CN110049762A - 穿心莲提取物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了高浓度活性成分的穿心莲提取物、制备方法以及治疗自身免疫性疾病和炎症性疾病的医药用途。
Description
技术领域
本发明公开了穿心莲(Andrographis paniculata)提取物、其制备方法和其医药用途。
背景技术
穿心莲为爵床科植物穿心莲Andrographis Paniculata(Brun.f.)Nees的干燥地上部分，其广泛分布于亚洲，如中国、印度等。作为一种中药，穿心莲已经在临床上用于治疗呼吸道感染、急性痢疾、胃肠炎、发热和流感、高血压以及其他疾病。
据报道，穿心莲中的活性成分包含穿心莲内酯类化合物，所述穿心莲内酯类化合物选自例如穿心莲内酯(AND)、新穿心莲内酯(NAND)、14-去氧穿心莲内酯(DAND)和14-去氧-11，12-去氢穿心莲内酯(DDAND)等。许多工艺已经被开发用于从穿心莲中提取活性成分。
WO 2009/059158公开一种穿心莲提取物制备方法，其中用90％乙醇回流提取穿心莲的干燥地上部分，收集乙醇部分再用90％乙醇提取一次，合并两次乙醇提取物，在去除乙醇后加入糊精，经干燥粉碎，得到穿心莲提取物。在该穿心莲提取物中，总穿心莲内酯在该提取物干粉中的重量百分比含量为10-22％，其中AND、DAND、DDAND和NAND在提取物中的重量百分比含量分别为例如6-10％、0.01-2％、2-4％和2-4％。
核因子κB(NF-κB)是一类转录因子蛋白，其家族成员包括RelA(p65)、RelB、c-Rel、NF-κB1(p50)以及NF-κB2(p52)，它们形成同二聚体或异二聚体与靶基因上的κB序列结合调节基因转录。NF-κB参与调控的靶基因具有广泛的生物学功能，如调控免疫细胞的增殖、分化、成熟和活化，所以NF-κB在固有免疫应答和适应性免疫应答中发挥了重要的调节作用。例如，NF-κB在免疫耐受形成中扮演着关键角色，包括中枢耐受和调节性T细胞(Treg)的外周功能。因此，NF-κB的失调被认为是自身免疫性疾病慢性炎症的发病机理之一。
长期以来，NF-κB的激活被认为是典型的促炎症信号通路，主要是通过促炎细胞因子如白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)来激活NF-κB。此外，NF-κB的活化可以上调许多促炎介质的表达，包括细胞因子、趋化因子和细胞粘附分子。这些促炎介质和IL-1B、TNF-α一起在慢性炎性疾病如类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病(IBD)、牛皮癣、系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘和慢性阻塞性肺疾病(COPD)的发病机理中扮演了重要角色。因此，抑制NF-κB信号通路是自身免疫性疾病和炎性疾病的潜在治疗方法。
IL-1β和TNF-α是自身免疫性疾病慢性炎症中关键的促炎细胞因子。几种TNF-α的中和抗体(如Humira)和可溶性TNF-α受体(Enbrel)已被批准用于自身免疫性疾病如RA和IBD的临床治疗。与TNF-α一样，IL-1β也是由炎症刺激产生，并通过激活其受体IL-1R，启动信号级联反应，介导各种生理反应包括炎症和免疫反应。例如在RA中，IL-1β刺激骨吸收并通过诱导蛋白多糖的损耗而引发组织损伤，如软骨降解。同时在这些RA患者中，滑膜中IL-1R受体拮抗剂(IL-1Ra)浓度不足，所以无法抵消IL-1β浓度的高带来的影响。
阿那白滞素(Kineret)是一种重组的IL-1Ra蛋白，它竞争性地抑制IL-1β与其受体的结合，从而阻止通过该途径发生的炎症。FDA批准阿那白滞素用于治疗RA和新生儿发病多系统炎性疾病(NOMID)。有时也用于治疗较不常见的疾病，如成人斯蒂尔病和白塞病。阿那白滞素也可用于狼疮肾炎的治疗，因为在狼疮肾炎中，肾小球基底膜中的胞外DNA和抗dsDNA抗体形成复合物，导致巨噬细胞IL-1β释放到相邻的系膜细胞IL-1受体上，从而引发炎症反应。
炎性肠病(IBD)包括以炎症性细胞浸润消化道粘膜为特征的慢性胃肠道疾病。溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)是其中两种常见的疾病。
据报道，在一些临床前和临床研究中，某些穿心莲提取物似乎具有治疗人炎性肠病的作用。然而，目前尚未确定任何穿心莲提取物的Ⅲ期临床疗效。一种称为HMPL-004的特定的穿心莲提取物在美国未达到期望的Ⅲ期临床试验终点。
发明概述
本发明公开了穿心莲提取物、其制备方法及其用途。该穿心莲提取物有望能有效治疗人炎性肠病IBD。
本发明公开了一种穿心莲提取物，其包含以重量计相对于提取物的重量含量为至少50.0％的总穿心莲内酯，其中所述总穿心莲内酯包含AND、NAND、DAND和DDAND，其以重量计相对于提取物的重量含量分别为20.0至50.0％、2.0至15.0％、0.5至6.0％以及5.0至20.0％。
本发明还提供了一种药物组合物，其包含本文所公开的提取物和一种药学上可接受的赋形剂(例如一种药学上可接受的载体)。
本发明还提供了一种治疗个体中的自身免疫性疾病和炎症性疾病的方法，其包括给需要其的个体施用治疗有效量的本文所公开的提取物或组合物。本文所述的个体可以是人。
本发明还提供了一种治疗个体中的炎性肠病(IBD)的方法，其包括给需要其的个体施用治疗有效量的本文所公开的提取物或组合物。本文所述的个体可以是人。
本发明还提供了一种制备本文所述的提取物的方法，其包括：
-用80％-95％的乙醇回流提取穿心莲的干燥地上部分；任选地用另外的80％-95％的乙醇提取固体残留物，合并乙醇相；收集乙醇相并去除溶剂，得到第一乙醇提取物；
-将糊精加入到第一乙醇提取物中；并将所得的混合物干燥，得到第一固体；
-用90％-100％的乙醇提取第一固体；收集乙醇相并用活性炭脱色；收集液相并去除溶剂，得到第二固体；
-用水洗涤第二固体；收集所得的固体残留物；以及
-用弱极性或非极性有机溶剂洗涤在水洗步骤后得到的固体残留物；收集所得的固体残留物，得到穿心莲提取物。
本发明还提供了一种制备本文所述的提取物的方法，其包括：
-用80％-95％的乙醇回流提取穿心莲的干燥地上部分；任选地用另外的80％-95％的乙醇提取固体残留物，合并乙醇相；收集乙醇相并去除溶剂，得到第一乙醇提取物；
-将糊精加入到第一乙醇提取物中；并将所得的混合物干燥，得到第一固体；
-用水洗涤第一固体；收集所得的固体残留物；
-用90％-100％的乙醇提取在水洗步骤中得到的固体残留物；收集乙醇相并用活性炭脱色；收集液相并去除溶剂，得到第二固体；以及
-用弱极性或非极性有机溶剂洗涤第二固体；收集所得的固体残留物，得到穿心莲提取物。
本发明还提供了一种增强FGF1和/或FGF2的mRNA表达的方法，其包括将本文所公开的穿心莲提取物与细胞接触。
附图说明
图1表示实施例1对LPS诱导的促炎因子mRNA表达的影响。A.TNFα；B.IL-1β；C.IL-6；D.IL-12p40；E.IL-18；F.Cox-2。
图2表示实施例1在人PBMC细胞中对抗CD3单克隆抗体和抗CD28单克隆抗体诱导的促炎因子mRNA表达的影响。A.CCL-20；B.IFNγ。
图3表示实施例1在T84细胞中对趋化因子mRNA表达的影响。A.CCL-20；B.CXCL-9；C.CXCL-10；D.CXCL-11。
图4表示实施例1在HT29细胞中对趋化因子mRNA表达的影响。A.CCL-20；B.CXCL-10；C.CXCL-11；D.CXCL-16。
图5表示实施例1在上皮细胞HT29和T84中对EGF mRNA表达的影响。
图6表示实施例1在上皮细胞T84中对FGF1和FGF2mRNA表达的影响。
图7表示实施例10在上皮细胞HT29中对EGF mRNA表达的影响。
图8表示实施例10在上皮细胞T84中对FGF1和FGF2mRNA表达的影响
图9表示实施例7在上皮细胞T84中对FGF1 mRNA表达的影响。
定义
如本说明书所用，以下的单词、短语和符号通常具有如下所述的含义，除非在使用它们的上下文中另有说明。以下缩写词和术语在本文也有指定的含义：
本文所用术语“提取物的重量”指的是在下一次使用前不经过进一步干燥的提取物的重量。
如本文所用，术语“总穿心莲内酯”指的是存在于本文所公开的提取物中的以二萜类-内酯为核心结构的化合物的总量。例如，总穿心莲内酯包括但不限于：穿心莲内酯(AND)、新穿心莲内酯(NAND)、14-去氧穿心莲内酯(DAND)和14-去氧-11，12-去氢穿心莲内酯(DDAND)。
如本文所用，术语“穿心莲内酯(AND)”指的是CAS登记号为5508-58-7的化合物。
如本文所用，术语“14-去氧穿心莲内酯(DAND)”指的是CAS登记号为4176-97-0的化合物。
如本文所用，术语“新穿心莲内酯(NAND)”指的是CAS登记号为27215-14-1的化合物。
如本文所用，术语“14-去氧-11，12-去氢穿心莲内酯(DDAND)”指的是CAS登记号为42895-58-9的化合物。
如本文所用，术语“80％-95％的乙醇”指的是包含水的乙醇(乙醇-水溶剂)，其中乙醇的含量为以体积计相对于乙醇-水溶剂的总体积的80至95％。
