CN105030763A - 蟛蜞菊内酯在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种中药单体成分蟛蜞菊内酯作为治疗溃疡性结肠炎的药物用途。蟛蜞菊内酯从中药材墨旱莲中获得并通过波谱数据确定结构。蟛蜞菊内酯灌胃给药后明显改善模型小鼠体重变化，增加结肠长度，明显改变结肠炎症水平，降低反映结肠炎症程度的NO含量，减少结肠组织中的髓过氧化物酶(MPO)活力，体外抑制IL-1β刺激Caco-2细胞炎症因子IL-8的释放。体内、外实验结果证明一定剂量下蟛蜞菊内酯可通过明显抑制结肠组织炎症因子释放而显著改善葡聚糖硫酸钠(DSS)所致小鼠急性溃疡性结肠炎，具有作为治疗或改善溃疡性结肠炎的药物新用途。

Description

蟛蜞菊内酯在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种单体物质蟛蜞菊内酯作为治疗炎症性肠病的药物新用途。

背景技术

溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，UC)是一种病因不明且易复发的慢性肠道炎性疾病，病变主要发生于结肠及其粘膜下层，累及直肠，逐渐蔓延至部分或整个结肠，结肠弥漫性的炎症和溃疡是UC的主要特征^[1，2]。临床表现为腹痛、持续性腹泻及血便、发热、腹胀等症状，严重影响着人们的生活质量。在欧美国家，UC发病率超过亚洲国家，我国的UC发病率也呈现上升趋势^[3]。临床UC治疗的药物主要分为以下几类：糖皮质激素类、氨基水杨酸类、免疫抑制剂、抗生物以及一些生物制剂如英夫利西单抗，阿达木单抗等，但是有不同程度的毒副作用，如：糖皮质激素易引起肥胖，TNF-a单抗可引起患者皮肤不适应症状等^[4-7]。寻找对UC具有良好治疗作用的中药，探明其作用机制，对于发现UC的新型治疗药物具有重要意义。

UC在中医属于“痢疾，泄泻等范畴，多因脾胃虚弱或饮食不洁等，湿热内生、蕴结于肠，而致反复发作。其病位在脾、肾、大肠，临床多用清热健脾、活血化瘀等方法可使UC症状缓解。中医辩证与辨病相结合，局部与整体相结合的方法运用于临床，体现在多种中药的内服与灌肠治疗的结合，可取得较好的疗效。中药作用多途径、多靶点，为了解决作用机制复杂和活性成分不明确的问题，有必要对中药单体化合物进行研究^[8]。

蟛蜞菊内酯(Wedelolactone)为香豆草醚类，具有多种生物活性，在药用植物醴肠EcliptaprostrataL.、金盏蟛蜞菊Wedeliacalenulacea、小连翘Hypericumerectum中均含有，有关蟛蜞菊内酯制备方法相关的专利已有多项(专利号分别为：03146584.6；201010603988.2；200810033010.x；201010603861.0；201210256560.4；20131099356.8)。目前，研究发现蟛蜞菊内酯是Na′/K′/ATP酶抑制剂和异构酶II抑制剂，对NF-κB、IKK、capasse-11等转录因子均有抑制作用^[9-13]，具有保肝、抗经后骨质疏松、免疫调节、抗癌、抑制乳腺癌的肺转移，抑制人肝星状细胞(LX-2)的纤维化、减毒功效等作用^[14-16]，发挥抗烟草花叶病毒(专利号：20130065910.0)、治疗关节炎(专利号：200310124512.0)、治疗和预防支气管哮喘、慢性支气管炎及肺气肿(专利号：200510023677.8)等多种药理功效。

本发明通过体内实验建立葡聚糖硫酸钠(dextransufatesodium，DSS)诱导小鼠溃疡性结肠炎模型，观察中药单体对小鼠实验性结肠炎的药效作用，并分析其可能的作用机制，同时，通过体外实验，在LPS诱导的RAW264.7炎症模型中，观察蟛蜞菊内酯的体外抗炎活性，并进一步从体内外深入探讨其作用机理。通过4％DSS诱导小鼠UC模型，发现单体能够减轻小鼠实验性溃疡性结肠炎症状，其作用机制可能与抑制中性粒细胞浸润和减少炎症因子释放有关，作为NF-kB的抑制剂，蟛蜞菊内酯发挥抗溃疡性结肠炎作用可能与抑制NF-kB的活化和MAPK通路激活有关。目前，尚未有文献报道蟛蜞菊内酯具有治疗肺纤维化疾病的功效及其在治疗肺纤维疾病药物中的应用。

