CN115629207A - 治疗肺炎的方法和所用的热淋清颗粒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及治疗肺炎的方法和所用的热淋清颗粒。一方面，涉及例如通过测定血清TNF‑α浓度考察热淋清颗粒治疗肺炎效果的方法，包括步骤：小鼠随机分，用LPS雾化造模，造模后灌胃给予热淋清颗粒，小鼠取血，收集血清测定如下项目的至少一种：肺指数、血清中TNF‑α、IL‑1β、LI‑6、PGE₂含量，根据检测数据获得热淋清颗粒对肺炎小鼠的治疗作用的统计学结果。本发明还提供了热淋清颗粒作为肺炎治疗药的用途。本发明显示热淋清颗粒是一种非常优良的肺炎治疗药。

Description

治疗肺炎的方法和所用的热淋清颗粒

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种中药制剂，尤其涉及一种以植物药材头花蓼制成的中药制剂热淋清颗粒，还涉及该中药制剂的制备方法以及它们的制药用途，尤其是，本发明涉及热淋清颗粒在制备用于治疗肺炎的药物中的用途。本发明研究结果显示，热淋清颗粒对肺炎积极治疗作用是明显的。本发明通过LPS致急性肺炎小鼠的保护作用的研究证实了热淋清颗粒作为肺炎治疗药的效果。

背景技术

肺炎(Pneumonia)是指肺部出现炎症，为呼吸系统的多发病、常见病。肺炎可以发生在任何年龄层的人身上，但以年幼及年长者、以及患有免疫力缺乏症或免疫系统比较差的人属于高危患者，他们比较容易发病。若病况严重，可以致命。据世界卫生组织调查，肺炎死亡率占呼吸系统急性感染死亡率的75％。肺炎是一个非常广泛的概念，因为肺部有炎症则称为肺炎，其病因可以使生物性、物理学、化学性等等。

关于肺炎的分类，根据感染源的来源不同可分为：院内感染性肺炎和社会获得性肺炎。(2)肺炎可由不同的致病因子引起，根据病因可将肺炎分为：感染性肺炎(根据病原体种类：包括细菌性肺炎，常见细菌有肺炎链球菌、葡萄球菌、嗜血流感杆菌等；病毒性肺炎，常见病毒如呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、腺病毒等；另外还有真菌性肺炎、支原体肺炎、衣原体肺炎等)、理化性肺炎(如放射性肺炎、吸入性肺炎的类脂性肺炎)、变态反应性肺炎(如过敏性肺炎和风湿性肺炎)。(3)由于致病因子和机体反应性的不同，炎症发生的部位、累及范围和病变性质也往往不同。炎症发生于肺泡内者称肺泡性肺炎(大多数肺炎为肺泡性)，累及肺间质者称间质性肺炎。病变范围以肺小叶为单位者称小叶性肺炎，累及肺段者称节段性肺炎，波及整个或多个大叶者称大叶性肺炎，另外还有毛细支气管炎等。(4)根据病程分类：分为急性肺炎、迁延性肺炎及慢性肺炎，一般迁延性肺炎病程长达1～3月，超过3个月则为慢性肺炎。(5)按病变性质可分为浆液性肺炎、纤维素性肺炎、化脓性肺炎、出血性肺炎、干酪性肺炎、肉芽肿性肺炎或机化性肺炎等不同类型。肺炎的常见症状包括：咳嗽，带黄绿色痰；发热伴有畏寒；剧烈或刺刺的胸痛，深呼吸或咳嗽时会更加严重；呼吸急促；气短；高热(体温至少39.5°C)。

热淋清颗粒是以贵州民族特色药头花蓼(Polygonum capitatum Buch.-Ham. exD. Don)为原料的单方制剂，其具有清热泻火，利尿通淋的功效；可用于治疗下焦湿热所致的热淋，症见尿频、尿急、尿痛；尿路感染、肾盂肾炎见上述证候者，临床上常用于治疗湿热蕴结下焦，机体气化不利所致诸症[梁斌，张丽艳，冉懋雄．中国苗药头花蓼[M]．北京：中国中医药出版社，2014；王重洋，潘舒，吴亚利，等．热淋清颗粒药理作用实验研究[J]．实用中医内科杂志，2012，26(03)：12-14；南海峰，刘杰，吴丹，等．热淋清颗粒配合常规抗生素治疗淋病的临床效果及对血清炎症介质表达的影响[J]．世界中西医结合杂志，2021，16(06)：1103-1107；国家药典委员会．中华人民共和国药典2020年版(一部)[S]．北京：中国医药科技出版社，2020]。

现代药理研究发现热淋清颗粒可对胃炎、肾炎、前列腺炎等多种炎症均有一定的治疗作用，而炎症反应多会引起机体不同程度的发热。中医认为发热是外邪入侵机体后，邪气与正气相争的结果，最早记载于《黄帝内经》，谓之“身热”，多属温病范畴[李应超．中医对发热的辨别与治疗[J]．中医杂志，2010，51(S1)：125-126；窦晓鑫，杨玉莹，卜志超，等．试从中医角度认识2019新型冠状病毒肺炎[J]．天津中医药，2020，37(02)：137-140]。

