CN102228479B

CN102228479B - 一种治疗口腔疾病的药物及其制备方法

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Publication number: CN102228479B
Application number: CN2011101588002A
Authority: CN
Inventors: 斯拉甫·艾白; 霍仕霞; 李治建
Original assignee: 斯拉甫·艾白
Current assignee: New Qikang Pharmaceutical Co.,Ltd.
Priority date: 2011-06-14
Filing date: 2011-06-14
Publication date: 2013-01-30
Anticipated expiration: 2031-06-14
Also published as: CN102228479A

Abstract

本发明涉及一种以维药没食子为原料药的治疗口腔疾病的药物及制备方法，该药物采用溶剂提取法得到没食子粗提物，进一步采用大孔树脂法或凝胶色谱法或超滤膜法得到没食子有效部位及其有效成分，再加上药学上可接受的辅料，制备成口含片、口崩片、口腔泡腾片、膜剂。该药物通过现代分离纯化技术手段，富集了没食子治疗口腔疾病的有效部位及有效成分，提高了功效成分的利用率，使其符合药物在体内吸收、分布代谢的规律，提高了药效。通过药理实验表明没食子有效部位及有效成分具有抗炎镇痛、抗菌、抗氧化、免疫调节等作用，同时能够很快修复口腔溃疡，加速口腔溃疡的愈合，并能有效抵抗口腔常见致病菌造成的牙龈炎、口臭咽臭、口舌生疮等口腔病症。

Description

一种治疗口腔疾病的药物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种治疗口腔疾病的药物及其制备方法。

背景技术

口腔在外界理化因子的损害、病原的侵入、牙颌面发育异常以及全身性疾病等情况下出现的病理现象。口腔疾病的种类很多，原发于口腔的疾病。根据最新的口腔流行病调查报告显示，近年来我国全民的口腔健康状况虽然得到逐步改善，但口腔溃疡、蛀牙、牙周疾病等高发疾病的防治形势十分严峻，口腔病患病率高达97.6％，口腔病的发生虽不致命，但表现为疼痛、溃烂、反复性发作，有时直接影响人们的工作、学习和劳动。不论民族、种族，各年龄段均可能发生。口腔疾病的发生与机体多种因素有关，可因遗传和个体因素、微循环障碍、精神压力、免疫失调、微生物感染、药物过敏、血液病、维生素缺乏、服用化疗药物、肿瘤晚期或全身疾病、超氧化物岐化酶活性下降等诸多因素所致。目前治疗口腔疾病无特效的治疗方法，对大多数患者来说局部用药或全身用药可促进减小口腔疾病所带来的疼痛等副作用和不良反应。因而探寻一种多靶点、安全、可靠、能缩短发作期延长间歇期治疗口腔疾病的新药有很大的潜力。

维药没食子是来源于没食子峰科昆虫没食子蜂Cynipsgallae-tinctorice Oliv的幼虫，寄生于壳斗科植物没食子树Quercus infectoria Oliv.幼枝上，所产成的虫瘿。近年来对没食子的研究结果表明，从中分离出鞣质、黄酮等，其中鞣质的含量已超过70％。在此基础上进行没食子鞣质的药理学研究证明，没食子鞣质对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、β-溶血性链球菌等有较强的抑制和杀灭作用；并能显著抑制急、慢性炎症；提高机体非特异性免疫功能；清热镇痛；清除自由基和抑制脂质过氧化损伤等。维吾尔古籍医著《大医典(Alkanun)》对没食子的属性、功能、主治进行阐述，没食子属性为一级寒，二级干热，具有受涩、止汗等功能，主治各种体癣、舌头炎、咽炎、结肠溃疡及慢性腹泻等病症。维吾尔医临床用于牙龈松弛、牙周炎、口臭、咽喉炎、大肠虚滑、泻痢不止、习惯性肠炎、疔疮出血等，分别对牙龈炎、牙周炎及溃疡性结肠炎等病症疗效显著。以没食子为主药的西帕依固龈液(新疆奇康哈博维药有限公司生产，国药准字Z65020012)，具有健齿固龈，清血止痛的作用，临床用于牙周疾病引起的牙齿酸软，咀嚼无力，松动移位，牙龈出血以及口舌生疮，咽喉肿痛，口臭烟臭，对口腔疾病的治疗效果尤其显著。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种以维药没食子为原料药的治疗口腔疾病的药物及制备方法，该药物采用溶剂提取法得到没食子粗提物，进一步采用大孔树脂法或凝胶色谱法或超滤膜法得到没食子有效部位及其有效成分，再加上药学上可接受的辅料，制备成口含片、口崩片、口腔泡腾片、膜剂。该药物通过现代分离纯化技术手段，富集了没食子治疗口腔疾病的有效部位及有效成分，提高了功效成分的提取率，使其符合药物在体内吸收、分布代谢的规律，提高了药效。通过药理实验表明没食子有效部位及有效成分具有抗炎镇痛、抗菌、抗氧化、免疫调节等作用，同时能够很快修复口腔溃疡，加速口腔溃疡的愈合，并能有效抵抗口腔常见致病菌造成的牙龈炎、口臭咽臭、口舌生疮等口腔病症。

本发明所述的一种治疗口腔疾病的药物，该药物是从维药没食子中提取分离得到没食子鞣质有效部位及有效成分，然后将有效部位和有效成分分别或将有效部位和有效成分混合，按常规制药方法制成口服含片、口崩片、口腔泡腾片或膜剂，具体操作按下列步骤进行：

a、将筛选好的没食子药材粉碎至5-80目，用5-14倍量的溶剂20-95％浓度的乙醇水溶液或水溶液提取1-4次，温度30℃-100℃，每次提取时间1-3小时，合并提取液，回收溶剂，浓缩，真空干燥或喷雾干燥，即得干浸膏，粉碎成粉末，过60-120目药筛，得粗提物；

b、再将没食子粗提物用0-60％乙醇溶解，用大孔树脂、聚酰胺或葡聚糖凝胶吸附，用0-95％的有机试剂乙醇水溶液或甲醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩，干燥，即得没食子鞣质有效部位，以于品重量计算含总鞣质50-99.9％；

c、然后进一步用制备液相色谱、逆流色谱技术得到没食子有效成分没食子酸、间-双没食子酸、没食子酸甲酯、1，2，3，6-四-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖、1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖等，含量为40-99.8％；

d、按常规制药方法，将步骤b所得没食子有效部位和步骤c所得有效成分混合或分别制备成口含片、口崩片、口腔泡腾片、散剂或膜剂即可。

本发明所述的一种治疗口腔疾病的药物，该药物是在专利号为ZL 97116074.0西帕依固龈液的基础上，进一步通过现代分离纯化技术手段，富集了没食子治疗口腔疾病的有效部位及有效成分，并通过药理实验验证药效优于西帕固龈液，且减少了服用剂量；同时将没食子有效部位及有效成分制备成药学上可接受的固体制剂，其有效成分因含有多个酚羟基使其具有较强极性和不稳定性，条件控制不当，便会水解而降低药效，故制备成固体制剂，能够使其有效成分的稳定性大大增强，丰富市场现有没食子制剂的剂型，同时固体制剂也较液体制剂使用方便，还能够通过合理的配方和工艺使药物有效成分提取及保留完全，改善口味等，而且药物在口腔内较长时间滞留，可提高口腔内组织的药物浓度，产生局部吸收而发挥疗效，从而使药物更好地发挥作用。