如本文所用，术语“90％-100％的乙醇”指的是包含水的乙醇(乙醇-水溶剂)或不含水的乙醇，其中乙醇的含量为以体积计相对于乙醇或乙醇-水溶剂的总体积的90至100％。
如本文所用，术语“无水乙醇”指的是高纯度的乙醇溶剂，其包含至少99％的乙醇，例如≥99.5％的乙醇(工业级)、≥99.7％的乙醇(化学纯)、≥99.8％的乙醇(分析纯)。
如本文所用，术语“个体”意指哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物是指哺乳类的任何成员，其包括但不限于：人；非人灵长类动物，如黑猩猩及其它猿类和猴类物种；农场动物，如牛、马、绵羊、山羊和猪；家畜，如兔、狗和猫；实验室动物，包括啮齿类动物，如大鼠、小鼠和豚鼠；等。非哺乳动物的例子包括但不限于鸟等。术语“个体”并不限定特定的年龄或性别。在一些实施方案中，个体是人。
如本文所用，术语“药学上可接受的”意指该术语后面限定的物质可用于制备药物组合物，其通常是安全的、无毒的，并且在生物学上或其它方面没有不希望的性质，尤其是对于人药用而言。
如本文所用，术语“约”意指近似、在……左右、大致或在……周围。当术语“约”与数值范围联用时，它通过将界限扩展至高于或低于所给出的数值来调整该范围。一般而言，术语“约”在本文中用于将所给出的数值调整至高于或低于该数值20％。
如本文所用，术语“弱极性或非极性有机溶剂”意指选自下列的一种有机溶剂：例如非极性溶剂，如烷烃类、进一步如己烷、石油醚和正庚烷，以及弱极性溶剂如甲基叔丁基醚。
具体实施方式
穿心莲提取物：
本发明提供了一种穿心莲提取物，其包含以重量计相对于提取物的重量含量为至少50％的总穿心莲内酯，其中所述总穿心莲内酯包含AND、NAND、DAND和DDAND，其以重量计相对于提取物的重量含量分别为20.0至50.0％、2.0至15.0％、0.5至6.0％、以及5.0至20.0％。
在一些实施方案中，所述穿心莲提取物包含以重量计相对于提取物的重量含量为至少50％的总穿心莲内酯，其中所述总穿心莲内酯包含AND、NAND、DAND和DDAND，其以重量计相对于提取物的重量含量分别为20.0至50.0％、4.0至15.0％、0.5至6.0％、以及5.0至15.0％。
在一些实施方案中，所述总穿心莲内酯以重量计相对于所述提取物的重量含量为55.0至75.0％。
在一些实施方案中，所述总穿心莲内酯以重量计相对于所述提取物的重量含量为55.0至70.0％。
在一些实施方案中，所述总穿心莲内酯以重量计相对于所述提取物的重量含量为60.0至70.0％。
在一些实施方案中，所述AND以重量计相对于所述提取物的重量含量为25.0至45.0％。
在一些实施方案中，所述AND以重量计相对于所述提取物的重量含量为25.0至30％。
在一些实施方案中，所述AND以重量计相对于所述提取物的重量含量为25.0至42.5％。
在一些实施方案中，所述AND以重量计相对于所述提取物的重量含量为30.0至45.0％。
在一些实施方案中，所述NAND以重量计相对于所述提取物的重量含量为2.0至12.0％。
在一些实施方案中，所述NAND以重量计相对于所述提取物的重量含量为2.0至10.0％。
在一些实施方案中，所述NAND以重量计相对于所述提取物的重量含量为2.0至9.0％。
在一些实施方案中，所述NAND以重量计相对于所述提取物的重量含量为2.0至8.0％。
在一些实施方案中，所述NAND以重量计相对于所述提取物的重量含量为2.0至6.0％。
在一些实施方案中，所述NAND以重量计相对于所述提取物的重量含量为2.0至4.0％。
在一些实施方案中，所述NAND以重量计相对于所述提取物的重量含量为4.0至12.0％。
在一些实施方案中，所述NAND以重量计相对于所述提取物的重量含量为6.0至10.0％。
在一些实施方案中，所述NAND以重量计相对于所述提取物的重量含量为6.0至9.0％。
在一些实施方案中，所述NAND以重量计相对于所述提取物的重量含量为6.0至8.0％。
在一些实施方案中，所述DAND以重量计相对于所述提取物的重量含量为1.0至5.0％。
在一些实施方案中，所述DAND以重量计相对于所述提取物的重量含量为1.0至4.0％。
在一些实施方案中，所述DAND以重量计相对于所述提取物的重量含量为2.0至4.0％。
在一些实施方案中，所述DDAND以重量计相对于所述提取物的重量含量为5.0至15.0％。
在一些实施方案中，所述DDAND以重量计相对于所述提取物的重量含量为10.0至15.0％。
在一些实施方案中，所述DDAND以重量计相对于所述提取物的重量含量为5.0至10.0％。
在一些实施方案中，所述DDAND以重量计相对于所述提取物的重量含量为6.0至9.0％。
在一些实施方案中，所述DDAND以重量计相对于所述提取物的重量含量为7.0至9.0％。
制备方法：
方法1：
本发明进一步提供了第一种制备穿心莲提取物的方法，其包括：
-用80％-95％的乙醇回流提取穿心莲的干燥地上部分；任选地用另外的80％-95％的乙醇提取固体残留物，合并乙醇相；收集乙醇相并去除溶剂，得到第一乙醇提取物；
-将糊精加入到第一乙醇提取物中；并将所得的混合物干燥，得到第一固体；
-用90％-100％的乙醇提取第一固体；收集乙醇相并用活性炭脱色；收集液相并去除溶剂，得到第二固体；
-用水洗涤第二固体；收集所得的固体残留物；以及
-用弱极性或非极性有机溶剂洗涤在水洗步骤后得到的固体残留物；收集所得的固体残留物，得到穿心莲提取物。
在一些实施方案中，将所述的穿心莲的干燥地上部分在用80-95％的乙醇提取之前进行粉碎。
在一些实施方案中，第一步中使用的80-95％的乙醇为89-91％的乙醇。
在一些实施方案中，第一步中使用的80-95％的乙醇为90％的乙醇。
在一些实施方案中，所述的用80-95％的乙醇回流提取穿心莲干燥地上部分的步骤，进行两次(即用另外的80-95％的乙醇提取固体残留物一次)，每次约2小时，即96至144分钟，例如110至130分钟。在一些实施方案中，所述的任选地用另外的80％-95％的乙醇提取固体残留物是通过用另外的80％-95％的乙醇回流残留的固体约2小时(即96至144分钟，例如110至130分钟)来进行的。
在一些实施方案中，所述的穿心莲的干燥地上部分与80-95％的乙醇(或者与所述的另外的80-95％的乙醇)的比例(千克/升)为1∶4至1∶10，例如为1∶5至1∶6。
在一些实施方案中，所述的第一乙醇提取物的密度为1.0-1.1克/毫升。
在一些实施方案中，所加入的糊精的量以重量计是所用的穿心莲的干燥地上部分的约3％(即2.4至3.6％)。在一些实施方案中，所述糊精以溶液的形式加入，例如以水溶液的形式。
在一些实施方案中，所述的用90-100％的乙醇提取第一固体的步骤，进行1-2次，例如2次，每次约1小时，即48至72分钟，例如55至65分钟。
在一些实施方案中，第三步中使用的90-100％的乙醇为无水乙醇。
在一些实施方案中，第三步中使用的90-100％的乙醇为95％的乙醇。
在一些实施方案中，所述的用90-100％的乙醇提取第一固体可以使用下列任何一个提取工艺：(1)于室温下搅拌，(2)加热至30-80℃并搅拌，或者(3)回流提取工艺。在一些实施方案中，用90-100％的乙醇提取指的是回流提取工艺，即在90-100％的乙醇中回流，例如在无水乙醇中回流。
在一些实施方案中，所使用的活性炭的量以重量计为加入糊精之后所得的第一固体的5-20％，例如20％。
在一些实施方案中，活性炭脱色在50-80℃，例如58-63℃下，在本领域普通技术人员明了的适当的时间内进行的。
在一些实施方案中，所述水洗步骤指的是，于70-90℃，例如80-85℃下在水中搅拌，并在本领域普通技术人员明了的适当的时间内进行。在一些实施方案中，加入糊精之后所得的第一固体与水的比例(千克/升)为1∶5至1∶15，例如为1∶8-1∶12，或者1∶10。
在一些实施方案中，所述水洗步骤进行一次或多次，例如一次或两次。
在一些实施方案中，所述弱极性或非极性有机溶剂可以选自非极性溶剂，如烷烃类、进一步如己烷、石油醚和正庚烷，以及选自弱极性溶剂如甲基叔丁基醚。在一些实施方案中，所述弱极性或非极性有机溶剂为正庚烷。
在一些实施方案中，在用弱极性或非极性有机溶剂洗涤的步骤之前，将水洗步骤中所得的固体残留物溶解在无水乙醇中并浓缩得到固体。
在一些实施方案中，所述用弱极性或非极性有机溶剂洗涤的步骤于15-30℃、例如20-30℃下，在本领域普通技术人员明了的适当的时间内进行。在一些实施方案中，用弱极性或非极性有机溶剂洗涤的步骤指的是于15-30℃、例如20-30℃下，在弱极性或非极性有机溶剂中，搅拌本领域普通技术人员明了的适当的时间。
方法2：
本发明进一步提供了第二种制备本文所公开的穿心莲提取物的方法，其包括：
-用80％-95％的乙醇回流提取穿心莲的干燥地上部分；任选地用另外的80％-95％的乙醇提取固体残留物，合并乙醇相；收集乙醇相并去除溶剂，得到第一乙醇提取物；
-将糊精加入到第一乙醇提取物中；并将所得的混合物干燥，得到第一固体；
-用水洗涤第一固体；收集所得的固体残留物；
-用90-100％的乙醇提取在水洗步骤中得到的固体残留物；收集乙醇相并用活性炭脱色；收集液相并去除溶剂，得到第二固体；