脂多糖诱导肺炎是目前研究肺炎的常用药理学模型。脂多糖(LPS)是内毒素的主要成分，来源于革兰氏阴性菌细胞壁的外膜，在污染的空气、职业性粉尘(谷物粉等)、香烟中到处都有LPS，职业性和环境性的吸人一定浓度的上述物质后可引起或加重一系列临床病症，如哮喘、支气管肺炎等。LPS引起支气管肺炎后经及时有效治疗可痊愈，否则，病程迁延，气道炎症反复发作可变成慢性支气管炎，如继续接触高浓度的脂多糖，病情将进行性加重，最终发展成为肺心病。研究发现，LPS在体内外引起多种细胞高表达趋化因子和致炎因子，在肺组织中引起中性粒细胞聚集增多的主要细胞因子是IL-1 β和TNF-a。

因此，本领域技术人员期待提供一种测定热淋清颗粒治疗肺炎效果的方法，和/或还期待提供一种热淋清颗粒，和/或还期待提供热淋清颗粒在制备用于治疗肺炎的药物中的用途。

发明内容

本发明的目的在于提供一种测定热淋清颗粒治疗肺炎的方法，和/或还期待提供一种热淋清颗粒，和/或还期待提供热淋清颗粒在制备具有治疗肺炎作用的药物中的用途。本发明以热淋清颗粒为研究对象，研究其对LPS致急性肺炎小鼠的对肺炎治疗的效果。已经出人意料地发现，通过使用本发明方法可以有效地测定热淋清颗粒的对肺炎的治疗作用。本发明基于此类发现而得以完成。

为此，本发明第一方面提供了一种测定热淋清颗粒治疗肺炎效果的方法，或者热淋清颗粒在制备用于治疗肺炎的药物中的用途，或者通过测定血清TNF-α浓度考察热淋清颗粒治疗肺炎效果的方法，所述方法包括如下步骤：

将BALB/c小鼠，雌雄各半，随机分为空白对照组、模型组、热淋清颗粒组、阳性对照组；

动物适应性喂养后，采用LPS雾化法进行造模；

造模后次日，热淋清颗粒组及阳性对照组灌胃给药，空白对照组及模型组灌胃给予等体积生理盐水；

给药完毕后，小鼠眼球取血，血液于室温处自然凝固30分钟，1000xg离心15分钟左右，收集血清上清，4°C保存待测(或-80℃冰箱冻存)；

小鼠取血后脱颈处死，取肺泡灌洗液、全肺组织待测；

测定如下项目的至少一种：小鼠眼球取血处死后迅速精准称取全肺重量，并计算肺指数；

将肺组织标本按病理检验标准操作程序进行脱水、修剪、包埋、切片、染色、封片、镜检处理，观察肺组织病理学改变；

使用ELISA试剂盒检测各组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、LI-6、PGE₂含量；

根据上述检测数据获得热淋清颗粒对(急性)肺炎小鼠的治疗作用的统计学结果。

根据本发明第一方面的方法，其中所述模型是在动物适应性喂养(实验室环境：25±2℃，相对湿度50±5%)7天后，采用LPS雾化法(20mg/kg)进行连续3天造模获得的。

根据本发明第一方面的方法，其中热淋清颗粒组分为热淋清颗粒高剂量组(6.24g/kg)、热淋清颗粒中剂量组(3.12g/kg)、热淋清颗粒低剂量组(1.56g/kg)。

根据本发明第一方面的方法，其中阳性对照组口服给予醋酸地塞米松0.878/kg/d。

根据本发明第一方面的方法，其中造模后次日，热淋清颗粒高、中、低剂量组及阳性对照组灌胃给药，空白对照组及模型组灌胃给予等体积生理盐水，1次/d，连续给药7d。

根据本发明第一方面的方法，其中将肺组织标本按病理检验标准操作程序进行脱水、修剪、包埋、切片、染色、封片、镜检处理的操作过程和条件如下：

根据本发明第一方面的方法，其中将肺组织标本按病理检验标准操作程序进行脱水的操作条件为：脱水时长：75%酒精4h，85%酒精2h，95%酒精1h，100%酒精0.5h，100%酒精0.5h，100%酒精0.5h，100%酒精0.5h，二甲苯10min，二甲苯10min，石蜡1h，石蜡2h，石蜡3h；

根据本发明第一方面的方法，其中将肺组织标本按病理检验标准操作程序的染色、封片按如下操作进行：切片脱蜡至水，苏木精染色10-20min，自来水冲洗1-3min，盐酸酒精分化5-10s，自来水冲洗1-3min，放入50℃的温水中或弱碱性水溶液中返蓝直到出现蓝色为止，自来水冲洗1-3min，放入85%的酒精3-5min，伊红染色3-5min，水洗3-5s，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固；

根据本发明第一方面的方法，其中将肺组织标本按病理检验标准操作程序进行镜检时，采用正置荧光显微镜对切片进行图像采集，每张切片先于200倍下观察全部组织，观察大体病变，选择要观察的区域采集400倍图片。

根据本发明第一方面的方法，其中ELISA检测各组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、LI-6、PGE₂含量时，取各组大鼠血清，按照ELISA试剂盒说明书操作方法检测各组小鼠血清的TNF-α、IL-1β、LI-6、PGE₂含量水平。

根据本发明第一方面的方法，其中所得实验数据均以±s来表示，使用(例如SPSS)统计软件对数据进行分析，多组间比较满足正态分布及方差齐性时，采用单因素方差法(One-way ANOVA)分析，P<0.05认为结果具有统计学差异。

