JP3611638B2 - ヒトコラゲナーゼ活性阻害剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、飴類、飲料、ガム等の食品、洗口液、歯磨等の口腔用組成物に好適で、歯周病の予防・治療効果が期待でき、しかも安全性の高いヒトコラゲナーゼ活性阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
歯周病は、歯周組織における種々の病態を含む炎症性疾患の総称であるが、一般に炎症が歯肉部分に限定される歯肉炎と、歯槽骨に達して慢性化する歯周炎とに大別される。歯周炎は歯槽膿漏とよばれていたが、慢性化に伴い歯肉及び歯槽骨の破壊をきたし歯の脱落にいたる。歯を失う原因の５０％が歯周病であり、中高年にかけては約８０％の人が罹患している。
【０００３】
歯周病の原因として、歯周ポケットのプラーク中の特定の細菌群、中でも黒色色素産生性のポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｉｒｏｍｏｎａｓ ） 菌群病原説が有力視されている（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ、１３巻、９１２ 頁、１９８６年参照）。その歯周組織破壊作用としては、細菌由来の直接作用因子（酵素やエンドトキシン等）や間接作用因子（宿主の免疫応答を介するもの）が関与していると考えられているが、何れにせよ結果的に歯肉および歯槽骨のコラーゲンが分解・吸収される点は共通である（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ 、９２巻、５０９ 頁、１９７８年参照）。
【０００４】
歯周病に関わるコラーゲン分解酵素としては、ポルフィロモナス由来のものと歯肉の線維芽細胞由来のものが注目されている。前者は最近部分精製された、金属とチオールを同時に要求する珍しい酵素であるが、まだ不明な点が多い（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 、２３巻、２５８ 頁、１９８８年参照）。
【０００５】
一方、線維芽細胞由来の間質型コラゲナーゼ（以下断りの無い限りコラゲナーゼと呼ぶ）は詳細に解明され、１次構造も明らかにされている（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６１ 巻、６６００頁、１９８６年参照） 。
【０００６】
コラゲナーゼは、結合組織中の間質型コラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型コラーゲン）を分解する際の律速酵素であり、コラーゲンの代謝に重要な役割を果たしている。炎症の存在する歯肉ではコラゲナーゼ活性が上昇すること（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１６巻、４１７ 頁、１９８１年参照）、またコラーゲンが歯肉炎の初期の段階から減少していること（Ａｒｃｈｉｅｖｅｓ ｏｆ Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１８巻、８９９ 頁、１９７３年参照） を考慮すると、歯肉のコラゲナーゼが歯周病の進行に深く関わっていると考えられる。
【０００７】
従来、歯周病の予防や治療には、スケーリングやルートプレーニングによる歯周ポケット内のプラークや歯石の除去、歯周ポケットの除去（歯肉切除）等が用いられていた。
【０００８】
また、最近薬物療法として抗菌剤ミノサイクリンを配合した治療剤が開発された。ミノサイクリンには、抗菌活性のみならずポルフィロモナスおよび好中球由来コラゲナーゼをイン・ビトロで阻害する活性を有することが報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ 、３０巻、１８２ 頁、１９８８年参照）。
【０００９】
上記公知の方法は、医師の指示に従った物理的、外科的、あるいは薬剤による治療に基づくものである。しかし、歯周病は日常的で罹患率の高い疾病であり、また、医師による治療に至るまでに病状が悪化し易いことを考慮すると、ガム、飴、飲料のような食品や、歯磨剤、洗口剤のような口腔用組成物として、前記の病因を除去し歯周病の予防や治療に役立つ安全性の高い物質を利用することが望まれる。
【００１０】
一方、ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）はこれまでトリテルペン骨格を持つ化合物として、ホウロクタケ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ 、２８１１頁、１９７０年参照） やＰｏｌｙｐｏｒｕｓ ｂｅｔｕｌｉｎｕｓ （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、２５４８頁、１９５３年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ 、３０７０頁、１９５４年参照） から抽出、精製されたことが報告されているが、ヒトコラゲナーゼ活性を阻害する作用があることは報告されていない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
かかる事情に鑑み、本発明者等は病因を除去し歯周病の予防や治療に役立つ安全性の高いヒトコラゲナーゼ活性阻害物質の探索を鋭意検討した結果、ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）、ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）を含むキノコ抽出エキス、またはホウロクタケの抽出エキスにヒトコラゲナーゼ活性を特異的に阻害する作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。
従って本発明の目的とするところは、歯周病の予防・治療効果が期待でき、しかも安全性の高いヒトコラゲナーゼ活性阻害剤を提供するにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上述の目的は、ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）、ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）を含むキノコ抽出エキスもしくはその乾燥エキス末、またはホウロクタケの抽出エキスもしくはその乾燥エキス末を有効成分とすることを特徴とするヒトコラゲナーゼ活性阻害剤によって達成される。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下本発明の構成について詳説する。
本発明において用いられるポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）、ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）を含むキノコの抽出エキスもしくはその乾燥エキス末、またはホウロクタケの抽出エキスもしくはその乾燥エキス末は、キノコ子実体等から以下の通り製造することが出来る。