本发明结合现代的提取技术和分离纯化方法，采用溶剂提取，分离纯化得有效部位和有效成分，提高了功效成分的提取率，使其符合药物在体内吸收、分布代谢的规律，提高了药效。

采用相关的药理学试验方法进行体外药效学实验，说明没食子鞣质有效部位及有效成分在用于治疗口腔疾病的药物用途。通过实验表明没食子有效部位及有效成分具有抗炎镇痛、抗菌、抗氧化、免疫调节等作用，同时能够很快修复口腔溃疡，加速口腔溃疡的愈合，并能有效抵抗口腔常见致病菌造成的牙龈炎、口臭咽臭、口舌生疮等口腔病症。

具体实施方式

下面以具体实施例对本发明作详细说明：

实施例1(以1000片为基数，制备口含片，并以表的方式进行列举)

a、将筛选好的没食子药材粉碎至5目，用5倍量的溶剂水溶液提取1次，温度30℃，提取时间1小时，回收溶剂，浓缩，真空干燥，即得干浸膏，粉碎成粉末，过60目药筛，得粗提物；

b、再将没食子粗提物用水溶液溶解，用大孔树脂吸附，依次用浓度0-95％的有机试剂乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩，干燥，即得没食子鞣质有效部位，以干品重量计算含总鞣质50％；

d、按常规制药方法，将步骤b所得没食子有效部位和步骤c所得有效成分混合或分别制备成口含片即可。

表1没食子有效部位及有效成分口含片处方

注：表中PVP为聚维酮。

按表1不同处方相应比例，依次加入辅料混合，压制片剂，片径10mm，片厚4.0mm，片中差异在5％以下，所得片剂的硬度为80-130N，口感较好。

实施例2(制备口崩片，并以表的方式进行列举)

a、将筛选好的没食子药材粉碎至20目，用8倍量的溶剂提取2次，温度50℃，每次提取时间2小时，合并提取液，回收溶剂，浓缩，真空干燥，即得干浸膏，粉碎成粉末，过80目药筛，得粗提物；

b、再将没食子粗提物用60％乙醇水溶液溶解，用葡聚糖凝胶吸附，依次用浓度0-95％的甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩，干燥，即得没食子鞣质有效部位，以干品重量计算含总鞣质60％；

c、然后进一步用逆流色谱制备得有效成分没食子酸、间-双没食子酸、没食子酸甲酯、1，2，3，6-四-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖、1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖等，含量为40-99.8％；

d、按常规制药方法，将步骤b所得没食子有效部位和步骤c所得有效成分混合或分别制备成口崩片。

表2没食子有效部位及有效成分口崩片处方

注：表中PVP为聚维酮。

按表2不同处方相应比例，依次加入辅料混合，压制片剂，片径10mm，片厚4.5mm，片中差异在3％以下，所得片剂的硬度为40-50N，崩解时限为15-40s，可在40s内于口内崩解，脆碎度按中国药典标准测量低于1％。

实施例3(制备口腔泡腾片，并以表的方式进行列举)

a、将筛选好的没食子药材粉碎至40目，用10倍量的溶剂提取3次，温度70℃，每次提取时间3小时，合并提取液，回收溶剂，浓缩，喷雾干燥，即得干浸膏，粉碎成粉末，过100目药筛，得粗提物；

b、再将没食子粗提物用浓度40％乙醇水溶液溶解，用聚酰胺吸附，依次用浓度0-95％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩，干燥，即得没食子鞣质有效部位，以干品重量计算含总鞣质70％；

d、按常规制药方法，将步骤b所得没食子有效部位和步骤c所得有效成分混合或分别制备成口腔泡腾片。

表3没食子有效部位及有效成分口腔泡腾片处方

注：PEG为聚乙二醇。

按表3各处方比例所制得口腔泡腾片平均片重为3.00g，表面光洁、细腻，淡棕黄色，将一片泡腾片投入25℃饮用水中，其很快沉于杯底，并立即放出大量气泡，片剂随之迅速溶解，在3分钟内形成淡棕色同名溶液。

实施例4(制备口腔膜剂，并以表的方式进行列举)

a、将筛选好的没食子药材粉碎至60目，用12倍量的溶剂提取4次，温度90℃，每次提取时间3小时，合并提取液，回收溶剂，浓缩，喷雾干燥，即得干浸膏，粉碎成粉末，过120目药筛，得粗提物；

b、再将没食子粗提物用浓度40％乙醇水溶液溶解，用聚酰胺吸附，依次用浓度0-95％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩，干燥，即得没食子鞣质有效部位，以干品重量计算含总鞣质55％；

d、按常规制药方法，将步骤b所得没食子有效部位和步骤c所得有效成分混合或分别制备成口腔膜剂。

表4没食子有效部位及有效成分口腔膜剂处方

注：PEG为聚乙二醇。

按表4各处方制备成口腔膜剂，本膜剂成膜性较好，药膜较柔软。

实施例5没食子有效部位治疗大鼠创伤性口腔溃疡的实验研究

口腔粘膜创伤是RAU发病的重要因素之一，如口腔手术、刷牙、吃一些坚硬的食物不经意留下的机械损伤，都会发展成RAU。所以对此类RAU采用对症治疗，清除感染，修复受损粘膜，是临床上治疗RAU的有效方法。本试验采用石炭酸灼伤性RAU模型，主要用于抗菌、消炎为主，辅以镇痛等对症治疗的药物药效学评价。主要的指标为溃疡愈合时间、溃疡面积大小的改变、溃疡周围炎症症状。

试验方法：取健康大鼠70只，雌雄各半，10％水合氯醛腹腔注射麻醉，参照文献方法造口腔溃疡模型，取下端内径2mm塑料管，内置棉花球，小棉球底部与管口一平，继而向管内滴入90％苯酚溶液，浸透小棉球为宜，然后将其置于大鼠左侧颊口腔粘膜上灼烧30s，24h后溃疡形成，随机分成7组，每组10只，正常组(不用于造模，只取血)、模型组、阳性药组(50mg·kg^-1)、没食子总鞣质部位低(25mg·kg^-1)、中(50mg·kg^-1)、高剂量组(100mg·kg^-1)。给药体积均为0.25mL，1d内分2次给予，早晚各给一次，溃疡局部给药5d。药物用1mL注射器抽取，经小鼠灌胃针头，缓慢涂布于溃疡部位和溃疡周围1-2cm范围内，给药前及每次给药后次日观察溃疡面积大小(以溃疡直径计)及溃疡愈合情况(无肉眼可见的溃疡视为愈合)，第6天腹主动脉取血测血象，处死动物取左侧口角作病理检查。