-用弱极性或非极性有机溶剂洗涤第二固体；收集所得的固体残留物，得到穿心莲提取物。
在一些实施方案中，将所述的穿心莲的干燥地上部分在用80-95％的乙醇提取之前进行粉碎。
在一些实施方案中，第一步中使用的80-95％的乙醇为89-91％的乙醇。
在一些实施方案中，第一步中使用的80-95％的乙醇为90％的乙醇。
在一些实施方案中，所述的用80-95％的乙醇回流提取穿心莲的干燥地上部分的步骤，进行两次(即用另外的80-95％的乙醇提取固体残留物一次)，每次约2小时，即96至144分钟，例如110至130分钟。在一些实施方案中，所述的任选地用另外的80％-95％的乙醇提取固体残留物是通过用另外的80％-95％的乙醇回流残留的固体约2小时(即96至144分钟，例如110至130分钟)来进行的。
在一些实施方案中，所述的穿心莲的干燥地上部分与80-95％的乙醇(或者与所述的另外的80-95％的乙醇)的比例(千克/升)为1∶5至1∶10，例如为1∶5至1∶6。
在一些实施方案中，所述的第一乙醇提取物的密度为1.0-1.1克/毫升。
在一些实施方案中，所加入的糊精的量以重量计是所用的穿心莲的干燥地上部分的约3％(即2.4至3.6％)。在一些实施方案中，所述糊精以溶液的形式加入，例如以水溶液的形式。
在一些实施方案中，所述水洗步骤指的是，于70-90℃、例如80-85℃下，在水中搅拌。在一些实施方案中，加入糊精之后所得的第一固体与水的比例(千克/升)为1∶5至1∶15，例如为1∶8至1∶12，或者1∶10。
在一些实施方案中，所述水洗步骤以本领域普通技术人员明了的适当的时间操作一次或多次，例如一次或两次。
在一些实施方案中，所述的用90-100％的乙醇提取的步骤，进行1-2次，例如2次，每次约1小时，即48分钟至72分钟，例如55至65分钟。
在一些实施方案中，第四步中使用的90-100％的乙醇为无水乙醇。
在一些实施方案中，第四步中使用的90-100％的乙醇为95％的乙醇。
在一些实施方案中，所述的用90-100％的乙醇提取可以是下列任何一个提取工艺：(1)于室温下搅拌，(2)加热至30-80℃并搅拌，或者(3)回流提取工艺。在一些实施方案中，用90-100％的乙醇提取指的是回流提取工艺，即在90-100％的乙醇中回流，例如在无水乙醇中回流。
在一些实施方案中，所使用的活性炭的量以重量计为加入糊精之后所得的第一固体的5-20％，例如20％。
在一些实施方案中，用活性炭脱色于50-80℃、例如70-80℃下，进行本领域普通技术人员明了的适当的时间。
在一些实施方案中，弱极性或非极性有机溶剂可以选自例如非极性溶剂，如烷烃类、进一步如己烷、石油醚和正庚烷，以及选自弱极性溶剂如甲基叔丁基醚。在一些实施方案中，弱极性或非极性有机溶剂为正庚烷。
在一些实施方案中，用弱极性或非极性有机溶剂洗涤的步骤是在15-30℃、例如20-30℃下，在本领域普通技术人员明了的适当的时间内进行的。在一些实施方案中，用弱极性或非极性有机溶剂洗涤的步骤指的是于15-30℃、例如20-30℃，在弱极性或非极性有机溶剂中搅拌本领域普通技术人员明了的适当的时间。
本文所公开的提取物的用途
本发明进一步公开了一种治疗个体中的自身免疫性疾病和炎症性疾病的方法，其包括给需要其的个体施用治疗有效量的本文所公开的提取物。
本发明进一步公开了本文所公开的提取物在治疗个体的自身免疫性疾病和炎症性疾病中的用途。
本发明进一步公开了本文所公开的提取物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗个体中的自身免疫性疾病和炎症性疾病。
在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病和炎症性疾病选自类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病(IBD)、银屑癣、系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)。
在一些实施方案中，所述炎性肠病为克罗恩病(CD)。
在一些实施方案中，所述炎性肠病为溃疡性结肠炎(UC)。
在一些实施方案中，提取物是一种药学上可接受的组合物的形式，所述组合物包含本文所公开的提取物。
在一些实施方案中，所述个体中FGF1和/或FGF2的表达水平在给个体施用治疗有效量的本文所公开的提取物之后升高。
组合物
本发明进一步公开了一种药物组合物，其包含本文所公开的提取物和一种药学上可接受的赋形剂(例如一种药学上可接受的载体)。
所述的包含本文所公开的提取物和一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其可以以固体剂型，例如胶囊和片剂口服施用。
也可以使用包含所述提取物和粉末状的赋形剂的明胶胶囊，其中的赋形剂可以是，例如乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸、二氧化硅等。类似的稀释剂可以用来制作压缩片剂。片剂和胶囊都可以制造成缓释产品，以在一段时间内提供持续的药物释放。压缩的片剂可以是糖包衣或薄膜包衣，以掩盖任何不可口的味道并保护片剂不受空气的影响，或者是肠包衣以在胃肠道中有选择性地崩解。例如，片剂可以用粘贴剂涂成薄膜包衣，粘贴剂是可以通过混合下列赋形剂制备得到：羟丙基甲基纤维素、丙二醇、二氧化钛和纯净水。
药学上可接受的赋形剂，例如选自能与本文所公开的提取物相容并且对所治疗的个体无害的赋形剂。例如，增溶剂如环糊精(其能与本文所公开的至少一种化合物和/或至少一种药学上可接受的盐形成特定的、溶解性更强的复合物)可用作药物赋形剂来递送本文所公开的提取物。其它赋形剂的例子包括胶态二氧化硅、硬脂酸镁、纤维素、十二烷基硫酸钠以及色素如D&C黄色10号(D&C Yellow#10)。合适的药学上可接受的赋形剂在本领域一本标准的参考书(Remington′s Pharmaceutical Sciences，A.Osol)中公开。
用于施用本文所公开的提取物的有用的药物剂型包括但不限于，硬明胶胶囊和软明胶胶囊，以及片剂。
所述施用的剂量将依赖于各种因素，如患者的年龄、健康和体重、疾病的程度、同时进行的治疗的类型(如有)、治疗的频率以及所期望的效果的性质。一般来说，活性成分的每日剂量可以变化，例如，从0.1至10000、如从0.1至2000毫克每天。例如，每天一次或多次10-500毫克可以有效地获得期望的结果。
在一些实施方案中，本文所公开的提取物在片剂或胶囊中的量可以是1、5、10、15、20、25、50、75、80、85、90、95、100、125、150、200、250、300、400或500毫克。
分析方法
1.提取物中总穿心莲内酯含量的qHNMR(定量HNMR)测定方法：
提取物中总穿心莲内酯的含量是通过qHNMR方法检测二萜内酯的三种典型类型(即A类型、B类型和C类型)来分析的。例如，AND属于A类型、DAND和NAND属于B类型、DDAND属于C类型。
1.1仪器和参数
NMR：Varian 400-MR或同等类型仪器；
探头：Varian 400ASW PFG
数据采集与处理系统：VNMRJ 4.0
脉冲序列：s2pul
温度：20-30℃
谱宽：6378Hz
延迟时间：12秒
脉冲宽度：10度
采样时间：2.569秒
扫描次数：32
1.2试剂
氘代试剂：DMSO-d6(包含四甲基硅烷，TMS)，J&K
内标物：2，3，5-三碘苯甲酸(TIBZ)，Amethyst
对照品：
AND，桂林三棱生物技术有限公司
DAND，自制
DDAND，自制
1.3样品溶液配制
取提取物样品(75±5毫克)和TIBZ(21±2毫克)，精密称定，并将其加入到5毫升离心管中。然后，加入DMSO-d6(1毫升)。振摇并超声至少20分钟至样品全部溶解，然后静置至室温。转移0.5毫升所述溶液至核磁管。
1.4样品测量
1.4.1定标及积分
a.将TMS的化学位移定为0ppm。采取手动积分法。
b.TIBZ的积分范围为8.246至8.360ppm。当TIBZ峰有偏移，可以适当调整积分范围，积分宽度保持不变，使TIBZ峰位于积分范围中央。
c.A类型二萜内酯的积分范围为6.578-6.670ppm。
d.B类型二萜内酯的积分范围为7.430-7.490ppm。
e.C类型二萜内酯的积分范围为7.610-7.680ppm。
f.将TIBZ的峰面积设定为1000。
1.4.2结果及计算
A类型二萜内酯的含量(XA％)是根据下面的等式计算：
其中，
As为A类型二萜内酯的峰面积
Ar为TIBZ的峰面积
Mr为TIBZ的重量，毫克
Pr为TIBZ的纯度，％
Wr为TIBZ的分子量
Ms为样品的重量
Ws为AND的分子量
类似地，B和C类型二萜内酯的含量(XB％和XC％)如上计算。
样品中总穿心莲内酯的含量(Xsum％)如下计算：
xsum％＝XA％+xB％+xC％。
2.AND、NAND、DAND和DDAND的HPLC测定方法
2.1仪器和参数
色谱系统：Waters AllianceTM2695HPLC，或同等类型仪器
色谱柱：Agilent Zorbax Extend C18，3.5um，150mm×4.6mm(PN：763953-902)