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本项发明预解决的问题

本项发明的目的在于发现蟛蜞菊内酯可用于治疗溃疡性结肠炎疾病的医药新用途。

实验方法

本项发明是经过体内、体外药理实验结果证明蟛蜞菊内酯可改善DSS诱导小鼠溃疡性结肠的炎症程度，通过HE染色观察结肠组织病理切片、采用TLISA法测定结肠组织中代表中性粒细胞浸润的MPO含量，代表组织过氧化水平的MDA含量，炎症相关细胞因子TNF-a及IL-6含量以及血清中NO含量，体外细胞实验考察蟛蜞菊内酯对人结肠癌细胞Caco-2增殖的影响，采用ELISA法测定一定剂量范围内药物对IL-1β诱导后Caco-2细胞的炎症因子释放的影响。体内外实验结果证明蟛蜞菊内酯显著改善葡聚糖硫酸钠(DSS)所致急性溃疡性结肠炎，具有作为治疗或改善炎症性肠病的药物新用途。

发明内容

本发明是关于作为医药品使用的蟛蜞菊内酯改善溃疡性结肠炎的新医药用途。详细地说，就是本发明专利是指蟛蜞菊内酯具有改善溃疡性结肠炎进程的功放，体内药理实验结果证明蟛蜞菊内酯可降低溃疡性结肠炎模型的结肠组织中MDA、TNF-a、I1-6含量，体外实验结果表明蟛蜞菊内酯可剂量依赖性对抑制诱导的人结肠癌细胞Caco-2的增殖，在一定范围内抑制IL-1β诱导Caco-2细胞炎症因子的释放，具有可用于治疗溃疡性结肠炎疾病的新医药用途。

有益效果

1、目前，没有任何研究报道蟛蜞菊内酯可用于溃疡性结肠炎的治疗。发明人通过体内外实验证明蟛蜞菊内酯对于DSS诱导的小鼠急性溃疡性结肠炎具有很好的治疗作用。本发明蟛蜞菊内酯可较好改善结肠炎症状，可用于制备治疗肺纤维疾病的药物。

2、本发明涉及实验材料来自多种原植物，成本低；也可采用有机合成方法获得，本物质药理活性明确，具有广泛的实用价值。

附图说明

图1蟛蜞菊内酯对UC小鼠DAI指数的影响(n＝8)。Blank：空白对照组；Model：模型组；WEL：蟛蜞菊内酯药物组；##P＜0.01，versusBlank

图2蟛蜞菊内酯对DSS诱导小鼠体重的影响(n＝8)。Blank：空白对照组；Model：模型组；WEL：蟛蜞菊内酯药物组；##P＜0.01，versusBlank

图3蟛蜞菊内酯对DSS诱导结肠炎小鼠结肠长度的影响(n＝8)Blank：空白对照组；Model：模型组；WEL：蟛蜞菊内酯药物组；##P＜0.01，versusBlank；*0.01＜P＜0.05，**P＜0.01，versusModel.

图4药物DSS诱导后结肠炎小鼠HE染色结肠组织切片和组织学病理损伤评分(n＝6)。Blank：空白对照组；Model：模型组；WEL-H/L：蟛蜞菊内酯高、低剂量组药组：^##P＜0.01，versusBlank；*0.01＜P＜0.05，^**P＜0.01，versusModel.

图5药物对DSS诱导后小鼠结肠组织中髓过氧化物酶(MPO)活力的影响。(n＝6，x±SD)Blank：空白对照组；Model：模型组：WEL-L/-H：蟛蜞菊内酯低、高剂量给药组；^#P＜0.05，^##P＜0.01，versusBlank；*0.01＜P＜0.05，^**P＜0.01，versusModel.

具体实施方式

实施例一蟛蜞菊内酯减轻溃疡性结肠炎的体内药学作用研究

1.1实验材料

1.1.1实验动物及药品

清洁级C57BL/6小鼠，雌性，18-22g，购于扬州大学比较医学中心(合格证编号：NO.201502346)。实验动物分笼饲养，每2天更换一次垫料，适应性饲养7天，实验期间自由饮水和进食。饲养环境温度为22±2℃，相对湿度为60％，每天12小时光照和12小时黑夜循环。

中药材墨旱莲干燥粉碎后、用80％乙醇回流提取得提取物，减压浓缩依次石油醚、乙酸乙酯等量萃取，乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱(CH₂Cl₂-MeOH(15∶5)洗脱)、凝胶sephadexLH-20柱层析采用CHCl₃-MeOH(1∶1)洗脱，甲醇-水重结晶得到化合物蟛蜞菊内酯，纯度为95％以上。