【００１４】
本発明に用いられるポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）を含むキノコとしては、例えばＤａｅｄａｌｅａ ｄｉｃｋｉｎｓｉ（ホウロクタケ）、Ｆｏｍｉｔｏｐｓｉｓ ｐｉｎｉｃｏｌａ（ツガサルノコシカケ）、Ｆｏｍｉｔｏｐｓｉｓ ｒｏｓｅａ （バライロサルノコシカケ）、Ｆｏｍｉｔｏｐｓｉｓ ｎｉｇｒａ （クロサルノコシカケ）、Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｂｅｔｕｌｉｎｕｓ 等タコウキン科のキノコ、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｖａｌｅｓｉａｃｕｍ（ツガノマンネンタケ）等のマンネンタケ科のキノコ等が挙げられる。
【００１５】
本発明のキノコの抽出エキスを製造する方法としては、例えばキノコ子実体の凍結乾燥物に対し重量比で５〜３０倍の抽出溶剤を加え、通常１５〜５０℃で２４時間〜１週間浸透して各キノコの抽出液を得る方法等が挙げられる。
また、抽出液をろ過あるいは遠心分離して不溶物を除去し、次いで通常の濃縮手段、例えば減圧濃縮等して濃縮の抽出エキスとして得ることもできる。
【００１６】
本発明のキノコの抽出エキスを製造する際の抽出溶剤としては、例えば、水、エタノール等の水溶性有機溶剤あるいはこれらの混合溶剤が挙げられる。
【００１７】
本発明のキノコの乾燥エキス末を製造する方法としては、前記抽出エキスを通常の乾燥手段、例えば減圧乾燥、噴霧乾燥あるいは凍結乾燥等により乾燥エキス末として得る方法等が挙げられる。
【００１８】
本発明のポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）を単離する方法としては、前記抽出エキスまたは乾燥エキス末を有機溶剤で抽出し、シリカゲルカラム等の分離手段で精製してポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）を単離する方法等が挙げられる。
【００１９】
本発明のヒトコラゲナーゼ活性阻害剤には、上記のポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）、抽出エキスまたはその乾燥エキス末の他、口腔用組成物に通常使用される公知の成分を任意に配合することができる。
【００２０】
本発明のヒトコラゲナーゼ活性阻害剤を適用する組成物形態としては、液剤，固形剤，半固形剤等いずれであっても良く、特にチューインガム，飴類，飲料等の食品，あるいは、歯磨剤，洗口剤，トローチ剤，塗布液剤等の口腔用組成物が好ましい。
【００２１】
これらの組成物を製造するのに使用される賦形剤または補助剤は、通常同目的に使用されるものから剤形に応じて適宜選択すればよく、特に限定されるものではないが、例えば乳糖、ステアリン酸マグネシウム、ソルビット、マンニット、カルボキシメチルセルロース、ハイドロキシプロピルセルロース、ハイドロキシプロピルメチルセルロース、サッカリン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、グリセリン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、カラギナン、アラビアゴム、エタノール、メントール、脂肪酸、クエン酸、無水ケイ酸、第二リン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト、炭酸カルシウム、二酸化チタン等が使用される。
【００２２】
更に、通常食品に用いられる甘味料、着色料、香料、保存料などを適宜使用することもできるし、クロルヘキシジンなどの殺菌剤、ミノサイクリンやアンピシリンなどの抗生物質を配合し、歯周病の予防や改善効果を高めることもできる。
【００２３】
本発明のヒトコラゲナーゼ活性阻害剤の組成物配合濃度は、組成物中に占めるポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）、またはポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）を含有するキノコの抽出エキスもしくはその乾燥エキス末の割合が適用組成物により異なり一概には規定出来ないが、組成物総量を１００重量％としたとき、ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）の濃度として、０．００１ 〜１０．０重量％が好ましく、特に０．００５ 〜１．０ 重量％が好ましい。またキノコの抽出エキスまたはその乾燥エキス末を含有するヒトコラゲナーゼ活性阻害剤を配合する場合には、抽出エキスの乾燥重量として、０．００５ 〜２０．０重量％が好ましく、特に０．０５〜５．０ 重量％が好ましい。
【００２４】
【発明の効果】
本発明により、歯周病における歯肉および歯槽骨のコラーゲン吸収の原因であるヒトコラゲナーゼに対し優れた阻害活性を有し、歯周病の予防および治療に有用で、且つ配合量の多少に関わらず使用上の安全性も極めて高いコラゲナーゼ活性阻害剤が提供できる。しかも本発明のヒトコラゲナーゼ活性阻害剤は、ヒトコラゲナーゼに特異的に作用するため、他の酵素群に影響を及ぼさずに、歯周病の予防および治療を行うのに適している。
【００２５】
【実施例】
以下、試験例及び実施例によって、本発明を更に詳細に説明する。尚、本発明のヒトコラゲナーゼ活性阻害剤が、メタロプロテアーゼ全般に対するキレーターとして作用するのではなくヒトコラゲナーゼを特異的に阻害することを示すため、ヒトコラゲナーゼと同じメタロプロテアーゼであるところのバクテリアコラゲナーゼ及びアンジオテンシン変換酵素に対する阻害活性を調べた。
【００２６】
（試験例−１）ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）、およびホウロクタケ抽出エキスのヒトコラゲナーゼ阻害作用
【００２７】
１． 試験物質
ホウロクタケの子実体を凍結乾燥させ、その７．３５ｋｇを１５ｌの８５％エタノールで抽出し、ホウロクタケエキスとした。
そのエキスを濃縮し、酢酸エチル抽出したものをシリカゲルカラム（ＢＷ−１２７ＺＨ）にかけ、クロロホルム：アセトン（８：２）で溶出した。さらに再度シリカゲルカラム（Ｋｌｅｓｓｅｌｇｅｌ ６０）にかけクロロホルム：アセトン（８２：１８）で溶出したものを、ＨＰＬＣのＯＤＳカラムにかけメタノール：水（８６：１４）の条件で溶出してポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）を６．０ｍｇ得た。
【００２８】
２． ヒトコラゲナーゼ
