CN115300485A - 一种口腔溃疡贴剂及其制备方法 - Google Patents

一种口腔溃疡贴剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种口腔溃疡贴剂及其制备方法，属于医疗制剂领域。一种口腔溃疡贴剂包括：片状的防水保护层以及覆盖在防水保护层侧面的缓释载药层；缓释载药层主要包括以下原料：缓释成膜材料、没食子水提物、葡萄糖酸锌、抑菌剂、矫味剂、第一增塑剂和第一溶剂。本发明提供的口腔溃疡贴剂，具有良好的粘附性，能够很好粘附于口腔溃疡患处，双层结构在一定程度上延长病损区的药物作用时间，止痛、消炎及促进愈合，造福广大口腔溃疡患者。在缓释载药层中以没食子水提物作为中药有效成分，利用冻干工艺，制备成口腔溃疡贴剂，使其具有粘附性强，不易脱落，疗效持久，使用方便的优点，可显著缩短口腔溃疡时间，减少患者疼痛，提高患者生活质量。

Description

一种口腔溃疡贴剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及医药制剂技术领域，具体涉及一种口腔溃疡贴剂及其制备方法。
背景技术
口腔溃疡是一种发生于口腔黏膜的溃疡性病症，其发病率高，可见于包括唇、舌头、颊黏膜和软腭等口腔粘膜部位。发作时局部剧烈烧灼、疼痛，严重时影响饮食、说话并，对日常生活造成不便，可并发头痛、头晕、恶心、乏力、发热、淋巴结肿大等全身症状。口腔溃疡引发的原因有多种，包括自身免疫力下降；维生素缺乏；外伤；病毒；白细胞水平降低等原因。临床上常见的口腔溃疡有复发性阿弗他性口炎、创伤性溃疡、癌性溃疡、放射性口炎、结核性溃疡等。在治疗时，一般以抗生素、激素、维生素及具有清热收敛生肌功效的中药以溃疡膜形式局部应用为主。但常用的溃疡膜容易脱落，导致药物渗透作用不够，同时局部给药耗尽后，创口裸露导致继发感染，影响疗效。因此，在口腔唾液湿性环境下，治疗口腔溃疡的药物能够长时间保护创口、隔绝外界侵蚀格外重要。
另外，现有口腔溃疡类药物在口腔唾液的作用下，向创口外侧缓释释放的速度要远快于向创口释放的速度，导致大部分药物随着唾液与外界食物等的侵蚀而流失，用于治疗创口的药物利用率很低，同时短时的作用很难起到长时间保护创口和隔绝外界侵蚀的作用。因此，制备出具有良好防止所给药物逆向释放、长时作用、隔绝外界侵蚀特性的口腔局部给药剂型是口腔溃疡类药物急需改进的一大难题。与目前临床常用的甾体或非甾体抗炎化学药物相比，中草药长期应用的副作用较少，并且比化学合成药物的成本更低，为了有效的防治口腔溃疡并且避免的长期应用药物所产生的副作用，因此中草药的研究越来越受到重视。
发明内容
本发明的目的是提供一种口腔溃疡贴剂及其制备方法，以解决现有如何将中草药应用于治疗口腔溃疡的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供一种口腔溃疡贴剂，所述口腔溃疡贴剂为双层结构，包括：片状的防水保护层以及覆盖在所述防水保护层侧面的缓释载药层；
所述缓释载药层主要包括以下原料：缓释成膜材料、没食子水提物、葡萄糖酸锌、抑菌剂、矫味剂、第一增塑剂和第一溶剂。
进一步地，在所述的口腔溃疡贴剂中，所述缓释载药层主要包括以下质量百分比的原料：缓释成膜材料20％～80％、没食子水提物0.001％～0.002％、葡萄糖酸锌1％～5.5％、抑菌剂0.05％～0.5％、矫味剂0.1％～2％、第一增塑剂5％～20％，余量为第一溶剂。
进一步地，在所述的口腔溃疡贴剂中，所述缓释成膜材料包括：卡波姆、壳聚糖、淀粉、明胶、阿拉伯胶、透明质酸钠、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠和聚乙烯醇中的一种或多种。
进一步地，在所述的口腔溃疡贴剂中，所述抑菌剂包括：乳酸链球菌素、对羟基苯甲酸丙酯钠、山梨酸钾和对羟基苯甲酸甲酯钠中的一种或多种。
进一步地，在所述的口腔溃疡贴剂中，所述矫味剂包括：甜菊苷、三氯蔗糖、甜蜜素、甜菊糖苷和粉末蔗糖中的一种或多种。
进一步地，在所述的口腔溃疡贴剂中，所述第一增塑剂包括：甘油、丙二醇、聚山梨酯或聚乙二醇；
优选地，所述第一溶剂包括：磷酸盐缓冲溶液。
进一步地，在所述的口腔溃疡贴剂中，所述防水保护层包括：防水材料、第二增塑剂和第二溶剂；
优选地，所述防水保护层主要包括以下质量百分比的原料：防水材料30％～70％、第二增塑剂10％～15％，余量为第二溶剂。
进一步地，在所述的口腔溃疡贴剂中，所述第二增塑剂包括：甘油、丙二醇、丙三醇、聚乙二醇和聚山梨酯中的一种或多种；
优选地，所述第二溶剂为乙醇或水；
优选地，所述防水材料包括：乙基纤维素或玉米阮；或，海藻酸钠以及氯化钙、硝酸纤维素和聚维酮中的一种或多种。
本发明提供所述的口腔溃疡贴剂的制备方法，包括以下步骤：
依次将缓释成膜材料、第一增塑剂溶于第一溶剂中，搅拌混匀获得第一混合溶液；
将矫味剂和抑菌剂溶于第一溶剂中，搅拌混匀获得第二混合溶液；
将第二混合溶液、葡萄糖酸锌和没食子水提物分别加入到第一混合溶液中，搅拌混合均匀制得缓释载药溶液；
将所述缓释载药溶液涂布在防水保护层上，经冻干成型，制得所述口腔溃疡贴剂。
进一步地，在所述的口腔溃疡贴剂的制备方法中，在所述防水材料为乙基纤维素或玉米阮时，所述防水保护层的制备方法包括：
将所述防水材料溶于所述第二溶剂中，再加入所述第二增塑剂，加热至温度60℃～80℃后，以转速50r/min～100r/min，搅拌45min～60min，制得防水保护溶液；
将所述防水保护溶液涂布后，在55℃～65℃温度下干燥成膜，制得所述防水保护层；
优选地，在所述防水材料为海藻酸钠以及氯化钙、硝酸纤维素和聚维酮中的一种或多种时，所述防水保护层的制备方法包括：
将海藻酸钠和第二增塑剂溶于第一溶剂中，加热至温度60℃～80℃，以转速50r/min～100r/min，搅拌45min～60min后，制得海藻酸钠溶液；
除海藻酸钠外的防水材料溶于第二溶剂中配成1wt％溶液，再与降温至25℃～50℃的所述海藻酸钠溶液混合均匀制得防水保护溶液；
将所述防水保护溶液涂布后，在55℃～65℃温度下干燥成膜，经洗涤后制得所述防水保护层。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的口腔溃疡贴剂，具有良好的粘附性，能够很好粘附于口腔溃疡患处，双层结构在一定程度上延长病损区的药物作用时间，止痛、消炎及促进愈合，造福广大口腔溃疡患者。在缓释载药层中以没食子水提物作为中药有效成分，利用冻干工艺，制备成口腔溃疡贴剂，使其具有粘附性强，不易脱落，疗效持久，使用方便的优点，可显著缩短口腔溃疡时间，减少患者疼痛，提高患者生活质量。