1.1.2实验试剂与仪器

DSS(葡聚糖硫酸钠，MW36000-50000，MPBiomedicals，LOTNO：M8667)、吐温-80(国药集团化学试剂有限公司，批号F20090526)、羧甲基纤维素钠(CMC-Na，国药集团化学试剂有限公司，批号F20111021)、MPO试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20150417)、RMPIMedium1640培养基(Gibco，批号1371024)、胎牛血清(BiologicalIndustries，批号1418110)、MTT(Biosharp公司)、DMSO(美国AMRESCO公司)。

电子天平(型号AL104，上海天平仪器厂)；GWP十万分之一分析天平(型号XS105DU，Mettler-ToledoAGLaboratory&WeighingTechnologles)；BiotekBLX800酶标仪；TGL-16离心高速台式冷冻离心机；-80℃低温冰箱(型号DW-86L386，青岛海尔特种电器有限公司)；医用数控超声波清洗器(型号KQ-250DE，昆山超声仪器有限公司)；EYELA恒温箱(型号SLI-700，TOKYORIKAKIKAICO.，LTD)；ThermoscientificCO2培养箱；洁净工作台(苏州佳宝净化工程设备有限公司，型号JB-CJ-IFDS)96孔培养板(Corning公司)；Olympus倒置显微镜(型号CKX31)等。

1.1.3药物试剂配制：

蟛蜞菊内酯溶液的配制：WEL先用2％叶温-80溶解，再用0.5％CMC-Na配制成混悬液。

1.2实验方法

1.2.1动物分组及溃疡性结肠炎的复制

40只老鼠随机分为4组，随机分为10组，每组10只，分别为：空白组(Vehicle，CMC-Na，灌胃)、模型组(4％DSS，CMC-Na，灌胃)、WEL高剂量组(WEL，50mg/kg，灌胃)、WEL低剂量组(WEL，25mg/kg，灌胃)。

临用前，用蒸馏水配制新鲜的4％的DSS(w/v)水溶液。模型组和WEL药物组给与4％DSS溶液自由饮用7天，再给与饮用纯净水2天；空白组一直饮用纯净水直到实验结束，共9天。在此期间，每天给药一次，给药体积均按0.2ml/20g灌胃，

1.2.2动物病理进程观察

每天观察记录小鼠活动、进食、精神状态、大便状态、体重和死亡等情况。实验期问统计疾病活动指数(Diseaseactivityindex，DAI)。实验结束后用颈脱臼法全部处死，并马上剖取结肠组织，测量结肠长度并拍照比较。离肛门1cm向上截取约2cm结肠放入10％褔尔马林中固定，其余组织进行后续的观察，用冷生理盐水将剖取的肠腔冲洗干净，放入-80℃冰箱保存，以使用于后继实验。

疾病活动指数(DAI)：结合动物的体重下降百分率(体重不变为0，1-5％为1分，5-10％为2分，10-20％为3分，大于20％为4分)、大便性状(正常为0，松散的大便为2分，腹泻为4分)和大便出血(正常0分，隐血阳性为2分，显性出血为4分)三种情况进行综合评分，将3项结果的总分除以3即得到DAI值。即DAI＝(体重指数+大便形状+出血情况)/3。

1.2.3结肠组织病理学观察和组织损伤评分

实验结束后，取新鲜的结肠组织，肉眼观察并记录结肠的形态、充血、溃疡、糜烂程度和范围。取约1cm结肠，经10％福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片厚4～5μm，HE染色，镜下观察并进行组织病理损伤评分。评分规则如下：

1)炎细胞浸润评分标准：0分：黏膜层内有极少量炎症细胞，1分：黏膜层内有较多的炎症细胞或黏膜层内的炎症细胞增多，2分：炎症细胞扩散至黏膜下层，3分：全层均有炎症细胞渗出；

2)组织损坏评分标准：0分：无黏膜损伤，1分：非连续的黏膜上皮损坏，2分：黏膜层上层细胞中度变性、坏死、脱落，3分：黏膜层上皮细胞重度变性、坏死、脱落；

将炎症细胞的渗出和组织损坏计分相加，计算出组织病理评分。

1.2.4数据统计

实验数据用GraphPadPrism5软件处理。多组间比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA，Dunnett’smultiplecomparisontest法作两两比较，数据均以均数±标准误差(x±SD)表示；体重及血便采用多重比较(two-wayANOVA，gonferroniposttests)法作两两比较，数据以均数±标准误差(X±SEM)表示检验差异显著性。

