KR101270704B1 - 석이버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 구강용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 석이버섯 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강 면역증강용 조성물을 제공한다. 본 발명의 석이버섯 추출물은 전신 면역에 대한 작용 없이 국소적으로 구강 면역을 활성화하므로, 구내 염증, 구강 질환의 예방 및 개선에 효과적이다.

Description

석이버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 구강용 조성물{ORAL COMPOSITION FOR ENHANCING ORAL IMMUNE COMPRISING THE EXTRACT OF UMBILICARIA ESCULENTA AS ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 석이버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 구강용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 전신 면역에는 작용하지 않고 국소적인 구강 면역을 촉진하여 구강 면역을 강화할 수 있는 구강용 조성물에 관한 것이다.

충치, 치주질환, 구취와 같은 구강 질환을 일으키는 주요한 원인은 구강 내의 미생물에 의한 감염으로 세균, 음식물, 타액의 상호작용에 의해 유발된다. 즉, 구강 내 세균의 발육에 필요한 영양분과 수분이 음식물과 타액, 치온구액 등에 의하여 계속 공급되고 구강 내의 환경이 미생물이 발육하기에 적합한 온도(37℃), pH(중성부근)를 갖는다.

구강은 비강점막과 함께 인체 점막의 최전방에 위치하여 있으며, 구강면역은 점막면역의 일부로서 구강점막, 침샘, 잇몸 등이 관여하고 있다. 구강은 침 내의 라이소자임, IgA, 락토페린 등 다양한 분비물을 통하여 보호되고 있다. 또한, 상피세포, 수지상 세포들이 존재하여 일차 방어막을 형성하며, 이들 세포는 침입한 항원을 탐식한 후, 근접한 림프절로 이동하여 T 세포를 활성화하는 면역반응을 유발하게 된다.

특히, 최근 구강 내 분비물 및 점막 자체의 방어효과뿐 아니라 많은 수의 면역세포가 연구개, 잇몸 등 구강 내에 존재하여 직접적으로 면역작용에 관여한다는 연구가 활발히 진행되고 있다.

실제 구강 환경에 있어서, 병적으로 또는 일상생활의 경우에도 구강이 건조해지거나 칫솔질 등에 의한 많은 미세 병변(micro-lesion)이 상피(epithelium)에 생겨 직간접적으로 손상을 입게 되며, 이들이 신속히 치유되지 않으면 통증, 감염 등의 우려가 있다.

최근 구강의 건강을 증진하기 위해 충치예방, 구취제거, 치주질환 예방을 위한 구강 제품이 많이 사용되고 있으나, 구강세정제나 미생물에 대한 항균활성 물질을 갖는 것들이 대부분이다. 그러나, 평상시 구강 면역을 증진한다면 구강 질환 예방이 가능할 뿐만 아니라 치료도 신속하게 이루어질 수 있다.

이에 본 발명자들은 효과적으로 구강 면역을 강화할 수 있는 천연 원료를 개발하기 위해 연구를 진행하였고, 이러한 연구의 결과로서 석이버섯(Umbilicaria esculenta) 추출물이 구강 면역을 증진할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 과제는 전신 면역에는 관여하지 않고 국소적으로 구강 면역을 증진하여 구강 질환을 예방할 수 있는 구강용 조성물을 제공하는 것이다.

이를 위해 본 발명은 석이버섯(Umbilicaria esculenta) 추출물을 유효성분으로 함유하는 구강용 조성물을 제공한다.

본 발명의 석이버섯 추출물은 독성이 없어 인체에 안전할 뿐만 아니라, 국소 구강면역만을 증진하므로 구강 내 염증, 구강 질환의 예방 및 개선에 효과적이다.

도 1은 석이버섯 추출물을 투여한 마우스로부터 분리한 하악골 림프절과 서혜부 림프절의 사이토카인 발현도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 석이버섯 추출물을 투여한 마우스로부터 분리한 서혜부 림프절을 분리하여 병리검사 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 석이버섯 추출물을 투여한 마우스로부터 분리한 하악골 림프절의 병리검사 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 석이버섯 추출물을 투여한 마우스로부터 분리한 구강점막의 병리검사 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

구강 내에 미세 병변(micro-lesion)은 빈번히 생기는 현상으로, 이들을 통하거나 잇몸 등을 통한 대식세포 등 수지상 세포와의 접촉은 구강 면역을 촉진하는 직접적인 통로가 될 수 있다. 즉, 비교적 큰 분자의 물질에 의해서도 구강 내에 존재하는 면역세포가 직접적으로 영향을 받을 수 있으며, 또한 잇몸 틈새(gingival crevices) 내에서 면역증진 물질이 면역세포를 직접 활성화할 수도 있고 잇몸으로 흡수될 수 있다.