ヒトコラゲナーゼとしては、ヒト線維肉腫細胞由来の足場非依存性細胞に、無血清無蛋白質培地中で産生させたヒトプロコラゲナーゼを、ＣＭセファロースＴＭ（ファルマシア社製）および亜鉛キレーティングセファロースＴＭ（ファルマシア社製）により精製して緩衝液に溶解し、これに活性化剤としてトリプシン（シグマ社製，Ｔｙｐｅ１２）を添加して、３５℃にて５分間インキュベートした後、ダイズトリプシン インヒビター（メルク社製）を添加してトリプシンを失活させたものを用いた。
【００２９】
３． ヒトコラゲナーゼ阻害活性の測定
ヒトコラゲナーゼに対するポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）、およびホウロクタケエキスの阻害活性の測定は以下の通り行った。
【００３０】
先ずポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）の場合は４．０ｍｇのポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）を１００μｌのジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し原液とし、測定用緩衝液〔０．２Ｍ食塩、５ｍＭ 塩化カルシウム、０．０５容量％Ｂｒｉｊ−３５（ＩＣＩ社製ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル）、０．０２容量％アジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．５ 〕で１００倍に希釈した。さらにその液を測定用緩衝液にて３〜１００倍希釈した。
【００３１】
各希釈液と、既知量（０．４ 単位； なお１単位は、３５℃で１分間に１μｇのＩ型コラーゲンを分解する酵素量を示す）の上記ヒトコラゲナーゼ溶液とを等量混合し、フルオレッセインイソチオシアネートで標識されたＩ型コラーゲン（コスモバイオ社製）を基質として、永井らの方法（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍａｔｉｏｎ、４ 巻、１２３ 頁、１９８４年参照）に準じコラゲナーゼ活性を測定することにより、阻害曲線を求め、それより５０％阻害するに必要な試験薬量をＩＣ５０値として読み取った。
【００３２】
ホウロクタケエキスの場合は遠心濃縮機で乾固し秤量後、５．０ｍｇを１００μｌのジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し原液とし、測定用緩衝液で２５倍に希釈した。
【００３３】
希釈液と、既知量（０．４ 単位； なお１単位は、３５℃で１分間に１μｇのＩ型コラーゲンを分解する酵素量を示す）の上記コラゲナーゼ溶液とを等量混合し、ウシＩ型コラーゲン（コスモバイオ社製）を基質として、３５℃で１６時間反応させた。この溶液に等量の試料用緩衝液〔３．２ 容量％ｎ−ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ） 、８容量％β−メルカプトエタノール、１６容量％ＢＰＢ 溶液（０．０５ 容量％ブロムフェノールブルー、７０容量％グリセリン、０．０６２５Ｍ トリス塩酸液、ｐＨ６．８）を含有する０．１Ｍトリス塩酸液、ｐＨ６．８ 〕を加え３分間煮沸し試料とした。
【００３４】
この試料をＬａｅｍｍｌｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７巻，６８０頁， １９７０年参照）に準じたＳＤＳ電気泳動に供し、ＣＢＢ染色液（０．２５容量％クマシーブリリアントブルーＲ−２５０，４５容量％メタノール、１０容量％酢酸）で１時間染色後、脱色液（２５容量％メタノール、８容量％酢酸）で脱色した。
【００３５】
電気泳動ゲルを乾燥後、電気泳動パターンのコラーゲンの切断されたバンドを画像解析装置〔Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ 〕（Ａｐｐｌｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ社製）により読み取り、そのバンドの濃さをヒトコラゲナーゼ活性の阻害の指標とした。
【００３６】
４． 試験結果
表１および表２に結果を示す。ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）には用量依存的なヒトコラゲナーゼ阻害活性がみられ、ＩＣ５０値は７．３μｇ／ｍｌ（１５．１μＭ）であった。またホウロクタケの８５％エタノール抽出エキスはヒトコラゲナーゼを完全に阻害した。
【００３７】
【表１】
【００３８】
【表２】
【００３９】
（試験例−２）各種キノコエキスのヒトコラゲナーゼ阻害作用
【００４０】
１． 試験物質
Ｆｏｍｉｔｏｐｓｉｓ ｐｉｎｉｃｏｌａ（ツガサルノコシカケ）、Ｆｏｍｉｔｏｐｓｉｓ ｒｏｓｅａ （バライロサルノコシカケ）、Ｆｏｍｉｔｏｐｓｉｓ ｎｉｇｒａ （クロサルノコシカケ）、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｖａｌｅｓｉａｃｕｍ（ツガノマンネンタケ）の子実体を凍結乾燥させ、その２．５ｇを７５ｍｌの８５％エタノールで抽出し、キノコエキスとした。
【００４１】
２．方法
用いたヒトコラゲナーゼおよびヒトコラゲナーゼ阻害活性の測定方法は試験例−１のホウロクタケエキスの場合の方法と同様に行なった。
【００４２】
３．試験結果
表３に結果を示す。検討した４種類のキノコエキスは、いずれもヒトコラゲナーゼを阻害した。
【００４３】
【表３】
【００４４】
（試験例−３）ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）阻害の特異性
【００４５】
１． 試験物質
試験例−１の方法で得たポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）を用いた。
【００４６】
２． バクテリアコラゲナーゼおよびその活性阻害測定法
バクテリアコラゲナーゼとしては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のコラゲナーゼ（シグマ社製，ＴｙｐｅＩ）を用いた。
【００４７】
ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ） ４００μｇ／ｍｌ を２倍ずつ１２．５μｇ／ｍｌ まで測定用緩衝液で希釈し、０．１ 単位（なお１単位は、２５℃で１分間に１μｍｏｌｅの基質を分解する酵素量を示す）のバクテリアコラゲナーゼに対する活性阻害を調べた。バクテリアコラゲナーゼ阻害活性の測定方法は試験例−１のホウロクタケエキスの場合の方法と同様に行なった。同時に ０．４単位のヒトコラゲナーゼに対する活性阻害も調べた。
【００４８】
３．アンジオテンシン変換酵素阻害測定法
（ａ）反応用緩衝液
３０ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）
【００４９】
（ｂ）アンジオテンシン変換酵素液
アンジオテンシン変換酵素（ウサギ由来、シグマ社製）を６０ｍＭＮａＣｌを含む１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）に０．１５ミリ単位／ｍｌになるように溶解した。ただし、１単位とは、３７℃、ｐＨ８．３において１分間に基質ヒップリル−ヒスチジル−ロイシンから１μｍｏｌの馬尿酸に分解される量を示す。