根据本发明第一方面的方法，其中使用TNF-α ELISA试剂盒测定TNF-α浓度，包括如下步骤：

a.标准品的稀释：取小试管6支，依次编号，先在各小试管中加入标准品稀释液100µl，然后取原浓度标准品100µl加至第一支试管中，充分混匀；再在该试管中取100µl加至第二支试管中，充分混匀；再在该试管中取100µl加至第三支试管中，充分混匀；再在该试管中取100µl加至第四支试管中，充分混匀；再在该试管中取100µl加至第五支试管中，充分混匀；然后在该试管中取100µl，弃掉；第六只试管作为0号标准品，稀释后各管浓度分别是：360pg/ml、180pg/ml、90pg/ml、45pg/ml、22.5pg/ml、0pg/ml；在酶标包被板上设标准品孔，依次加入不同浓度的标准品50µl，每个浓度做5个平行孔；

b.待测样品配制和加样：用采血管收集血液，血液于室温处自然凝固30分钟，1000xg离心15分钟左右，收集上清(血清)，将该上清与附加液以体积比9：1混合均匀，得到血清待测样品；分别设置待测样品孔、空白对照孔(空白对照孔不加样品、酶标试剂，其余各步操作与待测样品孔相同)；在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl；加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；所述附加液是含有1.25%甘氨酸和0.2%氯化锌的水溶液；

c.温育：每孔加入酶标试剂50μl，空白对照孔除外；用封板膜封板后将酶标板置37℃温育30分钟；

d.洗涤：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释30倍得到洗涤液；小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；

d.显色：每孔先加入50μl显色剂A，再加入50μl显色剂B，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟；接着每孔加终止液50μl以终止反应，此时蓝色转为黄色；

e.测定和计算：在加终止液后15分钟以内，以空白对照孔调零，用酶标仪在450nm波长下依序测量各孔的吸光度OD值；用标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的线性回归方程，用样品OD值算得样品浓度。

根据本发明第一方面的方法，其中所用各种材料为常规材料。

根据本发明第一方面的方法，其中所用ELISA试剂盒如实施例中述。

根据本发明第一方面的方法，其中所用各种材料为常规材料。

根据本发明第一方面的方法，其中所用ELISA试剂盒如实施例中述。

进一步的，本发明第二方面涉及一种热淋清颗粒，其是以头花蓼(Polygonumcapitatum Buch.-Ham. ex D. Don)为原料制成的颗粒剂。

根据本发明第二方面的热淋清颗粒，其是按照如下方法制备得到的：取头花蓼1250g，加水煎煮二次，每次1.5小时，煎液滤过，滤液合并，浓缩至适量，滤过，喷雾干燥，与适量的可溶性淀粉混匀，制成颗粒，干燥，制成500g，即得。

进一步的，本发明第三方面涉及本发明第二方面任一项所述热淋清颗粒在制备用于治疗肺炎的药物中的用途。

本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

肺炎是指终末气道、肺泡和肺间质的炎症，可由病原微生物、免疫损伤、理化因素、过敏等原因导致。近年来国内外学者常用脂多糖诱导建立肺炎动物模型以模拟肺炎发病情况。本发明使用头花蓼对脂多糖诱导肺炎动物模型治疗肺炎的效果进行考察。

头花蓼(Polygonum capitatum Buch-Ham ex D. Don)为蓼科蓼属多年生草本植物。具有清热利湿、利尿通淋之功效，在临床上治疗泌尿系统感染有着显著的效果。以其为原料制成的中成药制剂“热淋清颗粒”2004年进入国家基本医疗保险目录，2012年进入贵州省基本药物目录。

头花蓼是少数民族地区的常用药，主要用于肾盂肾炎、尿道感染、利尿通淋等症。相关的药理学研究少见，目前仅有任光友等几篇报道。任光友采用小鼠细菌性肾盂肾炎模型进行实验，结果头花蓼水提取物组小鼠尿液中的WBC和BLD与对照组比较明显减少，显示头花蓼水提物对肾盂肾炎具有一定的抗炎作用。任光友等以小鼠腹腔注射大肠杆菌菌液观察5天内小鼠死亡情况，结果对照组死亡率为100%，头花蓼组死亡率分别为20%和50%，显示头花蓼水提物能够对抗大肠杆菌引起的感染。任光友等以头花蓼水提物灌胃给药予家兔，结果，头花蓼水提物组与对照组比较，体温无显著性差异，但能降低静脉注射伤寒副伤寒菌苗引起的家兔的发热体温。任光友等，以头花蓼水提物分别灌胃给药家兔、小鼠，与空白组和速尿对照组比较尿量。结果显示头花蓼水提物对家兔和小鼠无明显利尿作用。徐英春等人采用琼脂稀释法检测了头花蓼对10株淋病奈瑟球菌(淋球菌)的体外抑菌活性，结果头花蓼对淋球菌有抑菌活性。其对10株淋球菌的最小抑菌浓度范围为8~32g/L，平均值为11.2g/L。

本发明方法能够呈现一种或多种优异效果。

附图说明

图1：热淋清颗粒对LPS致急性肺炎小鼠肺组织病理学改变的影响(×400)。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原材料均为市售商品。

在本发明中，如未另外说明，所用热淋清颗粒是按照如下方法制备得到的：取头花蓼1250g，加水煎煮二次，每次1.5小时，煎液滤过，滤液合并，浓缩至适量，滤过，喷雾干燥，与适量的可溶性淀粉混匀，制成颗粒，干燥，制成500g，即得。当然，本发明也可使用含糖型的热淋清颗粒。这些热淋清颗粒符合2020年版中国药典一部所载同名品种的规定。