본 발명에 따른 석이버섯(Umbilicaria esculenta) 추출물은 미세 병변, 잇몸 등과 같은 구강 점막을 통해 흡수되어 구강 내의 수지상세포 및 대식세포를 활성화하여 전신 면역에 대한 작용 없이 국소적으로 구강 면역을 강화한다. 이와 같은 석이버섯 추출물이 함유된 본 발명의 구강용 조성물은 구강 질환의 개선 및 예방에 사용될 수 있다.

석이버섯(Umbilicaria esculenta)은 돌버섯지의, 바위버섯지의라고도 불리는 전체 지름이 3~10 cm 정도 되는 석이과 석이속의 지의류이다. 표면은 황갈색 또는 갈색으로 광택이 없고 밋밋하며, 반점 모양으로 탈락하는 노출된 백색의 수층이 국국부적으로 나타난다. 맛이 담백하여 튀김 요리에 많이 쓰이고 지로포르산의 성분이 있어 한방에서는 강장, 각혈, 하혈 등의 지혈제로 쓰인다. 최근 석이버섯이 가지는 항산화, 항돌연변이원성, 항염증작용 등 다양한 기능이 밝혀지고 있다.

본 발명 조성물의 유효성분인 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 용매를 사용하여, 통상적으로 이용되는 열수추출, 실온추출, 가온추출, 초음파추출, 초임계추출 등의 방법으로 제조될 수 있다.

구체적으로는 물, 탄소수 1 내지 6의 글리콜, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 1,3-부틸렌글리콜 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출한다. 가장 바람직하게는 물을 추출용매로 사용하여 열수 추출한다.

바람직하게는 본 발명의 석이버섯 추출물은 석이버섯을 열수 추출하여 추출 용액을 얻는 단계; 추출 용액을 정치하여 여액과 침전물로 분리하는 단계; 및 상기 여액 중의 다당체를 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 알코올을 이용하여 침전시켜 침전물을 얻는 단계를 거쳐 제조된다.

이하, 각 단계별로 상세히 설명한다.

먼저, 석이버섯을 열수 추출하여 추출 용액을 얻는다.

이때 석이버섯은 건조하여 사용하거나 또는 그대로 사용할 수 있으며, 바람직하게는 건조된 상태로 사용한다.

상기 추출용매는 석이버섯 중량에 대비하여 1 내지 20배, 바람직하게는 3 내지 5배 사용하는 것이 바람직하다.

추출방법은 열수추출이 바람직하며, 50~120 ℃에서 1~10시간, 바람직하게는 80~100 ℃에서 2시간 동안 열수 추출한다.

이어서, 상기 추출 용액을 정치하여 여액과 침전물로 분리한다.

상기에서 얻은 석이버섯의 열수 추출물을 여과기로 여액과 불용성 물질을 분리한다. 이후 여액을 정치하여 여액과 침전물로 분리한다. 이때 정치는 0~10 ℃, 바람직하게는 2~5 ℃에서 12~48 시간, 바람직하게는 24시간 동안 수행하고, 상등액과 침전물을 분리한다.

다음으로, 여액 중의 다당체를 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 알코올, 바람직하게는 무수 또는 함수 에탄올을 이용하여 침전시켜 침전물을 얻는다.

상기에서 얻은 여액에 1~5배(v/v), 바람직하게는 1~2 배(v/v) 부피의 에탄올을 첨가하여 침전시켜 침전물을 얻은 후 침전물을 수거하여 증류수에 녹여 본 발명에 따른 석이버섯 추출물로 사용한다.

또한, 본 발명의 석이버섯 추출물은 감압 증류, 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물에서, 추출물의 함량은 구강용 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량%이며, 바람직하게는 0.01 내지 5 중량%이다. 최소한의 구강 면역 증진을 달성할 수 있도록 추출물의 함량은 상기 최소치 이상인 것이 바람직하며, 과량 첨가에 따른 사용감 저하 및 각종 제형에의 적용 가능성을 고려하여 추출물의 함량은 상기 최대치 이하인 것이 바람직하다. 이때, 추출물의 함량은 제형 또는 구강 조성물에 함유되는 성분들의 함량에 따라 상기 범위 내에서 적절히 조절하는 것이 바람직하다.

