CN114636764B - 穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分筛选方法，将穿心莲总提液与环氧合酶‑2、白细胞介素‑6和血管紧张素转化酶2混匀后进行孵育，通过超滤膜洗脱，再加入有机溶剂释放生物活性分子后超速离心，收集滤液得到配体溶液，冷冻干燥后加入溶剂进行仪器分析鉴定筛选得到穿心莲中的多靶标活性配体；构建了穿心莲抗炎、抗病毒活性成分与多靶标酶相互作用的关联性，有利于阐明穿心莲发挥疗效的潜在作用机制；且本发明实施例的方法简单、准确、高效，能够保持生物靶分子与药物小分子的天然构象以及两者之间的亲和作用，适用于天然药物或细菌发酵液等复杂体系中活性成分或先导化合物的高通量筛选和快速鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及天然药物技术领域，具体涉及穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分筛选方法。
背景技术
穿心莲为爵床科穿心莲属植物，穿心莲的干燥地上部分味苦、性寒，有清热燥湿和泻火解毒之功效，被誉为“天然抗生素”。民间常用于感冒发热、咽喉肿痛、痈肿疮疡和毒蛇咬伤等症。现代药理学研究表明，穿心莲具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗肿瘤、降糖、保护心血管、保肝和抑制血小板聚集等作用。
相关技术中，从穿心莲中分离、鉴定得到的化学成分包括二萜内酯类、黄酮类、环烯醚萜类、苯丙素类和生物碱等成分，而其中的特异活性成分并不明确，可发挥抗炎和抗病毒活性的穿心莲的药效物质基础及组分间的协同效应同样不明确。
发明内容
有鉴于此，本发明的实施例提供了一种可定向筛选出穿心莲有效发挥抗炎和抗病毒活性成分的方法。
本发明的实施例提供了穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分筛选方法，将穿心莲总提液与环氧合酶-2、白细胞介素-6和血管紧张素转化酶2混匀后进行孵育，通过超滤膜洗脱，再加入有机溶剂释放生物活性分子后超速离心，收集滤液得到配体溶液，冷冻干燥后加入溶剂进行仪器分析鉴定筛选得到穿心莲中的多靶标活性配体。
进一步地，所述穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分筛选方法，包括以下步骤：
(1)配制酶促缓冲溶液；
(2)配制穿心莲样品溶液；
(3)穿心莲样品溶液与多靶标酶亲和反应筛选活性成分。
进一步地，所述步骤(1)中，分别量取77.4mL、22.6mL浓度均为1mol/L的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，使用去离子水溶解至总体积为1L，充分混合后得到pH值7.4浓度0.1mol/L的磷酸钠酶促缓冲溶液；
进一步地，所述步骤(2)中，称取穿心莲药材100g，采用12倍量85％乙醇回流提取2次，每次2h，提取液合并，过滤后减压浓缩，冷冻干燥得到总提物，再称取适量总提物，使用酶促缓冲溶液充分溶解，得20mg/mL的穿心莲样品溶液；
进一步地，所述步骤(3)中，取适量穿心莲样品溶液和环氧合酶-2、白细胞介素-6、血管紧张素转化酶2充分混匀后置于37℃恒温振荡培养箱中孵育，孵育后的混合液通过超滤膜洗脱分离，向截留配体的超滤管中加入溶剂室温下静置，离心分离得到滤液，将滤液冷冻干燥后加入溶剂溶解得到与环氧合酶-2、白细胞介素-6、血管紧张素转化酶2结合的活性成分溶液，将所述活性成分溶液进行液相色谱-质谱仪器分析鉴定，得到穿心莲中抗炎和抗病毒活性成分；另取等量失活环氧合酶-2、白细胞介素-6、血管紧张素转化酶2与穿心莲样品溶液进行相同步骤的对照组实验。