检测器：2487双波长检测器
检测波长：220nm
流动相：
A相：水
B相：乙腈
梯度表：
| 时间 | ％A | ％B |
| 0 | 90 | 10 |
| 5 | 82 | 18 |
| 23 | 81 | 19 |
| 26 | 72 | 28 |
| 47 | 69 | 31 |
| 49 | 10 | 90 |
| 53 | 10 | 90 |
| 55 | 90 | 10 |
| 60 | 90 | 10 |
流速：1.0毫升/分钟
柱温：35℃
进样量：10微升
洗脱时间：60分钟
2.2对照品溶液配制
2.2.1稀释液
甲醇。
2.2.2储备溶液配制
取DAND(50±1毫克)，精密称定，置于50毫升容量瓶中(瓶I)。然后，加入稀释液(约40毫升)。振摇并超声瓶I至少10分钟至DAND全部溶解。静置至室温后，以稀释液稀释到需要的体积。
取AND(75±1毫克)、NAND(25±1毫克)和DDAND(25±1毫克)，精密称定，共置于50毫升容量瓶中(瓶II)。精密移取瓶I溶液(5毫升)至瓶II中。然后，加入稀释液(约35毫升)。振摇并超声至少15分钟至固体全部溶解。静置至室温后，以稀释液稀释到需要的体积。
2.2.3工作标准溶液配制
精密移取储备溶液(10毫升)至50毫升容量瓶中，随后以稀释液稀释到需要的体积。
2.3样品溶液配制
取提取物样品(100±1毫克)，精密称定，置于100毫升容量瓶中。加入稀释液(约80毫升)。振摇并超声至少15分钟至样品全部溶解。静置至室温后，以稀释液稀释到需要的体积。
2.4结果及计算
样品中AND的含量(X％)是根据下面的等式计算：
其中，
X％：样品中AND的含量
Aspl：样品中AND的吸收值
As：工作标准溶液中AND的吸收值
Cs：工作标准溶液中AND的浓度，毫克/毫升
D：样品稀释因子，100
W：样品的重量，毫克
类似地，样品中NAND、DAND和DDAND的含量可如上计算。
实施例
下述实施例是对本发明的举例说明，不应理解为以任何方式限制本发明。所使用的数据(例如，量、温度等)力争保证其准确性，但是应当理解其会有一些实验误差和偏移。除非另外说明，否则所有份数均是重量份数，温度为摄氏度。
实施例1：穿心莲提取物的制备
用89％-91％的乙醇(1800升)回流提取穿心莲的干燥地上部分(300千克)2小时。收集乙醇相，并将89％-91％的乙醇(1500升)加入到残留物中，接着又回流2小时。将乙醇溶液通过80目的筛网过滤并合并，然后减压浓缩(温度：≤65℃，压力：-0.045～-0.100MPa)并通过40目的筛网过滤，得到密度为1.022克/毫升的湿混合物。将糊精(9千克，可获自法国罗盖特公司，产品代号TACKIDEX B167)溶解在水(143.96升)中，并将其加入到所述湿混合物中，然后喷雾干燥(进口：185-195℃；出口：95-115℃)得到26.45千克固体粉末。
将固体粉末(上一步中所得的26.45千克中的120克)加入到无水乙醇(1.2升)中。该混合物于70-75℃搅拌1小时，接着立即过滤。将活性炭(24克)加入到滤液中。所得混合物于60℃搅拌1小时，接着立即过滤。将乙醇滤液浓缩得到59.5克固体。
将固体(上一步中所得的59.5克中的52克)加入到520毫升水中。所得混合物于80℃搅拌1小时并过滤。将滤饼溶解于无水乙醇中并浓缩得到19.2克固体。
将固体(上一步中所得的19.2克中的19克)加入到570毫升正庚烷中。所得混合物于室温搅拌24小时并过滤。将滤饼干燥得到17克穿心莲提取物。
提取物的组分通过上述分析方法来确定。结果在下面的表1中显示。
实施例2：穿心莲提取物的制备
用89％-91％的乙醇(1800升)回流提取穿心莲的干燥地上部分(300千克)2小时。收集乙醇相，并将89％-91％的乙醇(1500升)加入到残留物中，接着又回流2小时。将乙醇溶液通过80目的筛网过滤并合并，然后减压浓缩(温度：≤65℃，压力：-0.045～-0.100MPa)并通过40目的筛网过滤，得到密度为1.005克/毫升的湿混合物。将糊精(9千克)溶解在水(134.29升)中，并将其加入到所述湿混合物中，然后喷雾干燥(进口：185-195℃；出口：95-115℃)得到33.44千克固体粉末。
将固体粉末(上一步中所得的33.44千克中的1.615千克)加入到无水乙醇(16.15升)中。该混合物于70-75℃搅拌1小时，接着立即过滤。将活性炭(323克)加入到滤液中。所得混合物于60℃搅拌1小时，接着立即过滤。将乙醇滤液浓缩得到805.8克固体。
将固体(上一步中所得的805.8克中的781.3克)加入到水(7.8升)中。所得混合物于80～85℃搅拌1小时并过滤。将滤饼溶解于无水乙醇中并浓缩得到318.2克固体。
将固体(上一步中所得的318.2克中的278.8克)加入到正庚烷(8.4升)中。所得混合物于23-25℃搅拌24小时并过滤。将滤饼干燥得到252.8克穿心莲提取物。
提取物的组分通过上述分析方法来确定。结果在下面的表1中显示。
实施例3：穿心莲提取物的制备
用89％-91％的乙醇(1800升)回流提取穿心莲的干燥地上部分(300千克)2小时。收集乙醇相，并将89％-91％的乙醇(1500升)加入到残留物中，接着又回流2小时。将乙醇溶液通过80目的筛网过滤并合并，然后减压浓缩(温度：≤65℃，压力：-0.045～-0.100MPa)并通过40目的筛网过滤，得到密度为1.005克/毫升的湿混合物。将糊精(9千克)溶解在水(134.29升)中，并将其加入到所述湿混合物中，然后喷雾干燥(进口：185-195℃；出口：95-115℃)得到33.44千克固体粉末。
将固体粉末(上一步中所得的33.44千克中的200.01克)加入到水(2升)中，并于80-82℃搅拌1小时。于80-82℃静置40分钟后，丢弃上清液，并将固体残留物加入到水(2升)中，接着于80-82℃搅拌1小时。将所得混合物于80-82℃再放置60分钟。倒掉上清液，并将固体残留物加入到无水乙醇(2升)中。该混合物于75-77℃加热并搅拌1小时，接着立即过滤。
将活性炭(40.0克)加入到前一步中所得的滤液中。所得混合物于75-77℃搅拌1小时，接着立即过滤。将滤液浓缩，随后将其磨碎并通过60目的筛网过筛得到34.27克固体。
将固体(上一步中所得的34.27克中的30.0克)加入到正庚烷(0.9升)中。所得混合物于25-26℃搅拌3小时，接着立即过滤。将滤饼干燥、磨碎并通过60目的筛网过筛得到29.25克穿心莲提取物。
提取物的组分通过上述分析方法来确定。结果在下面的表1中显示。
实施例4：穿心莲提取物的制备
用89％-91％的乙醇(1800升)回流提取穿心莲的干燥地上部分(300千克)2小时。收集乙醇相，并将89％-91％的乙醇(1500升)加入到残留物中，接着又回流2小时。将乙醇溶液通过80目的筛网过滤并合并，然后减压浓缩(温度：≤65℃，压力：-0.045～-0.100MPa)并通过40目的筛网过滤，得到密度为1.002克/毫升的湿混合物。将糊精(9千克)溶解在水(143.88升)中，并将其加入到所述湿混合物中，然后喷雾干燥(进口：185-195℃；出口：95-115℃)得到27.10千克固体粉末。
将固体粉末(上一步中所得的27.10千克中的4千克)加入到水(40升)中，并搅拌1小时(内部温度80℃)。于88℃(内部温度80℃)静置80分钟后，去除上清液。加入水(40升)并搅拌1小时(内部温度80℃)。于88℃(内部温度80℃)再静置60分钟后，去除上清液。加入无水乙醇(40升)并于82-85℃(内部温度75-76℃)搅拌1小时。
然后加入活性炭(0.8千克)并于82℃(内部温度75-76℃)搅拌1小时，接着立即过滤。将滤液浓缩至干，随后将其磨碎并通过60目的筛网过筛得到710克固体。
将固体(上一步中所得的710克中的700克)加入到正庚烷(210升)中。所得混合物于室温(内部温度26-27℃)搅拌3小时，接着立即过滤。将滤饼干燥、磨碎并通过60目的筛网过筛得到653.1克穿心莲提取物。
提取物的组分通过上述分析方法来确定。结果在下面的表1中显示。
实施例5-11：穿心莲提取物的制备
类似地，本文所公开的实施例5-11的穿心莲提取物根据实施例4中所描述的步骤得到。提取物的组分通过上述分析方法来确定。结果在下面的表1中显示。
表1.穿心莲提取物中4个单一化合物、总穿心莲内酯的含量
下列实施方案也在本发明公开的范围内
1.一种穿心莲提取物，其包含以重量计相对于提取物的重量含量为至少50％的总穿心莲内酯，其中所述穿心莲内酯包含AND、NAND、DAND和DDAND，其以重量计相对于提取物的重量含量分别为20.0至50.0％、2.0至15.0％、0.5至6.0％、以及5.0至20.0％。
2.如实施方案1所述的提取物，其包含以重量计相对于提取物的重量含量为至少50％的总穿心莲内酯，其中所述穿心莲内酯包含AND、NAND、DAND和DDAND，其以重量计相对于提取物的重量含量分别为20.0至50.0％、4.0至15.0％、0.5至6.0％、以及5.0至15.0％。
3.如实施方案1或2所述的提取物，其中总穿心莲内酯以重量计相对于提取物的重量含量为55.0至75.0％。