统计学方法：

实验数据均采用平均值±标准差

t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义，均在EXCEL软件中处理。

实验结果：

肉眼观察：

各组造模成功后，溃疡大小相似，统计学无明显差异，动物溃疡部位一致。溃疡直径为2-3mm，圆形或椭圆形溃疡，深约0.5mm，部分大鼠溃疡表面有白色假膜覆盖。除正常组以外其余各组第一天均进食量较以前减少，第二天恢复正常。给药三天后给药组与模型组比较溃疡程度及感染程度均减轻。溃疡面明显缩小，愈合天数明显缩短。大鼠造模后24h溃疡情况，大鼠口腔内左侧粘膜溃烂，覆盖一层假膜，红肿。

对石炭酸性RAU的影响：

表5没食子有效部位对大鼠口腔溃疡愈合的影响(

n＝10)

由表5可见给药前各组之间溃疡面积没有统计学差异，给药后各组在第3天炎症减轻，冰硼散、中剂量组及高剂量组都有一只动物溃疡愈合。给药5天后除模型组其他各组动物溃疡愈合情况都达到了50％以上，第6天愈合率都达到80％，平均愈合天数在5～6天与临床口腔溃疡治疗时间一致。

对RAU大鼠WBC总数的影响：

表6没食子有效部位对大鼠口腔溃疡WBC总数的影响(

n＝10)

与正常组比较：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。

由表6可见，模型组动物与正常组比较外周血白细胞数量较显著升高(P＜0.01)，说明模型组大鼠有发热、炎症等症状发生。阳性药组和高剂量组与模型组比较白细胞数显著下降(P＜0.01)，说明没食子有效部位治疗组炎症明显减轻。研究表明没食子有效部位在抗炎、促进溃疡组织修复方面有着显著的药理作用。

病理检查结果：

正常对照组：各组大鼠粘膜没损伤，角化层下毛细血管正常，表皮没损伤。个别动物口腔粘膜表面角化增多或角化不全，上皮增生增厚，细胞层次增多。模型组：角质层增厚，粘膜变薄，粘膜下有较多炎症细胞浸润，纤维增生、增厚，其中角质层增厚，表皮增厚。部分大鼠出现皮肤萎缩，角质层变薄，肌肉变性，肌肉发红，损伤严重，结构不清，大小不一，横纹消失，排列不规则。也可见血管充血严重，毛细血管扩张充血。阳性药组：由于组织取材和包埋过程中粘膜位置没调正确，切片上粘膜没有完全切下，粘膜下层没有炎症细胞浸润，毛细血管未见充血，可见肌肉损伤。低剂量组：表皮薄厚不均、表皮没有角化。部分大鼠肌肉略有损伤，真皮浅层肌肉嗜酸变性，深层肌肉未见异常。中剂量组：表皮角化少，角质层薄无角化，细胞结构清楚，真皮胶原纤维排列整齐。高剂量组：角质层薄、无角化，细胞结构清楚，真皮胶原纤维排列整齐。与模型组比较，阳性药组和没食子有效部位组病理改变减轻。

结论：没食子有效部位对石炭酸所致的大鼠RAU有减轻局部炎症反应，促进溃疡愈合的作用。给药第6天各给药组大鼠溃疡愈合率都达到80％，白细胞数量显著下降(P＜0.01)，病理检查得出与模型组相比较，阳性药和没食子有效部位给药组口腔粘膜炎症情况有改善，说明没食子有效部位能有效地促进溃疡的恢复。

讨论：RAU是一种常见病、多发病，引起该病的病因比较复杂，创伤继发感染是口腔溃疡常见发病类型之一，目前缺乏统一的诊断标准并且无特异性的治疗方法。局部用药使口腔病灶组织与药物充分接触，增强口腔组织的抗病能力和修复能力，以达到治疗目的。针对RAU病症特点，大都是采用激素和抗生素，这类药物副作用大，不宜长期使用，而创伤继发感染性RAU患病率较高，较为频繁发生。在疾病的治疗和药物的选择上有待于开发有效缓解RAU临床症状，改善患者生活质量减少痛苦，长期应用副作用小的药物。本文没食子有效部位药效实验中，我们发现大鼠造模后，给药组及模型组进食量明显减少，次日进食正常，说明口腔溃疡造成疼痛影响大鼠进食。没食子有效部位治疗后平均溃疡愈合在第5～6天，溃疡面积也明显缩小，与临床治疗天数基本一致。对大鼠血象检测，结果显示治疗组较模型组大鼠白细胞数量明显降低(P＜0.01)，与正常组无差异，说明没食子有效部位在抗炎、减轻炎症反应、促进溃疡组织修复方面有着显著的药理作用。

实施例6没食子有效成分治疗大鼠免疫性口腔溃疡的实验研究

免疫因素在RAU的发病中起着重要作用。有研究发现RAU患者血清中存在一些对口腔粘膜致敏的T淋巴细胞和自身循环抗体，自身循环抗体类型有抗核抗体、抗口腔粘膜抗体、抗胃壁细胞抗体。近年来对RAU病因的研究多集中于免疫方面。研究显示，RAU病人的血清中IgA、IgG、IgD和IgE水平较高，然而某些RAU患者IgG、IgM和IgA水平较低。对RAU患者进行血液免疫学检测，发现一些炎症介质基因表达多态性是RAU发病的高危因素。RAU患者存在免疫功能下降和T细胞亚群失衡。采用免疫抑制剂和免疫增强剂可调剂RAU患者免疫系统功能，调高痊愈率。虽然RAU治疗方法多但疗效不够理想，治疗后复发率高，中药治疗缓和持久，针对其反复性疗效颇佳。随着免疫学等研究的深入目前对RAU病理模型多采用口腔粘膜抗原免疫动物产生RAU，实验动物产生的口腔溃疡与人类RAU症状、病理特征相似。从而支持了RAU发生的免疫异常学说，适合于探讨RAU免疫学发病机制和治疗RAU药物的验证。本研究采用异种口腔粘膜作为抗原复制大鼠RAU模型，探讨没食子有效成分治疗免疫性RAU的作用。

试验方法

家兔口腔粘膜抗原的制备：把透析袋剪成适当长度(10-20cm)的小段，注意带手套。在大体积的2％(W/V)碳酸氢钠和1mmol·L^-1EDTA(pH＝8.0)中将透析袋煮沸10min。用蒸馏水彻底清洗透析袋。放在1mmol·L^-1EDTA(pH＝8.0)中将之煮沸10min。冷却后，存放于4℃冰箱，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋时必须戴手套。用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。抗原制备取2只家兔，急性处死后剥取口腔粘膜组织，用内切式匀浆器匀浆，超声波震荡，低温离心，保留沉淀，取上清液再行透析滤过小分子物质，将大分子蛋白留于袋内。反复透析5次，将袋内物冷冻干燥，获得粉末状蛋白，溶于磷酸缓冲液中，再加入完全弗氏佐剂成乳化液。