本发明的实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例的穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分筛选方法，将穿心莲总提液与环氧合酶-2、白细胞介素-6和血管紧张素转化酶2混匀后进行孵育，通过超滤膜洗脱，再加入有机溶剂释放生物活性分子后超速离心，收集滤液得到配体溶液，冷冻干燥后加入溶剂进行仪器分析鉴定筛选得到穿心莲中的多靶标活性配体；筛选并鉴定出了穿心莲中具体的抗炎和抗病毒的活性成分，本发明实施例的方法构建了穿心莲抗炎、抗病毒活性成分与环氧合酶-2、血管紧张素转化酶2和白细胞介素-6相互作用的关联性，有利于阐明穿心莲发挥疗效的潜在作用机制；本发明实施例的方法鉴定出的穿心莲中的抗炎和抗病毒活性成分对环氧合酶-2、血管紧张素转化酶2的体外抑制效果好，进一步证实了穿心莲中鉴定出的活性成分具有抗炎和抗病毒作用；本发明实施例的鉴定筛选方法中的穿心莲提取液与环氧合酶-2、白细胞介素-6和血管紧张素转化酶2之间的相互作用是在溶液下进行的，保持了样品中活性配体和多靶酶的天然构象，能够最大程度地反映生理条件下活性配体和多靶酶之间的亲和作用；本发明实施例的鉴定筛选方法能快速测定从穿心莲中筛选出的活性配体与环氧合酶-2、白细胞介素-6和血管紧张素转化酶2之间的亲和常数，同时获得活性配体的质谱信息，从而实现活性成分的高通量筛选和鉴定；本发明实施例中的筛选过程不受配体基质的影响，这种独特的优势使得其特别适合于从复杂药用植物体系中筛选活性成分；且本发明实施例的筛选方法操作简单、灵敏度高、时间短、采用样品量少，有效提高了穿心莲的综合利用价值。
附图说明
图1是本发明实施例中穿心莲总提物化学成分的超滤筛选色谱图；
图2是本发明实施例中穿心莲总提物化学成分的另一超滤筛选色谱图；
图3是本发明实施例中穿心莲总提物化学成分的另一超滤筛选色谱图；
图4是本发明实施例方法筛选的穿心莲抗炎和抗病毒活性成分的化学结构；
图5(a)是本发明实施例方法筛选的穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸的多反应检测正离子模式的提取色谱图；
图5(b)是本发明实施例方法筛选的穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸的二级质谱图；
图6(c)是本发明实施例方法筛选的穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分5-羟基-7,8,2'-三甲氧基黄酮苷的多反应检测正离子模式的提取色谱图；
图6(d)是本发明实施例方法筛选的穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分5-羟基-7,8,2'-三甲氧基黄酮苷的二级质谱图；
图7(e)是本发明实施例方法筛选的穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分黄芩黄酮I-2'-O-葡萄糖苷的多反应检测正离子模式的提取色谱图；
图7(f)是本发明实施例方法筛选的穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分黄芩黄酮I-2'-O-葡萄糖苷的二级质谱图；
图8(g)是本发明实施例方法筛选的穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分穿心莲内酯的多反应检测正离子模式的提取色谱图；
图8(h)是本发明实施例方法筛选的穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分穿心莲内酯的二级质谱图；
图9(i)是本发明实施例方法筛选的穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分14-脱氧-11,12-二脱氢穿心莲内酯苷的多反应检测正离子模式的提取色谱图；
图9(j)是本发明实施例方法筛选的穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分14-脱氧-11,12-二脱氢穿心莲内酯苷的二级质谱图；
图10(k)是本发明实施例方法筛选的穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分6,4'-二甲氧基异黄酮苷的多反应检测正离子模式的提取色谱图；
图10(l)是本发明实施例方法筛选的穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分6,4'-二甲氧基异黄酮苷的二级质谱图；
图11(m)是本发明实施例方法筛选的穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分穿心莲黄酮苷D的多反应检测正离子模式的提取色谱图；