4.如实施方案1-3中任意一项所述的提取物，其中总穿心莲内酯以重量计相对于提取物的重量含量为55.0至70.0％。
5.如实施方案4中任意一项所述的提取物，其中总穿心莲内酯以重量计相对于提取物的重量含量为60.0至70.0％。
6.如实施方案1-5中任意一项所述的提取物，其中AND以重量计相对于提取物的重量含量为25.0至45.0％。
7.如实施方案6中任意一项所述的提取物，其中AND以重量计相对于提取物的重量含量为25.0至30.0％。
8.如实施方案6中任意一项所述的提取物，其中AND以重量计相对于提取物的重量含量为30.0至45.0％。
9.如实施方案1-8中任意一项所述的提取物，其中NAND以重量计相对于提取物的重量含量为2.0至12.0％。
10.如实施方案9中任意一项所述的提取物，其中NAND以重量计相对于提取物的重量含量为2.0至10.0％。
11.如实施方案10中任意一项所述的提取物，其中NAND以重量计相对于提取物的重量含量为2.0至9.0％。
12.如实施方案11中任意一项所述的提取物，其中NAND以重量计相对于提取物的重量含量为2.0至8.0％。
13.如实施方案12中任意一项所述的提取物，其中NAND以重量计相对于提取物的重量含量为2.0至6.0％。
14.如实施方案13中任意一项所述的提取物，其中NAND以重量计相对于提取物的重量含量为2.0至4.0％。
15.如实施方案1-8中任意一项所述的提取物，其中NAND以重量计相对于提取物的重量含量为4.0至12.0％。
16.如实施方案15中任意一项所述的提取物，其中NAND以重量计相对于提取物的重量含量为6.0至10.0％。
17.如实施方案16中任意一项所述的提取物，其中NAND以重量计相对于提取物的重量含量为6.0至9.0％。
18.如实施方案1-17中任意一项所述的提取物，其中DAND以重量计相对于提取物的重量含量为1.0至5.0％。
19.如实施方案18中任意一项所述的提取物，其中DAND以重量计相对于提取物的重量含量为1.0至4.0％。
20.如实施方案1-19中任意一项所述的提取物，其中DDAND以重量计相对于提取物的重量含量为5.0至15.0％。
21.如实施方案1-19中任意一项所述的提取物，其中DDAND以重量计相对于提取物的重量含量为10.0至15.0％。
22.如实施方案20中任意一项所述的提取物，其中DDAND以重量计相对于提取物的重量含量为5.0至10.0％。
23.如实施方案22中任意一项所述的提取物，其中DDAND以重量计相对于提取物的重量含量为6.0至9.0％。
24.一种药物组合物，其包含实施方案1-23中任意一项所述的提取物和一种药学上可接受的赋形剂。
25.一种治疗个体中的炎性肠病(IBD)的方法，其包括给需要其的个体施用治疗有效量的实施方案24所述的药物组合物。
26.如实施方案25所述的方法，其中所述炎性肠病(IBD)为克罗恩病或溃疡性结肠炎。
体外生物活性实验
实验1：对IL-1β表达的抑制作用
在IBD患者的炎症性肠粘膜中，固有层树突细胞和巨噬细胞是重要的抗原呈递细胞。这些细胞由于共生微生物的成分刺激和Toll样受体信号的传导而发生活化，产生大量的促炎细胞因子，例如IL-1β等。与健康受试者相比，在CD和UC患者的肠粘膜中发现IL-1β水平显著升高，表明在该疾病中IL-1β的活化增加。大量证据表明IL-1β在结肠炎症的发生中起着关键作用。抑制IL-1β可能是IBD(如CD和UC)的有效治疗方法之一。[NeurathMF.Cytokines in inflammatory bowel disease.Nat Rev Immunol.2014May；14(5)：329-42]
在脂多糖(脂多糖是革兰氏阴性细菌外膜的化学物质)诱导的人THP-1细胞实验体系中评价了本文所公开的样品和对照品1穿心莲提取物的体外抑制活性。对照品1在WO2009/059158的公开范围内，按WO 2009/059158中的提取方法制备。
THP-1细胞(来自ATCC，货号：TIB-202)用约20mL培养基(RPMI-1640，10％热灭活的胎牛血清和0.1％55mM的2-巯基乙醇和1％的GlutaMAX)培养在75cm2培养瓶(Corning，货号：430641)中，培养条件为37℃、5％CO2。其传代方法是将细胞每3天传代至2×105细胞/mL或者每2天传代至3×105细胞/mL。实验时，收集THP-1细胞悬浮液并以1000rpm离心5分钟，去除上清液，将细胞重新悬浮于新鲜培养基中，测定细胞密度并调整密度至6×105细胞/mL。将细胞接种到96孔板(BD falcon，货号：353072)中，并在37℃、5％CO2的条件下孵育培养，直至加入待测样品。
穿心莲提取物的两个样品在DMSO中进行梯度稀释，并进一步在培养基中稀释。其中的一个样品在WO 2009/059158的公开范围内，为对照品1。另一个样品在本文披露的提取物的范围内，为“实施例1”。将梯度稀释后的样品溶液加入细胞孔中。对照品1和实施例1的最终浓度分别为：300、120、48、19.2、7.68、3.07、1.23、0.49、0.20和0.08μg/mL。孵育30分钟后，将刺激剂LPS/PMA的混合物加入细胞中，最终浓度分别为LPS 1μg/mL、PMA 10ng/mL。然后，在37℃、5％CO2的条件下孵育约18小时。同时，按照ELISA试剂盒说明书，对ELISA板进行包被，每孔加入100μL包被抗体，并在室温下孵育过夜。
次日，取出细胞培养板，以900rpm离心10分钟。将120μL/孔的上清液转移到新的96孔板中。用商业化IL-1β ELISA试剂盒(R&D systems，货号：DY201)检测上清液中的IL-1B含量。最后，用分光光度计测定各孔的OD值。通过校正后的平均OD值和IL-1β标准曲线来确定每个样品IL-1β的浓度(C)。计算抑制率，方法如下：
其中，C测试样品指细胞经测试样品和刺激剂LPS/PMA孵育后的IL-1β浓度，CLPS/PMA指仅用刺激剂LPS/PMA孵育的细胞的IL-1β浓度。使用四参数模型拟合，将最低值设为0，将最高值设为100，计算IC50。将实施例1的IC50与对照品1的IC50进行比较得到的相对活性作为最终结果。相对活性的计算公式如下：
类似地，本文所公开的其它穿心莲提取物(“实施例2-6”)也进行测试。结果表明，实施例1-6比对照品1具有强得多的活性，相对活性值为419.2％(平均值)(n＝6)。结果见表2。
表2.在THP-1细胞中对LPS/PMA诱导的IL-1β蛋白表达的抑制作用
实验2：对NF-κB激活的抑制作用
肠上皮细胞、淋巴细胞和巨噬细胞中细胞因子表达的失调和信号传导的失调与IBD的发病机制相关，在这一复杂系统中转录因子NF-κB是主要的调节因子之一。在IBD病人肠道的炎症部位中NF-κB存在过表达和活化的情况，尤其是在巨噬细胞和上皮细胞中，并且NF-κB的增强程度与肠道炎症的严重程度显著相关。在IBD患者中，粘膜巨噬细胞中NF-κB的高表达伴随着促炎细胞因子表达和分泌的增加，如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12和IL-23等，导致持续的粘膜炎症和组织损伤。阻断NF-κB的激活已经成为IBD的治疗策略之一。例如，皮质类固醇能够抑制NF-κB活化。与此一致的是，接受糖皮质激素治疗的IBD患者结肠的单核细胞、上皮细胞和内皮细胞的NF-κB活化程度显著低于未经治疗的患者。[Atreya l.，等.NF-κB in inflammatory bowel disease.J Intern Med.2008Jun.；263(6)：591-6]
在HEK293/NF-κB荧光素酶报告基因系统中评估了本文中披露的样品和对照品1对TNF-α诱导的NF-κB激活的抑制活性。
本实验中使用的细胞是HEK293/NF-κB-luc稳定细胞株(Panomics，货号：RC0014)，为贴壁细胞。细胞培养在含有10％FBS的DMEM培养基中，并于37℃、5％CO2的条件下孵育。当细胞融合度达到90％时进行传代。在本实验中，用胰酶消化细胞并重悬在培养基中，测定细胞密度并将密度调至3×105细胞/mL。然后将细胞种至96孔板中，并置于37℃、5％CO2孵育过夜。
穿心莲提取物的两个样品，实施例1和对照品1，以及阳性对照IKK-2抑制剂lV(Calbiochem，货号：401481)在DMSO中进行梯度稀释，并进一步在培养基中稀释。将稀释后的样品溶液加入细胞中。对照品1和实施例1的最终浓度分别为：300、120、48、19.2、7.68、3.07、1.23和0.49μg/mL。IKK-2抑制剂IV的最终浓度为：10、4、1.6、0.64、0.26、0.10、0.041和0.016μM。将板置于37℃、5％CO2孵育30分钟。然后加入刺激剂rhTNFα，其终浓度为10ng/mL，在37℃、5％CO2的条件下孵育约6小时。
孵育结束后，弃去细胞上清液，加入细胞裂解液。将细胞板置于-70℃约20分钟，然后取出。待细胞裂解液解冻后，转移至白色96孔平底板。用商业化的荧光素酶检测系统(Promega，货号：E2520)检测NF-κB的激活水平。用仪器Victor3(Perkin Elmer)测量光信号值(L)。计算抑制率，公式如下：