本发明采用的没食子是中医常用药材，其性寒、味苦，具有固涩、收敛、燥湿、止血的作用，具有很好的抗炎、抗肿瘤、抗氧化和抗菌活性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明试验例二中的生物膜的细胞活力测定结果；其中，*，与对照组比较p＜0.05；△，与没食子组比较p＜0.05。
图2为本发明试验例二中的生物膜表面粗糙度比较结果；其中，*，与基线比较p＜0.05。
图3为本发明试验三中的没食子提取物对HGEK细胞活力的影响结果；其中，*，与阴性对照组相比，p<0.05。
图4为本发明试验三中的没食子提取物对炎症标志物的影响结果；*，与对照组比较，p<0.05；△，与LPS组比较p<0.05。
图5为本发明试验三中的划痕伤口愈合试验细胞迁移结果。
图6为本发明试验三中的没食子提取物对LPS刺激角质形成细胞中Nrf2和HO-1表达的影响；其中，*p<0.05。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明的方案为：
本发明的口腔溃疡贴剂为双层结构，包括：片状的防水保护层以及覆盖在防水保护层侧面的缓释载药层。口腔溃疡贴剂的厚度为0.3cm，防水保护层的厚度为0.1-0.15cm，缓释载药层的厚度为0.15-2cm。
缓释载药层主要包括以下质量百分比的原料：缓释成膜材料20％～80％、没食子水提物0.001％～0.002％、葡萄糖酸锌1％～5.5％、抑菌剂0.05％～0.5％、矫味剂0.1％～2％、第一增塑剂5％～20％，余量为第一溶剂。缓释成膜材料包括：卡波姆、壳聚糖、淀粉、明胶、阿拉伯胶、透明质酸钠、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠和聚乙烯醇中的一种或多种。抑菌剂包括：乳酸链球菌素、对羟基苯甲酸丙酯钠、山梨酸钾和对羟基苯甲酸甲酯钠中的一种或多种。矫味剂包括：甜菊苷、三氯蔗糖、甜蜜素、甜菊糖苷和粉末蔗糖中的一种或多种。第一增塑剂包括：甘油、丙二醇、聚山梨酯或聚乙二醇。第一溶剂包括：磷酸盐缓冲溶液，其中磷酸盐缓冲溶液配制为：称取7.9g NaCl、0.2g KCl、1.8g K2HPO4和0.24g KH2PO4溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液至7.4，最后加蒸馏水定容至1L，制成磷酸盐缓冲液。
防水保护层主要包括以下质量百分比的原料：防水材料30％～70％、第二增塑剂10％～15％，余量为第二溶剂。第二增塑剂包括：甘油、丙二醇、丙三醇、聚乙二醇和聚山梨酯中的一种或多种。第二溶剂为乙醇或水，其中实用质量浓度为75～95％的乙醇溶液。优选地，防水材料包括：乙基纤维素或玉米阮；或，海藻酸钠以及氯化钙、硝酸纤维素和聚维酮中的一种或多种。
本发明的口腔溃疡贴剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备防水保护层
(11)在防水材料为乙基纤维素或玉米阮时，防水保护层的制备方法包括：将防水材料溶于第二溶剂中，再加入第二增塑剂，加热至温度60℃～80℃后，以转速50r/min～100r/min，搅拌45min～60min，制得防水保护溶液；
将防水保护溶液涂布于冻干模具的内壁表面后，在55℃～65℃温度下干燥成膜，制得防水保护层。
(12)在防水材料为海藻酸钠以及氯化钙、硝酸纤维素和聚维酮中的一种或多种时，防水保护层的制备方法包括：
将海藻酸钠和第二增塑剂溶于第一溶剂中，加热至温度60℃～80℃，以转速50r/min～100r/min，搅拌45min～60min后，制得海藻酸钠溶液；
除海藻酸钠外的防水材料溶于第二溶剂中配成1wt％溶液，再与降温至25℃～50℃的海藻酸钠溶液混合均匀制得防水保护溶液；
将防水保护溶液涂布于冻干模具的内壁表面后，在55℃～65℃温度下干燥成膜，经用蒸馏水洗涤后制得制得防水保护层。
(2)制备缓释载药层
(21)依次将缓释成膜材料、第一增塑剂溶于第一溶剂中，搅拌混匀获得第一混合溶液；具体地，步骤(21)使用的第一溶剂占比为50～80％。
(22)将矫味剂和抑菌剂溶于第一溶剂中，搅拌混匀获得第二混合溶液；
(23)将第二混合溶液、葡萄糖酸锌和没食子水提物分别加入到第一混合溶液中，搅拌混合均匀制得缓释载药溶液。
(3)将缓释载药溶液涂布在冻干模具内的防水保护层上，然后放入冻干机中冻干成型，制得口腔溃疡贴剂。
其中，冻干成型操作为：在-20±2℃预冻至少5h，再降温至-40±5℃，继续冷冻2h，然后抽真空至气压≤20Pa，再于-20±2℃冷冻干燥，保持至少6h，最后于20℃±5℃干燥5h。
本发明的口腔溃疡贴剂裁剪成为1cm×1cm的矩形片，或直径为1cm的圆片，装入密封包装袋，于0～6℃条件下保存。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制；本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下，对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，均在本发明的保护范围内。
实施例1
本实施例的口腔溃疡贴剂为双层结构，一层为片状的防水保护层；另一层为缓释载药层，覆盖在防水保护层的一个侧面。防水保护层的厚度为2cm，缓释载药层的厚度为1cm。
缓释载药层主要包括以下质量百分比的原料：成膜材料为明胶，含量为20％；没食子水提物0.001％；葡萄糖酸锌5％；抑菌剂为对羟基苯甲酸甲酯钠，含量为0.5％；矫味剂为甜菊苷，含量为1％；第一增塑剂为甘油，含量为5％；余量为磷酸盐缓冲溶液的第一溶剂。
防水保护层主要包括以下质量百分比的原料：防水材料为玉米阮(15g)，含量为40％；第二增塑剂为甘油，含量为15％；余量为乙醇溶液(质量浓度95％)的第二溶剂。
本实施例的口腔溃疡贴剂的制备方法，包括：
(1)制备防水保护层；
将防水材料溶于第二溶剂中，再加入第一增塑剂，加热至温度70℃，转速100r/min，搅拌时间60min，将混匀后的溶液涂布于冻干模具的内壁表面；然后在55℃条件下鼓风干燥成膜，制成防水保护层。
(2)制备缓释载药层
将成膜材料溶于总质量50％的第一溶剂中，混匀获得溶液A；
将第一增塑剂加入溶液A中，搅拌混匀获得溶液B；
将矫味剂和抑菌剂溶解于剩余第一溶剂中，制备成C溶液；