【００５０】
（ｃ）アンジオテンシンＩ溶液
アンジオテンシンＩ（ペプチド研究所製）は、１０％アセトニトリル溶液（Ｖ／Ｖ）にて２５ｍｇ／ｍｌに溶解後、蒸留水にて１．２ｍｇ／ｍｌに希釈した。
【００５１】
（ｄ）アンジオテンシン変換酵素阻害活性の測定方法
ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）をジメチルスルフォキシドに４．０ｍｇ／ｍｌとなるよう溶解後、反応用緩衝液で適宜希釈し検体とした。
【００５２】
先ず上記の検体２０μｌとアンジオテンシン変換酵素液２０μｌを混合後、基質アンジオテンシンＩ溶液を２０μｌ添加し、１０分間３７℃で反応させ、０．２％トリフルオロ酢酸（Ｖ／Ｖ）を含む５０％アセトニトリル溶液（Ｖ／Ｖ）を６０μｌ添加し反応を停止した。
【００５３】
上記操作で得られた溶液を、高速液体クロマトグラフィーにて、アンジオテンシンＩＩ量を測定した。
【００５４】
高速液体クロマトグラフィーでのアンジオテンシンＩＩの溶離条件は、流速１ｍｌ、溶離液０．１％トリフルオロ酢酸（Ｖ／Ｖ）を含む２３％アセトニトリル（Ｖ／Ｖ）溶液、カラムＹＭＣ Ａ−３１２（山村化学研究所製、６×１５０ｍｍ）とした。また、アンジオテンシンＩＩ量は、２８０ｎｍでの吸光度で測定した。（この値をＸとする。）
【００５５】
一方、コントロールとして、ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）の代わりに反応用緩衝液のみを２０μｌ添加した群を作り、上記と同様の操作によりアンジオテンシン変換酵素阻害活性を測定した。なお、アンジオテンシン変換酵素反応液でのアンジオテンシンＩＩ量をＹとした。
【００５６】
また、比較例として、ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）の代わりにアンジオテンシン変換酵素阻害薬として知られているカプトプリルを反応用緩衝液にて溶解、希釈して加え、上記と同様の操作によりアンジオテンシン変換酵素阻害活性を測定した。
【００５７】
アンジオテンシン変換酵素の阻害率は、アンジオテンシンＩＩ量から数１により求めた。
【００５８】
【数１】
【００５９】
４．試験結果
表４に結果を示すように、種々の濃度のポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）はヒトコラゲナーゼを濃度依存的に阻害したが、バクテリアコラゲナーゼに対してはいずれの濃度でも阻害作用を示さなかった。
【００６０】
またアンジオテンシン変換酵素阻害率を求めた結果を表５に示す。比較例（カプトプリル１０ｎＭ）は５０％を示したが、比較例と比してポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）は、アンジオテンシン変換酵素を阻害しなかった。
【００６１】
この結果から、ヒトコラゲナーゼに対するポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）の阻害作用は、単なるメタロプロテアーゼに対するキレーターとしての作用ではなく、特異的なものであると考えられる。
【００６２】
【表４】
【００６３】
【表５】
【００６４】
実施例１（練歯磨）
表６に示した処方について常法に従ってポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）（試験例−１の方法で精製した）を０．１重量％含む練歯磨剤を製造した。即ち、水、グリセリン、カラギナン、サッカリン、パラオキシ安息香酸ブチル、クロルヘキシジンジグルコネート、香料、およびポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）の処方量を計量し、混合して粘結剤を膨潤させたのち、第２リン酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウムを加え、更によく混合し脱泡したのち、チューブに充填して練歯磨剤を得た。
【００６５】
【表６】
【００６６】
実施例２（練歯磨）
ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）の代わりにホウロクタケエキス（試験例−１の方法で抽出した）を用い、その添加量を１． ０重量％とする以外は実施例１と同様にして練歯磨剤を得た。
【００６７】
実施例３（トローチ剤）
表７に示した処方について常法に従いポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）（試験例−１の方法で精製した）を０．０５重量％含むトローチ剤を製造した。
【００６８】
【表７】
【００６９】
実施例４（トローチ剤）
ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）の代わりにホウロクタケエキス（試験例−１の方法で抽出した）を用い、その添加量を０． ５重量％とする以外は、実施例３と同様にしてトローチ剤を得た。
【００７０】
実施例５（洗口剤）
表８に示した処方について常法に従いポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）（試験例−１の方法で精製した）０．１重量％含む洗口剤を製造した。
【００７１】
【表８】
【００７２】
実施例６（洗口液）
ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）の代わりにホウロクタケエキス（試験例−１の方法で抽出した）を用い、その添加量を１． ０重量％とする以外は実施例５と同様にして洗口液を得た。
【００７３】
実施例７（チューインガム）
表９に示した処方について常法に従ってホウロクタケエキス（試験例−１の方法で抽出した）を１．０重量％含むチューインガムを製造した。
【００７４】
【表９】
【００７５】
即ち、４０℃に保温した全量のチューインガムベースおよび全量の水飴を、ニーダーに投入して１０分間混練し、粉糖の１／３ 量および全量のブドウ糖を投入して５分間、次いで粉糖の１／３ 量を投入して５分間混練した。次に、ホウロクタケエキスと香料を残りの１／３ 量の粉糖に混合したものを投入し、５分間混練してガムミックスを得た。
【００７６】
実施例８（ヌガー）
表１０に示した処方について常法に従ってホウロクタケエキス（試験例−１の方法で抽出した）を０．２重量％含むヌガーを製造した。
【００７７】
【表１０】
【００７８】
即ち、まず▲１▼を混合し泡立て、▲２▼は１３０℃まで煮詰めた。▲１▼に▲２▼を少しずつ加え、更に泡立て、これに、▲３▼を加え混合しながら冷却盤上に広げ成型してヌガーを得た。
【発明の属する技術分野】
本発明は、飴類、飲料、ガム等の食品、洗口液、歯磨等の口腔用組成物に好適で、歯周病の予防・治療効果が期待でき、しかも安全性の高いヒトコラゲナーゼ活性阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