试验方法：

取健康大鼠105只，雌雄各半，取上述制备的抗原乳化液，在SD大鼠脊柱两侧皮内注射上述抗原，每只注射两点，每点0.1mL，1次/2周×5次，当注射第2次时，大鼠口腔内便出现不同程度的充血，第3次注射后1周大鼠开始出现口腔溃疡，之后每周观察两次动物记录溃疡情况，注射第4次时，根据大鼠口腔内溃疡次数及数量进行调整注射剂量，使每只动物溃疡程度及数量均衡。第5次注射后，随机分组，分成9组，每组10只，正常组(不用于造模，只取血)、模型组、阳性药1组、阳性药2组、没食子有效部位及有效成分低、中、高剂量组、没食子有效成分灌胃组。口腔粘膜涂抹组一天两次给药，连续给药5d，给药期间观察口腔溃疡发生次数，并记录。末次给药后次次日，乙醚麻醉后腹主动脉取血4mL，室温下放置，0℃3000r/min离心10min分离血清，测血清抗体滴度；分别用黄嘌呤氧化酶法和化学法检测用药前后超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化脂质分解产物(MDA)的改变(操作步骤按试剂说明进行)；立即处死动物，取发生溃疡部位口腔粘膜用15％甲醛溶液固定备用。

双向扩散法检测RAU大鼠血清抗体效价

制备离子琼脂板：用10mL量筒，量取4mL融化的巴比妥琼脂，倒在玻璃上，待琼脂凝固后，打孔后用注射器针头将内琼脂挑出，在酒精灯上烘烤背面，使琼脂与玻璃板贴紧。

稀释抗原和抗体：采用2倍连续稀释法，将抗原抗体按2的等比级数连续稀释。方法是取试管数支，各加入稀释液(生理盐水)一份，在于第一试管中加抗原或抗体一份，用吹吸法混匀后，吸出一份加入第二管中，如此依次稀释至最后一管。其稀释倍数分别为：2、4、8……倍。将稀释好的抗原或抗体依次加到外周孔内，中心孔加入相应的抗体或抗原，加入的量以平琼脂表面为度或用微量注射器定量加入。加样后置大培养皿内(皿内放有湿滤纸或湿纱布以维持湿度)，盖好皿盖，置24-37℃温箱内保湿24-48小时。扩散后可出现清晰可见的沉淀线，以出现的沉淀线抗体稀释倍数最高的一孔为被测定抗体的效价。抗原出现沉淀线的最高稀释倍数与抗体不同。

试剂的配置：

琼脂的净化：高度净化的琼脂，买来即可使用，如果不纯则需要经过净化处理，取30g优质琼脂加970mL水，加热至琼脂全部融化，即成3％的琼脂，用3-4层纱布热滤过，滤液流入一搪瓷盘内，凝固后，切成1cm见方的小块，放入大容器中，将自来水通到容器底部，流水冲洗3d，冲洗时于容器上包个纱布，以防琼脂块顺水冲走。然后用蒸馏水浸泡2-3d，每天换水2-3次，琼脂块净化后即浸没于蒸馏水中，加万分之一硫柳汞防腐，置冰箱内保存备用。

巴比妥离子琼脂的制备：离子强度0.06，PH8.6巴比妥缓冲液：称取10.3g巴比妥钠、1.84g巴比妥酸(如μ＝0.05则称1.82g)溶于水稀释至1000mL。取净化的3％琼脂块，加热融化后加入等体积的离子强度0.06，PH8.6的巴比妥缓冲液，加热混匀即可，制备离子琼脂时，可在琼脂中加入万分之一的硫柳汞，防腐。琼脂中的缓冲液最好比电极槽中的低1/2，这样可以避免电泳时因电流过大引起琼脂变形。

比浊法检测RAU大鼠血清中抗体效价：取小试管作好标记，每只大鼠8管。1管为不加抗原的血清对照管每管加0.5mL血清，第2-8管为待测血清管每管加0.5mL血清；设抗原对照管3支每管加0.5mL口腔粘膜抗原和0.5mL缓冲液。加抗原：2-8管各加入不同稀释倍数的兔口腔粘膜抗原0.5mL，1管加缓冲液0.5mL，混匀后37℃水浴1小时，磷酸缓冲液为对照，用酶标仪于490nm处测定与不同稀释度血清反应后的吸光度值，以比相应对照孔吸光度＞0.010的血清稀释度作为抗口腔黏膜抗体滴度。

统计学方法：实验数据均采用平均值±标准差t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义，均在EXCEL软件中处理。

实验结果

没食子有效成分对大鼠口腔溃疡愈合的影响：

肉眼观察：在免疫造模过程中，所有造模动物均出现了多次不同程度的溃疡，溃疡多发生于舌头、两侧颊粘膜、下唇及牙龈部位，以圆形、椭圆形多见，针眼大小，随着抗原注入次数的增加，溃疡发生次数更频繁，证明造模成功。当注射第2次时，大鼠口腔内便出现不同程度的充血，第3次注射后1周大鼠开始出现口腔溃疡。肉眼可见溃疡面较小，针眼状，周围红肿，颜色较暗，3-7d可自愈以后又再次出现。造模3周后大鼠RAU观察，可见大鼠舌粘膜出现充血水肿，针眼状溃疡。大鼠处死后模型组一只大鼠口腔粘膜，可见大鼠口腔粘膜萎缩溃疡。给药后，除了模型组动物外，其余各组溃疡发生次数均有所减少，且病损减轻，愈合时间缩短，一般2-4d后愈合，说明阳性药以及没食子有效成分都有明显的减少大鼠RAU复发次数、并具有促进愈合、缩短病程的作用。

大鼠口腔溃疡愈合情况：本研究采用异种口腔粘膜作为抗原复制的大鼠口腔粘膜溃疡模型，其溃疡发生情况与人类复发性口腔粘膜溃疡相似，且溃疡的发生反复发作，溃疡大小和愈合时间长短不一，因此，可以用免疫方法制的口腔溃疡为复发性口腔粘膜溃疡模型。从表中可知阳性药地塞米松与模型组比较有差异，其余各组比较无差异，说明地塞米松对免疫性口腔粘膜溃疡的发生有较好的抑制作用。

表7没食子有效成分对大鼠口腔溃疡愈合的影响(

n＝10)

与模型组比较*P＜0.05。

抗体效价测定结果

双向扩散法测抗体效价：取琼脂板于黑色背景上观察抗原、抗体孔间有无白色沉淀线及沉淀线的融合情况。部分最高浓度抗原出现沉淀线，但模糊不清，说明造模大鼠血清中存在抗口腔粘膜抗体，但结果不理想，说明用该方法测血清中抗口腔粘膜抗体灵敏度较低。