将C溶液、葡萄糖酸锌和没食子提取物分别加入到B溶液中，混匀制成载药层溶液。
(3)将缓释载药层溶液涂布在冻干模具内的防水保护层上，然后放入冻干机中冻干成型，获得口腔溃疡贴剂。
实施例2
本实施例的口腔溃疡贴剂的结构与实施例1一致，区别在于缓释载药层和防水保护层的组成配比不同。
本实施例的缓释载药层主要包括以下质量百分比的原料：成膜材料为淀粉，含量为25％；没食子水提物0.0015％；葡萄糖酸锌5.5％；抑菌剂为对羟基苯甲酸甲酯钠，含量为0.1％；矫味剂为甜蜜素，含量为2％；第一增塑剂为丙二醇，含量为5％；余量为磷酸盐缓冲溶液的第一溶剂。
防水保护层主要包括以下质量百分比的原料：防水材料为乙基纤维素(35g)，含量为35％；第二增塑剂为甘油，含量为10％；余量为乙醇溶液(质量浓度95％)的第二溶剂。
本实施例的口腔溃疡贴剂的制备方法，包括：
(1)制备防水保护层；
将防水材料溶于第二溶剂中，再加入第一增塑剂，加热至温度65℃，转速80r/min，搅拌时间55min，将混匀后的溶液涂布于冻干模具的内壁表面；然后在60±5℃条件下鼓风干燥成膜，制成防水保护层。
(2)制备缓释载药层
将成膜材料溶于总质量40％的第一溶剂中，混匀获得溶液A；
将第一增塑剂加入溶液A中，搅拌混匀获得溶液B；
将矫味剂和抑菌剂溶解于剩余第一溶剂中，制备成C溶液；
将C溶液、葡萄糖酸锌和没食子提取物分别加入到B溶液中，混匀制成载药层溶液。
(3)将缓释载药层溶液涂布在冻干模具内的防水保护层上，然后放入冻干机中冻干成型，获得口腔溃疡贴剂。
实施例3
本实施例的口腔溃疡贴剂的结构与实施例1一致，区别在于缓释载药层和防水保护层的组成配比不同。
本实施例的缓释载药层主要包括以下质量百分比的原料：成膜材料为阿拉伯胶，含量为20％；没食子水提物0.002％；葡萄糖酸锌3％；抑菌剂为山梨酸钾，含量为0.2％；矫味剂为三氯蔗糖，含量为4％；第一增塑剂为聚山梨酯，含量为6％；余量为磷酸盐缓冲溶液的第一溶剂。
防水保护层主要包括以下质量百分比的原料：防水材料为海藻酸钠(20g)和氯化钙(1g)，含量为30％；第二增塑剂为丙二醇，含量为6％；余量为水的第二溶剂。
本实施例的口腔溃疡贴剂的制备方法，包括：
(1)制备防水保护层；
将海藻酸钠和第二增塑剂溶于第二溶剂中，加热至温度60℃，转速80r/min，搅拌时间45min，混匀制成海藻酸钠溶液，降温至30℃；
将氯化钙溶于第二溶剂中，制成质量浓度为1％的氯化钙溶液；将海藻酸钠溶液和氯化钙溶液两种溶液混匀并涂布于冻干模具的内壁表面，然后在60±5℃条件下干燥成膜，蒸馏水洗去多余的氯化钙，制成防水保护层。
(2)制备缓释载药层
将成膜材料溶于总质量55％的第一溶剂中，混匀获得溶液A；后续步骤同实施例1中制备缓释载药层后续步骤一致。
实施例4
本实施例的口腔溃疡贴剂的结构与实施例1一致，区别在于缓释载药层和防水保护层的组成配比不同。
本实施例的缓释载药层主要包括以下质量百分比的原料：成膜材料为明胶，含量为40％；没食子水提物0.0015％；葡萄糖酸锌5％；抑菌剂为对羟基苯甲酸丙酯钠，含量为0.3％；矫味剂为甜菊糖苷，含量为1％；第一增塑剂为聚乙二醇，含量为10％；余量为磷酸盐缓冲溶液的第一溶剂。
防水保护层主要包括以下质量百分比的原料：防水材料为乙基纤维素(35g)，含量为45％；第二增塑剂为丙二醇，含量为10％；余量为乙醇溶液(质量浓度85％)的第二溶剂。
本实施例的口腔溃疡贴剂的制备方法，包括：
(1)制备防水保护层；
将防水材料溶于第二溶剂中，再加入第二增塑剂，加热至温度70℃，转速60r/min，搅拌时间50min，将混匀后的溶液涂布于冻干模具的内壁表面；然后在60±5℃条件下鼓风干燥成膜，制成防水保护层。
(2)制备缓释载药层
将成膜材料溶于总质量55％的第一溶剂中，混匀获得溶液A；后续步骤同实施例1中制备缓释载药层后续步骤一致。
实施例5
本实施例的口腔溃疡贴剂的结构与实施例1一致，区别在于缓释载药层和防水保护层的组成配比不同。
本实施例的缓释载药层主要包括以下质量百分比的原料：成膜材料为透明质酸钠，含量为50％；没食子水提物0.0025％；葡萄糖酸锌4％；抑菌剂为山梨酸钾，含量为0.5％；矫味剂为甜菊糖苷，含量为2％；第一增塑剂为甘油，含量为15％；余量为磷酸盐缓冲溶液的第一溶剂。
防水保护层主要包括以下质量百分比的原料：防水材料为乙基纤维素(40g)，含量为55％；第二增塑剂为甘油，含量为10％；余量为乙醇溶液(质量浓度85％)的第二溶剂。
本实施例的口腔溃疡贴剂的制备方法，包括：
(1)制备防水保护层；
将防水材料溶于第二溶剂中，再加入第二增塑剂，加热至温度80℃，转速100r/min，搅拌时间55min，将混匀后的溶液涂布于冻干模具的内壁表面；然后在60±5℃条件下鼓风干燥成膜，制成防水保护层。
(2)制备缓释载药层
将成膜材料溶于总质量70％的第一溶剂中，混匀获得溶液A；后续步骤同实施例1中制备缓释载药层后续步骤一致。
实施例6
本实施例的口腔溃疡贴剂的结构与实施例1一致，区别在于缓释载药层和防水保护层的组成配比不同。
本实施例的缓释载药层主要包括以下质量百分比的原料：成膜材料为海藻酸钠，含量为55％；没食子水提物0.0035％；葡萄糖酸锌2％；抑菌剂为对羟基苯甲酸甲酯钠，含量为0.1％；矫味剂为甜菊糖苷，含量为1％；第一增塑剂为丙二醇，含量为13％；余量为磷酸盐缓冲溶液的第一溶剂。
防水保护层主要包括以下质量百分比的原料：防水材料为海藻酸钠(40g)和氯化钙(1g)，含量为50％；第二增塑剂为丙二醇，含量为8％；余量为蒸馏水的第二溶剂。
本实施例的口腔溃疡贴剂的制备方法，包括：
(1)制备防水保护层；
将海藻酸钠和第二增塑剂溶于第二溶剂中，加热至温度75℃，转速100r/min，搅拌时间60min，混匀制成海藻酸钠溶液，降温至30℃；
将氯化钙溶于第二溶剂中，制成质量浓度为1％的氯化钙溶液；将海藻酸钠溶液和氯化钙溶液两种溶液混匀并涂布于冻干模具的内壁表面，然后在60±5℃条件下干燥成膜，蒸馏水洗去多余的氯化钙，制成防水保护层。
(2)制备缓释载药层
将成膜材料溶于总质量60％的第一溶剂中，混匀获得溶液A；后续步骤同实施例1中制备缓释载药层后续步骤一致。
实施例7
本实施例的口腔溃疡贴剂的结构与实施例1一致，区别在于缓释载药层和防水保护层的组成配比不同。
本实施例的缓释载药层主要包括以下质量百分比的原料：成膜材料为聚乙烯醇，含量为65％；没食子水提物0.0025％；葡萄糖酸锌4％；抑菌剂为山梨酸钾，含量为0.2％；矫味剂为甜蜜素，含量为0.5％；第一增塑剂为聚山梨酯，含量为12％；余量为磷酸盐缓冲溶液的第一溶剂。