歯周病は、歯周組織における種々の病態を含む炎症性疾患の総称であるが、一般に炎症が歯肉部分に限定される歯肉炎と、歯槽骨に達して慢性化する歯周炎とに大別される。歯周炎は歯槽膿漏とよばれていたが、慢性化に伴い歯肉及び歯槽骨の破壊をきたし歯の脱落にいたる。歯を失う原因の５０％が歯周病であり、中高年にかけては約８０％の人が罹患している。
【０００３】
歯周病の原因として、歯周ポケットのプラーク中の特定の細菌群、中でも黒色色素産生性のポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｉｒｏｍｏｎａｓ ） 菌群病原説が有力視されている（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ、１３巻、９１２ 頁、１９８６年参照）。その歯周組織破壊作用としては、細菌由来の直接作用因子（酵素やエンドトキシン等）や間接作用因子（宿主の免疫応答を介するもの）が関与していると考えられているが、何れにせよ結果的に歯肉および歯槽骨のコラーゲンが分解・吸収される点は共通である（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ 、９２巻、５０９ 頁、１９７８年参照）。
【０００４】
歯周病に関わるコラーゲン分解酵素としては、ポルフィロモナス由来のものと歯肉の線維芽細胞由来のものが注目されている。前者は最近部分精製された、金属とチオールを同時に要求する珍しい酵素であるが、まだ不明な点が多い（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 、２３巻、２５８ 頁、１９８８年参照）。
【０００５】
一方、線維芽細胞由来の間質型コラゲナーゼ（以下断りの無い限りコラゲナーゼと呼ぶ）は詳細に解明され、１次構造も明らかにされている（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６１ 巻、６６００頁、１９８６年参照） 。
【０００６】
コラゲナーゼは、結合組織中の間質型コラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型コラーゲン）を分解する際の律速酵素であり、コラーゲンの代謝に重要な役割を果たしている。炎症の存在する歯肉ではコラゲナーゼ活性が上昇すること（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１６巻、４１７ 頁、１９８１年参照）、またコラーゲンが歯肉炎の初期の段階から減少していること（Ａｒｃｈｉｅｖｅｓ ｏｆ Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１８巻、８９９ 頁、１９７３年参照） を考慮すると、歯肉のコラゲナーゼが歯周病の進行に深く関わっていると考えられる。
【０００７】
従来、歯周病の予防や治療には、スケーリングやルートプレーニングによる歯周ポケット内のプラークや歯石の除去、歯周ポケットの除去（歯肉切除）等が用いられていた。
【０００８】
また、最近薬物療法として抗菌剤ミノサイクリンを配合した治療剤が開発された。ミノサイクリンには、抗菌活性のみならずポルフィロモナスおよび好中球由来コラゲナーゼをイン・ビトロで阻害する活性を有することが報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ 、３０巻、１８２ 頁、１９８８年参照）。
【０００９】
上記公知の方法は、医師の指示に従った物理的、外科的、あるいは薬剤による治療に基づくものである。しかし、歯周病は日常的で罹患率の高い疾病であり、また、医師による治療に至るまでに病状が悪化し易いことを考慮すると、ガム、飴、飲料のような食品や、歯磨剤、洗口剤のような口腔用組成物として、前記の病因を除去し歯周病の予防や治療に役立つ安全性の高い物質を利用することが望まれる。
【００１０】
一方、ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）はこれまでトリテルペン骨格を持つ化合物として、ホウロクタケ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ 、２８１１頁、１９７０年参照） やＰｏｌｙｐｏｒｕｓ ｂｅｔｕｌｉｎｕｓ （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、２５４８頁、１９５３年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ 、３０７０頁、１９５４年参照） から抽出、精製されたことが報告されているが、ヒトコラゲナーゼ活性を阻害する作用があることは報告されていない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
かかる事情に鑑み、本発明者等は病因を除去し歯周病の予防や治療に役立つ安全性の高いヒトコラゲナーゼ活性阻害物質の探索を鋭意検討した結果、ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）、ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）を含むキノコ抽出エキス、またはホウロクタケの抽出エキスにヒトコラゲナーゼ活性を特異的に阻害する作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。
従って本発明の目的とするところは、歯周病の予防・治療効果が期待でき、しかも安全性の高いヒトコラゲナーゼ活性阻害剤を提供するにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上述の目的は、ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）、ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）を含むキノコ抽出エキスもしくはその乾燥エキス末、またはホウロクタケの抽出エキスもしくはその乾燥エキス末を有効成分とすることを特徴とするヒトコラゲナーゼ活性阻害剤によって達成される。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下本発明の構成について詳説する。
本発明において用いられるポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）、ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）を含むキノコの抽出エキスもしくはその乾燥エキス末、またはホウロクタケの抽出エキスもしくはその乾燥エキス末は、キノコ子実体等から以下の通り製造することが出来る。
【００１４】