比浊法测抗体效价结果：酶标仪测定各管OD值(λ＝490nm)，以缓冲液调零。抗原抗体结合形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促聚剂聚乙二醇等作用下，自液相析出，形成微粒，使反应液出现浊度，浊度大OD值就较大。试验中发现4倍稀释抗原与血清混合测得的OD值，模型组与正常组比较测定OD值较高，说明模型组大鼠血清中有抗口腔粘膜抗体，说明了造模成功，给药组与模型相比较OD值较小，说明没食子有效成分有降低抗口腔黏膜抗体的趋势。其他组与正常组比较除了地塞米松组和中剂量组均有差异，说明血清中都有抗体产生。抗体滴度检测结果，各组与正常组比较，除地塞米松组外，其他各组抗体滴度增高。地塞米松组与模型组有差异，其余各组无差异，说明地塞米松组降低了RAU大鼠血液中抗口腔粘膜抗体水平。

表8没食子有效成分对RAU大鼠血清中抗体滴度的影响(

n＝10)

与对照组相比*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

对大鼠血清中SOD和MDA活性的影响：

SOD是机体清除氧自由基的重要酶类，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，它能抑制口腔粘膜组织中的脂质过氧化反应，并能稳定细胞膜，实验结果显示，与正常组比较模型组动物血清SOD活力明显下降，MDA含量明显升高。而没食子有效成分高、中剂量组、灌胃组给药后明显提高了血清SOD活力，说明其有抗氧化损伤能力。冰硼散组、没食子有效成分高、中、低、剂量组、灌胃组了血清MDA含量降低，表明没食子有效成分有一定的清除氧化代谢产物的作用。

表9没食子有效成分对血清中SOD和MDA活性的影响(

n＝10)

与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组比较▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

对大鼠血象的影响：对大鼠血液中三种不同功能的细胞红细胞、白细胞、血小板的影响进行观察，从表10中可以发现，模型组与正常组相比较白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白浓度(HGB)嗜中性粒细胞(Gran)、淋巴细胞(Lymph)显著升高，中性粒细胞(Mid)显著下降。白细胞在外周血中分五类：中性粒细胞、嗜碱粒细胞、嗜酸粒细胞、单核细胞和淋巴细胞，它们都参与不同的防御免疫任务。白细胞检查是一项与炎症有密切关系的检查，试验结果表明，没食子有效成分对其有不同程度的调节作用，说明没食子有效成分有抗炎作用。

表10没食子有效成分对RAU大鼠的血细胞影响(

n＝10)

病理检查结果：

正常对照组：各组大鼠粘膜没损伤，角化层层下毛细血管正常，无炎症细胞浸润，表皮没损伤。模型组：血管增生，充血严重，水肿，胶原纤维排列规则，角质层轻度角化，上皮结构清除，呈乳头状。阳性药I组：肌肉变性，胶原纤维排列规则，角质层轻度角化，上皮结构清除，呈乳头状。其余各组结果同阳性药I组，无血管充血现象。

结论：没食子有效成分明显减少口腔溃疡的发生次数，促进溃疡部位组织修复，能减低血清中抗口腔粘膜抗体滴度的，并且各治疗组血清中SOD活力明显升高，MDA含量明显下降。因此没食子有效成分具有提高大鼠的抗氧化能力。

讨论：口腔溃疡好发于角化程度较差的区域，如唇、面颊粘膜、舌粘膜。角化程度高的龈、硬腭部较少发生。局部表现为圆形或者椭圆形溃疡。发作时溃疡有“红、黄、凹、痛”的特征，即溃疡中央凹陷，基底不硬，周边有充血红晕带，表面覆有浅黄色假膜，灼痛感明显。可以分为发作期、愈合期和间歇期。整个发作期一般持续1～2周，具有不治而愈的自限性。RAU药物治疗以消炎、止痛、促进溃疡愈合为主，控制复发为主要目的。本研究采用免疫方法制造大鼠RAU模型，溃疡反复发作轻且轻重情况不同，有明显的间歇期和发作期，通过实验证实该方法类似人类RAU，被称为RAU的病理模型。

口腔溃疡局部涂抹给药，由于动物顺从性差，给药后大部分药物可能由于动物的吞咽动作流进消化道或溢出口腔，使药物在局部停留时间较短，影响药效评价。所以采用一天两次给药使药物作用充分达到应有的药效并单设一组灌胃给药组进行对比。由于免疫性RAU模型自发口腔溃疡，溃疡发生情况大小不定，所以每天给药时都进行观察，记录溃疡大小和数量。本研究对化学刺激诱发的口腔溃疡的治疗作用做了评价，结果证明没食子有效成分有显著的促进口腔粘膜溃疡愈合的作用并且明显减轻局部炎症症状。

研究发现RAU患者血清中存在一些对口腔粘膜致敏的T淋巴细胞和自身循环抗体。自身循环抗体类型有抗核抗体、抗口腔粘膜抗体、抗胃壁细胞抗体。这些自身循环抗体也是RAU发病的原因。籍此原理，目前利用免疫技术以成功获得RAU的动物模型。本研究应用免疫学方法造成实验大鼠的RAU发作，其发作特点与人类RAU的临床特点极其相似，该方法也叫RAU病理动物模型，是目前评价RAU药物疗效较为理想的动物模型。本实验采用异种口腔粘膜作为抗原复制的大鼠口腔粘膜溃疡模型，其溃疡发生情况、血清抗体滴度和病理改变与报道基本一致。实验结果证明没食子有效成分对大鼠疫性性口腔粘膜溃疡的发生有较好的抑制作用，使溃疡局部粘膜的病理改变和炎症明显减轻。并且血常规分析发现，没食子有效成分治疗组血清中白细胞数量较模型组下降，各类血细胞数量都恢复正常，说明没食子有效成分有抗炎调节机体免疫功能的作用。

SOD是体内重要的生物自由基消除剂，广泛存在于生物体内，是一种金属酶。SOD对自由基的清除主要是在于还原为水的过程中的第一中间产物，使其转化成为毒性较低的过氧化氢，所以SOD有利于组织细胞的更新和溃疡的愈合。超氧阴离子自由基和过氧化脂质参与许多疾病的病理过程，其性质活泼，反应性强。易造成组织和细胞的氧化损伤而引起各种疾病。体内超氧自由基与脂质发生过氧化反应产生具有细胞毒性的过氧化脂而引发复发性口腔溃疡，如果SOD可以及时清除自由基，则产生的可能性就极小，但是SOD清除能力是有限度的，如果超氧阴离子的产生超过SOD清除能力，SOD可被纯化，而失去酶活性，还会使机体受到过氧化损害。因此治疗自由基所诱发的RAU有效治疗方法是对过量自由基的清除。有研究表明，口腔疾病患者血中SOD的检测发现超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性降低，过氧化产物丙二醛(MDA)水平升高，MDA的高低间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度。因此本研究对免疫性RAU各组大鼠血清中SOD活性和MDA含量进行检测，与正常组比较模型组动物血清SOD活力明显下降，MDA含量明显升高。而没食子有效成分各治疗组给药后明显提高了RAU大鼠血清中SOD活力，降低了MDA含量。清除大鼠体内脂质过氧化物，提高机体抗氧化能力。