1.3实验结果

1.3.1蟛蜞菊内酯对DSS诱导的急性溃疡性小鼠一般状况的影响

空白组小鼠毛色有光泽，活动饮食正常，大便正常，体重增加。模型组小鼠在饮用DSS第3天后，体重开始下降，少动，喜扎堆，症状开始逐渐加重，大便变稀，部分小鼠出现血便；第5-7天体重均明显下降，饮食明显减少，毛发暗淡，均出现不同程度的稀便和血便；第8-9天，饮用纯净水后体重上升，血便症状减轻；WEL低剂最组小鼠精神及疾病活动情况较模型组健康。DA1指数如图1所示。

空白组体重无明显变化，模型组在饮用DSS第3天后，体重开始下降；第5-7天体重均明显下降；第8-9天，饮用纯净水后体重上升；WEL给药组与模型组没有明显差别。各组体重变化如图2所示。

1.3.2蟛蜞菊内酯对DSS诱导的急性溃疡性小鼠结肠形态和长度比较

空白组小鼠结肠外观呈粉红色，无充血水肿，可见颜色正常的成型粪便；模型组小鼠部分肠腔内可见到稀便，长度明显缩短；WEL给药组结肠长度均明显延长，肠腔内粪便成型；各种结肠长度如图3所示。

1.3.3蟛蜞菊内酯对DSS诱导的急性溃疡性小鼠结肠组织病理切片观察及评分

空白组小鼠结肠镜下各层结构完整清晰，腺体排列整齐，隐窝正常，黏膜上皮可见许多杯状细胞，无变性坏死，黏膜下层无水肿，未见炎性细胞浸润。模型组小鼠镜下可见大部分腺体破坏，排列紊乱，隐窝消失：可见大量炎性细胞浸润；蟛蜞菊内酯低剂量给药组的结肠切片显示病变稍微减轻，上炎性细胞浸润减少，黏膜上皮结构变性坏死减轻：蟛蜞菊内酯高低剂量给药组的结肠切片显示病变稍微减轻，上炎性细胞浸润减少，黏膜上皮结构变性环死减轻。切片及评分结果如图4所示。

1.3.4蟛蜞菊内酯对DSS诱导的急性溃疡性小鼠结肠组织MPO(髓过氧化物酶)活性

准确称取实施例1中各组小鼠结肠组织，用生理盐水按重量体积比1∶9制成10％匀浆。严格按照说明书操作，用紫外分光光度计在460nm处通过比色测定吸光度值，计算样品中髓过氧化物酶(MPO)活力，如图5所示。

1.3.5蟛蜞菊内酯肘DSS诱导的急性溃疡性小鼠血清中NO含量的影响

DSS诱导的小鼠UC体内炎症细胞大量增加，与空白对照组相比，体内炎性介质NO含量明显升高(P＜0.01)，与模型组相比，不同浓度的蟛蜞菊内酯给药后能不同程度地抑制小鼠血清中NO的生成，具有显著性差异(与模型组相比，^**P＜0.05或0.01)。结果表明蟛蜞菊内酯能抑制UC小鼠体内炎症因子NO的生成。如表1所示。

表1不同浓度药物对DSS诱导的溃疡性小鼠血清中NO含量的影响(n＝5，x±SD)

实施例二蟛蜞菊内酯减轻IL-1B对Caco-2的促进炎症作用

Caco-2细胞是一种来源于人类大肠腺癌上皮的细胞株，当生长达到融合后可自发分化形成极性，表现出成熟肠道上皮细胞的形态结构和功能特征，是研究结肠上皮蛋白表达及其功能的理想细胞^[1]。肠粘膜中的IL-8是由巨嗤细胞、上皮细胞、纤维母细胞分泌的蛋白，病变粘膜处的IL-8水平升高，升高水平与肠道炎症程度相关^[2]。为了观察蟛蜞菊内酯的抗溃疡性结肠炎的作用机制，我们首选通过MTT实验，确定蟛蜞菊内酯对Caco-2细胞的安安范围；再以安全浓度范围内的不同浓度蟛蜞菊内酯预处理Caco-2细胞，检测炎症水平变化，探讨其可能存在的机制，明确蟛蜞菊内酯的作用靶点及调节方向。