图11(n)是本发明实施例方法筛选的穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分穿心莲黄酮苷D的二级质谱图；
图12是本发明实施例穿心莲样品溶液与环氧合酶-2体外酶活性抑制实验的半数抑制浓度示意图；
图13是本发明实施例穿心莲样品溶液与血管紧张素转化酶2体外酶活性抑制实验的半数抑制浓度示意图。
其中：线a代表穿心莲总提物的HPLC色谱图；线b和线c分别代表与环氧合酶-2和失活环氧合酶-2作用后的液相色谱图；线d代表穿心莲总提物的HPLC色谱图；线e和线f分别代表与白细胞介素-6和失活白细胞介素-6作用后的液相色谱图；线g代表穿心莲总提物的HPLC色谱图；线h和线i分别代表与血管紧张素转化酶2和失活血管紧张素转化酶2作用后的液相色谱图；芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸的多反应检测正离子模式的提取所用离子为母离子447.31，信号强度为6.74×105；5-羟基-7,8,2'-三甲氧基黄酮苷的多反应检测正离子模式的提取所用离子为母离子491.45，信号强度为3.32×105；黄芩黄酮I-2'-O-葡萄糖苷的多反应检测正离子模式的取所用离子为母离子477.37，信号强度为3.35×105；穿心莲内酯的多反应检测正离子模式的提取所用离子为碎片离子333.37，信号强度为3.69×105；14-脱氧-11,12-二脱氢穿心莲内酯苷的多反应检测正离子模式的提取所用离子为碎片离子315.31，信号强度为1.61×106；6,4'-二甲氧基异黄酮苷的多反应检测正离子模式提取所用离子为母离子461.37，信号强度为1.29×106；穿心莲黄酮苷D的多反应检测正离子模式的提取所用离子为母离子521.47，信号强度为3.49×105。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地描述。
基于天然药物具有先天的靶标高亲和力和选择性相互作用的能力，因此可作为生物探针，在天然药物活性成分筛选过程中发挥着关键作用。绝大多数的药物小分子通过与疾病相关的酶、受体等大分子物质相互作用，进而在人体内发挥疗效。这些生物靶分子如酶能通过调节细胞活性和催化代谢反应来维持机体内的平衡，以酶为靶标对寻找和发现新药领域方面有着巨大的潜力。依据穿心莲的来源及作用的多样性，采用多靶标酶结合亲和超滤质谱技术高通量筛选穿心莲活性成分，从而加快活性成分的筛选速度，有助于揭示穿心莲活性成分发挥疗效的可能作用机制。
环氧合酶-2是前列腺素合成的关键限速酶，可将花生四烯酸转化为多种前列腺素。前列腺素作为重要的炎症介质，可促进细胞增生、刺激血管生成、抑制凋亡等功能。环氧合酶-2可参与炎症反应和肿瘤的形成，通过抑制环氧合酶-2的活性来阻断前列腺素的合成，进而降低炎症反应的发生和抑制肿瘤血管的生成等，目前可作为抗炎和新一代抗肿瘤药物的重要靶点。白细胞介素-6主要由巨噬细胞、B细胞、T细胞等多种细胞产生，可作为多功能炎性细胞因子，是炎症介质网络的关键成分。它也可诱导前列腺素的合成，参与炎症反应和发热反应。血管紧张素转化酶2被鉴定为新冠病毒的基本受体，血管紧张素转化酶2的下调在病毒感染后严重肺衰竭的发病机制中起着重要作用。血管紧张素转化酶2还可作为肾素-血管紧张素系统的一个强力负调节因子，平衡多种功能。此外，血管紧张素转化酶2可结合氨基酸转运蛋白，在肾脏和肠道对氨基酸的吸收发挥关键的作用。基于穿心莲的传统应用，从穿心莲总提物中快速筛选抑制环氧合酶-2、白细胞介素-6和血管紧张素转化酶2的活性成分，对穿心莲的资源开发和利用具有重要的意义。
从穿心莲中报道的主要活性成分是穿心莲内酯类和黄酮类成分。然而，由于穿心莲中化学成分种类繁多且结构复杂，仍存在着一些问题还未得到解决，如哪些特异性活性成分发挥药理作用及其可能的作用机制如何。另外，以活性导向筛选穿心莲有效成分的传统方法，虽在实践中被大量采用，但其工作效率较低。
实施例一
本发明的实施例提供了穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分筛选方法，将穿心莲总提液与环氧合酶-2、白细胞介素-6和血管紧张素转化酶2混匀后进行孵育，通过超滤膜洗脱，再加入有机溶剂释放生物活性分子后超速离心，收集滤液得到配体溶液，冷冻干燥后加入溶剂进行仪器分析鉴定筛选得到穿心莲中的多靶标活性配体。