实施例7没食子有效部位对口腔常见致病菌的敏感性试验及其镇痛作用的初步研究

没食子的药理学研究证明对细菌和真菌其有较强的抑制和杀灭作用；并能显著抑制急、慢性炎症；提高机体非特异性免疫功能；清热镇痛；清除自由基和抑制脂质过氧化损伤等。没食子在临床上使用多年，具有健齿固龈、清血止血、消炎和防腐之功效，被用于治疗牙周炎、牙龈炎、咽喉炎及口臭等。金黄色葡萄球菌常导致创口感染、表皮感染等，是口腔炎症和脓肿等颌面感染的常见病原菌。白色念珠菌可侵犯人体许多部位，可引起皮肤念珠菌病、粘膜念珠菌病、鹅口疮、口角炎、阴道炎。抗真菌维药复方(由地锦草、没食子、天仙藤、苦楝皮、毛诃子等药材组成)作为自治区维吾尔医医院院内制剂使用，临床上用于治疗真菌感染疾病，疗效显著、复发率低。国外学者研究发现没食子酸和没食子酸甲酯有很强的抗口腔细菌的作用，对粘性放线菌的MIC为1mg·mL^-1，变形链球菌、远缘链球菌等都在2-4mg·mL^-1。RAU局部继发感染后粘膜发生炎症、局部坏死，具有烧灼性疼痛的特点，给患者带来很大痛苦。本实验通过观察没食子有效部位对口腔常见致RAU的致病菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌的敏感性及对醋酸所致小鼠扭体反应的影响，初步探讨其可能的治疗口腔疾病的作用机制，为临床用药提供依据。

试验方法：

抑菌试验：

实验菌的准备：取冷藏金黄色葡糖球菌与大肠杆菌冻存菌株接种于营养肉汤培养基中，37℃孵育12h。细菌计数采用平板菌落计数法。

平板的准备：尽快将菌液倒入融化后冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基15mL/平皿，至水平位置迅速旋转平皿，使培养菌与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。

药液的配置：按商品药的使用治疗量的比例配制药液；如商品西帕依固龈液按其说明量治疗量20mg·mL^-1，可按这个比例配制药液，可取100mg没食子有效部位加入5mL的水中混匀。此稀释液即为用于做药敏试验的药液。

药物纸片的制备：取1号定性滤纸，用打孔机打成6mm直径的圆形小纸片，取圆纸片50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎。20min高压消毒后，放在37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。将灭菌滤纸片浸在2mg·mL^-1(无菌蒸馏水溶)的没食子有效部位药液当中2h取出烘干，阳性对照药用DMSO溶浓度为100μg·mL^-1。对大肠杆菌、白色念珠菌对没食子有效部位敏感试验方法同上，白色念珠菌培养48h，阳性对照用特比萘芬。

抑菌试验：纸片扩散法或流式细胞术测金葡菌、大肠杆菌对没食子有效部位敏感试验：取琼脂平板一块，用记号笔在皿底玻璃上平均划分三区，每区靠边分别注明青霉素区、空白区、没食子有效部位分区。用无菌棉签取金葡菌(菌液调至1×10⁸)均匀涂布于琼脂平面上。注意棉签不可过湿，沾上菌液后于试管壁处轻轻压一下待稍干。用镊子沾取95％酒精点燃灭菌后，接种的金葡菌的平板上分别取青霉素、生理盐水、没食子有效部位的纸片，接种金葡菌的平板区中央(每取一种药物纸片前，镊子均需烧灼灭菌，待稍凉后再取药物纸片)。将平板置37℃孵箱培养24h，观察结果。细菌对某种药物敏感，则含该药纸片周围无细菌生长，此区称抑菌圈，以毫米为单位测量抑菌圈直径(包括纸片直径)，可判断细菌对药物的敏感程度。(判断标准以所用纸片的规定标准一致)。

观察指标的标准：抑菌圈＜10mm，表示不敏感；10mm表示轻度敏感；11-15mm，表示中度敏感；16-20mm，表示高度敏感。

镇痛试验：取小鼠50只，体重为20±2g随机分成5组，每组10只，将没食子有效部位及有效成分分为低(30mg·kg^-1)、中(60mg·kg^-1)、高(120mg·kg^-1)三个剂量组，对乙酰氨基酚150mg·kg-1为阳性对照组，正常对照组给等量生理盐水。将没食子有效部位配制成溶液，0.2mL/10g灌胃给药5天，每天一次末次给药30min后，每只小鼠分别腹腔注射6g·L^-1的冰醋酸溶液0.2mL/只，10min后，记录每只动物10min内的扭体次数(以小鼠出现腹部内凹、躯干与后肢申张，臀部高起为扭体反应)，计算镇痛率。镇痛率(％)＝(模型组扭体次数-给药组扭体次数)/模型组扭体次数×100％，进行统计学处理。

统计学方法：实验数据均采用平均值±标准差

结果：

抑菌结果：

表11没食子有效部位抑菌结果(

n＝4)

从表11中可知金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌对浓度20mg·mL^-1没食子有效部位及有效成分高度敏感，说明没食子有效部位有很强的抑菌作用。

镇痛试验结果：没食子有效部位各剂量组均能减少醋酸致小鼠扭体反应次数，具有镇痛作用，与模型组比较，阳性药、没食子有效部位中、高剂量有明显差异(P＜0.01)。结果表明没食子有效部位各剂量组对醋酸所致的小鼠疼痛有不同程度的抑制作用。

表12没食子有效部位对醋酸所致小鼠扭体反应的影响(

n＝10)

与正常对照组相比*P＜0.05，**P＜0.01

结论及讨论：RAU患者临床上主要表现为炎症和疼痛，在局部形成溃疡后继发感染，造成口腔溃疡局部粘膜组织炎症、坏死，使病程延长，加重患者的痛苦。以没食子为原料的单方制剂西帕依固龈液是收录国家基本药品目录的维药，由国家部颁标准维吾尔药分册收载，具有健齿固龈、消炎和防腐的功效，用于治疗牙周炎、牙龈炎、咽喉炎及口臭等。在临床已应用十余年，证明消炎镇痛效果显著。已有实验证明其对口腔致病菌有很强的抑制作用。本实验通过观察没食子有效部位对口腔常见细菌的抑制作用，发现没食子有效部位对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌都有较强的抑制作用。与宋忠臣等的没食子对口腔常见细菌抑制作用的体外研究结果比较，优于其实验结果。其报道的最佳抑菌浓度为20mg·mL^-1，对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径为20mm。综上所述，虽然没食子有效部位对口腔常见细菌有明显的抑制作用。但对抑菌的作用机制等方面目前尚未清楚，还有待进一步研究。本研究表明没食子有效部位对醋酸所致的小鼠疼痛有明显的抑制作用，综上结果得出没食子有效部位有提高机体特异性免疫力和促进巨噬细胞吞噬功能、抗菌镇痛的作用。进一步证明没食子有效部位能够改善口腔疾病症状，可预防溃疡和牙龈炎的发生，减轻患者痛苦。

