CN102018747B - 红芪和红芪多糖在制备改善学习记忆及治疗阿尔茨海默病药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了红芪及红芪多糖在制备治疗老年性痴呆药物中的新用途，本发明中红芪及红芪多糖能保护Aβ_25-35对SH-SY5Y细胞的损伤，增加SH-SY5Y细胞的存活；通过Morris水迷宫实验，显示红芪和红芪多糖能改善快速脑老化小鼠及海马注射Aβ的AD大鼠认知功能障碍；进一步的组织学检测发现，红芪和红芪多糖可以提高快速老化小鼠脑内中枢单胺类神经递质5-HT、5-HIAA、NE、DA的水平。

Description

红芪和红芪多糖在制备改善学习记忆及治疗阿尔茨海默病药物的应用

技术领域：

本发明涉及红芪及红芪多糖在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用，属于中药领域。

技术背景：

“人口老龄化”问题，在21世纪是世界上每一个国家都将面临的巨大挑战。世界现有老人超过6亿(60岁及以上，除注明外下同)，到21世纪的头半个世纪末，即2050年，世界老年人口将明显增加到20％，即每5个人中就有一位是老年人。“老化”，的确是21世纪面临的一项挑战。当前，人口老龄化成为经济社会发展过程中的一个重要人口现象。截止到2006年底，北京市老年人口达到236万人，占全市总人口的14.9％。

阿尔茨海默病(Alzeimer’s disease，AD)是老年人常见的一种神经退行性疾病，俗称老年性痴呆或早老性痴呆。临床特征是进行性认知功能障碍，至疾病后期，患者生活不能自理。目前全球大约有两千多万老年人患有老年痴呆病，严重危害中老年人身心健康，但是给患者及其家属所带来的痛苦和负担要远高于上述两种疾病，成为现代化社会、经济、医学、家庭亟待解决的问题之一。全世界有2400万病患，60岁以上人群的患病率是5.1％，85岁以上者患老年痴呆症的比例是30％。中国目前有5百万患病人口，相关的医护开支每年达1千亿元人民币。目前，人们对于AD的病理特征和临床表现已经有一定了解。发现在AD患者脑内老年斑沉积，神经元纤维缠结和神经元丧失是AD重要的神经病理特征。并且从老年斑中提取出一种主要成分，β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)，同时证明Aβ对神经细胞有毒性作用，可能在AD发病中起重要作用，但对于AD的病因仍无定论。当前研究对于AD的病因和发病机制众说纷纭，无统一认识，同时造成临床上对AD的治疗没有突破性进展。如果人类不能找到有效的治疗方法，25年后全球预计有2200万人患上阿尔茨海默病，到2050年患此疾病的人数将达4500万人，阿尔茨海默病将成为人类社会的流行病。有人称其为21世纪家庭的灾难。这将是十分紧迫的社会和医学问题。也是医学界最棘手的难题。

AD的特征病理产物——构成老年斑核心成分的Aβ和引起神经原纤维缠结的异常磷酸化tau蛋白一直被作为AD研究的重点，并且是目前设计和研发治疗AD相关药物的重要靶点。其中，Aβ对神经细胞的毒性作用在AD发病过程中起着关键性的作用，因此，寻找有效抑制Aβ毒性作用的药物是治疗AD的一个重点研究方向。

中医认为痴呆多属肾阴亏虚、痰瘀阻窍等虚实夹杂之证，治疗时多以滋阴补肾治其本，活血化瘀、豁痰开窍治其标。因此临床多选择滋阴补肾药、活血化瘀药和豁痰开窍药进行组方配伍治疗痴呆，而且具有一定的疗效。然而从现代医药理论的角度来看，这些中药治疗老年性痴呆的作用机理仍不清楚，它们的中医功效用现代医学阐释是否恰当准确，或者还有更丰富的内涵，都需要我们利用现有的医学技术进行验证和探索。这种验证或者探索既丰富了中医理论，也有可能与现代医学碰擦出新的火花，扩大现代医学的认知领域。

活血化瘀药、豁痰开窍药和滋阴补肾药一般用于临床痴呆治疗，也是实验室研究AD治疗的常用中药。红芪是重要的补益抗衰老中药，具有镇痛、抗炎、耐缺氧、免疫调节等作用，其主要提取物红芪多糖在免疫调节方面更是有突出的功效，能明显减少体内的氧自由基、抑制肿瘤生长，并能较好的保护心、肝等重要脏器。

对于红芪及其提取物对大脑作用的研究较少，通过实验我们发现红芪和红芪多糖能明显提高Aβ诱导的SH-SY5Y(人神经母细胞瘤)细胞的存活率；改善快速脑老化小鼠及海马注射Aβ的AD大鼠认知功能障碍，提高快速老化小鼠脑内中枢单胺类神经递质5-HT(五羟色胺)、5-HIAA(5-羟吲哚乙酸)、NE(去甲肾上腺素)、DA(多巴胺)的水平。由于至今仍无红芪和红芪多糖治疗老年性痴呆的报道，因此研究它们保护脑神经细胞，调节脑神经递质分泌，防治老年性痴呆的作用机制极具价值。