防水保护层主要包括以下质量百分比的原料：防水材料为乙基纤维素(20g)，含量为45％；第二增塑剂为甘油，含量为5％；余量为乙醇溶液(质量浓度80％)的第二溶剂。
本实施例的口腔溃疡贴剂的制备方法，包括：
(1)制备防水保护层；
将防水材料溶于第二溶剂中，再加入第二增塑剂，加热至温度60℃，转速70r/min，搅拌时间60min，将混匀后的溶液涂布于冻干模具的内壁表面；然后在60±5℃条件下鼓风干燥成膜，制成防水保护层。
(2)制备缓释载药层
将成膜材料溶于总质量50％的第一溶剂中，混匀获得溶液A；后续步骤同实施例1中制备缓释载药层后续步骤一致。
实施例8
本实施例的口腔溃疡贴剂的结构与实施例1一致，区别在于缓释载药层和防水保护层的组成配比不同。
本实施例的缓释载药层主要包括以下质量百分比的原料：成膜材料为羧甲基纤维素钠，含量为75％；没食子水提物0.0035％；葡萄糖酸锌1％；抑菌剂为对羟基苯甲酸丙酯钠，含量为0.3％；矫味剂为三氯蔗糖，含量为0.2％；第一增塑剂为聚乙二醇，含量为14％；余量为磷酸盐缓冲溶液的第一溶剂。
防水保护层主要包括以下质量百分比的原料：防水材料为玉米阮(15g)，含量为50％；第二增塑剂为丙二醇，含量为6％；余量为乙醇溶液(质量浓度90％)的第二溶剂。
本实施例的口腔溃疡贴剂的制备方法，包括：
(1)制备防水保护层；
将防水材料溶于第二溶剂中，再加入第二增塑剂，加热至温度70℃，转速50r/min，搅拌时间60min，将混匀后的溶液涂布于冻干模具的内壁表面；然后在60±5℃条件下鼓风干燥成膜，制成防水保护层。
(2)制备缓释载药层
将成膜材料溶于总质量55％的第一溶剂中，混匀获得溶液A；后续步骤同实施例1中制备缓释载药层后续步骤一致。
实施例9
本实施例的口腔溃疡贴剂的结构与实施例1一致，区别在于缓释载药层和防水保护层的组成配比不同。
本实施例的缓释载药层主要包括以下质量百分比的原料：成膜材料为卡波姆，含量为70％；没食子水提物0.0040％；葡萄糖酸锌2％；抑菌剂为山梨酸钾，含量为0.05％；矫味剂为甜菊糖苷，含量为0.1％；第一增塑剂为甘油，含量为15％；余量为磷酸盐缓冲溶液的第一溶剂。
防水保护层主要包括以下质量百分比的原料：防水材料为海藻酸钠(45g)和氯化钙(1g)，含量为60％；第二增塑剂为丙二醇，含量为7％；余量为蒸馏水的第二溶剂。
本实施例的口腔溃疡贴剂的制备方法，包括：
(1)制备防水保护层；
将海藻酸钠和第二增塑剂溶于第二溶剂中，加热至温度70℃，转速80r/min，搅拌时间45min，混匀制成海藻酸钠溶液，降温至30℃；
将氯化钙溶于第二溶剂中，制成质量浓度为1％的氯化钙溶液；将海藻酸钠溶液和氯化钙溶液两种溶液混匀并涂布于冻干模具的内壁表面，然后在60±5℃条件下干燥成膜，蒸馏水洗去多余的氯化钙，制成防水保护层。
(2)制备缓释载药层
将成膜材料溶于总质量65％的第一溶剂中，混匀获得溶液A；后续步骤同实施例1中制备缓释载药层后续步骤一致。
实施例10
本实施例的口腔溃疡贴剂的结构与实施例1一致，区别在于缓释载药层和防水保护层的组成配比不同。
本实施例的缓释载药层主要包括以下质量百分比的原料：成膜材料为壳聚糖，含量为75％；没食子水提物0.0030％；葡萄糖酸锌1％；抑菌剂为对羟基苯甲酸丙酯钠，含量为0.02％；矫味剂为蔗糖，含量为0.2％；第一增塑剂为丙二醇，含量为5％；余量为磷酸盐缓冲溶液的第一溶剂。
防水保护层主要包括以下质量百分比的原料：防水材料为乙基纤维素(30g)，含量为50％；第二增塑剂为甘油，含量为6％；余量为乙醇溶液(质量浓度75％)的第二溶剂。
本实施例的口腔溃疡贴剂的制备方法，包括：
(1)制备防水保护层；
将防水材料溶于第二溶剂中，再加入第二增塑剂，加热至温度80℃，转速100r/min，搅拌时间60min，将混匀后的溶液涂布于冻干模具的内壁表面；然后在60±5℃条件下鼓风干燥成膜，制成防水保护层。
(2)制备缓释载药层
将成膜材料溶于总质量65％的第一溶剂中，混匀获得溶液A；后续步骤同实施例1中制备缓释载药层后续步骤一致。
实施例11
本实施例的口腔溃疡贴剂的结构与实施例1一致，区别在于缓释载药层和防水保护层的组成配比不同。
本实施例的缓释载药层主要包括以下质量百分比的原料：成膜材料为羟丙甲纤维素，含量为50％；没食子水提物0.0035％；葡萄糖酸锌3％；抑菌剂为山梨酸钾，含量为0.2％；矫味剂为三氯蔗糖，含量为0.1％；第一增塑剂为聚山梨酯，含量为8％；余量为磷酸盐缓冲溶液的第一溶剂。
防水保护层主要包括以下质量百分比的原料：防水材料为乙基纤维素(35g)，含量为60％；第二增塑剂为甘油，含量为10％；余量为乙醇溶液(质量浓度75％)的第二溶剂。
本实施例的口腔溃疡贴剂的制备方法，包括：
(1)制备防水保护层；
将防水材料溶于第二溶剂中，再加入第二增塑剂，加热至温度80℃，转速80r/min，搅拌时间50min，将混匀后的溶液涂布于冻干模具的内壁表面；然后在60±5℃条件下鼓风干燥成膜，制成防水保护层。
(2)制备缓释载药层
将成膜材料溶于总质量45％的第一溶剂中，混匀获得溶液A；后续步骤同实施例1中制备缓释载药层后续步骤一致。
试验例一：没食子水提取物对TNF-α诱导的人牙龈成纤维细胞黏附分子表达水平的影响
1材料和方法
1.1药品
没食子水提物(新疆奇康哈博维药有限责任公司，中国，批号：20161 112)，提取方法：没食子粉碎机粉碎为粗粉，加水(重量比1:6)浸泡2h，煎煮4次，每次1h，合并煎液后过滤；真空干燥为浸膏后称重分装待用。
1.2主要试剂与仪器
胎牛蛋白酶类血清(hyclone，美国，lot:nuk00138)、胰蛋白酶(trypsin，美国sigma公司，exp:08/2011)、噻唑蓝(sigma公司，美国，lot:201006)、重组型成人TNF-α(sigma公司，美国，lot:201006)，胰蛋白酶高浓度水平测定实验试剂盒(ptomega公司，美国，lot:201006)，Westem抗体(Abcam公司，英国)，westernblot荧光分析仪和荧光光谱系统(amershambiosciences公司，英国)，CO2培养箱(sanyo公司，日本)，pcr仪、实时微分定量折射荧光系统pcr仪和倒置实时定量酶标仪(bio-rad公司，美国)，倒置实时定量折射荧光仪和显微镜(olympus公司，日本)。
1.3人牙龈成纤维细胞培养