实施例8没食子有效部位体外抗炎活性评价

炎症反应的最重要功能是将炎症细胞输送到炎症局部，白细胞的渗出是炎症反应最重要的特征。中性粒细胞和单核细胞渗出可吞噬和降解细菌、免疫复合物和坏死组织碎片，构成炎症反应的主要防御环节。但炎症细胞也可通过释放酶、化学介质(如IL-1、IL-6、IL-8、COX、TNF-α、NO、PGE2等)和毒性自由基等，从而造成瀑布式的炎症控性反应，使组织损伤并成为炎症的重要病理过程。故当机体外来病原菌清除，恢复免疫细胞免疫功能的恒定，已终止炎症反应，或是阻止炎症反应的任意环节便可以减轻炎症症状。所以若能够抑制促炎介质的分泌及作用，而减轻炎症症状恢复正常免疫功能是抗炎免疫调节药物作用的重要作用机制。免疫调节药具有抗炎和双向免疫调节作用，近年来成为国内外研究的热点之一，值得注意的是许多中草药具有抗炎和免疫调节作用。

很多促炎介质在口腔疾病的发生发展中起着重要的作用，例如TNF-α可致口腔上皮损坏形成溃疡，其主要由巨噬细胞分泌，还反作用于巨噬细胞，刺激细胞产生活性氧自由基等进而加重口腔粘膜炎症损伤，使溃疡向病理方向发展。溃疡基底部巨噬细胞还会强烈表达iNOS，被激活后产生大量的NO，造成严重的细胞损伤，加重局部炎症反应。脂多糖(lipopolysaccharide)是革兰阴性细菌细胞壁外膜的结构成分之一，可以诱导机体产生发热、休克及痛觉增敏等表现，是较为常见的炎症致病因子。RAW264.7细胞属小鼠单核/巨噬细胞系，可被LPS激活产生大量的炎症介质(NO、TNF-α、COX-2等)，模拟体内炎症反应。本研究采用LPS诱导RAW264.7细胞形成体外炎症反应模型，探讨没食子有效部位对RAW264.7细胞在致炎因子作用下分泌TNF-α的含量以及iNOS、COX-2、TNF-α基因表达量的影响。

没食子有效部位对RAW264.7细胞生长曲线和细胞活力的影响：

细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，也可以测定药物等外来因素对细胞生长的影响。本实验观察没食子有效部位及LPS作用于RAW264.7细胞7天，测得细胞生长曲线，随着药物作用时间的延长，细胞生长曲线的变化，得出药时关系，为最终选择合适的浓度或更合理的浓度梯度进行下一步的实验提供参考。

实验方法

细胞生长曲线的绘制：

制备细胞悬液：细胞消化后计数，用培养液稀释调整为1-8×10⁴个/mL，以每孔100μL接种于24孔板，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养，12小时待细胞完全贴壁后，每天测2个复孔，最后两天各测一孔，测定前每孔加100μL(5mg·mL-1)的MTT，继续培养4小时，弃上清液，加DMSO150mL/孔，吹打使甲臜颗粒充分溶解。吸取200μL该溶解液至96孔板孔中，在酶标仪上读取OD值，检测波长490nm。

没食子有效部位对RAW264.7细胞生长曲线的影响：

制备细胞悬液：细胞消化后计数，用培养液稀释调整为1-8×10⁴个/mL，以每孔100μL接种于24孔板，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，12小时待细胞完全贴壁后，分为两组，没食子有效部位组加入没食子有效部位终浓度为25μg·mL^-1。空白对照组加等体积溶剂的培养液，在加药后的1、2、3、4、5、6、7天测结果。

不同药物对RAW264.7细胞生长曲线的影响：

制备细胞悬液：细胞消化后计数，用培养液稀释调整为1-8×10⁴个·mL^-1，以每孔100μL接种于24孔板，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，12小时待细胞完全贴壁后，分为4组，没食子有效部位加入没食子有效部位+LPS终浓度为25μg·mL^-1，LPS组加10μg·mL^-1的LPS10μL，地塞米松+LPS组加10^-7mmol·mL^-1地塞米松100μL。空白对照组加等体积溶剂的培养液，在加药后的1、2、3、4、5、6、7天测结果。

台盼兰法检测细胞活力：取对数生长期的RAW264.7细胞，以1×10⁴个·mL^-1的细胞悬液，接种于25mL培养瓶中，每瓶4mL，置37℃、5％CO₂孵箱培养。培养24h后，吸弃各瓶培养液，加入不含药物的空白培养液及含有相应浓度药物(100μg·mL^-1、50μg·mL^-1、25μg·mL^-1、12.5μg·mL^-1)的新鲜培养液。培养48h后，消化细胞，进行台盼兰染色，倒置显微镜下观察，血球计数板计数。细胞活力＝(总细胞数-不排斥染料的蓝色细胞个数)/总细胞数×100％。连续计数3次，取其平均值，实验重复3次。

统计学方法：实验数据均采用平均值±标准差

实验结果

没食子有效部位对RAW264.7细胞形态学的影响：

RAW264.7细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养基(高糖型)中生长良好。传代后2-4h贴壁，形态以类圆形和不规则多边形为主，一般含1-2个核，有伪足，细胞胞体较小。细胞生长快，5-6天可汇合。细胞贴壁紧，用胰酶难以消化。消化前先用PBS液把细胞洗1遍，然后加入胰酶进行第1遍消化，这时会有部分细胞被消化下来。把这部分细胞移走，剩下的细胞用PBS液泡3-5min，弃去PBS液。再加胰酶进行第2遍消化，这样大部分细胞都会消化下来。药物处理细胞后显微镜下观察没食子有效部位对体外培养的RAW264.7细胞的影响，对照组的RAW264.7细胞均匀分布，形态呈梭形或多角形，贴壁牢固，透明度高，形态正常，折光性强，核分裂相对较多，生长旺盛。与空白组相比较，单纯没食子有效部位作用后与正常组比较形态无差别但部分细胞可见体积变大较多，核分裂较多。LPS组与正常细胞组比较细胞伪足增多，胞体变大。没食子有效部位+LPS组RAW264.7细胞部分皱缩，体积变小，核分裂相较少，聚集成团，折光性差，胞浆内可见大量黑色颗粒，透明度显著下降，部分漂浮于培养液中，细胞肿胀，部分细胞膜破裂，表明细胞已经坏死。

对生长曲线的影响：随着药物作用时间的延长，不同药物对RAW264.7细胞增殖速度有明显差异。正常细胞生长曲线在贴壁24h细胞潜伏期过后，在2-5d细胞进入对数生长期，细胞生长加快，大约在第5-6d细胞进入平台期，8-9d细胞生长受到抑制，没食子有效部位干预后，细胞生长加快(24-72h)，在第4天细胞开始出现进入平台期，细胞活性减弱，7d后生长受到抑制。观察LPS、没食子鞣质+LPS和没食子酸+LPS干预细胞，培养1-5d，在对数生长期对细胞生长曲线的影响，实验发现，以上不同药物干预下，细胞在第4d生长受到抑制，细胞活力和和增值能力较正常细胞下降，但是在细胞接种后的72h之内影响不大，可以再次阶段检测药物对细胞吞噬功能的影响。