实施例1：热淋清颗粒对LPS致急性肺炎小鼠的保护作用

本实验采用LPS诱导BALB/c小鼠肺炎模型，将小鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组和热淋清颗粒高、中、低剂量组，每组12只，检测各组小鼠肺指数、HE染色检测小鼠肺组织病理学改变、ELISA测定肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1、IL-6、PGE2的含量。

1．实验材料

(1)实验动物

健康SPF级BALB/c小鼠，雌性各半，体重18-22g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2019-0004。

(2)主要仪器

压缩式雾化器(欧百瑞，CNB69011)、

离心机(Nest，2015002)、

冰箱(海尔，BCD-215KAN DZ)、

立式超低温保存箱(海尔，DW-86L386)、

移液器(10~100μl，大龙，KA0005852)、

移液器(100~1000μl，大龙，DX64849)、

北京托普(DEM-3，自动洗板机)、

BIOBASE(EL10A，自动酶标仪)。

(3)主要试剂

热淋清颗粒(贵州威门药业股份有限公司，210602)、

醋酸地塞米松片(常乐制药，D2104121)、

LPS(脂多糖，Lipopolysaccharide，SIGMA，L9143)、

小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA Kit(基因美，货号JYM0218Mo/批号GR20220610)、

小鼠IL-1β ELISA Kit(基因美，货号JYM0531Mo/批号GR20220610)、

小鼠IL-6 ELISA Kit(基因美，货号JYM0012Mo/批号GR20220610)、

小鼠前列腺素E2(PGE2)ELISA kit(基因美，货号JYM0603Mo/批号GR20220610)。

(4)试剂配置

LPS溶液制备：将150mg的LPS定容于15ml容量瓶，置于4℃冰箱保存。

热淋清颗粒混悬液的制备：取适量热淋清颗粒于研钵中研磨，取41.6g研磨后粉末用生理盐水定容于100ml容量瓶中，此为高剂量；取高剂量40ml溶液加入40ml生理盐水，摇匀，此为中剂量；取中剂量20ml溶液并加入20ml生理盐水，摇匀，此为低剂量。

阳性对照药溶液制备：将适量地塞米松片置于研钵中研磨，精准称取研磨后粉末8.78g，于100ml容量瓶定容备用0.0878g/ml)。

2．实验方法

(1)分组、造模和给药

选取健康BALB/c小鼠，雌雄各半，随机分为6组，分别为空白对照组、模型组、热淋清颗粒高剂量组(6.24g/kg)、热淋清颗粒中剂量组(3.12g/kg)、热淋清颗粒低剂量组(1.56g/kg)、阳性对照组(地塞米松0.878mg/kg/d)，每组12只；

适应性喂养(实验室环境：25±2℃，相对湿度50±5%)7天后造模；采用LPS雾化法(20mg/kg)进行造模，连续造模三天；

造模后次日，热淋清颗粒高、中、低剂量组及阳性对照组灌胃给药，空白对照组及模型组灌胃给予等体积生理盐水，1次/d，连续给药7d；

(2)取材

小鼠眼球取血后脱颈处死，血液于室温处自然凝固30分钟，1000xg离心15分钟左右，收集血清上清，4°C保存待测(或-80℃冰箱冻存)；

小鼠取血后取肺泡灌洗液(冻存)、全肺组织(右叶冻存，左叶置于福尔马林保存)待测；

(3)检测和数据处理

(3.1)热淋清颗粒对LPS致急性肺炎小鼠肺指数的影响：

小鼠眼球取血处死后，迅速精准称取全肺重量，按下式计算肺指数：肺指数=小鼠肺重(g)/小鼠体重(g)；

(3.2)热淋清颗粒对LPS致急性肺炎小鼠肺组织病理学改变的影响：

将肺组织标本按病理检验标准操作程序进行脱水、修剪、包埋、切片、染色、封片、镜检；

[例如，固定肺组织经全自动脱水机脱水的操作条件为：脱水时长：75%酒精4h，85%酒精2h，95%酒精1h，100%酒精0.5h，100%酒精0.5h，100%酒精0.5h，100%酒精0.5h，二甲苯10min，二甲苯10min，石蜡1h，石蜡2h，石蜡3h；

[例如，在经包埋、切片后按如下操作进行染色和封片处理：切片脱蜡至水，苏木精染色10-20min，自来水冲洗1-3min，盐酸酒精分化5-10s，自来水冲洗1-3min，放入50℃的温水中或弱碱性水溶液中返蓝直到出现蓝色为止，自来水冲洗1-3min，放入85%的酒精3-5min，伊红染色3-5min，水洗3-5s，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固；

[例如，图像采集时，采用德国徕卡公司生产的正置荧光显微镜(DM500)对切片进行图像采集，每张切片先于200倍下观察全部组织，观察大体病变，选择要观察的区域采集400倍图片，观察具体病变并进行肺损伤评分：根据肺间质水肿、炎症细胞浸润、肺泡水肿、肺泡出血、肺不张、透明膜形成病变程度，按照正常、轻度、中度、重度分别按0~3分计分]；

(3.3)测定热淋清颗粒对LPS致急性肺炎小鼠肺泡灌洗液IL-6、IL-1β、PGE₂、TNF-α水平的影响：

使用ELISA试剂盒检测各组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、LI-6、PGE₂含量：取各组小鼠血清，按照ELISA试剂盒说明书操作方法检测各组血清的IL-1β、LI-6、PGE₂含量水平；另外按照实施例2的方法对血清进行TNF-α指标检测；