收集9名患者(男性5位，女性4位，年龄20-25岁，签署知情同意书)拔除正畸前磨牙时刮除牙根获得正常牙龈纤维组织。每日使用无血清dmem的培养液或清水冲洗正常牙龈纤维组织3次共3天，用眼科剪将牙龈组织中的纤维组织剪碎成为2-4mm3大小左右的牙龈纤维碎块，置于CO2培养箱(5％CO2、37℃、饱和湿度)中对孵育细胞进行培养。使用倒置口腔显微镜观察正常牙龈成纤维组织细胞的形态和其生长的情况，细胞贴壁后隔日少量换液，细胞组织出现融合后立即使用胰蛋白酶消化法(2％胰蛋白酶；0.2％edta)消化收集的成纤维细胞，传代培养，取第5～7代的成纤维细胞用于本试验例。
1.4 Westen blot分析
取15个T25培养瓶培养传代人牙龈成纤维细胞，以随机数法分为S1、S2、S3、S4、S5五组，每组3瓶，S1组为的空白对照组，不加TNF-α，S2-S5组加入浓度调整后终质量浓度为100ng/ml的TNF-α，后分别加入质量浓度为0、100、200、400mmol/L的没食子水提取物1mL。分别于3d、6d、9d后收集细胞，每个时间点收集1瓶细胞并提取总蛋白质，系列样本在通过电泳后转移到聚乙烯偏聚三氟乙烯薄膜，并在其中包含5％天然脱脂奶粉的PBS缓冲液中连续孵育2h。然后再次分别加入1:250的牛和羊的牛抗-vcam-1以及兔的羊抗-icam-1多克隆性的抗体，4℃左右孵育过夜。第二天先用PBS缓冲液反复洗涤3次后再加入辣根草酸过氧化酶(horseradishperoxidase，HRP)偶联多克隆抗体IgG，孵育1h。PBS洗涤3次后检测特异性免疫结合。以GAPDH作为内参对照，在自显影胶片上曝光60s，蛋白条扫描后进行灰度测定和分析，重复实验3次。
1.5逆转录多聚酶链反应(reverse transcription polymerase chainreaction，RT-PCR)
培养的方法、分组同1.3，收集合成细胞后，采用细胞rnctrizol的方法进行分析提取总细胞RNA后再相反转录到cDNA，并于-20℃冰箱冰冻冷藏保存。取2μg cDNA进行PCR扩增real-time PCR检测，系统采集图像，以标本ICAM-1、Vcam-1与β-actin-1条带的灰度相对比值作为该条带的标本基因组所表达的灰度相对值，重复实验3次。
1.6统计学分析
采用SPSS21.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差(X±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，组间的比较采用SNK-q检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1没食子水提物对TNF-α诱导的人牙龈成纤维细胞VCAM-1和ICAM-1蛋白表达水平的影响，结果见表1。
表1没食子水提物对TNF-α诱导的人牙龈成纤维细胞VCAM-1和ICAM-1蛋白表达水平的影响
Figure BDA0003789875570000191
Figure BDA0003789875570000201
a.compared with S1，P<0.05；b.compared with S2，P<0.05
如表1所示，TNF-α诱导的人牙龈成纤维细胞组VCAM-1和ICAM-1蛋白表达水平显著高于空白对照组(S2-S5组与S1组相比，P<0.01)，而加入没食子水提物的实验组VCAM-1和ICAM-1蛋白表达水平较未加入没食子水提物的的实验组TNF-α诱导的人牙龈成纤维细胞组显著减少(S3-S5组与S2组相比，P<0.05)，结果表明没食子水提物可以抑制TNF-α诱导的ICAM-1和VCAM-1的蛋白表达水平。并且随着没食子水提物浓度的升高，抑制水平效果更加显著(S4、S5组与S3组相比，P<0.05)，当没食子水提物浓度达到200mmol/L，诱导的抑制水平效果会达到稳定的程度(S4与S5组相比，P＞0.05)。而达到诱导抑制浓度后的时间长短对抑制效果没有显著影响(P＞0.05)。
2.2没食子水提物对TNF-α诱导的人牙龈成纤维细胞中的VCAM-1和ICAM-1mRNA表达水平的影响，结果见表2。
表2没食子水提物对TNF-α诱导的人牙龈成纤维细胞VCAM-1和ICAM-1mRNA表达水平的影响
Figure BDA0003789875570000202
a.compared with S1，P<0.05；b.compared with S2，P<0.05
如表2所示，TNF-α诱导的人牙龈成纤维细胞组VCAM-1和ICAM-1的mRNA表达水平全部显著高于空白对照组(S2-S5组与S1组相比，P<0.01)，而加入没食子水提物的实验组中VCAM-1和ICAM-1的mRNA表达较未加入没食子水提物的实验组经TNF-α诱导的人牙龈成纤维细胞显著减少(S3-S5组与S2组相比，P<0.05)，表明没食子水提物可以产生对TNF-α诱导的VCAM-1和ICAM-1的mRNA抑制表达。随没食子水提物浓度的升高，抑制效果水平显著增加(S4、S5组与S3组相比P<0.05)，当没食子水提物浓度达到200mmol/L，抑制效果水平达到稳定程度(S4与S5组相比，P＞0.05)，当没食子水提物浓度达到400mmol/L时，VCAM-1和ICAM-1mRNA诱导的抑制水平效果会达到诱导前的程度水平(S5组与S1组相比，P＞0.05)而达到诱导抑制浓度后的时间长短对抑制效果没有显著影响(P＞0.05)。
试验例二：没食子水取物对钛表面念珠菌生物膜抑制作用的研究
1.2研究方法
1.2.1生物膜培养
复苏白色念珠菌菌株(ATCC 90028)和光滑念珠菌菌株(ATCC 2001)，在37℃环境下的沙氏葡萄糖肉汤(Sabouraud-Dextrose Broth，USP)培养基上进行有氧培养。再将细胞悬浮液(1×106个细胞/mL)在RPMI 1640中培养24小时。将细胞离心(5000rpm，5min)，用无菌盐水洗涤两次，再转移至RPMI 1640培养基中。
1.2.2标本制备与分组
使用3D打印制备纯钛试件盘(1.3×0.2cm)，并用研磨膏和陶瓷颗粒抛光12h。采用75％酒精清洗试件，高温(121℃)高压(1.1bar)灭菌器灭菌20min。将样本分为三组(n＝12/组)。实验组为10μM没食子水提取物。氯己定漱口液为阳性对照组，无菌生理盐水溶液为阴性对照组。
1.2.3标本的处理