1、蟛蜞菊内酯对Caco-2细胞增殖的影响

Caco-2细胞消化制成混悬液，细胞计数板计数后，2.5×10接种于96孔板内，每孔200μl，分别加入10、20、40μM蟛蜞菊内酯分别培养至24h，再加入20μl浓度为5mg/ml的MTT，37℃避光静置反应4h。吸出孔内液体，再加入200μlDMSO，15min后结晶全部济解，置酶标仪490mn处吸光度值。结果表明在10-40μM范围内，蟛蜞菊对Caco-2无细胞毒性，不影响细胞增殖，无显著性差异，如表2所示。

表2不同浓度药物对Caco-2细咆增值及IL-8水平的影响(24h，x±SD)

2、蟛蜞菊内酯对IL-1β刺激Caco-2细胞上清中IL-8水平的影响

人结肠腺癌细胞株Caco-2，用加入10％胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5％CO2浓度培养箱中培养。细胞接种于直径60min培养皿中，贴壁后开始药物刺激。分别分为空白对照组，模型组(1ng/mlIL-1β)及不同浓度给药组(10、20、40μM蟛蜞菊内酯)，药物组中不同浓度蟛蜞菊内酯预处理2h后再加入IL-1β。培养24h后。收集细胞上清，-70℃保存待测。

按照ELISA试剂盒说明操作，步骤简述如下：按照等比稀释法配制标准品，使终浓度为：1000、500、250、125、62.5、31.2、15.6pg/ml，备用。酵标板室温放置至温度平衡。将100μl不问稀释度的标准品或待测样品分别加入酶标板，留置空白孔，室温輕育2h。弃去液体，以每孔400μl洗洛液洗板4次。吸尽孔内液体后，每微孔内再加入100μl的检测抗体，室温孵育2h。弃去液体后，重复洗板4次。再次吸尽孔内液体，每孔加入200μl显色底物，室温下避光孵育30min，之后迅速加入50μl终止液，混匀孔内液体，于酶标仪450nm处测定吸光度值。以IL-8标准品含量作横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，以样品OD值的均值经过倍数转换在曲线上查出含量，以pg/mL表示。结果表明Caco-2细胞在1ng/mlIL-1β刺激下大量释放炎症因子IL-8(与空白组相比，^##P＜0.01)，在10～40μM蟛蜞菊内酯干预下，IL-1β诱导Cato-2细胞表达IL-8显著下调(与模型组相比，^##P＜0.01or0.05)，如表3所示。

表3不同浓度药物对Caco-2细胞IL-1β刺激前后IL-8水平的影响(24h，x±SD)

四、讨论：

溃疡性结肠炎是与肠道粘膜免疫系统异常反应有关的一类疾病，UC患者肠粘膜中IL-1β，IL-8，THF-α等促炎因子高表达，IL-6，IL-10等抑炎因子低表达，研究表明肠道粘膜中存在T辅助细胞亚群，Th1分泌IL-1，IL-8等，Th2分泌IL-6、IL-10等，免疫平衡在结肠炎的进展中起到重要作用。文献报道IL-1β可降低Caco-2细胞上清的IL-6含量，IL-1β同时也是NF-kB信号通路中的下游靶点，活化的NF-kB可以增加IL-1β的表达。病理切片实验结果表明，DSS诱导急性结肠损伤在使小鼠体重下降的同时，受损的结肠明显发生改变，结肠内皮细胞肿胀，中性粒细胞大量释放，不同剂量蟛蜞菊内酯药物治疗后可改变模型MPO活力(P＜0.05)。HE染色结果显示，药物治疗组能改善结肠上皮细胞的形态，以大剂量效果尤为明显，且能抑制血清中代表炎症因于的NO含量。体外实验不同浓度的蟛蜞菊内酯可抑制IL-1β刺激结肠上皮细胞的炎症因子IL-8释放，具有潜在的阻止上皮细胞炎症的进一步扩大的作用。综上，蟛蜞菊内酯可减少结肠损伤部位中性粒细胞的释放、改善结肠炎症症状，增加模型小鼠体重，对溃疡性结肠具有较好的治疗作用。

Claims (2)

1.蟛蜞菊内酯在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的蟛蜞菊内酯在治疗溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于蟛蜞菊内酯由如下方法获得：墨旱莲药材干燥粉碎后、用80％乙醇回流提取得提取物，减压浓缩依次石油醚、乙酸乙酯等量萃取，乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱(CH₂Cl₂-MeOH(15∶5)洗脱)、凝胶sephadexLH-20柱层析采用CHCl₃-MeOH(1∶1)洗脱，甲醇-水重结晶得到化合物蟛蜞菊内酯，纯度为95％以上。