本発明に用いられるポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）を含むキノコとしては、例えばＤａｅｄａｌｅａ ｄｉｃｋｉｎｓｉ（ホウロクタケ）、Ｆｏｍｉｔｏｐｓｉｓ ｐｉｎｉｃｏｌａ（ツガサルノコシカケ）、Ｆｏｍｉｔｏｐｓｉｓ ｒｏｓｅａ （バライロサルノコシカケ）、Ｆｏｍｉｔｏｐｓｉｓ ｎｉｇｒａ （クロサルノコシカケ）、Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｂｅｔｕｌｉｎｕｓ 等タコウキン科のキノコ、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｖａｌｅｓｉａｃｕｍ（ツガノマンネンタケ）等のマンネンタケ科のキノコ等が挙げられる。
【００１５】
本発明のキノコの抽出エキスを製造する方法としては、例えばキノコ子実体の凍結乾燥物に対し重量比で５〜３０倍の抽出溶剤を加え、通常１５〜５０℃で２４時間〜１週間浸透して各キノコの抽出液を得る方法等が挙げられる。
また、抽出液をろ過あるいは遠心分離して不溶物を除去し、次いで通常の濃縮手段、例えば減圧濃縮等して濃縮の抽出エキスとして得ることもできる。
【００１６】
本発明のキノコの抽出エキスを製造する際の抽出溶剤としては、例えば、水、エタノール等の水溶性有機溶剤あるいはこれらの混合溶剤が挙げられる。
【００１７】
本発明のキノコの乾燥エキス末を製造する方法としては、前記抽出エキスを通常の乾燥手段、例えば減圧乾燥、噴霧乾燥あるいは凍結乾燥等により乾燥エキス末として得る方法等が挙げられる。
【００１８】
本発明のポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）を単離する方法としては、前記抽出エキスまたは乾燥エキス末を有機溶剤で抽出し、シリカゲルカラム等の分離手段で精製してポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）を単離する方法等が挙げられる。
【００１９】
本発明のヒトコラゲナーゼ活性阻害剤には、上記のポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）、抽出エキスまたはその乾燥エキス末の他、口腔用組成物に通常使用される公知の成分を任意に配合することができる。
【００２０】
本発明のヒトコラゲナーゼ活性阻害剤を適用する組成物形態としては、液剤，固形剤，半固形剤等いずれであっても良く、特にチューインガム，飴類，飲料等の食品，あるいは、歯磨剤，洗口剤，トローチ剤，塗布液剤等の口腔用組成物が好ましい。
【００２１】
これらの組成物を製造するのに使用される賦形剤または補助剤は、通常同目的に使用されるものから剤形に応じて適宜選択すればよく、特に限定されるものではないが、例えば乳糖、ステアリン酸マグネシウム、ソルビット、マンニット、カルボキシメチルセルロース、ハイドロキシプロピルセルロース、ハイドロキシプロピルメチルセルロース、サッカリン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、グリセリン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、カラギナン、アラビアゴム、エタノール、メントール、脂肪酸、クエン酸、無水ケイ酸、第二リン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト、炭酸カルシウム、二酸化チタン等が使用される。
【００２２】
更に、通常食品に用いられる甘味料、着色料、香料、保存料などを適宜使用することもできるし、クロルヘキシジンなどの殺菌剤、ミノサイクリンやアンピシリンなどの抗生物質を配合し、歯周病の予防や改善効果を高めることもできる。
【００２３】
本発明のヒトコラゲナーゼ活性阻害剤の組成物配合濃度は、組成物中に占めるポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）、またはポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）を含有するキノコの抽出エキスもしくはその乾燥エキス末の割合が適用組成物により異なり一概には規定出来ないが、組成物総量を１００重量％としたとき、ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）の濃度として、０．００１ 〜１０．０重量％が好ましく、特に０．００５ 〜１．０ 重量％が好ましい。またキノコの抽出エキスまたはその乾燥エキス末を含有するヒトコラゲナーゼ活性阻害剤を配合する場合には、抽出エキスの乾燥重量として、０．００５ 〜２０．０重量％が好ましく、特に０．０５〜５．０ 重量％が好ましい。
【００２４】
【発明の効果】
本発明により、歯周病における歯肉および歯槽骨のコラーゲン吸収の原因であるヒトコラゲナーゼに対し優れた阻害活性を有し、歯周病の予防および治療に有用で、且つ配合量の多少に関わらず使用上の安全性も極めて高いコラゲナーゼ活性阻害剤が提供できる。しかも本発明のヒトコラゲナーゼ活性阻害剤は、ヒトコラゲナーゼに特異的に作用するため、他の酵素群に影響を及ぼさずに、歯周病の予防および治療を行うのに適している。
【００２５】
【実施例】
以下、試験例及び実施例によって、本発明を更に詳細に説明する。尚、本発明のヒトコラゲナーゼ活性阻害剤が、メタロプロテアーゼ全般に対するキレーターとして作用するのではなくヒトコラゲナーゼを特異的に阻害することを示すため、ヒトコラゲナーゼと同じメタロプロテアーゼであるところのバクテリアコラゲナーゼ及びアンジオテンシン変換酵素に対する阻害活性を調べた。
【００２６】
（試験例−１）ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）、およびホウロクタケ抽出エキスのヒトコラゲナーゼ阻害作用
【００２７】
１． 試験物質
ホウロクタケの子実体を凍結乾燥させ、その７．３５ｋｇを１５ｌの８５％エタノールで抽出し、ホウロクタケエキスとした。
そのエキスを濃縮し、酢酸エチル抽出したものをシリカゲルカラム（ＢＷ−１２７ＺＨ）にかけ、クロロホルム：アセトン（８：２）で溶出した。さらに再度シリカゲルカラム（Ｋｌｅｓｓｅｌｇｅｌ ６０）にかけクロロホルム：アセトン（８２：１８）で溶出したものを、ＨＰＬＣのＯＤＳカラムにかけメタノール：水（８６：１４）の条件で溶出してポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）を６．０ｍｇ得た。
【００２８】
２． ヒトコラゲナーゼ
ヒトコラゲナーゼとしては、ヒト線維肉腫細胞由来の足場非依存性細胞に、無血清無蛋白質培地中で産生させたヒトプロコラゲナーゼを、ＣＭセファロースＴＭ（ファルマシア社製）および亜鉛キレーティングセファロースＴＭ（ファルマシア社製）により精製して緩衝液に溶解し、これに活性化剤としてトリプシン（シグマ社製，Ｔｙｐｅ１２）を添加して、３５℃にて５分間インキュベートした後、ダイズトリプシン インヒビター（メルク社製）を添加してトリプシンを失活させたものを用いた。
【００２９】
３． ヒトコラゲナーゼ阻害活性の測定