将标本浸入人工唾液(重量比：1％羧甲基、0.0084％氯化钠、0.12％氯化钾、0.0342％磷酸钾以及0.0146％氯化钙)中诱导形成唾液膜，在体积比24％的氯化镁溶液中24℃下孵育30min。将RPMI 1640培养基(1×106个细胞/mL)中的微生物细胞悬浮液分别与RPMI 1640培养基(10倍稀释液)混合培养，在钛盘面上形成单种白色念珠菌生物膜和白色念珠菌与光滑念珠菌共培养生物膜，37℃微需氧环境(通过使用一个带有蜡烛的厌氧罐来减少了氧气的含量，以模拟种植体周围环境)下孵育培养24h，后分离细胞悬液，将标本用生理盐水冲洗两次。从生物膜形成之日起24h、48h和72h将标本置于合成溶液中，培养基每24h更换一次。在每个时间节点末，将样本浸入三组受试物质中并保持10分钟的接触。样本处理后使用无菌生理盐水溶液清洗样本两次，更新培养基，然后在37℃的微氧条件下继续孵育培养。样本在96h时进行实验与数据分析。
1.2.4细胞活力分析
将样本转移到含有1mL无菌盐水溶液的试管中，在搅拌器中搅拌1min后对样本并进行连续稀释，并确定活菌的含量(10-1至10-6)。将每一系列稀释液取10μl进行等分样本，并分三份接种在USP培养基上，37℃下培养48h，读取菌落计数。计数活细胞数并乘以连续稀释值。数据以每毫升菌落形成单位(CFU/mL)表示。
1.2.5细胞代谢测定
采用MTT法检测细胞代谢水平。标本在37℃下含有10％MTT的600μL培养基中避光孵育培养4h。去除上清液并加入600μL异丙醇酸后进行样品均质。收集上清液，在570nm的分光光度计下分析其吸光度。
1.2.6表面粗糙度分析
使用轮廓仪分析评估生物膜的表面粗糙度，生物膜的复杂性和厚度与表面粗糙度正相关。将生物膜置于在2.5％戊二醛水溶液中24h，并通过增加乙醇循环(50％至100％)在室温下脱水。20倍放大倍率下分别对试样的两个不同部位(上面、侧面)进行表面粗糙度测量(3×速度)。对表面无生物膜(基线)的对照样本也进行测量。
1.3数据分析
对细胞计数进行对数变换以便于统计。统计分析采用单因素方差分析(ANOVA)和Tukey检验。P＜0.05位具有统计学意义。
2结果
2.1生物学活性检测
对于生物膜的细胞活力测定结果见图1显示，氯己定和没食子水提取物对单菌种以及共培养生物膜均有抑制作用，与对照组相比有统计学差异(p<0.05)，对于共培养生物膜，氯己定的抑制作用最强(p<0.05)。对于生物膜的代谢活性测定结果显示，氯己定和没食子水提取物均可以显著降低单菌种以及共培养生物膜的代谢(p<0.05)，但他们之间比较无统计学差异(p>0.05)。
2.2表面粗糙度检测
生物膜表面粗糙度比较结果见图2显示，结果表明，在白念菌的单种生物膜中，氯己定和没食子水提取物处理的样本的表面粗糙度与基线无差异(p>0.05)，但与对照组有统计学差异(p<0.05)，这说明药物治疗显著减少了生物膜的存在。对于共培养生物膜，用氯己定处理的标本与基线无差异(p>0.05)，但与对照组和没食子水提取物相比，差异有统计学意义(p<0.05)。这表明对于共培养生物膜，没食子水提取物的效果略逊于氯己定。
试验例三：没食子水取物对牙龈上皮角质形成细胞的体外影响研究
1材料和方法
1.1药品、试剂与仪器
没食子(新疆奇康哈博维药有限责任公司，中国，批号：20161 112)；DMEM培养基、EDTA、MTT试剂盒、ELISA试剂盒(sigma公司，美国)；RNeasy试剂盒(QIAGEN，美国)；胰蛋白酶(Seromond Biochrom公司，德国)；无血清角质细胞培养液(GIBCO公司，美国)；TaqMan试剂盒(Applied Biosystems公司，美国)；分光光度仪、倒置显微镜(Olympus公司，日本)；轮廓仪分析(Taylor Hobson公司，英国)。
1.2研究方法
1.2.1标本制备与分组
没食子水提取物制备方法：没食子使用粉碎机粉碎为粗粉，加水(重量比1:5)浸泡4h，煎煮3次并分别过滤，每次1h，合并煎液后过滤；真空干燥为浸膏后称重分装待用。实验组没食子使用其浸膏与PBS混合制备，溶液浓度分别调整为1mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml和10mg/ml，该浓度是依据没食子漱口液西帕依固龈液的浓度而确定。
本试验例共分为6组：(1)阴性对照(PBS)；(2)阳性对照(1μg/ml LPS)；(3)1mg/ml没食子组；(4)2.5mg/ml没食子组；(5)5mg/ml没食子组；(6)10mg/ml没食子组。
1.2.2人牙龈上皮角质形成细胞(HGEK-16)系的建立
选取龈切手术切取的健康牙龈，PBS清洗3次，去除多余结缔组织。置于0.25％胰蛋白酶和0.05％EDTA(体积比1：1)混合液中，37℃消化1h，取上部溶液，2000r/min离心5min后弃上清。PBS清洗，加入限定型无血清角质细胞培养液10ml混匀，调整细胞密度至l×l04个/cm2后计数并接种培养(37℃)。当细胞融合约80％密度时，进行传代培养。每天观察细胞的形态及生长、增殖情况。角质细胞鉴定采用Envision法进行角蛋白免疫组化染色，-80℃低温冰箱冰冻保存。
1.2.3细胞培养
复苏HGEK细胞，在培养箱(5％CO2，95％相对湿度，37℃)中进行培养。细胞置于DMEM培养基，加入0.25％胰蛋白酶，100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺和0.25mg/ml真菌酮。每隔4天更换一次培养基，每周传代一次。本试验例使用的细胞是第3-5代细胞。
1.2.4细胞活力测定
采用MTT法测定HEGK细胞活力。将牙龈上皮角质形成细胞(0.1×106个细胞/ml)置于12孔板中，加入不同浓度的没食子提取物(1mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml和10mg/ml)进行24h培养(5％CO2，95％相对湿度，37℃)，后吸去培养液，使用PBS冲洗细胞。再次加入不同浓度的没食子提取物培养24h，后每孔加入500ml MTT，37℃下避光培养4h后去除MTT，并添加异丙醇。使用分光光度计测量OD570。实验重复三次。
1.3实时定量聚合酶链反应分析
传代培养24h后检测细胞上清液IL-1β、IL-6和TNF-α基因和蛋白表达水平。各实验组培养24h后，Trizol法提取总RNA。使用Primer3设计IL-1β、IL-6和TNF-α的引物序列。RT-PCR使用TaqMan试剂盒进行，通过细胞培养物中收集的RNA提取物加计算GAPDH相关的基因表达水平。所有检测重复三次。
1.4 ELISA试验