对细胞活力的影响：台盼蓝是检测细胞膜完整性最常用的生物染色试剂。健康的正常细胞，细胞膜完整，能够排斥台盼蓝；而死亡的细胞，膜的完整性丧失，通透性增加，细胞被台盼蓝染成蓝色，很容易与活细胞区分。细胞经台盼蓝染色后，可通过显微镜，直接镜下计数或拍照后计数，实现对活细胞的计数。细胞活力结果显示在药液浓度为100μg·mL^-1时，细胞活力可以达到60％以上，所以，检测细胞增殖抑制作用实验，采用100μg·mL^-1以下浓度。浓度越大，细胞活力越低，说明药液浓度越大，细胞毒性作用越明显。药液浓度在大于100μg·mL^-1时，药物毒性已经不是安全毒性范围内了。

表13没食子有效部位对细胞活力的影响(％)

结论：细胞生长条件适合，细胞在接种24h后即进入对数生长期，第5-6天长满。LPS、地塞米松、没食子有效部位在一定的浓度范围内对细胞无毒性作用。

讨论：实验中正常细胞在第五天到达平台期，一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的对数生长期，呈平台状的平顶期及退化衰亡4个部分。在没食子有效部位的干预下RAW264.7细胞在1-4d生长明显加快，干预第4d细胞开始出现进入平台期说明在没食子有效部位对RAW264.7细胞增殖能力有促进转为抑制。在LPS干预下细胞在1-4d对数生长期停止生长进入平台期，没食子有效部位和LPS同时干预细胞随着作用时间的延长细胞增殖受到抑制。台盼兰法检测细胞活力发现加LPS刺激和未加LPS刺激细胞活力没有改变，显微镜下观察，LPS刺激后细胞形态变化很大，说明细胞被激活。而没食子有效部位形态并没有很大改变，但加LPS共同刺激后，细胞形态发生改变，由此推测，没食子有效部位与LPS共同作用细胞后对细胞增殖影响不明显，单独作用细胞可促进细胞生长但随作用时间的延长由增殖转为抑制。

没食子有效成分对RAW264.7细胞增殖、形态和吞噬功能的影响：

机体免疫保护机制可分为两大类，第一类为先天性免疫反应也称非特异性免疫反应，第二类为后天性免疫反应也称特异性免疫反应。单核/巨噬细胞是宿主免疫反应是重要防御细胞和提呈细胞，参与特异性免疫和非特异性免疫反应，它会将入侵的外来病原菌消减，成为机体对抗外来物质的第一道防线，在炎症反应中渗出可吞噬和降解细菌、免疫复合物和坏死组织碎片，构成炎症反应的主要防御环节。故以巨噬细胞增殖和吞噬功能等细胞行为变化为研究对象，成为开发新型免疫调节药物的新策略。本研究在LPS刺激RAW264.7细胞炎症反应条件下，探讨没食子有效成分对其吞噬功能、形态、细胞活性的影响。

实验结果：

细胞形态观察：RAW264.7细胞在外源致炎物质刺激下有很好的反应，可以作为炎症细胞模型来应用。通过细胞形态观察可以得出正常细胞贴壁后6h细胞形态呈圆形、椭圆性、多角形、状态良好，细胞表面少见突起。巨噬细胞在环境因素刺激下，可发生形态、膜分子表达以及细胞功能与形态也发生改变变化。LPS作用6h后，巨噬细胞体积明显增大，呈圆形、椭圆形、不规则形，还可见较长伪足，表面有突起。

增殖结果：从表14中可知与LPS共同刺激的没食子有效成分组20、40μg·mL^-1有显著增值作用，增值率分别为115.28％和114.89％，80μg·mL^-1的没食子有效成分作用后没有明显的增值作用。未加LPS组，40、80μg·mL^-1没食子有效成分对RAW264.7细胞的增值率都达到130％以上，并且在5-80μg·mL^-1范围内没食子有效成分各剂量组对RAW264.7细胞有明显促进增值作用，成一定的浓度依赖型。

表14对RAW264.7细胞增殖的影响(

n＝4)

注：与control组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

没食子有效成分对RAW264.7细胞吞噬功能的影响：

表15对RAW264.7细胞吞噬功能的影响(

n＝4)

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，与LPS组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

从表15中可知50μg·mL^-1的没食子有效成分对10μg·L^-1的LPS刺激的RAW264.7细胞吞噬功能有明显的促进作用。不同浓度的没食子有效成分对其没有明显的促进作用。

结论：没食子有效成分对RAW264.7细胞增值有明显的促进作用，但对LPS刺激后的细胞无明显作用，没食子有效成分使LPS刺激后的细胞吞噬功能增强。

讨论：巨噬细胞具有广泛的生物学功能，在免疫反应的很多阶段发挥重要作用。主要包括：(1)加工处理提呈抗原、启动特异性免疫应答；(2)非特异性吞噬杀伤作用和活化后分泌毒性物质、抗微生物肽及酶类等产物发挥杀伤效应；(3)免疫调节作用(4)抗肿瘤作用。在免疫药理学的研究中，中药对巨噬细胞功能的影响受到人们越来越多的关注，并有望从中开发出具有高效低毒免疫调节作用的新药。RAW264.7细胞属单核/巨噬细胞系，在外源活性物质刺激后其吞噬率及吞噬速度增高，杀菌、杀瘤能力分泌活性及抗原呈递能力也增强。例如LPS，通过刺激巨噬细胞而激活防御反应，其可增加细胞的粘附，触发细胞表达、分泌许多细胞因子。本实验通过没食子有效成分与RAW264.7增值、吞噬的关系发现，没食子有效成分一方面能明显促进细胞增殖能力和生存能力，具有活化巨噬细胞的作用。另一方面对LPS刺激活化的细胞增殖能力并没有明显的促进作用，但是对其吞噬功能有一定的增强作用，从而发挥着双向调节的作用。

Claims

1.一种治疗口腔疾病的药物的制备方法，其特征在于该方法是从维药没食子中提取分离得到没食子鞣质有效部位及有效成分，然后将有效部位和有效成分分别按常规制药方法制成口含片、口崩片、口腔泡腾片或膜剂，或将有效部位和有效成分混合，按常规制药方法制成口含片、口崩片、口腔泡腾片或膜剂，具体操作按下列步骤进行：

b、再将没食子粗提物用浓度为0-60％乙醇水溶液溶解，用大孔树脂、聚酰胺或葡聚糖凝胶吸附，用浓度0-95％的有机试剂乙醇水溶液或甲醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩，干燥，即得没食子鞣质有效部位，以干品重量计算含总鞣质50-99.9％；

c、然后进一步用制备液相色谱或逆流色谱技术或得到没食子有效成分没食子酸、间-双没食子酸、没食子酸甲酯、1，2，3，6-四-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖和1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖，含量为40-99.8％；

d、按常规制药方法，将步骤b所得没食子有效部位和步骤c所得有效成分混合或分别制备成口含片、口崩片、口腔泡腾片或膜剂即可。