其中，L测试样品指细胞经测试样品和刺激剂孵育后的光信号值；L最大信号指仅用刺激剂孵育的细胞的光信号值；L最小信号指未用测试样品和刺激剂孵育的细胞的光信号值。使用“XLfit”软件计算IC50。将实施例1的IC50与对照品1的IC50进行比较得到的相对活性作为最终结果。相对活性的计算公式如下：
类似地，其它穿心莲提取物(“实施例2-6”)也进行测试。结果表明，实施例1-6比对照品1具有强得多的活性，相对活性值为418.5％(平均值)(n＝6)。结果见表3。
表3.对NF-κB激活的抑制作用
实验3：对促炎基因调控的影响
在炎性肠病中，细胞因子调控了炎症反应的多个方面，因此，对疾病的发生发挥了重要的作用。其中，IBD中促炎因子和抑炎因子的失衡阻碍了炎症的恢复，使疾病持续存在，并诱发组织损伤。研究表明，TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-12p40等促炎因子对粘膜炎症的发生有重要作用。例如，TNF-α通过激活NF-κB、RIP激酶(receptor-interacting proteinkinases)及caspase 3通路，在炎性肠病中发挥了多种促炎作用，如促进血管生成、诱导潘氏细胞坏死性凋亡、诱导成纤维细胞表达基质金属蛋白酶、激活巨噬细胞与效应T细胞、激活肌球蛋白轻链激酶，进而引起肠上皮细胞损伤。肠道发生炎症时IL-12家族细胞因子由抗原递呈细胞产生，可维持局部的Th17细胞应答，并抑制调节性T细胞的活性。针对促炎因子的抗体疗法，在治疗包括炎性肠病在内的各种自免疫性疾病中取得了巨大成功。例如，抗TNF-α抗体infliximab可促进中重度炎症性肠病患者粘膜修复，显示出良好的临床疗效[Darcy M.，等，Ulcerative Colitis.2015Decision resources Group]。此外，IL-12和IL-23共有亚基p40的特异性抗体Ustekinumab，在治疗活跃性克罗恩病患者的过程中展现出良好的临床响应，对不响应TNF抗体疗法的病人，效果尤佳[Yu QH.，等.Crohn’sDisease.2015Decision Resources Group]。
实施例1对促炎因子表达的抑制作用，在LPS刺激的人外周血单核细胞中进行了体外评价。作为对照，也测量了5-氨基水杨酸(5-ASA)对促炎因子表达的影响。
人外周血单核细胞(hPBMCs)从健康人血液中通过Ficoll密度梯度分离获得，并保存在液氮中备用。实验时，细胞从液氮中取出解冻并离心。然后将细胞重悬于新鲜培养基中(含10％灭活血清的RPMI-1640培养基)，培养过夜。接种时，测定细胞密度并将密度调整至1×106细胞/mL后接种于96孔板，并置于37℃、5％CO2环境下培养。
两种穿心莲提取物，对照品1和实施例1在DMSO中进行梯度稀释，并进一步在培养基进行稀释。将稀释的溶液依次加入细胞中，置于37℃、5％CO2培养约30分钟。然后向细胞中添加刺激剂LPS或抗CD3单克隆抗体与抗CD28单克隆抗体混合物。刺激剂的终浓度为：LPS为1μg/mL，抗CD3单克隆抗体为1μg/mL，抗CD28单克隆抗体为0.5μg/mL。将板置于37℃、5％CO2环境下继续培养约5小时。收集细胞并去除上清液。并加入150μL/孔RLT缓冲液。将板保存于-80℃直至抽提RNA。
使用RNeasy 96试剂盒(QIAGEN)抽提细胞总RNA，并以High Capacity cDNA RT试剂盒(Applied Biosystems)进行反转录，合成cDNA。最后用SYBR Premix Ex Taq TM II(TakaRa)进行实时定量PCR检测基因的表达情况。GAPDH作为内参基因(引物序列见表4)。通过q-PCR分析的基因的表达量以内参基因GAPDH进行归一化，并以2-ΔΔCT法进行分析。计算公式如下：
其中：
CT测试样品为经过测试样品及刺激剂处理的细胞中，目标基因的CT值；
CT测试样品-GAPDH为经过测试样品及刺激剂处理的细胞中，GAPDH基因的CT值；
CT最小信号为未经过测试样品及刺激剂处理的细胞中，目标基因的CT值；
CT最小信号-GAPDH为未经过测试样品及刺激剂处理的细胞中，GAPDH基因的CT值；
抑制率计算方法如下：
其中：
Fold测试样品为经过测试样品及刺激剂处理的细胞中的相对表达量；
Fold最大信号为仅经过刺激剂处理的细胞中的相对表达量；
Fold最小信号为未经过测试样品及刺激剂处理的细胞中的相对表达量；
结果显示，在人外周血单核细胞hPBMC中，实施例1剂量依赖性地显著抑制LPS诱导的TNFα、IL-1β、IL-6、IL-12p40、IL-18及Cox2基因的mRNA表达(图1)。同时，实施例1也抑制抗CD3抗体/抗CD28抗体诱导的CCL-20和IFNγ基因在hPBMC中的mRNA表达(图2)。
实验4：对趋化因子基因表达的影响
趋化因子是一类具有定向细胞趋化功能的细胞因子，在宿主防御及炎症发生过程均发挥重要作用。当机体受到炎刺激时，促炎趋化因子可由多种细胞产生并释放，进而从血液中招募中性粒细胞、单核细胞等白细胞及其他效应细胞至炎症部位及组织受损处发挥生物学功能。
由于趋化因子CCL-20及其同源受体CCR6在炎性肠病(IBD)患者中过度表达[Skovdahl HK.，等.Expression of CCL-20and its corresponding receptor CCR6isenhanced in active inflammatory bowel disease.and TLR3mediates CCL-20expression in colonic epithelial cells.PLoS One.2015Nov 4；10(11)：e0141710]，因此受到研究者的广泛关注。最近的研究表明，CCL-20是炎性肠病的易感基因，多种细胞受到炎性因子刺激时，均可表达CCL-20。此外，CCL-20还可介导Treg、Th17、B细胞及未成熟的树突细胞等CCR6阳性效应细胞迁移至肠道粘膜。因此，阻断CCL-20通路可能为炎性肠病的治疗带来有益的效果。
实验中，我们使用了HT29和T84两种贴壁上皮细胞。HT29细胞培养在含有10％FBS的McCoy′s 5a培养基中，T84细胞培养在含有5％FBS的DMEM/F-12(1：1)培养基中。所有细胞在37℃、5％CO2环境下培养。当细胞融合度达到90％时，进行传代。实验时，细胞以胰蛋白酶消化，重悬于培养基中。测定细胞密度并将密度调整至1×106细胞/mL后接种于96孔板，并置于37℃、5％CO2环境下培养过夜。
两种穿心莲提取物，对照品1和实施例1以DMSO进行连续稀释，再以培养基进一步稀释后，将稀释的溶液加入细胞中。对照品1终浓度为300、100、30及10μg/mL；实施例1终浓度为100、30、10及1μg/mL。将板置于37℃、5％CO2培养30分钟后，加入刺激剂rhTNFα，其终浓度为50ng/mL。将板置于37℃、5％CO2继续培养约5小时。去除上清液，并加入150μL/孔RLT缓冲液。将板保存于-80℃直至RNA抽提。
使用RNeasy 96试剂盒(QIAGEN)抽提细胞总RNA，并以High Capacity cDNA RT试剂盒(Applied Biosystems)进行反转录合成cDNA。最后用SYBR Premix Ex Taq TM II(TakaRa)进行实时定量PCR检测基因的表达情况。GAPDH作为内参基因(引物序列见表4)。通过q-PCR分析的基因的表达量对内参基因GAPDH进行归一化，并以2-ΔΔCT法进行分析。计算公式如下：
其中：
CT测试样品为经过测试样品及刺激剂处理的细胞中，目标基因的CT值；
CT测试样品-GAPDH为经过测试样品及刺激剂处理的细胞中，GAPDH基因的CT值；
CT最小信号为未经过测试样品及刺激剂处理的细胞中，目标基因的CT值；
CT最小信号-GAPDH为未经过测试样品及刺激剂处理的细胞中，GAPDH基因的CT值；
抑制率计算方法如下：
其中：
Fold测试样品为经过测试样品及刺激剂处理的细胞中的相对表达量；
Fold最大信号为仅经过刺激剂处理的细胞中的相对表达量；
Fold最小信号为未经过测试样品及刺激剂处理的细胞中的相对表达量；
结果显示，实施例1显著抑制T84细胞中CCL-20、CXCL-9、CXCL-10、CXCL-11的表达(图3)，同时显著抑制HT29细胞中CCL-20、CXCL-10、CXCL-11、CXCL-16的表达(图4)。
实验5：对生长因子基因表达的影响
粘膜修复已经成为IBD的一个重要治疗目标，它可以预测病人的持续临床缓解状况。肠上皮的完整的屏障功能是粘膜修复的结构基础，它能防止共生细菌进入粘膜层和粘膜下层激活免疫细胞。因此，粘膜修复应被认为是抑制肠壁深层炎症的起点，而不是肠道炎症完全愈合的标志。