使用人IL-β1(RAB0273)、IL-6(RAB0306)和TNF-α(RAB0476)ELISA试剂盒，根据使用说明书收集细胞培养上清液，测定各实验组细胞炎症标志物的蛋白质水平。
1.5划痕愈合迁移试验
采用划伤单层模型确定没食子浓度对伤口愈合的影响。将细胞以0.1×106个细胞/ml的密度接种到12孔板中，37℃下培养24h。将细胞置于DMEM培养基，加入10μg/ml丝裂霉素C培养2h以抑制细胞有丝分裂。伤口使用10μl移液管尖(直径700–900μm)制造。PBS冲洗去除细胞碎片，分为3个实验组(阴性对照组、阳性对照组(LPS组)和10mg/ml没食子组)分别进行观测。使用倒置显微镜拍摄的伤口长度，伤口闭合度为伤口加样后12小时和24小时的宽度差。
1.6免疫印迹分析
用免疫印迹法检测LPS和没食子处理细胞后Nrf2和HO-1蛋白的表达。将细胞(0.1×106个细胞/ml)接种在12孔板中，37℃培养24h后，各实验组使用含有蛋白酶抑制剂的缓冲液提取蛋白质，4℃下12000rpm下离心15分钟。采用BCA法对上清液蛋白质进行定量分析。
1.7统计分析
使用SPSS21.0软件对细胞活力试验通过方差分析(ANOVA)进行多重比较，组内比较采用Bonferroni分析。p<0.05为具有统计学意义。
2结果
2.1没食子对HGEK细胞活力的影响
没食子提取物对HGEK细胞活力的影响结果见图3显示，结果表明，实验组在没食子2.5mg/ml、5mg/ml和10mg/ml浓度下与阴性对照组、阳性对照组以及1mg/ml实验组比较，细胞活力显著增强(p<0.05)，增强程度随没食子提取物浓度增加而增强，但这三个实验组(2.5mg/ml、5mg/ml和10mg/ml)之间细胞活力无统计学差异(P＞0.05)。
2.2没食子提取物对炎症标志物的影响
没食子提取物对炎症标志物的影响结果见图4显示，结果显示，LPS组(1μg/ml)可使IL-β1、IL-6和TNF-α的表达显著增加(p<0.05)，表明LPS是满足实验要求的促炎性细胞因子。与LPS组(1μg/ml)相比，2.5mg/ml、5mg/ml和10mg/ml浓度的没食子显著降低了促炎性细胞因子基因表达水平(p<0.05)。ELISA结果显示，实验组(2.5mg/ml、5mg/ml和10mg/ml，LPS1μg/ml)的IL-β1、IL-6和TNF-α的蛋白水平也显著降低(p<0.05)。但没食子浓度为1mg/ml时与阴性对照组比较无统计学差异(P＞0.05)。
2.3划痕伤口愈合试验(细胞迁移)
使用ImageJ图像软件分析计算伤口面积，划痕伤口愈合试验细胞迁移结果见图5显示。伤口闭合数据以24h时相对于基线时间点的百分比平均值表示，阴性对照组、阳性对照组(LPS组)和10mg/ml没食子组相比，HEGK细胞24h内迁移率具有显著的统计学差异(p<0.05)，但各组之间无统计学差异(P＞0.05)，24h后伤口几乎完全闭合。
2.4Nrf2信号通路的机理分析
没食子提取物对LPS刺激角质形成细胞中Nrf2和HO-1表达的影响见图6，研究结果显示，与LPS刺激的HEGK细胞相比，没食子组(10mg/ml)增加了Nrf2和HO-1基因的表达和蛋白质的产生(p<0.05)。
试验例四：不同维护方法对野外驻训官兵牙周状况及牙周致病菌的影响
1材料与方法
1.1病例纳入及分组
选择某部官兵210例，其中野外驻训(4400m)的官兵140例，在平原留守人员70例(均为男性)，年龄(20.5±6.4)岁。纳入条件：①无全身系统性疾病；②半年内未行牙周基础治疗；③3个月内未使用抗生素以及免疫抑制剂。所有参与实验的官兵均详细告知并签署知情同意书。分组情况：A组(60例)，低海拔驻军官兵构成，采用常规口腔维护(刷牙+漱口)的方法；B组(60例)，由高原驻训官兵构成，采用常规口腔维护的方法；C组(60例)，由高原驻训官兵构成，采用实施例1的口腔溃疡贴剂中缓释载药层溶解液含漱(1min，3次/日)配合常规口腔维护的方法(B、C两组采用随机数法平均分配)，受试官兵统一培训BASS刷牙法。
1.2主要材料与仪器
实施例1的口腔溃疡贴剂中缓释载药层溶解液样品(10mg/mL，自制)，胎牛血清(HYCLONE，美国，Lot：NUK00122)、胰蛋白酶(trypsin，美国Sigma公司，Exp：02/2019)、Westem抗体(Abcam公司，英国)，标准菌株(第四军医大学动物实验中心，中国)；ELISA试剂盒(济南起点医疗有限公司，中国)；Whatman滤纸(Whatman公司，英国)；Western blot分析系统(Amersham Biosciences公司，英国)，PCR仪、实时定量荧光PCR仪和酶标仪(Bio-Rad公司，美国)，倒置显微镜(Olympus公司，日本)。
1.3口腔检查与采集样本
使用Williams牙周探针检测牙齿(颊面及舌面近中，中部，远中)，记录PD复检三次取平均值。采用含漱牙菌斑显示剂的方法检测口腔菌斑，紫色着色即为菌斑。记录GI和PI指数并复检三次取平均值。将Whatman滤纸分别裁成10mm×2mm，灭菌后称重。吹干、隔湿后插入上颌中切牙中部龈沟内，60s后取出称重，前后质量差复检三次取平均值。滤纸使用PBS浸泡并离心提取上清液，低温冰箱-70℃保存。
1.4口腔维护及复查
所有受试者按计划进行维护，于第3、7个月进行复查，记录牙周临床指标，GCF量，并使用1.3的方法采集龈沟液。
1.5测定MMP-3含量
所有样本收集完成后于室温下解冻样本，检测MMP-3含量(其中MMP含量＝MMP总量/GCF量；MMP总量＝MMP检测量×洗脱体积)。
1.6牙周致病菌的检测
驻训结束后使用刮取受试官兵下颌切牙舌侧龈袋底的龈下菌斑，放入含5％PBS液EP管，离心(12000r/min，10min)后提取沉淀物。设计、合成引物，并对龈下菌斑DNA进行扩增，以5种标准菌株，其引物的序列见表3：牙龈卟啉单孢菌(Porphyromonas gingivdis，P.g)、福赛氏类杆菌(Tannerella forsythia，T.f)、中间普氏菌(Prevotella intermedia，P.i)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola，T.d)以及伴放线放线杆菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans，A.a)为阳性对照，以变异链球菌(Streptococcus mutans，S.m)为阴性对照，凝胶电泳。
表3 5种牙周致病菌特异性引物序列
