CN115607691B - 具有优良解热作用的热淋清颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有优良解热作用的热淋清颗粒，其是以头花蓼(Polygonum capitatum Buch.‑Ham.ex D.Don)为原料制成的颗粒剂，其能够抑制生物体温异常上升、抑制生物体血清TNF‑α浓度升高、抑制生物体下丘脑cAMP浓度升高，以及能够抑制生物体下丘脑PGE2浓度升高。本发明还涉及所述热淋清颗粒在制备用于解热的药物中的用途。本发明还涉及测定热淋清颗粒的解热作用的方法，其包括给动物灌胃给予热淋清颗粒，测定动物的AVP浓度和TNF‑α浓度以及PGE2浓度和cAMP浓度。本发明热淋清颗粒具有优良的解热效果。

Description

具有优良解热作用的热淋清颗粒
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种中药制剂，尤其涉及一种以植物药材头花蓼制成的中药制剂热淋清颗粒，还涉及该中药制剂的制备方法以及它们的制药用途，尤其是，本发明涉及热淋清颗粒在制备用于解热作用的药物中的用途。
背景技术
发热是外源性热源进入机体后，作用于淋巴细胞、巨噬细胞等免疫相关细胞，使其产生内生热源，该物质可作用于中枢介质进而作用于体温调节中枢，从而引起体温升高，造成机体发热[娄东晓，严冬，郭敏，等.毛萼香茶菜醇提物对干酵母致热大鼠解热机制研究[J].中国药科大学学报，2019，50(01)：87-92]。
热淋清颗粒是以贵州民族特色药头花蓼(Polygonum capitatum Buch.-Ham.exD.Don)为原料的单方制剂，其具有清热泻火，利尿通淋的功效；可用于治疗下焦湿热所致的热淋，症见尿频、尿急、尿痛；尿路感染、肾盂肾炎见上述证候者，临床上常用于治疗湿热蕴结下焦，机体气化不利所致诸症[梁斌，张丽艳，冉懋雄.中国苗药头花蓼[M].北京：中国中医药出版社，2014；王重洋，潘舒，吴亚利，等.热淋清颗粒药理作用实验研究[J].实用中医内科杂志，2012，26(03)：12-14；南海峰，刘杰，吴丹，等.热淋清颗粒配合常规抗生素治疗淋病的临床效果及对血清炎症介质表达的影响[J].世界中西医结合杂志，2021，16(06)：1103-1107；国家药典委员会.中华人民共和国药典2020年版(一部)[S].北京：中国医药科技出版社，2020]。
现代药理研究发现热淋清颗粒可对胃炎、肾炎、前列腺炎等多种炎症均有一定的治疗作用，而炎症反应多会引起机体不同程度的发热。中医认为发热是外邪入侵机体后，邪气与正气相争的结果，最早记载于《黄帝内经》，谓之“身热”，多属温病范畴[李应超.中医对发热的辨别与治疗[J].中医杂志，2010，51(S1)：125-126；窦晓鑫，杨玉莹，卜志超，等.试从中医角度认识2019新型冠状病毒肺炎[J].天津中医药，2020，37(02)：137-140]。
药理学研究中，目前常用的发热模型造模药物主要为2，4-二硝基酚、干酵母等[左泽平，王志斌，郭玉东，等.常用大鼠发热模型研究[J].中国比较医学杂志，2012，22(02)：52-57]。2，4-二硝基酚所致发热模型致热时间较短(3-5h)，而颈背部皮下注射干酵母混悬液造模稳定，持续时间长(20h)，是检验中药及其制剂解热作用最常使用的模型。
颈背部皮下注射干酵母混悬液的方法诱导大鼠发热模型[吴佳霖，吕邵娃，孙亚丽，等.白虎汤对不同大鼠发热模型解热机制的研究[J].中南药学，2018，16(04)：492-495；李欣芮，宋惠欣.发热模型的研究进展[J].云南中医中药杂志，2015，36(04)：77-79]是一种优良的药理试验模型。然而该模型是否适用于研究热淋清颗粒解热效果，目前尚无业界尝试。
因此，本领域技术人员期待提供一种测定热淋清颗粒的解热作用的方法，和/或还期待提供一种热淋清颗粒，和/或还期待提供热淋清颗粒在制备具有解热作用的药物中的用途。
发明内容
本发明的目的在于提供一种测定热淋清颗粒的解热作用的方法，和/或还期待提供一种热淋清颗粒，和/或还期待提供热淋清颗粒在制备具有解热作用的药物中的用途。本发明以热淋清颗粒为研究对象，研究其对干酵母致热大鼠模型的解热效果。已经出人意料地发现，通过使用本发明方法可以有效地测定热淋清颗粒的解热作用。本发明基于此类发现而得以完成。
为此，本发明第一方面提供了一种测定热淋清颗粒的解热作用(指标)的方法，或者通过测定血清TNF-α浓度考察热淋清颗粒解热作用的方法，其包括如下步骤：
通过给动物皮下注射干酵母制作发热模型后，给动物灌胃给予热淋清颗粒，然后记录动物体温、采集动物动脉血并测定血中的AVP浓度和TNF-α浓度、采集动物下丘脑并测定其中的PGE2浓度和cAMP浓度，对所得体温和浓度的结果进行统计学处理。
根据本发明第一方面的方法，其中所述热淋清颗粒能够抑制生物体温异常上升例如能够抑制干酵母致热模型动物体温上升。
根据本发明第一方面的方法，其中所述热淋清颗粒能够抑制生物体血清TNF-α浓度升高例如能够抑制干酵母致热模型动物血清TNF-α浓度升高。
根据本发明第一方面的方法，其中所述热淋清颗粒能够抑制生物体下丘脑cAMP浓度升高例如能够抑制干酵母致热模型动物下丘脑cAMP浓度升高。
根据本发明第一方面的方法，其中所述热淋清颗粒能够抑制生物体下丘脑PGE2浓度升高例如能够抑制干酵母致热模型动物下丘脑PGE2浓度升高。
根据本发明第一方面的方法，其中所述动物是SD大鼠。
根据本发明第一方面的方法，其中皮下注射15％干酵母(5mL/kg)制作发热模型。
根据本发明第一方面的方法，其中造模4h后灌胃给予热淋清颗粒。
根据本发明第一方面的方法，热淋清颗粒用水混悬/溶解后灌胃给予动物。
根据本发明第一方面的方法，给药后4h记录体温；然后大鼠麻醉、采集动脉血和下丘脑。
根据本发明第一方面的方法，采集的动脉血照如下方式处理：血液于室温处自然凝固30分钟，1000xg离心15分钟左右，收集血清上清，4℃保存待测。