粘膜修复依赖于肠上皮细胞的复原、增殖和分化，其中表皮生长因子(EGF)扮演着重要的角色。在IBD患者中观察到血清中EGF的水平显著低于健康人。有趣的是，在针对UC病人的临床试验中，局部给予重组EGF的短期治疗使病人获得了临床缓解，这表明EGF在该疾病的治疗中发挥了有益的作用。[Huynh E.，等.EGF and EGFR：promising targets formodulating inflammation and mucosal healing therapy in IBD.Inflamm CellSignal.2015；2(3)：e840]。在一治疗伴有坏疽性脓皮病的IBD的案例中，每日局部应用EGF能在2周内促进伤口的显著愈合，即使降低甾体激素的使用5个月也达到了完全的伤口愈合。研究表明，UC病人接受治疗时辅以重组人EGF蛋白局部应用，有利于病情缓解[KrishnanK.，et al.Intestinal growth factors：potential use in the treatment ofinflammatory bowel disease and their role in mucosal healing.InflammatoryBowel Diseases.2011；17(1)：410-22]。
成纤维细胞生长因子家族由至少18个肝素结合肽(FGF1-FGF18)和致癌基因组成。FGF1和FGF 2通常分别被称为酸性FGF(aFGF)和碱性FGF(bFGF)。FGF家族成员普遍可以增强细胞增殖、调节细胞分化、加速细胞迁移、血管生成以及细胞外基质重塑。FGF1是治疗受损伤口愈合的最有希望的细胞因子之一。先前的研究也表明，在IBD病人中包括FGF-2在内的几种生长因子表达量升高，推测它们可能与上皮的修复相关。此外也有研究报道在活跃的IBD患者血清中升高的FGF-2水平可能会促进粘膜愈合和/或肠道纤维生成。
在人HT29细胞株和人T84细胞系中研究了对EGF和FGF表达的促进作用。
本试验中使用了两种贴壁上皮细胞株：HT29和T84。HT29细胞培养在含有10％FBS的McCoy’s 5a培养基中，而T84细胞则用含有5％FBS的DMEM/F-12(1∶1)培养基培养。所有细胞都在37℃、5％CO2的环境中培养。当细胞融合度达到90％时传代培养。
在本实验中，细胞经胰蛋白酶消化后用培养基重悬。测定细胞密度并调整细胞密度至1×106细胞/mL。然后将细胞接种于96孔板中，在37℃、5％CO2的环境中培养过夜。
穿心莲提取物的两个样品，实施例1和对照品1在DMSO中进行梯度稀释，并进一步在培养基中稀释。将稀释后的溶液加入细胞中。对照品1的最终浓度为：300、100、30和10μg/mL；实施例1的最终浓度为：100、30、10和1μg/mL。将板置于37℃、5％CO2的环境中孵育约24小时。去除上清液，并加入150μL/孔RLT缓冲液。将板保存于-80℃直至抽提RNA。
使用RNeasy 96试剂盒(QIAGEN)抽提细胞总RNA，并以High Capacity cDNA RT试剂盒(Applied Biosystems)进行反转录，合成cDNA。最后用SYBR Premix Ex Taq TM II(TakaRa)进行实时定量PCR检测基因的表达情况。GAPDH作为内参基因(引物序列见表4)。通过q-PCR分析的基因的表达量以内参基因GAPDH进行归一化，并以2-ΔΔCT法进行分析。计算公式如下：
其中：
CT测试样品为经过测试样品处理的细胞中，目标基因的CT值；
CT测试样品-GAPDH为经过测试样品处理的细胞中，GAPDH基因的CT值；
CT最小信号为未经过测试样品处理的细胞中，目标基因的CT值；
CT最小信号-GAPDH为未经过测试样品处理的细胞中，GAPDH基因的CT值；
结果显示，在HT29和T84细胞中，实施例1和AND均上调了EGF的mRNA表达(图5)。在T84细胞中，实施例1还上调了FGF1和FGF2的mRNA表达，而单独的AND没有类似作用。这表明对FGF1和FGF2的上调作用与AND无关(图6)。
类似地，按照上述方法测定实施例10的穿心莲提取物在上皮细胞系HT29和T84中对EGF、FGF1和FGF2mRNA表达的增强影响。结果如图7-8所示。实施例10导致了EGF以及FGF1和FGF2mRNA表达的增加。100μg/ml实施例10的效果显著好于100μg/ml对照品1的效果。
表4引物序列
实验6：对生长因子基因调控的影响
在人T84细胞株中研究实施例7的穿心莲提取物和四个单体成分AND、NAND、DAND和DDAND对FGF1表达的促进作用。
本试验中使用贴壁上皮细胞株T84。为了维持细胞培养，T84细胞用含有5％FBS的DMEM/F-12(1∶1)培养基培养。所有细胞都在37℃、5％CO2的环境中孵育。当细胞融合度达到90％时传代培养。
在本实验中，细胞经胰蛋白酶消化后用培养基重悬。确定并调整细胞密度至1×106细胞/mL。然后将细胞接种于96孔板中，并在37℃、5％CO2的环境中培养过夜。
穿心莲提取物的两个样品，实施例7和对照品1，以及单体AND、NAND、DAND、DDAND和它们的混合物(命名为4个单体混合物，其中AND、NAND、DAND、DDAND按重量计各占所述混合物重量的69％、11％、5％和15％)，在DMSO中进行梯度稀释，并进一步在培养基中稀释。将稀释后的溶液加入细胞孔中。对照品1的最终浓度为：300和100μg/mL。实施例7的最终浓度为100μg/mL。AND的最终浓度为40μg/mL，NAND、DAND和DDAND的最终浓度为10μg/mL。4个单体混合物的最终浓度为100和30μg/mL。将板置于37℃、5％CO2的环境中孵育约24小时。去除上清液，并加入150μL/孔RLT缓冲液。将板保存于-80℃直至抽提RNA。
使用RNeasy 96试剂盒(QIAGEN)抽提细胞总RNA，并以High CapacitycDNA RT试剂盒(Applied Biosystems)进行反转录，合成cDNA。最后用SYBR Premix ExTaq TM II(TakaRa)进行实时定量PCR检测基因的表达情况。GAPDH作为内参基因(引物序列见表5)。通过q-PCR分析的基因的表达量以内参基因GAPDH进行归一化，并以2-ΔΔCT法进行倍数改变分析。计算公式如下：
其中：
CT测试样品为经过测试样品处理的细胞中，目标基因的CT值；
CT测试样品-GAPDH为经过测试样品处理的细胞中，GAPDH基因的CT值；
CT最小信号为未经过测试样品处理的细胞中，目标基因的CT值；
CT最小信号-GAPDH为未经过测试样品处理的细胞中，GAPDH基因的CT值；
结果如图9所示。与实施例10类似，实施例7明显上调了FGF1mRNA表达。100μg/ml实施例7的效果好于100μg/ml对照品1的效果。各单体化合物，AND，NAND，DAND，DDAND，均未表现出类似的FGF1上调作用。而4个单体的混合物在100μg/ml对FGF1的表达有微弱的上调作用，但效果明显地弱于100μg/ml实施例7。
表5引物序列
| 目标基因 | 上游引物 | 下游引物 |
| 人FGF1 | GATGGCACAGTGGATGGGAC | AAGCCCGTCGGTGTCCATGG |
| 人GAPDH | TCGACAGTCAGCCGCATCTTCTTT | ACCAAATCCGTTGACTCCGACCTT |
实验7：实施例10和11对DNBS诱导的大鼠肠炎预防模型的体内功效
1.实验材料
1.1.受试化合物及配制方法
受试样品：穿心莲提取物：实施例10(用于下面的实验一)；和实施例11(用于下面的实验二)。
对照药：对照品1；和柳氮磺胺吡啶(Sulfasalazine，SASP)，Sigma-Aldrich，CatS0883。
受试样品和对照品1的口服混悬液的配制过程如下：称取实施例10和11的提取物和对照品1，于50mL离心管中，加入适量的0.5％羧甲基纤维素钠(0.5％CMC-Na)，超声15分钟，得到不同浓度的混悬液。制剂在临用前配制，避光保存，使用前振荡均匀后给药。动物给药体积为10mL/kg。
SASP口服混悬液的配制过程如下：称取SASP，于50mL离心管中加入适量的0.5％羧甲基纤维素钠(0.5％CMC-Na)，超声15分钟，得到浓度为30mg/mL混悬液。制剂在临用前配制并避光保存，使用前振荡均匀后给药。动物给药体积为10mL/kg。
1.2.实验动物：
雄性Wistar大鼠，110-130g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
1.3.实验试剂
DNBS(2，4-二硝基苯磺酸)：东京化工有限公司(日本)；货号：D2275。
羧甲基纤维素钠(CMC-Na)：Sigma-Aldrich，货号：C9481。
舒泰(Zoletil)：Tiletamine-zolazepam；VirbacS.A，Garros，France
塞拉嗪(xylazine)：吉林省华牧动物保健品有限公司，兽药字(2015)070011777。
2.实验方法
2.1.动物分组和给药方案
表6.本发明的穿心莲提取物治疗DNBS诱导的大鼠结肠炎模型的分组及给药方案
*SASP组：SASP组动物在第一天在造模前两小时给溶媒对照，造模后4小时给SASP一次，此后连续五天，每日给药一次。
2.2.模型构建
Wistar大鼠随机分组。禁食大鼠用舒泰(25mg/kg)和噻拉嗪(0.5mg/kg)麻醉后，采用结肠内滴注0.25mL溶于30％乙醇的10或12mg DNBS诱发结肠炎，空白对照组大鼠结肠内仅滴注30％乙醇。
2.3.观察指标
体重：在分组当天及以后每天测量大鼠体重。