Figure BDA0003789875570000291
1.7统计学分析
使用SPSS22.0进行统计学分析，采用不等距重复测量的方差设计进行检测(LSD检验和Bonferroni检验)，P＜0.05具有统计学意义。
2结果
按要求最终完成官兵共180人。通过Mauchly球形检验，显示各组重复测量数据之间具有相关性(P＜0.05)。
2.1 PD、GI、PI指数比较
各组PD、GI、PI指数比较分别见表4、表5和表6所示。
表4各组PD指数比较
Figure BDA0003789875570000292
表5各组GI指数比较
Figure BDA0003789875570000301
表6各组PI指数比较
Figure BDA0003789875570000302
同一时间点比较，驻训前各组PD、GI、PI指数比较无显著差异(P>0.05)；3个月B组的GI、PI指数与A组和C组比较显著上升(P<0.05)，A组与C组无统计学差异(P>0.05)；7个月时B组PD、GI、PI指数与A组和C组比较均有显著上升(P<0.05)，A组和C组的PD、GI指数比较没有统计学差异(P>0.05)，PI指数比较据有统计学差异(P<0.05)。
组内随时间变化比较时，A组的牙周指数随时间变化无统计学差异(P>0.05)；B组的PD指数7个月时与之前比较有统计学差异(P<0.05)，而驻训前和3个月时比较无统计学差异(P>0.05)，GI、PI指数随时间变化均有显著性变化(P<0.05)；C组的PD、GI指数随时间变化无统计学差异(P>0.05)，PI指数7个月时与之前比较有统计学差异(P<0.05)。
2.2MMP-3含量的比较
各组MMP-3含量的比较见表7所示。
表7各组MMP-3含量的比较
Figure BDA0003789875570000311
同一时间点比较时，驻训前各组MMP-3含量比较无统计学差异(P>0.05)；3个月时B组的MMP-3含量与显著上升(P<0.05)，而A组与C组无统计学差异(P>0.05)；7个月时各组MMP-3含量均有显著变化(P<0.05)。组内随时间变化比较时，A组的MMP-3含量不随时间变化(P>0.05)；B组的MMP-3含量均有统计学差异(P<0.05)；C组的MMP-3含量7个月时与之前比较有统计学差异(P<0.05)。
2.3 5种牙周致病菌的检出情况比较
5种牙周致病菌的检出情况比较N/％结果见表8所示。
表8 5种牙周致病菌的检出情况比较N/％
Figure BDA0003789875570000312
Figure BDA0003789875570000321
野外驻训的官兵(B组，C组)检出率显著高于低海拔驻军官兵(A组)(P<0.05)；B组检出率高于C组(P<0.05)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种口腔溃疡贴剂，其特征在于，所述口腔溃疡贴剂为双层结构，包括：片状的防水保护层以及覆盖在所述防水保护层侧面的缓释载药层；
所述缓释载药层主要包括以下原料：缓释成膜材料、没食子水提物、葡萄糖酸锌、抑菌剂、矫味剂、第一增塑剂和第一溶剂。
2.根据权利要求1所述的口腔溃疡贴剂，其特征在于，所述缓释载药层主要包括以下质量百分比的原料：缓释成膜材料20％～80％、没食子水提物0.001％～0.002％、葡萄糖酸锌1％～5.5％、抑菌剂0.05％～0.5％、矫味剂0.1％～2％、第一增塑剂5％～20％，余量为第一溶剂。
3.根据权利要求1或2所述的口腔溃疡贴剂，其特征在于，所述缓释成膜材料包括：卡波姆、壳聚糖、淀粉、明胶、阿拉伯胶、透明质酸钠、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠和聚乙烯醇中的一种或多种。
4.根据权利要求1或2所述的口腔溃疡贴剂，其特征在于，所述抑菌剂包括：乳酸链球菌素、对羟基苯甲酸丙酯钠、山梨酸钾和对羟基苯甲酸甲酯钠中的一种或多种。
5.根据权利要求1或2所述的口腔溃疡贴剂，其特征在于，所述矫味剂包括：甜菊苷、三氯蔗糖、甜蜜素、甜菊糖苷和粉末蔗糖中的一种或多种。
6.根据权利要求1或2所述的口腔溃疡贴剂，其特征在于，所述第一增塑剂包括：甘油、丙二醇、聚山梨酯或聚乙二醇；
优选地，所述第一溶剂包括：磷酸盐缓冲溶液。
7.根据权利要求1所述的口腔溃疡贴剂，其特征在于，所述防水保护层包括：防水材料、第二增塑剂和第二溶剂；
优选地，所述防水保护层主要包括以下质量百分比的原料：防水材料30％～70％、第二增塑剂10％～15％，余量为第二溶剂。
8.根据权利要求1或7所述的口腔溃疡贴剂，其特征在于，所述第二增塑剂包括：甘油、丙二醇、丙三醇、聚乙二醇和聚山梨酯中的一种或多种；
优选地，所述第二溶剂为乙醇或水；
优选地，所述防水材料包括：乙基纤维素或玉米阮；或，海藻酸钠以及氯化钙、硝酸纤维素和聚维酮中的一种或多种。
9.一种如权利要求8所述的口腔溃疡贴剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
依次将缓释成膜材料、第一增塑剂溶于第一溶剂中，搅拌混匀获得第一混合溶液；
将矫味剂和抑菌剂溶于第一溶剂中，搅拌混匀获得第二混合溶液；
将第二混合溶液、葡萄糖酸锌和没食子水提物分别加入到第一混合溶液中，搅拌混合均匀制得缓释载药溶液；
将所述缓释载药溶液涂布在防水保护层上，经冻干成型，制得所述口腔溃疡贴剂。
10.根据权利要求9所述的口腔溃疡贴剂的制备方法，其特征在于，在所述防水材料为乙基纤维素或玉米阮时，所述防水保护层的制备方法包括：
将所述防水材料溶于所述第二溶剂中，再加入所述第二增塑剂，加热至温度60℃～80℃后，以转速50r/min～100r/min，搅拌45min～60min，制得防水保护溶液；
将所述防水保护溶液涂布后，在55℃～65℃温度下干燥成膜，制得所述防水保护层；
优选地，在所述防水材料为海藻酸钠以及氯化钙、硝酸纤维素和聚维酮中的一种或多种时，所述防水保护层的制备方法包括：
将海藻酸钠和第二增塑剂溶于第一溶剂中，加热至温度60℃～80℃，以转速50r/min～100r/min，搅拌45min～60min后，制得海藻酸钠溶液；
除海藻酸钠外的防水材料溶于第二溶剂中配成1wt％溶液，再与降温至25℃～50℃的所述海藻酸钠溶液混合均匀制得防水保护溶液；
将所述防水保护溶液涂布后，在55℃～65℃温度下干燥成膜，经洗涤后制得所述防水保护层。
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