根据本发明第一方面的方法，其包括如下步骤：
(1)热淋清颗粒混悬液的制备：将适量热淋清颗粒置于研钵中研磨，精准称取研磨后粉末24.0g，于50mL容量瓶中用水定容备用；精准称取研磨后粉末12.0g，于50mL容量瓶中用水定容备用；精准称取研磨后粉末6.0g，于50mL容量瓶中用水定容备用；
(2)试验分组、造模、给药：随机选取SD大鼠60只，雌雄各半，适应性喂养7d；实验当日每30min测量一次体温，共3次，取平均值作为基础体温；
随机将60只大鼠平均分为6组，即：正常组、模型对照组、阳性对照组、热淋清颗粒高剂量组、热淋清颗粒中剂量组、热淋清颗粒低剂量组；
除正常组皮下注射生理盐水(5mL/kg)，其余各组均皮下注射15％干酵母(5mL/kg)制作发热模型；
造模4h后，对热淋清颗粒高、中、低剂量组分别灌胃4.8g/kg、2.4g/kg、1.2g/kg热淋清颗粒，阳性对照组灌胃0.1g/kg对乙酰氨基酚，模型对照组和正常组均灌胃等体积生理盐水。
(3)检测和数据处理：给药后4h记录体温；然后将各组大鼠麻醉，腹主动脉取血，血液于室温处自然凝固30分钟，1000xg离心15分钟左右，收集血清上清，4℃保存待测；实验大鼠取血后，颈部脱臼处死，冰浴条件下迅速取出大鼠下丘脑，存放于-80℃冰箱内保存待测；按照ELISA试剂盒说明书对大鼠血清进行AVP和TNF-α指标检测，对大鼠下丘脑进行PGE2、cAMP指标检测；使用统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差表示，各组数据采用方差分析，以P<0.05判定结果具有统计学差异。
根据本发明第一方面的方法，其包括如下步骤：
(1)热淋清颗粒混悬液的制备：将适量热淋清颗粒置于研钵中研磨，精准称取研磨后粉末24.0g，于50mL容量瓶中用水定容备用；精准称取研磨后粉末12.0g，于50mL容量瓶中用水定容备用；精准称取研磨后粉末6.0g，于50mL容量瓶中用水定容备用。
(2)试验分组、造模、给药：随机选取SD大鼠60只，雌雄各半，适应性喂养7d，实验室环境：25±2℃，相对湿度50±5％；实验当日每30min测量一次体温，共3次，取平均值作为基础体温；
随机将60只大鼠平均分为6组，即：正常组、模型对照组、阳性对照组、热淋清颗粒高剂量组、热淋清颗粒中剂量组、热淋清颗粒低剂量组；
除正常组皮下注射生理盐水5mL/kg，其余各组均皮下注射15％干酵母(5mL/kg)制作发热模型；
造模4h后，每只鼠体温均升高至少0.8℃，对热淋清颗粒高、中、低剂量组分别灌胃4.8g/kg、2.4g/kg、1.2g/kg热淋清颗粒，阳性对照组灌胃0.1g/kg对乙酰氨基酚，模型对照组和正常组均灌胃等体积生理盐水。
(3)检测和数据处理：给药后4h记录体温；然后将各组大鼠麻醉，腹主动脉取血，血液于室温处自然凝固30分钟，1000xg离心15分钟左右，收集血清上清，4℃保存待测；实验大鼠取血后，颈部脱臼处死，冰浴条件下迅速取出大鼠下丘脑，存放于-80℃冰箱内保存待测；按照ELISA试剂盒说明书对大鼠血清进行AVP和TNF-α指标检测，对大鼠下丘脑进行PGE2、cAMP指标检测；使用(SPSS26.0)统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差表示，各组数据采用方差分析，以P<0.05判定结果具有统计学差异。
根据本发明第一方面的方法，其中使用TNF-αELISA试剂盒测定TNF-α浓度，包括如下步骤：
a.标准品的稀释和加样：取小试管6支，依次编号，先在各小试管中加入标准品稀释液100μl，然后取原浓度标准品100μl加至第一支试管中，充分混匀；再在该试管中取100μl加至第二支试管中，充分混匀；再在该试管中取100μl加至第三支试管中，充分混匀；再在该试管中取100μl加至第四支试管中，充分混匀；再在该试管中取100μl加至第五支试管中，充分混匀；然后在该试管中取100μl，弃掉；第六只试管作为0号标准品，稀释后各管浓度分别是：640pg/ml、320pg/ml、160pg/ml、80pg/ml、40pg/ml、0pg/ml；在酶标板上设标准品孔，依次加入不同浓度的标准品50μl，每个浓度做5个平行孔；
b.待测样品配制和加样：用采血管收集血液，血液于室温处自然凝固30分钟，1000xg离心15分钟左右，收集上清(血清)，将该上清与附加液以体积比9：1混合均匀，得到血清待测样品；分别设置待测样品孔、空白对照孔(空白对照孔不加样品、酶标试剂及生物素标记的抗TNF-α抗体，其余各步操作与待测样品孔相同)；在酶标板上待测样品孔中先加样品40μl，然后再加生物素标记的抗TNF-α抗体10μl；加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；所述附加液是含有1.2％甘氨酸和0.25％氯化锌的水溶液；
c.温育：每孔加入酶标试剂50μl，空白对照孔除外；用封板膜封板后将酶标板置37℃温育30分钟；
d.洗涤：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释30倍得到洗涤液；小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
d.显色：每孔先加入50μl显色剂A，再加入50μl显色剂B，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟；接着每孔加终止液50μl以终止反应，此时蓝色转为黄色；
e.测定和计算：在加终止液后15分钟以内，以空白对照孔调零，用酶标仪在450nm波长下依序测量各孔的吸光度OD值；用标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的线性回归方程，用样品OD值算得样品浓度。