具体地，所述穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分筛选方法，包括以下步骤：
(1)配制酶促缓冲溶液；
具体地，分别量取77.4mL、22.6mL浓度均为1mol/L的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，使用去离子水溶解至总体积为1L，充分混合后得到pH值7.4浓度0.1mol/L的磷酸钠酶促缓冲溶液；
(2)配制穿心莲样品溶液；
具体地，称取穿心莲药材100g，采用12倍量85％乙醇回流提取2次，每次2h，提取液合并，过滤后减压浓缩，冷冻干燥得到总提物，再称取适量总提物，使用酶促缓冲溶液充分溶解，得20mg/mL的穿心莲样品溶液；
(3)穿心莲样品溶液与多靶标酶亲和反应筛选活性成分；
具体地，将100μL穿心莲样品溶液和10μL 5U的环氧合酶-2、20μL1μg的白细胞介素-6、20μL1μg的血管紧张素转化酶2充分混匀后置于37℃恒温振荡培养箱中孵育60～90min；将混合液通过截留分子量为10KD或30KD的超滤膜，将穿心莲中与环氧合酶-2、白细胞介素-6、血管紧张素转化酶2结合的配体、未结合的配体进行分离；经10000～12000rpm下高速离心10～15min后，再向超滤管中加入200～300μL所述酶促缓冲溶液，在10000～12000rpm下高速离心3～4次，每次10～15min洗脱未结合的配体；然后向超滤管里加入200～300μL体积比为9:1的甲醇-水混合溶液或乙腈-水混合溶液，室温静置10～15min后在10000～12000rpm下高速离心3～4次，每次10～15min释放与环氧合酶-2、白细胞介素-6或血管紧张素转化酶2结合的配体；收集3～4次离心后的滤液，再经冷冻干燥后加入50～100μL纯乙腈或纯甲醇溶液溶解；采用高效液相色谱-质谱对从穿心莲筛选得到的潜在活性成分进行分析、鉴定；另外，取等量的环氧合酶-2、白细胞介素-6或血管紧张素转化酶2置于100℃沸水中加热，失活后与穿心莲样品溶液进行相同步骤的对照组实验。
液相色谱仪条件为：Agilent 1100、Agilent 1220Infinity或Agilent1290Infinity II；色谱柱：Waters Symmetry RP-C18(规格为4.6mm×250mm，5μm)或AthenaC18-WP(规格为4.6mm×150mm，5μm)；流动相：水-0.1％甲酸(A)和乙腈(B)；梯度洗脱程序：0-40min，5％-95％B、0-8min，5％-20％B；8-24min，20％-45％B；24-30min，45％-95％B；30-40min，95％-95％、0-8min，5％-20％B；8-30min，20％-45％B；30-35min，45％-95％B；35-40min，95％-95％或0-8min，8％-20％B；8-30min，20％-55％B；30-32min，55％-75％B；32-40min，75％-95％B；柱温：25℃或30℃；进样量：5μL、10μL或20μL；流速：0.6mL/min、0.8mL/min或1mL/min；检测波长：254nm或280nm。
质谱检测条件为：Agilent 1290infinity II 6530C或Thermo FisherScientific(access max)；采用正离子电离模式；二级谱扫描方式：数据依赖型扫描；质量扫描范围：150-1000m/z；喷雾电压：3000V或3500V；毛细管温度：300℃或350℃；汽化温度：250℃、300℃或350℃；辅助气压力：10lb/in2；鞘气压力：40lb/in2。
其中，穿心莲总提物中抗炎和抗病毒活性成分质谱鉴定信息见表1。
表1穿心莲总提物中抗炎和抗病毒活性成分质谱鉴定
基于穿心莲总提物与环氧合酶-2、白细胞介素-6和血管紧张素转化酶2作用前后活性成分色谱峰的变化，采用相对结合亲和力(RBA)用于进一步评价穿心莲总提物中潜在活性成分与这三种靶酶之间的亲和程度；根据经与活性靶酶和失活靶酶作用后的穿心莲总提物的各色谱峰的峰面积，计算环氧合酶-2、白细胞介素-6和血管紧张素转化酶2对穿心莲筛选的抗炎和抗病毒活性成分的结合度，其公式如下：