본 발명의 구강용 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 석이버섯 추출물 이외에 구강용 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 연마제, 습윤제, 보조 기포제, 결합제, 감미제, pH 조절제, 방부제, 향료, 증백제, 색소, 용제 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 페이스트상, 고형상, 액상 또는 검(gum) 등 어떠한 형상으로도 제조 가능하다. 구체적인 제형으로는 치약, 치분, 젤리, 카라멜, 캔디, 구강 린스, 구강 청정제, 껌 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 제형이 치약인 경우, 통상적으로 치약에 함유되는 성분들인 알루미나, 실리카겔, 침강실리카, 탄산칼슘, 인산일수소칼슘, 중탄산나트륨 등과 같은 연마제; 솔비톨, 글리세린, 폴리에틸렌글리콜 등과 같은 습윤제; 소듐라우릴설페이트, 소듐라우릴사르코시네이트, 도데실벤조설포네이트 등과 같은 기포제; 카르복시메틸셀룰로오스, 카라기난, 폴리아크릴레이트 등과 같은 결합제; 사카린, 아스파탐, 스테비오사이드 등과 같은 감미제; 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필 등과 같은 방부제; 불화타르륨, 불화인산나트륨, 비타민류, 소금 등과 같은 약효제; 향료; 색소; 및 pH 조정제 등을 포함할 수 있다.

[실시예]

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 보다 명확히 표현하기 위한 목적으로 기재될 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 석이버섯 추출물의 제조

석이버섯은 건조 후 0.5~1cm 크기로 세절한 후 5 중량 배수의 물을 첨가하여 100 ℃에서 2시간 동안 열수추출 하였다. 얻어진 추출액에 압착 여과기로 여액과 불용성 물질들을 분리한 후 여액을 2~5 ℃의 저온에서 24시간 동안 정치하여, 상등액과 침전물을 분리하였다. 얻어진 상등액에 2배 부피의 95%(v/v)에탄올을 가하고 침전물을 회수하여 사용하였다.

비교예 1: 표고버섯 추출물의 제조

상기 실시예 1과 동일한 방법으로, 표고버섯 추출물을 제조하였다.

실험예 1: 성분분석

상기 제조된 석이버섯 분획의 기본적인 조성분석을 위하여 단백질 및 당 함량을 분석하였으며, 균류 다당체 면역활성의 상당부분은 베타-글루칸에서 기인하는 바, 베타-글루칸 함량을 측정하였다.

총 당의 정량은 페놀-황산법(Dubois et al., Analytical Chemistry, 28, 350-356, 1956)에 준하여 측정하였으며, 단백질은 Lowry법을 사용하였고, 베타-글루칸은 알려진 효소 분석법(McCleary, B.V. Journal of the Institute of Brewing, 91, 285-295, 1985; Manzi, P. Food Chemistry, 68, 315-318, 2000)을 사용하여 정량하였다.

열수 추출로 얻어진 시료는 대부분 당으로 구성되었고 단백 성분은 거의 나타나지 않았으며, 다당 대비 베타-글루칸 비율(%)은 70.8% 로서 다당체중 상당량이 베타-글루칸으로 분석되었다.

실험예 2: 국소적 구강면역 증강 효과 확인

일반적인 항암동물모델에서는 면역증강제를 복강으로 투여하여, 전신면역을 증강시키는 방법을 사용한다. 그러나 구강면역을 국소적으로 증가시키기 위해서는 면역증강제의 투여방법을 달리해야 하며, 본 실험에서는 시료인 석이버섯 추출물을 구강에 서서히 투여하여 구강점막을 통하여 흡수되도록 하였다. 실시예 1의 석이버섯 추출물을 2 mg/마우스로 마우스 구강(C57BL/6, 6주령, 시험군당 5마리)에 3일 동안 투여하여 체중 변화 및 하악골 림프절(mandibular lymph node)과 서혜부 림프절(inguinal lymph node)의 무게변화를 관찰하였다.

그 결과, 체중변화는 관찰되지 않았으며 이 결과로부터 시료에 의한 독성이 없음을 예측할 수 있었다.

시료 투여시 구강 면역에 미치는 영향을 분석하기 위해서 하악골 림프절의 무게를 측정하였다. 하악골 림프절은 구강 점막과 근접해 있는 면역장기로서 구강면역시스템의 변화를 간접적으로 측정할 수 있다. 반면에 전신 면역에 미치는 영향을 측정하기 위하여 비장 및 서혜부 림프절의 무게를 측정하였다. 그 결과는 아래 표 1에 나타내었다. 음성대조군은 시료를 녹이는데 사용한 PBS 용액을 투여하였다.