根据本发明第一方面的方法，其中所用各种材料为常规材料。
根据本发明第一方面的方法，其中所用ELISA试剂盒如实施例中述。
进一步的，本发明第二方面涉及一种热淋清颗粒，其是以头花蓼(Polygonumcapitatum Buch.-Ham.ex D.Don)为原料制成的颗粒剂。
根据本发明第二方面的热淋清颗粒，其中所述热淋清颗粒能够抑制生物体温异常上升例如能够抑制干酵母致热模型动物体温上升。
根据本发明第二方面的热淋清颗粒，其中所述热淋清颗粒能够抑制生物体血清TNF-α浓度升高例如能够抑制干酵母致热模型动物血清TNF-α浓度升高。
根据本发明第二方面的热淋清颗粒，其中所述热淋清颗粒能够抑制生物体下丘脑cAMP浓度升高例如能够抑制干酵母致热模型动物下丘脑cAMP浓度升高。
根据本发明第二方面的热淋清颗粒，其中所述热淋清颗粒能够抑制生物体下丘脑PGE2浓度升高例如能够抑制干酵母致热模型动物下丘脑PGE2浓度升高。
根据本发明第二方面的热淋清颗粒，其是按照如下方法制备得到的：取头花蓼1250g，加水煎煮二次，每次1.5小时，煎液滤过，滤液合并，浓缩至适量，滤过，喷雾干燥，与适量的可溶性淀粉混匀，制成颗粒，干燥，制成500g，即得
进一步的，本发明第三方面涉及一种具有解热作用的热淋清颗粒，其如本发明第二方面任一项所述。
进一步的，本发明第四方面涉及本发明第二方面任一项所述热淋清颗粒在制备用于解热的药物中的用途。
本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
头花蓼(Polygonum capitatum Buch-Ham ex D.Don)为蓼科蓼属多年生草本植物。具有清热利湿、利尿通淋之功效，在临床上治疗泌尿系统感染有着显著的效果。以其为原料制成的中成药制剂“热淋清颗粒”2004年进入国家基本医疗保险目录，2012年进入贵州省基本药物目录。
头花蓼是少数民族地区的常用药，主要用于肾盂肾炎、尿道感染、利尿通淋等症。相关的药理学研究少见，目前仅有任光友等几篇报道。任光友采用大鼠细菌性肾盂肾炎模型进行实验，结果头花蓼水提取物组大鼠尿液中的WBC和BLD与对照组比较明显减少，显示头花蓼水提物对肾盂肾炎具有一定的抗炎作用。任光友等以小鼠腹腔注射大肠杆菌菌液观察5天内小鼠死亡情况，结果对照组死亡率为100％，头花蓼组死亡率分别为20％和50％，显示头花蓼水提物能够对抗大肠杆菌引起的感染。任光友等以头花蓼水提物灌胃给药予家兔，结果，头花蓼水提物组与对照组比较，体温无显著性差异，但能降低静脉注射伤寒副伤寒菌苗引起的家兔的发热体温。任光友等，以头花蓼水提物分别灌胃给药家兔、大鼠，与空白组和速尿对照组比较尿量。结果显示头花蓼水提物对家兔和大鼠无明显利尿作用。徐英春等人采用琼脂稀释法检测了头花蓼对10株淋病奈瑟球菌(淋球菌)的体外抑菌活性，结果头花蓼对淋球菌有抑菌活性。其对10株淋球菌的最小抑菌浓度范围为8～32g/L，平均值为11.2g/L。
本发明方法能够呈现一种或多种优异效果。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原材料均为市售商品。
在本发明中，如未另外说明，所用热淋清颗粒是按照如下方法制备得到的：取头花蓼1250g，加水煎煮二次，每次1.5小时，煎液滤过，滤液合并，浓缩至适量，滤过，喷雾干燥，与适量的可溶性淀粉混匀，制成颗粒，干燥，制成500g，即得。当然，本发明也可使用含糖型的热淋清颗粒。这些热淋清颗粒符合2020年版中国药典一部所载同名品种的规定。
实施例1：测定热淋清颗粒对干酵母致热大鼠的解热作用
1.实验材料
(1)实验动物：
健康SPF级SD大鼠，雌雄各半，体重(200±20)g，购于长沙市天勤生物技术有限公司，许可证号：SCXK(湘)2019-0014。
(2)药物：
热淋清颗粒(贵州威门药业股份有限公司，批号：210602)、对乙酰氨基酚(特一药业集团股份有限公司，批号：32210507)、干酵母粉(安琪酵母股份有限公司，批号：D33F1)
(3)主要试剂与仪器：
TNF-αELISA试剂盒(Bioswamp，货号/批号：RA20035/20211210)，
AVP ELISA试剂盒(Bioswamp，货号/批号：RA20797/20211210)，
PGE2 ELISA试剂盒(Bioswamp，货号/批号：RA20013/20211210)，
cAMP ELISA试剂盒(Bioswamp，货号/批号：RA20134/20211210)，
甘油(Solarbio，货号/批号：306D039)；
自动酶标仪(BIOBASE，型号：EL10A)，
电子温度计(界面医疗器械有限公司，型号：PL-500)，
离心机(THERMO，型号：ST 16R)，
立式超低冰箱(海尔，型号：DW-86L386)。
2.实验方法
(1)实验药物的制备
热淋清颗粒混悬液的制备：将适量热淋清颗粒置于研钵中研磨，精准称取研磨后粉末24.0g，于50mL容量瓶中用水定容备用(0.48g/mL)；精准称取研磨后粉末12.0g，于50mL容量瓶中用水定容备用(0.24g/mL)；精准称取研磨后粉末6.0g，于50mL容量瓶中用水定容备用(0.12g/mL)。
(2)试验分组、造模、给药
随机选取SD大鼠60只，雌雄各半，适应性喂养7d(实验室环境：25±2℃，相对湿度50±5％)。实验当日每30min测量一次体温，共3次，取平均值作为基础体温；
随机将60只大鼠平均分为6组，即：正常组、模型对照组、阳性对照组、热淋清颗粒高剂量组、热淋清颗粒中剂量组、热淋清颗粒低剂量组；
除正常组皮下注射生理盐水(5mL/kg)，其余各组均皮下注射15％干酵母(5mL/kg)制作发热模型；
造模4h后(此时每只鼠体温均升高至少0.8℃)，对热淋清颗粒高、中、低剂量组分别灌胃4.8g/kg、2.4g/kg、1.2g/kg热淋清颗粒，阳性对照组灌胃0.1g/kg对乙酰氨基酚，模型对照组和正常组均灌胃等体积生理盐水。