所得实验数据均以±s来表示，使用(SPSS26.0)统计软件对数据进行分析，多组间比较满足正态分布及方差齐性时，采用单因素方差法(One-way ANOVA)分析，P<0.05认为结果具有统计学差异；

根据上述检测数据获得热淋清颗粒对(急性)肺炎小鼠的治疗作用的统计学结果。

3．实验结果

(1)热淋清颗粒对LPS致急性肺炎小鼠体重、肺指数的影响

结果显示，各组小鼠造模后体重无显著差异(P>0.05)。与空白组比较，模型组小鼠肺指数显著升高(P<0.01)；与模型组比较，热淋清颗粒高剂量组和阳性对照组小鼠肺指数显著下降(P<0.05)。见表1。

表1：热淋清颗粒对LPS致急性肺炎小鼠体重、肺指数的影响(±s，n=6)

注：与空白组比较：^** P<0.01，^* P<0.05；与模型组比较：^## P<0.01，^# P<0.05；

(2)热淋清颗粒对LPS致急性肺炎小鼠肺组织病理学的影响

HE染色显示，空白组小鼠肺组织表面胸膜脏层覆有一薄层浆膜，最外为一单层间皮细胞，间皮下有少量纤维组织，组织结构正常，无明显增厚；胸膜下各级支气管分支结构完整，肺泡内偶见少量炎细胞浸润；模型组可见支气管内见少量炎细胞浸润，肺泡内见多量炎细胞浸润，见少量肺出血；与模型组比较，热淋清颗粒各剂量组和阳性对照组小鼠肺组织上述病理学改变明显减轻，以热淋清颗粒高剂量组最轻。结果见图1。另外已发现⑦组和⑧组肺组织病理学结果与④组类似。

(3)热淋清颗粒对LPS致急性肺炎小鼠肺泡灌洗液IL-6、IL-1、PGE₂、TNF-α水平的影响

ELISA结果显示，与空白组比较，模型组小鼠肺泡灌洗液IL-6、IL-1、PGE₂、TNF-α水平显著升高(P<0.01)；与模型组比较，热淋清颗粒高剂量组和阳性对照组肺泡灌洗液IL-6、IL-1、PGE₂、TNF-α水平显著下降(P<0.01)，热淋清颗粒中、低剂量组肺泡灌洗液IL-6、IL-1、PGE₂亦有不同程度下降(P<0.05)。见表2。

表2：热淋清颗粒对LPS致急性肺炎小鼠肺泡灌洗液IL-6、IL-1、PGE₂、TNF-α水平的影响(±s，n=6)

注：与空白组比较：^** P<0.01，^* P<0.05；与模型组比较：^## P<0.01，^# P<0.05；

实施例2：测定小鼠血清中的TNF-α浓度

本实施例2使用TNF-α ELISA试剂盒检测小鼠血清中的TNF-α浓度。本文所用TNF-αELISA试剂盒为市售的JYM0218Mo型小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒，该TNF-αELISA试剂盒可用于体外定量检测小鼠血清、血浆、组织、细胞上清及相关液体样本中肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量。TNF-α ELISA试剂盒的特异性是可检测样本中的小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)，且与其它相关蛋白无明显交叉反应；TNF-α ELISA试剂盒的重复性为，板内变异系数≤9%(通常板内变异系数≤3%是优选的)，板间变异系数≤13%(通常板间变异系数≤6%是优选的)，该试剂盒的检测范围为8pg/ml-500pg/ml，方法灵敏度≤1.2pg/ml。

TNF-α ELISA试剂盒的实验原理为，应用双抗体夹心法测定标本中小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。用纯化的小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入肿瘤坏死因子α(TNF-α)，再与HRP标记的肿瘤坏死因子α(TNF-α)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色；TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色；颜色的深浅和样品中的肿瘤坏死因子α(TNF-α)呈正相关；用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)浓度。

所述TNF-α ELISA试剂盒组成如下：说明书1份、封板膜2片(96)、酶标板(96孔，12孔×8条)1×96、酶标试剂(Enzyme Reagent)6ml×1瓶、标准品(Standards，720pg/ml)0.5ml×1瓶、标准品稀释液1.5ml×1瓶、样品稀释液6ml×1瓶、显色剂A液(SubstrateSolution A)6ml×1瓶、显色剂B液(Substrate Solution B)6ml×1瓶、终止液(StopSolution)6ml×1瓶、浓缩洗涤液(Wash Buffer)(20ml×30倍)×1瓶、封板膜2片(96)。

使用本文所述TNF-α ELISA试剂盒处理样本有一般要求。对于血清而言：用采血管收集血液，血液于室温处自然凝固30分钟，1000xg离心15分钟左右，收集血清上清，4°C保存待测，或者分装后-20°C或-80°C保存。