RBA(％)＝Aa/Ab×100％
式中，RBA为多靶酶与穿心莲筛选的抗炎和抗病毒活性成分之间的相对结合亲和力，Aa和Ab分别代表经与活性靶酶和失活靶酶处理的穿心莲总提物的各色谱峰峰面积。
参照附图1～11n及表1，穿心莲中有11、11和11个潜在活性成分分别对环氧合酶-2、白细胞介素-6和血管紧张素转化酶2有着不同的亲和作用。对于环氧合酶-2来说，峰5的RBA值最大，为1.651，其次是峰11的1.605；对于白细胞介素-6来说，峰5有着最大的RBA值1.647，其次是峰7的1.595和峰11的1.543；对于血管紧张素转化酶2来说，峰11的RBA值最大，其值为2.002，其次是峰5的1.557和峰4的1.548。从穿心莲总提物中筛选出的潜在抗炎和抗病毒活性成分有芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸、5-羟基-7,8,2'-三甲氧基黄酮苷、黄芩黄酮I-2'-O-葡萄糖苷、穿心莲内酯、14-脱氧-11,12-二脱氢穿心莲内酯苷、6,4'-二甲氧基异黄酮苷、穿心莲黄酮苷D和14-脱氧-11,12-二脱氢穿心莲内酯。
从穿心莲中筛选出的潜在活性成分的RBA值都有着明显的差异，其中RBA值(＞1.5)的活性成分，由于与环氧合酶-2、白细胞介素-6和血管紧张素转化酶2的结合程度较强，在反应过程中较多的被保留下来；其他RBA值较低的成分由于与靶酶的结合亲和力较低，在反应过程中较少地被保留下来。对于抗炎活性来说，与其他化合物的RBA值相比，RBA值大的峰5和11对环氧合酶-2的亲和力高，RBA值大的峰5、7和11对白细胞介素-6的亲和力高，可作为潜在的抗炎活性成分群；对于抗病毒活性来说，RBA值大的峰4、5和11对血管紧张素转化酶2的结合力高，可作为主要的抗病毒活性成分群。这些结果表明，从穿心莲总提液中筛选出的活性配体可以靶向作用于环氧合酶-2、白细胞介素-6和血管紧张素转化酶2，其潜在的活性成分之间存在着协同作用，共同发挥着多种药理活性，如峰5(穿心莲内酯)和峰11(14-脱氧-11,12-二脱氢穿心莲内酯)可靶向结合这三种靶标共同发挥着抗炎和抗病毒活性；而有些活性化合物可特异性靶向结合某种药物靶标，如峰7(5-羟基-7,8-二甲氧基黄烷酮异构体)可特异性靶向结合白细胞介素-6，峰4(黄芩黄酮I-2'-O-葡萄糖苷)可靶向作用于血管紧张素转化酶2，发挥抗炎或抗病毒活性。
本发明实施例通过穿心莲样品溶液与多靶标酶进行体外抑制实验进一步验证本发明实施例的方法筛选鉴定出的穿心莲活性成分具有抗炎和抗病毒的作用。
具体地，环氧合酶-2活性抑制实验采用环氧合酶-2抑制剂筛选试剂盒，
先将COX-2探针(50×)、COX-2辅助因子(50×)和COX-2底物(50×)用COX-2测定缓冲液稀释10倍；然后将150μL COX-2测定缓冲液、10μL COX-2辅助因子工作液和10μL COX-2工作液混合在于96孔黑板上；将10μL不同浓度的穿心莲样品溶液加入混合物中，在37℃恒温振荡培养箱中孵育10min；随后，向96孔黑板中的各孔加入10μL的COX-2探针工作液，快速加入10μL的COX-2底物工作液；再在37℃黑暗孵育5-20min后进行荧光测定；检测时的激发波长为560nm，发射波长为590nm；采用以下公式来计算抑制率：
抑制率(％)＝(RFU1-RFU2)/(RFU1-RFU3)×100％
其中，RFU1、RFU2和RFU3分别代表100％酶活性对照组、穿心莲样品溶液和空白对照组的相对荧光值；每个样品溶液进行三次平行检测，且实验数据均以平均值±标准差表示。
血管紧张素转化酶-2活性抑制实验采用血管紧张素转化酶-2抑制剂，先将92μL测定缓冲液、1μL ACE2溶液和5μL穿心莲样品溶液混合在96孔黑板上，在37℃恒温振荡培养箱下孵育15-30min；然后在低温下快速加入2μL底物，在37℃恒温振荡培养箱避光孵育至少2h后进行荧光检测；检测时的发射波长在325nm处测量，激发波长在393nm处测量；应用以下公式计算每个样品的抑制率：
抑制率(％)＝(RFU1-RFU2)/(RFU1-RFU3)×100％
上式中，RFU1、RFU2和RFU3分别代表100％酶活性对照组、穿心莲样品和空白对照组的相对荧光值；每个样品溶液进行三次平行检测，且实验数据均以平均值±标准差表示。