(3)检测和数据处理
给药后4h记录体温；
然后将各组大鼠麻醉，腹主动脉取血，血液于室温处自然凝固30分钟，1000xg离心15分钟左右，收集血清上清，4℃保存待测；
实验大鼠取血后，颈部脱臼处死，冰浴条件下迅速取出大鼠下丘脑，存放于-80℃冰箱内保存待测；
按照ELISA试剂盒说明书对大鼠血清进行AVP指标检测，对大鼠下丘脑进行PGE2、cAMP指标检测；另外按照实施例2的方法对大鼠血清进行TNF-α指标检测；
使用(SPSS26.0)统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差(X±s)表示，各组数据采用方差分析，以P<0.05判定结果具有统计学差异；
根据上述检测数据获得热淋清颗粒对干酵母致热大鼠的解热作用的统计学结果。
3.实验结果
(1)热淋清颗粒对干酵母致热模型大鼠血清AVP、TNF-α水平的影响
血清ELISA结果显示：
与正常组比较，模型组大鼠AVP、TNF-α水平显著升高(P<0.01)；
与模型组比较，热淋清高、中剂量组大鼠AVP水平显著升高(P<0.01)、TNF-α水平显著下降(P<0.01)，且与热淋清剂量密切相关；
阳性对照组亦可降低大鼠血清TNF-α水平。见表1。
表1：热淋清颗粒对干酵母致热模型大鼠血清AVP、TNF-α水平的影响
组别 AVP/(μg/L) TNF-α/(ng/L)
①正常组 820.49±85.05 58.47±5.23
②模型组 1099.27±62.57** 85.86±4.75**
③阳性对照组 1052.80±41.81 61.84±4.77##
④热淋清颗粒高剂量组 1466.59±160.38## 64.49±8.82##
⑤热淋清颗粒中剂量组 1290.38±135.19## 73.94±6.70##
⑥热淋清颗粒低剂量组 1138.72±113.70 76.56±8.35#
⑦组 1347.32±147.72## 62.36±7.63##
⑧组 1264.53±125.33## 66.74±8.97##
注：与正常组比较：**P<0.01，*P<0.05；与模型组比较：##P<0.01，#P<0.05；
(2)热淋清颗粒对干酵母致热模型大鼠下丘脑cAMP、PGE2含量的影响
下丘脑ELISA结果显示：
与正常组比较，模型组大鼠下丘脑cAMP、PGE2含量显著升高(P<0.01)；
与模型组比较，热淋清高、中、低剂量组和阳性对照组cAMP、PGE2含量显著下降(P<0.01)，且与热淋清剂量密切相关。见表2。
表2：热淋清颗粒对干酵母致热模型大鼠下丘脑cAMP、PGE2含量的影响(X±s，n＝10)
注：与正常组比较：**P<0.01，*P<0.05；与模型组比较：##P<0.01，#P<0.05；
(3)热淋清颗粒对干酵母致热模型大鼠体温变化情况的影响
体温测定结果显示：
各组大鼠基础体温无显著差异(P>0.05)；
干酵母致热模型建立后，与正常组比较，模型组大鼠体温显著升高(P<0.01)；
与模型组比较，热淋清高、中、低剂量组及阳性对照组干酵母致热模型大鼠体温无显著差异(P>0.05)；
使用热淋清及阳性对照药物干预干酵母致热模型大鼠后，与正常组比较，模型组大鼠体温显著升高(P<0.01)，热淋清高、中剂量组和阳性对照组均可显著降低模型大鼠体温(P<0.01)，热淋清颗粒低剂量组亦可在一定程度降低模型大鼠体温(P<0.05)。见表3。
表3：热淋清颗粒对干酵母致热模型大鼠体温变化情况的影响
组别 基础体温/℃ 致热模型体温/℃ 用药后体温/℃
①正常组 37.42±0.20 37.73±0.25 37.64±0.24
②模型组 37.22±0.18 38.87±0.33** 39.50±0.23**
③阳性对照组 37.39±0.25 38.89±0.32 37.91±0.33##
④热淋清颗粒高剂量组 37.48±0.19 38.85±0.30 38.13±0.37##
⑤热淋清颗粒中剂量组 37.44±0.33 38.83±0.27 38.96±0.36##
⑥热淋清颗粒低剂量组 37.44±0.28 38.80±0.39 39.19±0.35#
⑦组 37.61±0.24 38.87±0.26 38.42±0.36##
⑧组 37.54±0.27 38.84±0.36 38.65±0.34##
注：与正常组比较：**P<0.01，*P<0.05；与模型组比较：##P<0.01，#P<0.05；
实施例2：使用TNF-αELISA试剂盒检测大鼠血清中的TNF-α浓度
本文所用TNF-αELISA试剂盒为市售的RA20035型大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒，该TNF-αELISA试剂盒可用于体外定量检测大鼠血清、血浆、组织、细胞上清及相关液体样本中肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量。TNF-αELISA试剂盒的特异性是可检测样本中的大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)，且与其它相关蛋白无明显交叉反应；TNF-αELISA试剂盒的重复性为，板内变异系数≤9％(通常板内变异系数≤3％是优选的)，板间变异系数≤11％(通常板间变异系数≤5％是优选的)，该试剂盒的检测范围为8pg/ml-640pg/ml，方法灵敏度≤1.6pg/ml。