本实施例2使用TNF-α ELISA试剂盒检测小鼠血清中的TNF-α浓度，操作步骤如下：

a.标准品的稀释：

取小试管6支，依次编号，先在各小试管中加入标准品稀释液100µl，然后取原浓度标准品100µl加至第一支试管中，充分混匀；再在该试管中取100µl加至第二支试管中，充分混匀；再在该试管中取100µl加至第三支试管中，充分混匀；再在该试管中取100µl加至第四支试管中，充分混匀；再在该试管中取100µl加至第五支试管中，充分混匀；然后在该试管中取100µl，弃掉；第六只试管作为0号标准品，稀释后各管浓度分别是：360pg/ml、180pg/ml、90pg/ml、45pg/ml、22.5pg/ml、0pg/ml；在酶标包被板上设标准品孔，依次加入不同浓度的标准品50µl，每个浓度做5个平行孔；

b.待测样品配制和加样：用采血管收集血液，血液于室温处自然凝固30分钟，1000xg离心15分钟左右，收集上清(血清)，将该上清与附加液以体积比9：1混合均匀，得到血清待测样品；分别设置待测样品孔、空白对照孔(空白对照孔不加样品、酶标试剂，其余各步操作与待测样品孔相同)；在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl；加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；所述附加液是含有1.25%甘氨酸和0.2%氯化锌的水溶液；

c.温育：每孔加入酶标试剂50μl，空白对照孔除外；用封板膜封板后将酶标板置37℃温育30分钟；

d.洗涤：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释30倍得到洗涤液；小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；

d.显色：每孔先加入50μl显色剂A，再加入50μl显色剂B，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟；接着每孔加终止液50μl以终止反应，此时蓝色转为黄色；

e.测定和计算：在加终止液后15分钟以内，以空白对照孔调零，用酶标仪在450nm波长下依序测量各孔的吸光度OD值；用标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的线性回归方程，用样品OD值算得样品浓度。需要注意的是，计算血清样品中的TNF-α浓度时应考虑与附加液稀释的倍数。

使用本实施例2方法测定实施例1之LPS致急性肺炎小鼠血清TNF-α浓度的结果见上文表2(每组结果为12只动物的±s结果)。另外，在以上表2使用实施例2方法测定TNF-α时，每个组别12只动物血清等比例混合得到混合血清(其在本文中可称为混合血清X)，以此混合血清使用实施例2方法TNF-α ELISA试剂盒测定，以考察板内变异系数(板内CV，板内平行试验5道统计，下同)和板间变异系数(板间CV，板间平行试验5板统计，下同)表征的重复性，结果，①~⑥之6个组别的板内CV分别为：3.17%、3.04%、3.76%、2.94%、3.85%、3.47%，①~⑥之6个组别的板间CV分别为：5.63%、6.13%、6.06%、5.36%、5.94%、6.32%；各组均显示出优良的测定结果重复性。然而已经发现，当未使上述附加液与血清预混合时，TNF-α ELISA测试对于给予热淋清动物血清呈现CV显著变差的结果而不符合一般ELISA的测定要求，这种结果在下文实施例3等处得以呈现。需要说明的是，在本发明中使用其它ELISA试剂盒测定其它指标时未发现这种仅在热淋清动物血清中才呈现的TNF-α之CV结果差的现象。

实施例3：参考实施例1和实施例2，使用同样的TNF-α ELISA试剂盒检测小鼠混合血清X在同样方法中的板内和板间变异系数，不同的仅是实施例2之步骤“b.待测样品配制和加样”中所用附加液是含有1.25%甘氨酸的水溶液；结果，①~⑥之6个组别的板内CV分别为：3.86%、3.47%、3.11%、16.53%、14.35%、14.63%，①~⑥之6个组别的板间CV分别为：5.66%、6.13%、5.85%、17.34%、15.31%、14.13%，显示给予热淋清的小鼠血清在此ELISA法中CV表征的重复性不理想。

实施例4：参考实施例1和实施例2，使用同样的TNF-α ELISA试剂盒检测小鼠混合血清X在同样方法中的板内和板间变异系数，不同的仅是实施例2之步骤“b.待测样品配制和加样”中所用附加液是含有0.2%氯化锌的水溶液；结果，①~⑥之6个组别的板内CV分别为：4.03%、3.87%、3.72%、16.12%、15.53%、13.14%，①~⑥之6个组别的板间CV分别为：5.32%、4.82%、5.11%、16.78%、14.63%、12.11%，显示给予热淋清的小鼠血清在此ELISA法中CV表征的重复性不理想。

实施例5：参考实施例1和实施例2，使用同样的TNF-α ELISA试剂盒检测小鼠混合血清X在同样方法中的板内和板间变异系数，不同的仅是步骤“b.待测样品配制和加样”中混合血清X直接测定而不与附加液混合；结果，①~⑥之6个组别的板内CV分别为：4.63%、4.13%、3.93%、15.89%、15.23%、13.74%，①~⑥之6个组别的板间CV分别为：5.65%、5.13%、5.02%、17.54%、16.13%、13.27%，显示给予热淋清的小鼠血清在此ELISA法中CV表征的重复性不理想。

实施例6：热淋清颗粒治疗肺炎的效果

本发明实施例1考察并显示了热淋清颗粒对相关疾病的优良治疗效果，本实施例6对这种治疗效果作拓展性研究。

本实施例6是在实施例1试验中平行执行并增加的试验组(这些试验组未记载在实施例1中，而是在本实施例6进行补充说明)，即增加以下编号为的⑦和⑧的2个热淋清颗粒试验组：

⑦热淋清颗粒中剂量组：热淋清颗粒3.12g/kg+葡萄糖酸亚铁60mg/kg，

⑧热淋清颗粒低剂量组：热淋清颗粒1.56g/kg+葡萄糖酸亚铁30mg/kg。

试验所用葡萄糖酸亚铁为国药准字H41023259的片剂(康诺药业)，试验时药品在有效期内，葡萄糖酸亚铁片与热淋清颗粒一起按比例混配制成给药的药液。

⑦组和⑧组的结果参见实施例1所记载的。另外在实施例2测定TNF-α时，⑦组和⑧组的板内CV分别为3.44%和3.09%、板间CV分别为6.42%和5.84%，显示呈现优良的方法学特征。