ヒトコラゲナーゼに対するポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）、およびホウロクタケエキスの阻害活性の測定は以下の通り行った。
【００３０】
先ずポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）の場合は４．０ｍｇのポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）を１００μｌのジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し原液とし、測定用緩衝液〔０．２Ｍ食塩、５ｍＭ 塩化カルシウム、０．０５容量％Ｂｒｉｊ−３５（ＩＣＩ社製ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル）、０．０２容量％アジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．５ 〕で１００倍に希釈した。さらにその液を測定用緩衝液にて３〜１００倍希釈した。
【００３１】
各希釈液と、既知量（０．４ 単位； なお１単位は、３５℃で１分間に１μｇのＩ型コラーゲンを分解する酵素量を示す）の上記ヒトコラゲナーゼ溶液とを等量混合し、フルオレッセインイソチオシアネートで標識されたＩ型コラーゲン（コスモバイオ社製）を基質として、永井らの方法（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍａｔｉｏｎ、４ 巻、１２３ 頁、１９８４年参照）に準じコラゲナーゼ活性を測定することにより、阻害曲線を求め、それより５０％阻害するに必要な試験薬量をＩＣ５０値として読み取った。
【００３２】
ホウロクタケエキスの場合は遠心濃縮機で乾固し秤量後、５．０ｍｇを１００μｌのジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し原液とし、測定用緩衝液で２５倍に希釈した。
【００３３】
希釈液と、既知量（０．４ 単位； なお１単位は、３５℃で１分間に１μｇのＩ型コラーゲンを分解する酵素量を示す）の上記コラゲナーゼ溶液とを等量混合し、ウシＩ型コラーゲン（コスモバイオ社製）を基質として、３５℃で１６時間反応させた。この溶液に等量の試料用緩衝液〔３．２ 容量％ｎ−ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ） 、８容量％β−メルカプトエタノール、１６容量％ＢＰＢ 溶液（０．０５ 容量％ブロムフェノールブルー、７０容量％グリセリン、０．０６２５Ｍ トリス塩酸液、ｐＨ６．８）を含有する０．１Ｍトリス塩酸液、ｐＨ６．８ 〕を加え３分間煮沸し試料とした。
【００３４】
この試料をＬａｅｍｍｌｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７巻，６８０頁， １９７０年参照）に準じたＳＤＳ電気泳動に供し、ＣＢＢ染色液（０．２５容量％クマシーブリリアントブルーＲ−２５０，４５容量％メタノール、１０容量％酢酸）で１時間染色後、脱色液（２５容量％メタノール、８容量％酢酸）で脱色した。
【００３５】
電気泳動ゲルを乾燥後、電気泳動パターンのコラーゲンの切断されたバンドを画像解析装置〔Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ 〕（Ａｐｐｌｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ社製）により読み取り、そのバンドの濃さをヒトコラゲナーゼ活性の阻害の指標とした。
【００３６】
４． 試験結果
表１および表２に結果を示す。ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）には用量依存的なヒトコラゲナーゼ阻害活性がみられ、ＩＣ５０値は７．３μｇ／ｍｌ（１５．１μＭ）であった。またホウロクタケの８５％エタノール抽出エキスはヒトコラゲナーゼを完全に阻害した。
【００３７】
【表１】
【表２】
（試験例−２）各種キノコエキスのヒトコラゲナーゼ阻害作用
【００４０】
１． 試験物質
Ｆｏｍｉｔｏｐｓｉｓ ｐｉｎｉｃｏｌａ（ツガサルノコシカケ）、Ｆｏｍｉｔｏｐｓｉｓ ｒｏｓｅａ （バライロサルノコシカケ）、Ｆｏｍｉｔｏｐｓｉｓ ｎｉｇｒａ （クロサルノコシカケ）、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｖａｌｅｓｉａｃｕｍ（ツガノマンネンタケ）の子実体を凍結乾燥させ、その２．５ｇを７５ｍｌの８５％エタノールで抽出し、キノコエキスとした。
【００４１】
２．方法
用いたヒトコラゲナーゼおよびヒトコラゲナーゼ阻害活性の測定方法は試験例−１のホウロクタケエキスの場合の方法と同様に行なった。
【００４２】
３．試験結果
表３に結果を示す。検討した４種類のキノコエキスは、いずれもヒトコラゲナーゼを阻害した。
【００４３】
【表３】
（試験例−３）ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）阻害の特異性
【００４５】
１． 試験物質
試験例−１の方法で得たポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）を用いた。
【００４６】
２． バクテリアコラゲナーゼおよびその活性阻害測定法
バクテリアコラゲナーゼとしては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のコラゲナーゼ（シグマ社製，ＴｙｐｅＩ）を用いた。
【００４７】
ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ） ４００μｇ／ｍｌ を２倍ずつ１２．５μｇ／ｍｌ まで測定用緩衝液で希釈し、０．１ 単位（なお１単位は、２５℃で１分間に１μｍｏｌｅの基質を分解する酵素量を示す）のバクテリアコラゲナーゼに対する活性阻害を調べた。バクテリアコラゲナーゼ阻害活性の測定方法は試験例−１のホウロクタケエキスの場合の方法と同様に行なった。同時に ０．４単位のヒトコラゲナーゼに対する活性阻害も調べた。
【００４８】
３．アンジオテンシン変換酵素阻害測定法
（ａ）反応用緩衝液
３０ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）
【００４９】
（ｂ）アンジオテンシン変換酵素液
アンジオテンシン変換酵素（ウサギ由来、シグマ社製）を６０ｍＭＮａＣｌを含む１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）に０．１５ミリ単位／ｍｌになるように溶解した。ただし、１単位とは、３７℃、ｐＨ８．３において１分間に基質ヒップリル−ヒスチジル−ロイシンから１μｍｏｌの馬尿酸に分解される量を示す。
【００５０】
（ｃ）アンジオテンシンＩ溶液
アンジオテンシンＩ（ペプチド研究所製）は、１０％アセトニトリル溶液（Ｖ／Ｖ）にて２５ｍｇ／ｍｌに溶解後、蒸留水にて１．２ｍｇ／ｍｌに希釈した。