TNF-αELISA试剂盒的实验原理为，应用双抗体夹心法测定标本中大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平；用纯化的大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入肿瘤坏死因子α(TNF-α)，再与HRP标记的肿瘤坏死因子α(TNF-α)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色；TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色；颜色的深浅和样品中的肿瘤坏死因子α(TNF-α)呈正相关；用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)浓度。
所述TNF-αELISA试剂盒组成如下：说明书1份、封板膜2片(96)、酶标板(96孔，12孔×8条)1×96、检测抗体(Detection Antibody，生物素标记的抗TNF-α抗体)1.5ml×1瓶、酶标试剂(Enzyme Reagent)6ml×1瓶、标准品(Standards，1280pg/ml)0.6ml×1瓶、标准品稀释液/测定稀释剂(Assay Diluent)2ml×1瓶、显色剂A液(Substrate Solution A)6ml×1瓶、显色剂B液(Substrate Solution B)6ml×1瓶、终止液(Stop Solution)6ml×1瓶、浓缩洗涤液(Wash Buffer)(20ml×30倍)×1瓶。
使用本文所述TNF-αELISA试剂盒处理样本有一般要求。对于血清而言：用采血管收集血液，血液于室温处自然凝固30分钟，1000xg离心15分钟左右，收集血清上清，4℃保存待测，或者分装后-20℃或-80℃保存；对于血浆而言：收集好的血浆根据要求选择EDTA或者柠檬酸钠作为抗凝剂，2-8℃1000xg离心15分钟左右，30分钟内收集好，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融；对于细胞上清及相关液体而言：收集好的样本离心后应尽快实验，或者分装后-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。
本实施例2使用TNF-αELISA试剂盒检测大鼠血清中的TNF-α浓度，操作步骤如下：
a.标准品的稀释和加样：取小试管6支，依次编号，先在各小试管中加入标准品稀释液100μl，然后取原浓度标准品100μl加至第一支试管中，充分混匀；再在该试管中取100μl加至第二支试管中，充分混匀；再在该试管中取100μl加至第三支试管中，充分混匀；再在该试管中取100μl加至第四支试管中，充分混匀；再在该试管中取100μl加至第五支试管中，充分混匀；然后在该试管中取100μl，弃掉；第六只试管作为0号标准品，稀释后各管浓度分别是：640pg/ml、320pg/ml、160pg/ml、80pg/ml、40pg/ml、0pg/ml；在酶标板上设标准品孔，依次加入不同浓度的标准品50μl，每个浓度做5个平行孔；
b.待测样品配制和加样：用采血管收集血液，血液于室温处自然凝固30分钟，1000xg离心15分钟左右，收集上清(血清)，将该上清与附加液以体积比9：1混合均匀，得到血清待测样品；分别设置待测样品孔、空白对照孔(空白对照孔不加样品、酶标试剂及生物素标记的抗TNF-α抗体，其余各步操作与待测样品孔相同)；在酶标板上待测样品孔中先加样品40μl，然后再加生物素标记的抗TNF-α抗体10μl；加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；所述附加液是含有1.2％甘氨酸和0.25％氯化锌的水溶液；
c.温育：每孔加入酶标试剂50μl，空白对照孔除外；用封板膜封板后将酶标板置37℃温育30分钟；
d.洗涤：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释30倍得到洗涤液；小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
d.显色：每孔先加入50μl显色剂A，再加入50μl显色剂B，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟；接着每孔加终止液50μl以终止反应，此时蓝色转为黄色；
e.测定和计算：在加终止液后15分钟以内，以空白对照孔调零，用酶标仪在450nm波长下依序测量各孔的吸光度OD值；用标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的线性回归方程，用样品OD值算得样品浓度。需要注意的是，计算血清样品中的TNF-α浓度时应考虑与附加液稀释的倍数。
使用本实施例2方法测定实施例1之干酵母致热模型大鼠血清TNF-α浓度的结果见上文表1(每组结果为10只动物的X±s结果)。另外，在以上表1使用实施例2方法测定TNF-α时，每个组别10只动物血清等比例混合得到混合血清(其在本文中可称为混合血清X)，以此混合血清使用实施例2方法TNF-αELISA试剂盒测定，以考察板内变异系数(板内CV，板内平行试验5道统计，下同)和板间变异系数(板间CV，板间平行试验5板统计，下同)表征的重复性，结果，①～⑥之6个组别的板内CV分别为：2.26％、1.86％、2.73％、2.86％、2.62％、2.58％，①～⑥之6个组别的板间CV分别为：3.41％、3.03％、2.86％、4.23％、3.94％、3.78％；各组均显示出优良的测定结果重复性。然而已经发现，当未使上述附加液与血清预混合时，TNF-αELISA测试对于给予热淋清动物血清呈现CV显著变差的结果而不符合一般ELISA的测定要求，这种结果在下文实施例3等处得以呈现。需要说明的是，在本发明中使用其它ELISA试剂盒测定其它指标时未发现这种仅在热淋清动物血清中才呈现的TNF-α之CV结果差的现象。