参照附图12～13，采用抑制剂筛选试剂盒检测穿心莲样品溶液对环氧合酶-2和血管紧张素转化酶2的抑制活性。体外环氧合酶-2和血管紧张素转化酶2活性抑制实验表明，穿心莲样品溶液对环氧合酶-2和血管紧张素转化酶2均具有抑制活性，IC50值分别为140.649±15.344μg/mL和1.489±0.183mg/mL。与此同时，进一步对代表性的活性成分也进行了体外环氧合酶-2和血管紧张素转化酶2活性抑制实验验证，结果表明本发明实施例筛选鉴定出的代表性的活性成分具有同时抗炎、抗病毒的作用。对于环氧合酶-2来说，峰5(穿心莲内酯)和峰11(14-脱氧-11,12-二脱氢穿心莲内酯)对应的IC50分别为2.123±0.0917mM和4.242±0.4256mM；对于血管紧张素转化酶2来说，穿心莲内酯和14-脱氧-11,12-二脱氢穿心莲内酯的IC50分别为3.790±0.2030mM和3.455±0.3263mM。
实施例二
本发明的实施例提供了穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分筛选方法，包括以下步骤：(1)配制酶促缓冲溶液；
具体地，分别量取77.4mL、22.6mL浓度均为1mol/L的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，使用去离子水溶解至总体积为1L，充分混合后得到pH值7.4浓度0.1mol/L的磷酸钠酶促缓冲溶液；
(2)配制穿心莲样品溶液；
具体地，称取穿心莲药材100g，采用12倍量85％乙醇回流提取2次，每次2h，提取液合并，过滤后减压浓缩，冷冻干燥得到总提物，再称取适量总提物，使用酶促缓冲溶液充分溶解，得20mg/mL的穿心莲样品溶液；
(3)穿心莲样品溶液与多靶标酶亲和反应筛选活性成分；
具体地，将100μL穿心莲样品溶液和10μL10 U的环氧合酶-2、20μL 2μg的白细胞介素-6、20μL 2μg的血管紧张素转化酶2充分混匀后置于37℃恒温振荡培养箱中孵育60-90min；将混合液通过截留分子量为10KD或30KD的超滤膜，将穿心莲中与环氧合酶-2、白细胞介素-6、血管紧张素转化酶2结合的配体、未结合的配体进行分离；经10000～12000rpm下高速离心10～15min后，再向超滤管中加入200～300μL所述酶促缓冲溶液，在10000～12000rpm下高速离心3～4次，每次10～15min洗脱未结合的配体；然后向超滤管里加入200～300μL体积比为9:1的甲醇-水混合溶液或乙腈-水混合溶液，室温静置10～15min后在10000～12000rpm下高速离心3～4次，每次10～15min释放与环氧合酶-2、白细胞介素-6或血管紧张素转化酶2结合的配体；收集3～4次离心后的滤液，再经冷冻干燥后加入50～100μL纯乙腈或纯甲醇溶液溶解；采用高效液相色谱-质谱对从穿心莲筛选得到的潜在活性成分进行分析、鉴定；另外，取等量的环氧合酶-2、白细胞介素-6或血管紧张素转化酶2置于100℃沸水中加热，失活后与穿心莲样品溶液进行相同的步骤的对照组实验。
其余与实施例一相同。
在本文中，所涉及的前、后、上、下等方位词是以附图中零部件位于图中以及零部件相互之间的位置来定义的，只是为了表达技术方案的清楚及方便。应当理解，所述方位词的使用不应限制本申请请求保护的范围。
在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分筛选方法，其特征是：将穿心莲总提液与环氧合酶-2、白细胞介素-6和血管紧张素转化酶2混匀后进行孵育，通过超滤膜洗脱，再加入有机溶剂释放生物活性分子后超速离心，收集滤液得到配体溶液，冷冻干燥后加入溶剂进行仪器分析鉴定筛选得到穿心莲中抗炎和抗病毒的多靶标活性配体；包括以下步骤：
(1)配制酶促缓冲溶液；
(2)配制穿心莲样品溶液；
(3)穿心莲样品溶液与多靶标酶亲和反应筛选活性成分；
穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分为芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸、5-羟基-7,8,2'-三甲氧基黄酮苷、黄芩黄酮I-2'-O-葡萄糖苷、穿心莲内酯、14-脱氧-11,12-二脱氢穿心莲内酯苷、6,4'-二甲氧基异黄酮苷、穿心莲黄酮苷D和14-脱氧-11,12-二脱氢穿心莲内酯；
