠脓毒症急性肺损伤反应[黄晗,李凤芝,李杨,等.灵芝多糖对脓毒症急性肺损伤大鼠肺功能及TLR4/NF-κB通路的影响[J].中草药,2021,52(08):2351-2356]。TLR4/MyD88/NF-κB p65信号通路广泛存在于各种组织细胞中,参与多种疾病的发生与调控。TLR4是最早被人们发现且研究最为广泛的TLR家族成员,在脓毒症的发病机制中扮演着重要的角色,其结构包括胞外结构域、单个跨膜结构域和胞内结构域。MyD88在TLR4/MyD88/NF-κB p65信号通路中信号传导作用显著。NF-κB在炎症反应中是负责调节先天性和适应性免疫应答的主要转录因子,其可被炎症因子激活,促进炎症的发生。通过盲肠结扎穿孔法建立脓毒症急性肺损伤模型,大鼠盲肠内细菌扩散激活TLR4,TLR4激活后招募含IL受体相关蛋白-1等相关接头分子,启动下游通路,进而激活NF-κB,引起多种促炎细胞因子的上调(如TNF-α、PGE2等),促进机体炎症的的发生。大量促炎细胞因子随机体循环运输到肺组织,趋化更多炎症细胞造成脓毒症急性肺损伤。因此抑制TLR4/MyD88/NF-κB p65信号通路的激活,降低促炎因子和炎症介质的表达量是保护脓毒症急性肺损伤的重要途径。
脓毒症在传统中医理论体系中并无相应病名,现代中医研究认为脓毒症是由外来之毒扰乱机体正常代谢及功能,入里化热,变生热毒,属中医学“温病”“热病”的范畴[王西墨,余剑波,金胜威.脓毒症肺损伤中西医结合诊治专家共识[J].中国中西医结合外科杂志,2020,26(03):400-408]。中医以清热凉营、活血益气、通腑泻肺等方法对脓毒症急性肺损伤进行治疗,用药以清热解毒、益气活血类为主[刘清泉.对脓毒症中医病机特点及治法的认识[J].北京中医,2007(04):198-200]。热淋清颗粒是以头花蓼为原料的单方制剂,具清热解毒,利尿通淋,活血止痛等功效。现代药理研究结果表明,热淋清颗粒的主要成分头花蓼及其提取物有抗菌、抗炎、抗氧化、解热镇痛等多种生理活性[吕炎唏,王隶书,程东岩,等.中药头花蓼的化学成分和药理作用研究概况[J].中国药师,2017,20(10):1849-1853],临床多用于治疗尿路感染、肾盂肾炎等症,且有相关实研究表明头花蓼抗炎作用机制可能与其降低TNF-α、IL-6等炎症细胞因子水平有关[张伟,余珊珊,陈爱明.头花蓼治疗变应性接触性皮炎小鼠的疗效及作用机制探讨[J].现代中西医结合杂志,2015,24(18):1958-1960+1963]。本实验采用盲肠结扎穿孔法制备脓毒症急性肺损伤模型,通过热淋清颗粒干预治疗,观察其减轻脓毒症大鼠急性肺损伤的作用机制。结果显示,热淋清颗粒可显著降低肺组织湿/干重比,修复脓毒症急性肺损伤大鼠的肺组织病理学改变,降低血清TNF-α、IL-1α、PGE2水平和肺组织中TLR4、MyD88、NF-kB mRNA及蛋白的表达量。
综上所述,热淋清颗粒具有减轻脓毒症大鼠急性肺损伤反应、保护肺功能的作用,其机制可能与抑制大鼠肺组织中炎症反应的发生和调节TLR4/MyD88/NF-κB p65通路有关,本实验研究为热淋清颗粒临床治疗脓毒症急性肺损伤提供实验依据。
概要地说,本发明从实验的角度探讨了热淋清颗粒对脓毒症急性肺损伤模型大鼠的保护作用及其机制。具体方法是,将SD大鼠随机分为6组:假手术组、模型组、热淋清颗粒高剂量组[4.8g/(kg·d)]、热淋清颗粒中剂量组[2.4g/(kg·d)]、热淋清颗粒低剂量组[1.2g/(kg·d)]、阳性对照组[地塞米松1.5mg/(kg·d)],每组10只。各组均采用灌胃给药,1次/d,连续给药7d,末次给药后各组大鼠均采用盲肠结扎穿孔法制备脓毒症急性肺损伤模型(假手术组不结扎和穿孔),造模24h后取材。取各组大鼠右肺中叶计算肺组织湿/干重比;采用HE染色法观察各组大鼠肺组织病理学改变并进行损伤评分;采用ELISA法检测各组大鼠血清中IL-1α、TNF-α、PGE2水平含量;采用RT-PCR法检测各组大鼠肺组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA相对表达量;采用Western-Blot检测各组大鼠肺组织中TLR4、MyD88、NF-κBp65蛋白相对表达量。结果显示:与假手术组比较,模型组大鼠肺组织湿/干重比、肺组织病理损伤评分显著升高(P<0.01);与模型组比较,热淋清颗粒高剂量组和阳性对照组可显著降低大鼠肺组织湿/干重比、肺组织病理损伤(P<0.05);与假手术组比较,模型组大鼠血清TNF-α、IL-1α、PGE2水平及肺组织TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA和蛋白表达量均显著升高(P<0.01);与模型组比较,热淋清颗粒高、中剂量组和阳性对照组大鼠血清TNF-α、IL-1α、PGE2水平及肺组织TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA和蛋白表达量显著降低(P<0.05);热淋清颗粒高剂量组上述各指标改善情况优于阳性对照组。从本文结果可见,热淋清颗粒能减轻脓毒症大鼠急性肺损伤,其机制可能与调节TLR4/MyD88/NF-κBp65通路有关。上述结果表明使用热淋清颗粒治疗脓毒症是有效的。
本文中所举的实施例仅用以说明本发明的组成及功效,并非因此局限本发明的专利范围,故对于本领域的技术人员来说,在不脱离本发明结构的前提下,还可以作出类似修改,均隶属于本发明的专利范畴。这些也应该视为本发明的保护范围,这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。
Claims (3)
1.热淋清颗粒在制备用于减轻脓毒症动物急性肺损伤的药物中的用途,其特征在于:所述热淋清颗粒是以头花蓼即Polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D.Don为原料制成的颗粒剂。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述颗粒剂能够抑制脓毒症动物急性肺损伤模型动物血清TNF-α浓度升高。
3.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述颗粒剂是按照如下方法制备得到的:取头花蓼1250g,加水煎煮二次,每次1.5小时,煎液滤过,滤液合并,浓缩至适量,滤过,喷雾干燥,与适量的可溶性淀粉混匀,制成颗粒,干燥,制成500g,即得。
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