实施例3：参考实施例1和实施例2，使用同样的TNF-αELISA试剂盒检测大鼠混合血清X在同样方法中的板内和板间变异系数，不同的仅是步骤“b.待测样品配制和加样”中所用附加液是含有1.2％甘氨酸的水溶液；结果，①～⑥之6个组别的板内CV分别为：2.48％、2.73％、2.27％、12.21％、10.06％、8.74％，①～⑥之6个组别的板间CV分别为：3.17％、2.94％、3.03％、14.17％、11.42％、10.74％，显示给予热淋清的大鼠血清在此ELISA法中CV表征的重复性不理想。
实施例4：参考实施例1和实施例2，使用同样的TNF-αELISA试剂盒检测大鼠混合血清X在同样方法中的板内和板间变异系数，不同的仅是步骤“b.待测样品配制和加样”中所用附加液是含有0.25％氯化锌的水溶液；结果，①～⑥之6个组别的板内CV分别为：2.63％、2.35％、2.82％、11.27％、9.48％、8.56％，①～⑥之6个组别的板间CV分别为：3.52％、3.25％、3.62％、13.04％、10.73％、9.57％，显示给予热淋清的大鼠血清在此ELISA法中CV表征的重复性不理想。
实施例5：参考实施例1和实施例2，使用同样的TNF-αELISA试剂盒检测大鼠混合血清X在同样方法中的板内和板间变异系数，不同的仅是步骤“b.待测样品配制和加样”中混合血清X直接测定而不与附加液混合；结果，①～⑥之6个组别的板内CV分别为：2.72％、2.56％、2.48％、13.73％、11.84％、10.62％，①～⑥之6个组别的板间CV分别为：3.42％、3.47％、2.97％、15.68％、13.83％、12.17％，显示给予热淋清的大鼠血清在此ELISA法中CV表征的重复性不理想。
实施例6：热淋清颗粒解热的效果
本发明实施例1考察并显示了热淋清颗粒对解热的优良效果，本实施例6对这种治疗效果作拓展性研究。
本实施例6是在实施例1试验中平行执行并增加的试验组(这些试验组未记载在实施例1中，而是在本实施例6进行补充说明)，即增加以下编号为的⑦和⑧的2个热淋清颗粒试验组：
⑦热淋清颗粒中剂量组：热淋清颗粒2.4g/kg+葡萄糖酸亚铁48mg/kg，
⑧热淋清颗粒低剂量组：热淋清颗粒1.2g/kg+葡萄糖酸亚铁23mg/kg。
试验所用葡萄糖酸亚铁为国药准字H41023259的片剂(康诺药业)，试验时药品在有效期内，葡萄糖酸亚铁片与热淋清颗粒一起按比例混配制成给药的药液。
⑦组和⑧组的结果参见实施例1所记载的。另外在实施例2测定TNF-α时，⑦组和⑧组的板内CV分别为2.93％和2.42％、板间CV分别为4.03％和3.82％，显示呈现优良的方法学特征。
本实施例结果表明通过使热淋清颗粒/葡萄糖酸亚铁以2.4g/48mg比例组合给药时，葡萄糖酸亚铁能够提高热淋清颗粒的治疗效果，特别是以TNF-α血清浓度表征的治疗效果。
因此，在本发明任一方面的任一实施方案中，在给生物体施用热淋清颗粒的同时还施用葡萄糖酸亚铁，热淋清颗粒和葡萄糖酸亚铁的重量比为48～52：1例如重量比为50：1；例如，在本发明的制药用途方面，用于治疗相应疾病的药物中还包含上述比例量的葡萄糖酸亚铁。
头花蓼是热淋清颗粒的主要原料，为蓼科植物头花蓼的全草，文献记载其味苦辛，性温平，清热解毒治热淋[广西壮族自治区革命委员会卫生管理服务站编.广西中草药，第2册[M].南宁：广西人民出版社.1970]。目前对热淋清颗粒的研究主要集中于其对泌尿系统感染等，大量的动物实验及临床研究已证明热淋清颗粒疗效显著并成为临床治疗泌尿系统感染的首选药之一。现代研究发现其对胃炎、肾炎等多种炎症也有一定的治疗作用，而炎症多会引起机体发热的症状。中医认为，发热是外邪入侵后、邪气与正气相争的结果，多用清上焦蕴热药物缓解机体发热。治疗下焦热淋症的中药多具有“清上达下”的作用[康开彪，柳树英，李淑玲，等.王自立教授运用清上达下法辨治热淋经验[J].西部中医药，2021，34(02)：62-63]，因此推测热淋清颗粒具有清上焦蕴热的作用。2020年热淋清颗粒已被贵州省中医药管理局纳入《贵州省新冠肺炎中医康复方案》中，因此本课题组拟观察热淋清颗粒的解热作用探讨其作用机理，为临床提供更多选择。
发热是机体在外源性物质刺激下产生内生热源，如：肿瘤坏死因子(TNF-α)，导致中枢体温调节介质失衡。环磷酸腺苷(cAMP)和前列腺素E2(PGE2)均为体温正调节介质，精氨酸加压素(AVP)为体温负调节介质，当体温负调节介质降低与/或体温正调节介质升高时，机体即出现发热症状[姚锐，王常明，张璇，等.大黄水煎液对干酵母致热大鼠“泄热”的机制研究[J].时珍国医国药，2021，32(09)：2058-2060]。
TNF-α等促炎因子通过多种不同途径富集于体温调节中枢，提高机体体温调控点，造成机体体温异常升高，使机体发生炎性反应，是重要的内生热源[曹峰，唐阿梅.不同柴胡剂量小柴胡汤对LPS诱导发热大鼠模型体温及血清IL-1β、IL-6、TNF-α的影响[J].世界科学技术-中医药现代化，2014，16(01)：58-62]。TNF-α可作用于体温调节中枢，导致中枢体温调节介质失衡，其可促进下丘脑产生PGE2。有研究发现将TNF-α注射至大鼠静脉可诱导发热，并显著增加大鼠下丘脑中PGE2水平[Long NC，Otterness I，Kunkel S L，et al.Roles ofinterleukin 1-βand tumor necrosis factor in lipopolysaccharide fever in rats[J].American Journal of Physiology，1990，259：724-728]。PGE2是花生四烯酸代谢产物，现已被公认为与发热关系最密切且相关研究最为丰富的体温中枢正调节因子，其可刺激下丘脑内温度相关神经元，改变突触间放电频率，且可与G蛋白偶联，升高下丘脑中cAMP水平。cAMP被认为是最接近于体温调节中枢末端的正调节因子。微量cAMP注射入动物脑内便可造成发热[逯全东.柴胡解热作用的物质基础及作用机制的实验研究[D].山东中医药大学，2013]。当机体发热时，PGE2和cAMP在下丘脑中含量将显著升高。AVP是由下丘脑合成、分泌的激素类物质，其可改变由体温正调控因子造成的温度神经元突触放电异常，现代研究证实其可明显抑制由内生热源引起的机体发热，是体温调节中不可或缺的负调节因子[姚锐，王常明，张璇，等.大黄水煎液对干酵母致热大鼠“泄热”的机制研究[J].时珍国医国药，2021，32(09)：2058-2060]。