【００５１】
（ｄ）アンジオテンシン変換酵素阻害活性の測定方法
ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）をジメチルスルフォキシドに４．０ｍｇ／ｍｌとなるよう溶解後、反応用緩衝液で適宜希釈し検体とした。
【００５２】
先ず上記の検体２０μｌとアンジオテンシン変換酵素液２０μｌを混合後、基質アンジオテンシンＩ溶液を２０μｌ添加し、１０分間３７℃で反応させ、０．２％トリフルオロ酢酸（Ｖ／Ｖ）を含む５０％アセトニトリル溶液（Ｖ／Ｖ）を６０μｌ添加し反応を停止した。
【００５３】
上記操作で得られた溶液を、高速液体クロマトグラフィーにて、アンジオテンシンＩＩ量を測定した。
【００５４】
高速液体クロマトグラフィーでのアンジオテンシンＩＩの溶離条件は、流速１ｍｌ、溶離液０．１％トリフルオロ酢酸（Ｖ／Ｖ）を含む２３％アセトニトリル（Ｖ／Ｖ）溶液、カラムＹＭＣ Ａ−３１２（山村化学研究所製、６×１５０ｍｍ）とした。また、アンジオテンシンＩＩ量は、２８０ｎｍでの吸光度で測定した。（この値をＸとする。）
【００５５】
一方、コントロールとして、ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）の代わりに反応用緩衝液のみを２０μｌ添加した群を作り、上記と同様の操作によりアンジオテンシン変換酵素阻害活性を測定した。なお、アンジオテンシン変換酵素反応液でのアンジオテンシンＩＩ量をＹとした。
【００５６】
また、比較例として、ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）の代わりにアンジオテンシン変換酵素阻害薬として知られているカプトプリルを反応用緩衝液にて溶解、希釈して加え、上記と同様の操作によりアンジオテンシン変換酵素阻害活性を測定した。
【００５７】
アンジオテンシン変換酵素の阻害率は、アンジオテンシンＩＩ量から数１により求めた。
【００５８】
【数１】
４．試験結果
表４に結果を示すように、種々の濃度のポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）はヒトコラゲナーゼを濃度依存的に阻害したが、バクテリアコラゲナーゼに対してはいずれの濃度でも阻害作用を示さなかった。
【００６０】
またアンジオテンシン変換酵素阻害率を求めた結果を表５に示す。比較例（カプトプリル１０ｎＭ）は５０％を示したが、比較例と比してポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）は、アンジオテンシン変換酵素を阻害しなかった。
【００６１】
この結果から、ヒトコラゲナーゼに対するポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）の阻害作用は、単なるメタロプロテアーゼに対するキレーターとしての作用ではなく、特異的なものであると考えられる。
【００６２】
【表４】
【表５】
実施例１（練歯磨）
表６に示した処方について常法に従ってポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）（試験例−１の方法で精製した）を０．１重量％含む練歯磨剤を製造した。即ち、水、グリセリン、カラギナン、サッカリン、パラオキシ安息香酸ブチル、クロルヘキシジンジグルコネート、香料、およびポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）の処方量を計量し、混合して粘結剤を膨潤させたのち、第２リン酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウムを加え、更によく混合し脱泡したのち、チューブに充填して練歯磨剤を得た。
【００６５】
【表６】
実施例２（練歯磨）
ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）の代わりにホウロクタケエキス（試験例−１の方法で抽出した）を用い、その添加量を１． ０重量％とする以外は実施例１と同様にして練歯磨剤を得た。
【００６７】
実施例３（トローチ剤）
表７に示した処方について常法に従いポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）（試験例−１の方法で精製した）を０．０５重量％含むトローチ剤を製造した。
【００６８】
【表７】
実施例４（トローチ剤）
ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）の代わりにホウロクタケエキス（試験例−１の方法で抽出した）を用い、その添加量を０． ５重量％とする以外は、実施例３と同様にしてトローチ剤を得た。
【００７０】
実施例５（洗口剤）
表８に示した処方について常法に従いポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）（試験例−１の方法で精製した）０．１重量％含む洗口剤を製造した。
【００７１】
【表８】
実施例６（洗口液）
ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）の代わりにホウロクタケエキス（試験例−１の方法で抽出した）を用い、その添加量を１． ０重量％とする以外は実施例５と同様にして洗口液を得た。
【００７３】
実施例７（チューインガム）
表９に示した処方について常法に従ってホウロクタケエキス（試験例−１の方法で抽出した）を１．０重量％含むチューインガムを製造した。
【００７４】
【表９】
即ち、４０℃に保温した全量のチューインガムベースおよび全量の水飴を、ニーダーに投入して１０分間混練し、粉糖の１／３ 量および全量のブドウ糖を投入して５分間、次いで粉糖の１／３ 量を投入して５分間混練した。次に、ホウロクタケエキスと香料を残りの１／３ 量の粉糖に混合したものを投入し、５分間混練してガムミックスを得た。
【００７６】
実施例８（ヌガー）
表１０に示した処方について常法に従ってホウロクタケエキス（試験例−１の方法で抽出した）を０．２重量％含むヌガーを製造した。
【００７７】
【表１０】
即ち、まず▲１▼を混合し泡立て、▲２▼は１３０℃まで煮詰めた。▲１▼に▲２▼を少しずつ加え、更に泡立て、これに、▲３▼を加え混合しながら冷却盤上に広げ成型してヌガーを得た。
Claims (3)
- ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）を有効成分とすることを特徴とするヒトコラゲナーゼ活性阻害剤。
- ポリポレニックアシッドＣ（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）を含むキノコ由来の抽出エキスまたはその乾燥エキス末を有効成分とすることを特徴とするヒトコラゲナーゼ活性阻害剤。
- キノコが、ホウロクタケ（Ｄａｅｄａｌｅａ ｄｉｃｋｉｎｓｉ）であることを特徴とする請求項２記載のヒトコラゲナーゼ活性阻害剤。
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