구분	음성대조군	실시예 1의 석이버섯 추출물	비교예 1의 표고버섯 추출물
체중(%)	103.3±5.9	100.1±3.1	101.9±2.1
비장(mg)	70.8±2.5	68.2±4.5	70.2±4.2
서혜부 림프절(mg,x2)	5.6±0.7	5.3±0.2	5.3±0.7
하악골 림프절(mg x8)	6.0±1.0	9.0±1.8	6.2±1.5

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 석이버섯 추출물을 투여하였을 경우 비장과 서혜부 림프절의 무게는 변화가 없었지만, 하악골 림프절의 무게는 증가하였다. 반면, 음성대조군과 비교예 1의 표고버섯 추출물은 하악골 림프절의 무게에 영향을 주지 않았다. 이로부터 석이버섯 추출물을 구강에 투여할 경우 구강면역이 활성화됨을 확인할 수 있었다.

실험예 3: 하악골 림프절에서의 사이토카인 발현 측정

보다 확실한 분석을 위하여 서혜부 림프절과 하악골 림프절을 분리한 후 RNA를 분리하여, 사이토카인 발현도를 측정하였다.

마우스에서 분리한 림프절에서 세포를 분리하고 TRIZOL 시약을 이용하여 RNA를 분리하였다. RNA 0.3 ㎍을 이용하여 cDNA를 42 ℃에서 60분, 94 ℃에서 5분간 합성하였다. 만들어진 cDNA 3 ㎕와 10 pM의 프라이머를 이용하여 PCR를 수행하였다. 프라이머 마다 annealing 온도를 54 ℃ ~ 58 ℃ 사이로 다르게 하였고 베타-액틴은 annealing 온도를 54 ℃로 25 cycle 수행하였다. PCR 생성물은 1% 아가로즈 겔에 8 ㎕ 로딩한 후 50V로 전기영동 하였다. 올리고 염기서열은 아래 표 2와 같다.

구분	염기서열
베타-액틴	sense : 5'-TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAAC-3' antisense : 5'-TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G-3'
TNF-a	sense : 5'-AGG TTC TGT CCC TTT CAC TCA CTG-3' antisense : 5'-AGA GAA CCT GGG AGT AGA CAA GGT A-3'
IFN-r	sense : 5'-AGC GGC TGA CTG AAC TCA GAT TGT AG-3' antisense : 5'-GTC ACA GTT TTC AGC TGT ATA GGG-3
IL-1b	sense : 5'-ATG GCA ATG TTC CTG AAC TCA ACT-3' antisense : 5'-CAG GAC AGG TAT AGA TTC TTT CCT TT-3'
IL-2	sense : 5'-CTT GCC CAA GCA GGC CAC AG-3' antisense : 5'-GAG CCT TAT GTG TTG TAA GC-3'
IL-4	sense : 5'-GAA TGT ACC AGG AGC CAT ATC-3' antisense : 5'-CTC AGT ACT ACG AGT AAT CCA-3'
iNOS	sense : 5'-CCT TCC GAA GTT TCT GGC AGC AGC-3' antisense : 5'-GGC TGT CAG AGC CTC GTG GCT TTG G-3'

도 1은 석이버섯 추출물을 투여한 마우스로부터 분리한 하악골 림프절과 서혜부 림프절의 사이토카인 발현도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.

도 1을 참조하면, 실시예 1의 석이버섯 추출물을 투여한 마우스에서 분리한 하악골 림프절에서는 IL-2 및 IFN-γ 등의 면역증강성 사이토카인의 발현도가 높음을 알 수 있었다. 반면, 서혜부 림프절에서는 실시예 1의 석이버섯 추출물 투여에 따른 사이토카인의 변화가 없었다.

실험예 4: 서혜부 림프절, 하악골 림프절, 구강점막 조직에 대한 병리 검사

서혜부 림프절, 하악골 림프절, 구강점막 조직에 대한 병리 검사를 실시하였다. 항-CD3 항체를 이용하여 T세포의 분포를, 항-CD11c를 이용하여 수지상 세포(dendritic cell)의 분포를 측정하였다.