本发明实验中模型组大鼠体温、血清中TNF-α、AVP含量、下丘脑中PGE2、cAMP含量均较正常组显著上升，给予热淋清颗粒治疗后的发热大鼠体温、血清中TNF-α及下丘脑中PGE2、cAMP含量均较模型组显著降低，血清中AVP含量显著升高，提示热淋清颗粒可抑制内生热源物质和体温正调节因子的产生、升高体内体温负调控因子水平，从而发挥解热作用，且抑制发热大鼠体温上升在一定范围内存在量效关系。
综上，本发明实验通过颈背部皮下注射干酵母混悬液制造大鼠发热模型，结果表明，热淋清颗粒高、中剂量均可显著降低发热大鼠体温，存在一定的量效关系，且具有解热时间久，作用温和的特点，推测其作用机制可能是抑制机体内生热源物质和体温正调节因子的产生、增加体温负调控因子水平，从而发挥解热作用。
概要地说，本发明从实验的角度探讨了热淋清颗粒对干酵母致热模型大鼠的解热作用及其作用机制。具体方法是，采用颈背部皮下注射干酵母悬浊液法复制大鼠发热模型，将60只SD大鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组和热淋清颗粒高、中、低剂量组，每组10只，雌雄各半；检测造模后不同时间点大鼠体温，ELISA法检测血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、精氨酸加压素(AVP)及下丘脑中的前列腺素E2(PGE2)、环磷酸腺苷(cAMP)水平。结果显示：模型组大鼠体温、血清中TNF-α、AVP含量、下丘脑中PGE2、cAMP含量均较正常组显著上升(P<0.01)；热淋清颗粒高、中剂量组大鼠体温、血清中TNF-α及下丘脑中PGE2、cAMP含量均较模型组显著降低(P<0.01)；热淋清颗粒抑制发热大鼠体温上升在一定范围内存在量效关系；与模型组比较，热淋清高剂量组AVP水平显著升高(P<0.01)。从本文结果可见，热淋清颗粒具有良好的解热作用且高剂量效果最优，其作用机制可能是通过抑制机体内生热源TNF-α生成，降低体温中枢正调节介质PGE2、cAMP分泌水平，促进机体体温调节介质AVP的分泌而达到解热作用。
本文中所举的实施例仅用以说明本发明的组成及功效，并非因此局限本发明的专利范围，故对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出类似修改，均隶属于本发明的专利范畴。这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。

Claims (14)

1.使用TNF-α ELISA试剂盒测定TNF-α浓度的方法，其特征在于，所述试剂盒为市售的RA20035型大鼠肿瘤坏死因子α ELISA试剂盒；
其包括如下步骤：通过给动物SD大鼠皮下注射干酵母制作发热模型后，给动物灌胃给予热淋清颗粒，然后记录动物体温、采集动物动脉血并测定血中的AVP浓度和TNF-α浓度、采集动物下丘脑并测定其中的PGE2浓度和cAMP浓度，对所得体温和浓度的结果进行统计学处理；其中实验大鼠取血后，颈部脱臼处死，冰浴条件下迅速取出大鼠下丘脑，存放于-80℃冰箱内保存待测；
所述测定TNF-α浓度的方法的步骤包括如下步骤：
a.标准品的稀释和加样：取小试管6支，依次编号，先在各小试管中加入标准品稀释液100µl，然后取原浓度标准品100µl加至第一支试管中，充分混匀；再在第一支试管中取100µl加至第二支试管中，充分混匀；再在第二支试管中取100µl加至第三支试管中，充分混匀；再在第三支试管中取100µl加至第四支试管中，充分混匀；再在第四支试管中取100µl加至第五支试管中，充分混匀；然后在第五支试管中取100µl，弃掉；第六只试管作为0号标准品，稀释后各管浓度分别是：640pg/ml、320pg/ml、160pg/ml、80pg/ml、40pg/ml、0pg/ml；在酶标板上设标准品孔，依次加入不同浓度的标准品50µl，每个浓度做5个平行孔；
b.待测样品配制和加样：用采血管收集血液，血液于室温处自然凝固30分钟，1000xg离心15分钟，收集上清即血清，将该上清与附加液以体积比9：1混合均匀，得到血清待测样品；分别设置待测样品孔、空白对照孔，其中空白对照孔不加样品、酶标试剂及生物素标记的抗TNF-α抗体，其余各步操作与待测样品孔相同；在酶标板上待测样品孔中先加样品40μl，然后再加生物素标记的抗TNF-α抗体10μl；加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；所述附加液是含有1.25%甘氨酸和0.25%氯化锌的水溶液；
c.温育：每孔加入酶标试剂50μl，空白对照孔除外；用封板膜封板后将酶标板置37℃温育30分钟；
d.洗涤：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释30倍得到洗涤液；小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
d.显色：每孔先加入50μl显色剂A，再加入50μl显色剂B，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟；接着每孔加终止液50μl以终止反应，此时蓝色转为黄色；