本实施例结果表明通过使热淋清颗粒/葡萄糖酸亚铁以3.12g/60mg比例组合给药时，葡萄糖酸亚铁能够提高热淋清颗粒的治疗效果，特别是以TNF-α血清浓度表征的治疗效果。

因此，在本发明任一方面的任一实施方案中，在给生物体施用热淋清颗粒的同时还施用葡萄糖酸亚铁，热淋清颗粒和葡萄糖酸亚铁的重量比为48~52：1例如重量比为52：1；例如，在本发明的制药用途方面，用于治疗相应疾病的药物中还包含上述比例量的葡萄糖酸亚铁。

头花蓼是热淋清颗粒的主要原料，为蓼科植物头花蓼的全草，文献记载其味苦辛，性温平，清热解毒治热淋[广西壮族自治区革命委员会卫生管理服务站编．广西中草药，第2册[M]．南宁：广西人民出版社．1970]。目前对热淋清颗粒的研究主要集中于其对泌尿系统感染等，大量的动物实验及临床研究已证明热淋清颗粒疗效显著并成为临床治疗泌尿系统感染的首选药之一。现代研究发现其对胃炎、肾炎等多种炎症也有一定的治疗作用，而炎症多会引起机体发热的症状。中医认为，发热是外邪入侵后、邪气与正气相争的结果，多用清上焦蕴热药物缓解机体发热。治疗下焦热淋症的中药多具有“清上达下”的作用[康开彪，柳树英，李淑玲，等．王自立教授运用清上达下法辨治热淋经验[J]．西部中医药，2021，34(02)：62-63]，因此推测热淋清颗粒具有清上焦蕴热的作用。2020年热淋清颗粒已被贵州省中医药管理局纳入《贵州省新冠肺炎中医康复方案》中，因此本课题组拟观察热淋清颗粒的解热作用探讨其作用机理，为临床提供更多选择。

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰阴性细菌外膜的主要成分，由类脂A、核心多糖和O-特异性链三部分组成。核心寡糖在中间连接位于外层具有亲水结构的O-特异性链和位于内层具有疏水性的类脂A。其中核心寡糖是由9~10个糖基组成的分枝寡糖链，又可被进一步划分为内核心寡糖与外核心寡糖。内核心寡糖通过酸不稳定的酮苷键将核心寡糖附着于脂质A。外核心寡糖主要由中性和碱性己糖组成，与O-特异性链连接，其在不同菌株中存在单糖组成和构型上的差异，是决定LPS核心型的基础。当细菌侵入人体后，会释放其表面LPS，LPS首先与脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide-binding protein，LBP)结合，LBP将LPS运送到免疫细胞的膜表面，与膜表面的蛋白质CD14相结合。LPS在细菌正常生活状态时不释放，但在细菌菌体死亡破裂、人工方法裂解后或细胞活跃生长繁殖时释放出来，其本身无毒性作用，但其作为非特异性免疫原，当进入微循环后与宿主效应细胞(主要为单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞)相互作用分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素6(lL-6)、活性氧自由基(ROS)、NO等生物活性分子，引起机体发热、弥散性血管内凝血、多器官机能衰竭及休克等临床综合症。LPS的毒性是通过LPS在细菌周围形成一层保护屏障以逃避抗生素的作用，作用于宿主细胞，产生炎性细胞因子，使机体内环境处于紊乱状态，引起内毒素血症、脓毒症等疾病。LPS的活性主要因其具有免疫激活作用，可以抗肿瘤、抗辐射、抗感染、促进后发性白内障的发生、促进牙周炎症、促进包细胞增生和缓解哮喘等多种生物学功能。

概要地说，本发明从实验的角度探讨了热淋清颗粒对LPS致急性肺炎小鼠的保护作用及其机制。本发明具体方法是，采用LPS诱导BALB/c小鼠肺炎模型，将小鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照组和热淋清颗粒高、中、低剂量组，每组12只，检测各组小鼠肺指数、HE染色检测小鼠肺组织病理学改变、ELISA测定肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1、IL-6、PGE2的含量。本实验中模型组小鼠肺指数、肺泡灌洗液中IL-6、IL-1、PGE₂、TNF-α含量均较空白组显著上升，给予热淋清颗粒高剂量治疗后的小鼠肺指数、肺泡灌洗液中IL-6、IL-1、PGE₂、TNF-α含量均较模型组显著降低；给予热淋清颗粒中、低剂量治疗后小鼠肺泡灌洗液IL-6、IL-1、PGE₂亦有不同程度下降，提示热淋清颗粒可抑制炎性因子的产生，从而发挥治疗肺炎的作用，且治疗效果在一定范围内存在量效关系。

从本文结果可见，热淋清颗粒能减轻肺炎例如急性肺炎的症状并改善相关血清指标，结果表明使用热淋清颗粒治疗肺炎是有效的。

本文中所举的实施例仅用以说明本发明的组成及功效，并非因此局限本发明的专利范围，故对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出类似修改，均隶属于本发明的专利范畴。这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。

Claims (10)