腹泻评分：从造模后第三天开始，每天对动物的粪便稠度进行评分。评分标准：0分，成型便；1分，湿润/粘稠粪便；2分，松散粪便；3分，水样粪便。
结肠称重及长度测量：从造模后第6天在末次给药后4小时处死大鼠，中线切开以打开腹腔，观察结肠与其它器官的粘连程度。取盲肠端至直肠端结肠全段，清空内容物、用生理盐水清洗干净，对结肠测量长度、称重，计算结肠重量与结肠长度的比重率(结肠重量/长度)。
病理组织学分析：选取结肠组织中包含肉眼可见溃疡的一段制备瑞士卷，10％中性福尔马林溶液固定，二甲苯脱水，石蜡包埋，切片，苏木精和曙红(H&E)染色。根据参考文献(David Prescott，BSc，et al.Loss of Phosphoinositide 3-Kinase p110γisProtective in the Acute Phase but Detrimental in the Resolution Phase ofHapten-Induced Colitis，Inflamm Bowel Dis.Volume 19，Number3，March 2013)的评分标准，对组织切片进行病理学变化的判读，每个样本的病变情况分级由以下10个评分标准的总和进行半定量分析(见表7)。
表7结肠组织病理学变化的评分标准
2.4.统计分析
所有数据以均值±标准差来表示。
体重用GraphPad Prism 6.0软件以重复多次测量方差分析(Repeated-measuresANOVA methods)。然后用Fisher′s Least Significant Difference(LSD)test作显著性分析，计算p值，*p＜0.05为与溶媒对照组差异具有显著性意义，**p＜0.01为与溶媒对照组差异具有极显著性意义。
每个动物结肠比重抑制率按以下公式计算，其中CW为结肠重量，CL为结肠长度：
结肠长度和结肠比重数据使用GraphPad Prism 6.0软件进行统计分析。根据数据分布的正态性，各给药组与溶媒组之间两两比较用正态分布(Unpairedttest)或非正态分布(Mann-Whitney test)作显著性分析。
溶媒对照组和给药组之间的腹泻评分和病理评分差异，使用GraphPad Prism 6.0软件的Mann-Whitney test非参数检验的统计学方法进行分析。*p＜0.05为与溶媒对照组差异具有统计学显著性，**p＜0.01为与溶媒对照组差异具有统计学极显著性。
3.实验结果与讨论
3.1.本发明的提取物对DNBS诱导的结肠炎大鼠腹泻评分及体重的影响
Wistar大鼠在造模后第二天出现严重腹泻，维持到第四天，第四天开始逐渐缓解。于第三天开始每天进行腹泻评分。本发明的提取物40mg/kg/天组与溶媒组比较缓解了疾病进展，于给药第三天至第六天减轻腹泻程度；并且在第三天和第四天对腹泻的减轻效果看上去好于阳性药SASP(300mg/kg/天)和“对照品1”130mg/kg/天。
与空白对照相比，模型溶媒组Wistar大鼠在造模后第二天体重增长趋势显著减缓。本发明的提取物(5～40mg/kg/天)能在一定程度上恢复体重增长。药效类似于阳性药SASP(300mg/kg/天)和“对照品1”130mg/kg/天给药组。
口服5～40mg/kg/天本发明的穿心莲提取物对DNBS诱导的大鼠结肠炎模型表现出在体重和腹泻方面有一定的改善作用，而且表现出一定的剂量依赖关系，其在40mg/kg/天剂量下效果最为显著。
3.2本发明的提取物对DNBS诱导结肠炎的大鼠结肠比重的影响
从以下数据可以看出，在实验结束后，本发明的提取物处理组中结肠比重显著减轻(表8)。20mg/kg/天和40mg/kg/天给药组的结肠比重抑制率达到大约40％左右，与阳性药SASP(300mg/kg/天)和“对照品1”130mg/kg/天作用程度相似。
表8在DNBS诱导的结肠炎模型中结肠重量和结肠长度的比值
*p＜0.05vs.溶媒对照，**p＜0.01vs.溶媒对照，***p＜0.001vs.溶媒对照，
3.3本发明的提取物对改善DNBS诱导的结肠炎模型的病理评分的影响
空白对照组中，所有结肠样品都有局灶的炎性细胞浸润，未见粘膜溃疡。溶媒对照组中，病理改变表现为7只大鼠结肠样品出现严重粘膜溃疡，正常粘膜结构严重破坏，大量炎性细胞浸润、甚至累及肠壁全程，粘膜水肿和肠壁肌层增厚的病理变化：1只大鼠结肠样品仅有轻微的炎性细胞浸润灶病变表现。阳性药SASP(300mg/kg/天)给药组，5只大鼠结肠样品出现重度的溃疡和炎性细胞浸润，3只大鼠结肠样品仅出现轻微的炎性细胞浸润灶，未见明显溃疡，但该组中大部分大鼠的结肠样品都有粘膜水肿的病变。本发明的提取物(10，20，40mg/kg/天)给药组，每组有5只大鼠结肠样品出现中度到重度的溃疡，大量炎性细胞浸润和肌层增厚；每组其他3只大鼠结肠只有炎性细胞浸润灶，没有明显溃疡；所有大鼠的结肠都有粘膜水肿的病变。
从组织病理评分结果分析，和溶媒对照组相比，本发明的提取物(10，20，40mg/kg/天)处理组中，组织病理评分显著降低，其中40mg/kg/天实施例10处理组与300mg/kg/天的SASP处理组具有相当的组织病理评分。本发明的提取物20和40mg/kg/天给药剂量对DNBS诱导的大鼠结肠炎模型的组织病理学变化有明显的改善作用，主要表现在减少溃疡面积及严重溃疡损伤百分数，炎性细胞浸润，粘膜水肿，肌层增厚方面(表9)。
表9本发明的提取物对DNBS诱导的结肠炎模型中结肠组织病理评分的影响
注：与溶媒对照组相比，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01。
Claims (12)
1.一种穿心莲提取物，其包含以重量计相对于提取物的重量含量为至少50.0％的总穿心莲内酯，其中所述总穿心莲内酯包含AND、NAND、DAND和DDAND，其以重量计相对于提取物的重量含量分别为20.0至50.0％、2.0至15.0％、0.5至6.0％、以及5.0至20.0％。
2.如权利要求1所述的提取物，其中，总穿心莲内酯以重量计相对于提取物的重量含量为55.0至75.0％，其中所述总穿心莲内酯包含AND、NAND、DAND和DDAND，其以重量计相对于提取物的重量含量分别为20.0至50.0％、4.0至15.0％、0.5至6.0％、以及5.0至15.0％。
3.如权利要求1所述的提取物，其中，总穿心莲内酯以重量计相对于提取物的重量含量为55.0至75.0％，其中所述总穿心莲内酯包含AND、NAND、DAND和DDAND，其以重量计相对于提取物的重量含量分别为25.0至45.0％、4.0至12.0％、1.0至5.0％、以及5.0至10.0％。
4.如权利要求1所述的提取物，其中总穿心莲内酯以重量计相对于提取物的重量含量为55.0至75.0％，其中所述总穿心莲内酯包含AND、NAND、DAND和DDAND，其以重量计相对于提取物的重量含量分别为30.0至45.0％、6.0至10.0％、1.0至5.0％、以及5.0至10.0％。
5.一种制备权利要求1-4中任意一项所述的提取物的工艺，其包括以下步骤：
-用80％-95％的乙醇回流提取穿心莲的干燥地上部分；任选地用另外的80％-95％的乙醇提取固体残留物，合并乙醇相；收集乙醇相并去除溶剂，得到第一乙醇提取物；
-将糊精加入到第一乙醇提取物中；并将所得的混合物干燥，得到第一固体；
-用90％-100％的乙醇提取第一固体；收集乙醇相并用活性炭脱色；收集液相并去除溶剂，得到第二固体；
-用水洗涤第二固体；收集所得的固体残留物；以及
-用弱极性或非极性有机溶剂洗涤在水洗步骤中得到的固体残留物；收集所得的固体残留物，得到穿心莲提取物。
6.一种制备权利要求1-3中任意一项所述的提取物的工艺，其包括以下步骤：
-用80％-95％的乙醇回流提取穿心莲的干燥地上部分；任选地用另外的80％-95％的乙醇提取固体残留物，合并乙醇相；收集乙醇相并去除溶剂，得到第一乙醇提取物；
-将糊精加入到第一乙醇提取物中；并将所得的混合物干燥，得到第一固体；
-用水洗涤第一固体；收集所得的固体残留物；
-用90-100％的乙醇提取在水洗步骤中得到的固体残留物；收集乙醇相并用活性炭脱色；收集液相并去除溶剂，得到第二固体；
-用弱极性或非极性有机溶剂洗涤第二固体；收集所得的固体残留物，得到穿心莲提取物。
7.通过权利要求5的方法制备的穿心莲提取物。
8.通过权利要求6的方法制备的穿心莲提取物。
9.一种药物组合物，其包含权利要求1-4和7-8中任意一项所述的提取物和一种药学上可接受的赋形剂。
10.一种治疗个体中的自身免疫性疾病和炎症性疾病的方法，其包括给需要其的个体施用治疗有效量的权利要求9所述的药物组合物。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述自身免疫性疾病和炎症性疾病选自类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病(IBD)、银屑癣、系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述炎性肠病为溃疡性结肠炎或克罗恩病。
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