마우스 조직을 2~3일 동안 10% 파라포름알데히드로 고정하였다. 점막 조직을 통상적인 방법에 따라 수세, 탈수, 파라핀 포매과정을 거쳤고, DAB 염색을 위하여 슬라이드에 5~6 mM 두께의 절편을 붙이고 항-CD3 및항-CD11c 항체를 이용하여 면역 염색을 시행하였다. 내인성 퍼록시다아제의 활성을 억제 하기 위하여 3% H₂O₂에 30분간 반응시키고, 블로킹 세럼(blocking serum)을 이용하여 60분간 반응시킨 다음, 일차항체를 실온에서 하루 동안 반응시켰다. 다음날 이차항체를 실온에서 2시간 반응시킨 다음 PBS로 3회 세척하고, ABC 시약을 1시간 동안 반응시켰다. 이이서 DAB로 1분간 발색시키고 헤마톡시린으로 30초간 염색하였다. 여러번 PBS로 세척한 후 탈수를 시행하였고 포매한 절편을 마운팅 용액을 이용하여 봉입하였다.

도 2는 석이버섯 추출물을 투여한 마우스로부터 분리한 서혜부 림프절의 병리검사결과를 나타낸 것이다.

도 2를 참조하면, 음성대조군과 실시예 1의 석이버섯 추출물을 투여한 마우스로부터 분리한 서혜부 림프절의 경우 T 세포와 수지상 세포의 분포에 차이가 없었다.

도 3은 석이버섯 추출물을 투여한 마우스로부터 분리한 하악골 림프절의 병리검사결과를 나타낸 것이다.

도 3을 참조하면, 서혜부 림프절과 달리 하악골 림프절의 경우 석이버섯을 투여한 결과 T 세포와 수지상 세포가 증가하고 있음을 확인할 수 있었다.

도 4는 석이버섯 추출물을 투여한 마우스로부터 분리한 구강점막의 병리검사결과를 나타낸 것이다.

도 4를 참조하면, 실시예 1의 석이버섯 추출물을 투여한 마우스의 구강점막에서도 하악골 림프절과 마찬가지로 T 세포와 수시상 세포의 분포가 증가하고 있음을 확인할 수 있었다.

이상의 결과로부터, 석이버섯 추출물을 투여함에 따라 구강 면역이 강화되었음을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명의 제형예로서 구강 청정제, 치약, 구강 린스 및 껌을 예시하고 있으나, 본 발명의 구강용 조성물의 제형은 이에 제한되는 것은 아니다.

제형예 1: 구강 청정제

하기의 표 3과 같이 실시예 1의 추출물을 함유하는 구강 청정제를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분명	함량(중량%)
에탄올	10
농글리세린	15
폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 공중합체	1
불소나트륨	0.22
석이버섯 추출물	1
정제수	잔량
합계	100

제형예 2: 치약

하기의 표 4와 같이 실시예 1의 추출물을 함유하는 치약을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분명	함량(중량%)
침강 실리카	20
농글리세린	40
자일리톨	1
라우릴황산나트륨	1
카르복시메틸셀롤로오스나트륨	0.2
불소나트륨	0.6
석이버섯 추출물	0.22
정제수	1
합계	100

제형예 3: 구강 린스

하기의 표 5와 같이 실시예 1의 추출물을 함유하는 구강 린스를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분명	함량(중량%)
솔비톨	5
비이온 계면활성제	0.5
불화나트륨	0.02
에탄올	3
폴리에틸렌글리콜	5
비타민 E 유도체	0.1
사카린	0.1
항균제	0.05
향료	적량
색소	적량
석이버섯 추출물	0.5
정제수	잔량
합계	100

제형예 4: 껌

하기의 표 6과 같이 실시예 1의 추출물을 함유하는 껌을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분명	함량(중량%)
자일리톨	20
비타민 E 유도체	0.1
사카린	0.2
항균제	0.05
향료	적량
색소	적량
석이버섯 추출물	0.5
껌 베이스	잔량
합계	100

Claims (7)

1. 석이버섯(Umbilicaria esculenta)을 열수 추출하여 얻는 여액을 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 알코올을 이용하여 침전시켜 얻은 석이버섯 추출물을 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량%으로 함유하는 구강 면역 증강 효과를 갖는 구강용 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 석이버섯을 열수 추출하여 추출 용액을 얻는 단계;
   추출 용액을 정치하여 여액과 침전물로 분리하는 단계; 및
   상기 여액 중의 다당체를 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 알코올을 이용하여 침전시켜 침전물을 얻는 단계
   를 포함하여 제1항의 구강용 조성물을 제조하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 열수 추출은
   50 내지 120 ℃에서 1 내지 10시간 동안 수행하는 것인 방법.
6. 제4항에 있어서, 상기 정치는
   2~5 ℃에서 12 내지 48시간 동안 수행하는 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 치약, 치분, 젤리, 카라멜, 캔디, 구강 린스, 구강 청정제, 및 껌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 제형을 갖는 것인 조성물.
   
   
   
   

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