1.测定热淋清颗粒治疗肺炎效果的方法或者通过测定血清TNF-α浓度考察热淋清颗粒治疗肺炎效果的方法，所述方法包括如下步骤：

将BALB/c小鼠，雌雄各半，随机分为空白对照组、模型组、热淋清颗粒组、阳性对照组；

动物适应性喂养后，采用LPS雾化法进行造模；

造模后次日，热淋清颗粒组及阳性对照组灌胃给药，空白对照组及模型组灌胃给予等体积生理盐水；

给药完毕后，小鼠眼球取血，血液于室温处自然凝固30分钟，1000xg离心15分钟左右，收集血清上清，4°C保存待测(或-80℃冰箱冻存)；

小鼠取血后脱颈处死，取肺泡灌洗液、全肺组织待测；

测定如下项目的至少一种：小鼠眼球取血处死后迅速精准称取全肺重量，并计算肺指数；

将肺组织标本按病理检验标准操作程序进行脱水、修剪、包埋、切片、染色、封片、镜检处理，观察肺组织病理学改变；

使用ELISA试剂盒检测各组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、LI-6、PGE₂含量；

根据上述检测数据获得热淋清颗粒对(急性)肺炎小鼠的治疗作用的统计学结果。

2.根据权利要求1的方法，其中所述模型是在动物适应性喂养7天后，采用LPS雾化法(20mg/kg)进行连续3天造模获得的。

3.根据权利要求1的方法，其中：

热淋清颗粒组分为热淋清颗粒高剂量组(6.24g/kg)、热淋清颗粒中剂量组(3.12g/kg)、热淋清颗粒低剂量组(1.56g/kg)；

阳性对照组口服给予醋酸地塞米松0.878/kg/d；

造模后次日，热淋清颗粒高、中、低剂量组及阳性对照组灌胃给药，空白对照组及模型组灌胃给予等体积生理盐水，1次/d，连续给药7d。

4.根据权利要求1的方法，其中：

将肺组织标本按病理检验标准操作程序进行脱水的操作条件为：脱水时长：75%酒精4h，85%酒精2h，95%酒精1h，100%酒精0.5h，100%酒精0.5h，100%酒精0.5h，100%酒精0.5h，二甲苯10min，二甲苯10min，石蜡1h，石蜡2h，石蜡3h；

将肺组织标本按病理检验标准操作程序的染色、封片按如下操作进行：切片脱蜡至水，苏木精染色10-20min，自来水冲洗1-3min，盐酸酒精分化5-10s，自来水冲洗1-3min，放入50℃的温水中或弱碱性水溶液中返蓝直到出现蓝色为止，自来水冲洗1-3min，放入85%的酒精3-5min，伊红染色3-5min，水洗3-5s，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固；

将肺组织标本按病理检验标准操作程序进行镜检时，采用正置荧光显微镜对切片进行图像采集，每张切片先于200倍下观察全部组织，观察大体病变，选择要观察的区域采集400倍图片。

5.根据权利要求1的方法，其中：ELISA检测各组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、LI-6、PGE₂含量时，取各组大鼠血清，按照ELISA试剂盒说明书操作方法检测各组小鼠血清的TNF-α、IL-1β、LI-6、PGE₂含量水平。

6.根据权利要求1的方法，其中所得实验数据均以±s来表示，使用(例如SPSS)统计软件对数据进行分析，多组间比较满足正态分布及方差齐性时，采用单因素方差法(One-wayANOVA)分析，P<0.05认为结果具有统计学差异。

7.根据权利要求1的方法，其中使用TNF-α ELISA试剂盒测定TNF-α浓度，包括如下步骤：

a.标准品的稀释：取小试管6支，依次编号，先在各小试管中加入标准品稀释液100µl，然后取原浓度标准品100µl加至第一支试管中，充分混匀；再在该试管中取100µl加至第二支试管中，充分混匀；再在该试管中取100µl加至第三支试管中，充分混匀；再在该试管中取100µl加至第四支试管中，充分混匀；再在该试管中取100µl加至第五支试管中，充分混匀；然后在该试管中取100µl，弃掉；第六只试管作为0号标准品，稀释后各管浓度分别是：360pg/ml、180pg/ml、90pg/ml、45pg/ml、22.5pg/ml、0pg/ml；在酶标包被板上设标准品孔，依次加入不同浓度的标准品50µl，每个浓度做5个平行孔；

b.待测样品配制和加样：用采血管收集血液，血液于室温处自然凝固30分钟，1000xg离心15分钟左右，收集上清(血清)，将该上清与附加液以体积比9：1混合均匀，得到血清待测样品；分别设置待测样品孔、空白对照孔(空白对照孔不加样品、酶标试剂，其余各步操作与待测样品孔相同)；在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl；加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；所述附加液是含有1.25%甘氨酸和0.2%氯化锌的水溶液；

c.温育：每孔加入酶标试剂50μl，空白对照孔除外；用封板膜封板后将酶标板置37℃温育30分钟；

d.洗涤：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释30倍得到洗涤液；小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；

d.显色：每孔先加入50μl显色剂A，再加入50μl显色剂B，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟；接着每孔加终止液50μl以终止反应，此时蓝色转为黄色；

e.测定和计算：在加终止液后15分钟以内，以空白对照孔调零，用酶标仪在450nm波长下依序测量各孔的吸光度OD值；用标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的线性回归方程，用样品OD值算得样品浓度。

8.一种热淋清颗粒，其是以头花蓼(Polygonum capitatum Buch.-Ham. ex D. Don)为原料制成的颗粒剂。

9.根据权利要求8的热淋清颗粒，其是按照如下方法制备得到的：取头花蓼1250g，加水煎煮二次，每次1.5小时，煎液滤过，滤液合并，浓缩至适量，滤过，喷雾干燥，与适量的可溶性淀粉混匀，制成颗粒，干燥，制成500g，即得。

10.权利要求8或9的在制备用于治疗肺炎的药物中的用途。

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