仪器分析包括液相色谱和质谱分析，液相色谱仪条件为：Agilent1220Infinity；色谱柱：Waters Symmetry RP-C18，规格为4.6mm×250mm，5μm；流动相：水-0.1％甲酸(A)和乙腈(B)；梯度洗脱程序：0-8min，8％-20％B；8-30min，20％-55％B；30-32min，55％-75％B；32-40min，75％-95％B；柱温：30℃；进样量10μL；流速0.8mL/min；检测波长：254nm；
质谱检测条件为：Thermo Fisher Scientific(access max)；采用正离子电离模式；二级谱扫描方式：数据依赖型扫描；质量扫描范围150-1000m/z；喷雾电压：3000V；毛细管温度：300℃；汽化温度：300℃；辅助气压力：10bl/in2；鞘气压力：40bl/in2。
2.根据权利要求1所述的穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分筛选方法，其特征是：所述步骤(1)中，分别量取77.4mL、22.6mL浓度均为1mol/L的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，使用去离子水溶解至总体积为1L，充分混合后得到pH值7.4浓度0.1mol/L的磷酸钠酶促缓冲溶液。
3.根据权利要求1所述的穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分筛选方法，其特征是：所述步骤(2)中，称取穿心莲药材100g，采用12倍量85％乙醇回流提取2次，每次2h，提取液合并，过滤后减压浓缩，冷冻干燥得到总提物，再称取适量总提物，使用酶促缓冲溶液充分溶解，得20mg/mL的穿心莲样品溶液。
4.根据权利要求1所述的穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分筛选方法，其特征是：所述步骤(3)中，取适量穿心莲样品溶液和环氧合酶-2、白细胞介素-6、血管紧张素转化酶2充分混匀后置于37℃恒温振荡培养箱中孵育，孵育后的混合液通过超滤膜洗脱分离，向截留配体的超滤管中加入溶剂室温下静置，离心分离得到滤液，将滤液冷冻干燥后加入溶剂溶解得到与环氧合酶-2、白细胞介素-6、血管紧张素转化酶2结合的活性成分溶液，将所述活性成分溶液进行色谱-质谱仪器分析鉴定，筛选得到穿心莲中抗炎和抗病毒活性成分；另取等量失活的环氧合酶-2、白细胞介素-6、血管紧张素转化酶2与穿心莲样品溶液进行相同步骤的对照组实验。
5.根据权利要求1所述的穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分筛选方法，其特征是：所述步骤(3)中，将100μL穿心莲样品溶液和10μL 5U的环氧合酶-2、20μL0.05g/L的白细胞介素-6、20μL 0.05g/L的血管紧张素转化酶2充分混匀后置于37℃恒温振荡培养箱中孵育60～90min；将混合液通过截留分子量为10KD或30KD的超滤膜，将穿心莲中与环氧合酶-2、白细胞介素-6、血管紧张素转化酶2结合的配体、未结合的配体进行分离；经10000～12000rpm下高速离心10～15min后，再向超滤管中加入200～300μL所述酶促缓冲溶液，在10000～12000rpm下高速离心3～4次，每次10～15min洗脱未结合的配体；然后向超滤管里加入200～300μL体积比为9:1的甲醇-水混合溶液或乙腈-水混合溶液，室温静置10～15min后在10000～12000rpm下高速离心3～4次，每次10～15min释放与环氧合酶-2、白细胞介素-6或血管紧张素转化酶2结合的配体；收集3～4次离心后的滤液，再经冷冻干燥后加入50～100μL纯乙腈或纯甲醇溶液溶解；
采用高效液相色谱-质谱对从穿心莲筛选得到的潜在活性成分进行分析、鉴定；
另外，取等量的环氧合酶-2、白细胞介素-6或血管紧张素转化酶2置于100℃沸水中加热，失活后与穿心莲样品溶液进行相同步骤的对照组实验。
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