e.测定和计算：在加终止液后15分钟以内，以空白对照孔调零，用酶标仪在450nm波长下依序测量各孔的吸光度OD值；用标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的线性回归方程，用样品OD值算得样品浓度。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述热淋清颗粒能够抑制干酵母致热模型动物体温上升。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述热淋清颗粒能够抑制干酵母致热模型动物血清TNF-α浓度升高。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述热淋清颗粒能够抑制干酵母致热模型动物下丘脑cAMP浓度升高。
5.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述热淋清颗粒能够抑制干酵母致热模型动物下丘脑PGE2浓度升高。
6.根据权利要求1的方法，其特征在于，其中皮下注射5mL/kg的15%干酵母制作发热模型。
7.根据权利要求1的方法，其特征在于，其特征在于，通过给动物SD大鼠皮下注射干酵母制作发热模型后4h后灌胃给予热淋清颗粒。
8.根据权利要求1的方法，其特征在于，热淋清颗粒用水混悬/溶解后灌胃给予动物。
9.根据权利要求1的方法，其特征在于，给药后4h记录体温；然后大鼠麻醉、采集动脉血和下丘脑。
10.根据权利要求1的方法，其特征在于，采集的动脉血照如下方式处理：血液于室温处自然凝固30分钟，1000g离心15分钟，收集血清上清，4℃保存待测。
11.根据权利要求1的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)热淋清颗粒混悬液的制备：将适量热淋清颗粒置于研钵中研磨，精准称取研磨后粉末24.0g，于50mL容量瓶中用水定容备用；精准称取研磨后粉末12.0g，于50mL容量瓶中用水定容备用；精准称取研磨后粉末6.0g，于50mL容量瓶中用水定容备用；
(2)试验分组、造模、给药：随机选取SD大鼠60只，雌雄各半，适应性喂养7d；实验当日每30min测量一次体温，共3次，取平均值作为基础体温；
随机将60只大鼠平均分为6组，即：正常组、模型对照组、阳性对照组、热淋清颗粒高剂量组、热淋清颗粒中剂量组、热淋清颗粒低剂量组；
除正常组皮下注射生理盐水5mL/kg，其余各组均皮下注射5mL/kg的15%干酵母制作发热模型；
造模4h后，对热淋清颗粒高、中、低剂量组分别灌胃4.8g/kg、2.4g/kg、1.2g/kg热淋清颗粒，阳性对照组灌胃0.1g/kg对乙酰氨基酚，模型对照组和正常组均灌胃等体积生理盐水；
(3)检测和数据处理：给药后4h记录体温；然后将各组大鼠麻醉，腹主动脉取血，血液于室温处自然凝固30分钟，1000xg离心15分钟，收集血清上清，4°C保存待测；实验大鼠取血后，颈部脱臼处死，冰浴条件下迅速取出大鼠下丘脑，存放于-80℃冰箱内保存待测；按照ELISA试剂盒说明书对大鼠血清进行AVP指标检测，对大鼠下丘脑进行PGE2、cAMP指标检测；使用统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差表示，各组数据采用方差分析，以P<0.05判定结果具有统计学差异。
12.根据权利要求1的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)热淋清颗粒混悬液的制备：将适量热淋清颗粒置于研钵中研磨，精准称取研磨后粉末24.0g，于50mL容量瓶中用水定容备用；精准称取研磨后粉末12.0g，于50mL容量瓶中用水定容备用；精准称取研磨后粉末6.0g，于50mL容量瓶中用水定容备用；
(2)试验分组、造模、给药：随机选取SD大鼠60只，雌雄各半，适应性喂养7d，实验室环境：25±2℃，相对湿度50±5%；实验当日每30min测量一次体温，共3次，取平均值作为基础体温；
随机将60只大鼠平均分为6组，即：正常组、模型对照组、阳性对照组、热淋清颗粒高剂量组、热淋清颗粒中剂量组、热淋清颗粒低剂量组；
除正常组皮下注射生理盐水5mL/kg，其余各组均皮下注射5mL/kg的15%干酵母制作发热模型；
造模4h后，每只鼠体温均升高至少0.8℃，对热淋清颗粒高、中、低剂量组分别灌胃4.8g/kg、2.4g/kg、1.2g/kg热淋清颗粒，阳性对照组灌胃0.1g/kg对乙酰氨基酚，模型对照组和正常组均灌胃等体积生理盐水；
(3)检测和数据处理：给药后4h记录体温；然后将各组大鼠麻醉，腹主动脉取血，血液于室温处自然凝固30分钟，1000xg离心15分钟，收集血清上清，4°C保存待测；实验大鼠取血后，颈部脱臼处死，冰浴条件下迅速取出大鼠下丘脑，存放于-80℃冰箱内保存待测；按照ELISA试剂盒说明书对大鼠血清进行AVP指标检测，对大鼠下丘脑进行PGE2、cAMP指标检测；使用SPSS26.0统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差表示，各组数据采用方差分析，以P<0.05判定结果具有统计学差异。
13.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述热淋清颗粒是以头花蓼即Polygonumcapitatum Buch.-Ham.ex D.Don为原料制成的颗粒剂。
14.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述热淋清颗粒是按照如下方法制备得到的：取头花蓼1250g，加水煎煮二次，每次1.5小时，煎液滤过，滤液合并，浓缩至适量，滤过，喷雾干燥，与适量的可溶性淀粉混匀，制成颗粒，干燥，制成500g，即得。
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