发明内容：

本发明目的在于提供红芪在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。

本发明目的在于提供红芪在制备改善学习记忆能力药物中的应用。

本发明目的在于提供红芪多糖在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。

本发明目的在于提供红芪多糖在制备改善学习记忆能力药物中的应用。

本发明提供红芪在制备改善认知功能障碍药物中的应用。

本发明提供红芪在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。

本发明提供红芪在制备保护SH-SY5Y细胞药物中的应用。

本发明提供红芪在制备提高脑内单胺类神经递质含量药物中的应用；所述脑内单胺类神经递质为5-HT、5-HIAA、NE、DA。

本发明提供红芪多糖在制备改善认知功能障碍药物中的应用。

本发明提供红芪多糖在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。

本发明提供红芪多糖在制备保护SH-SY5Y细胞药物中的应用。

本发明提供红芪多糖在制备提高脑内单胺类神经递质含量药物中的应用；所述脑内单胺类神经递质为五羟色胺(5-serotonin，5-HT)、5-羟吲哚乙酸(5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA)、去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)、DA多巴胺(dihydroxyphenyl ethylamine，DA)。

红芪、红芪多糖的上述应用，可以理解为红芪、红芪多糖单独用于改善认知功能障碍、治疗阿尔茨海默病、保护SH-SY5Y细胞、提高脑内单胺类神经递质含量或者是在与其他药物配伍时其发挥上述的作用。

为临床服用方便，上述红芪可以按照中药制剂的一般工艺：如直接粉碎，或者经常规的溶媒提取后浓缩制成提取物，也包括常规溶媒提取后再进一步精制的方法，如过大孔树脂柱。

所述红芪多糖优选如下方法制备：红芪根粉碎，加入10倍量的水，并加入纤维素酶(1％量)，调节pH到5，煎煮两次，每次2小时，过滤，收集滤液。滤液调PH至中性，浓缩至相对密度1.20以上(60℃测定)，加入乙醇，使含醇量达道60％，静置24小时，倾弃上清液，离心收集沉淀，沉淀用乙醇洗涤两次，冷冻干燥，即得。

上述红芪、红芪多糖可以制备成胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液、缓释、速释制剂或注射剂等临床可接受的剂型，为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等。

本发明体外细胞实验部分以SH-SY5Y细胞作为研究的靶细胞，来源于一种神经脊源的恶性胚胎瘤，其形态、生理和生化功能与正常神经细胞相似，可用于神经退行性疾病的体外细胞模型的研究。通过Aβ_25-35诱导SH-SY5Y细胞损伤的老年性痴呆细胞模型被广泛应用于国内外老年性痴呆的研究。

Aβ_25-35是整个Aβ肽链从第25位至第35位氨基酸顺序所组成的一个氨基酸肽段，其序列为：GSNKGAIIGLM。尽管Aβ_25-35存在缺乏与金属结合位点的缺点，但是它具有聚集的特性，并保留了Aβ肽段的毒性作用，它被认为是Aβ的有效部位。

体内整体实验中采用的SAM-P/8小鼠是日本竹田俊男教授通过对AKR/J自然变异小鼠进行近交延代培养得到一种自然快速老化小鼠，该家族诸多品系中的SAM-P/8表现出明显的学习记忆功能减退，处于一种低紧张、低恐怖的痴呆状态，具备AD的许多特征，诸如皮质萎缩、皮质和海马锥体神经细胞数目下降、Aβ样颗粒(β-CIGS)广泛沉着、脑干网状结构大细胞群背侧部出现海绵状变化、星状胶质细胞反应等，是目前国际上公认的研究认知功能障碍、学习记忆能力以及老年痴呆的最佳模型之一。

本发明以国内外公认的实验模型为基础，采用MTT比色法和乳酸脱氢酶(LDH)漏出量为评价指标，证实了红芪和红芪多糖能保护Aβ_25-35对SH-SY5Y细胞的损伤，增加SH-SY5Y细胞的存活；通过Morris水迷宫实验，显示红芪和红芪多糖能改善快速脑老化小鼠及海马注射Aβ的AD大鼠认知功能障碍；进一步的组织学检测发现，红芪和红芪多糖可以提高快速老化小鼠脑内中枢单胺类神经递质5-HT、5-HIAA、NE、DA的水平，这是它们治疗老年痴呆病的作用机制之一。

下述实验用于进一步说明本发明，但是对本发明范围的限制。

实验例1 SH-SY5Y细胞损伤模型的建立

1.材料

1.1细胞来源

人神经母细胞瘤株系SH-SY5Y细胞是由宣武医院神经药理实验室惠赠。

1.2主要试剂

低限基本培养基(MEM)和F-12营养混合物培养基(F12)培养基购于Gibco公司，胎牛血清和青、链霉素购自于PAA公司，非必需氨基酸购自于Hyclone公司，胰蛋白酶、四甲基偶氮唑盐(MTT)购于Amresco公司，Aβ_25-35、十二烷基硫酸钠(SDS)购于Sigma公司，乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒购自南京建成试剂公司，其他试剂皆为国产分析纯。

1.3试验仪器

酶标仪(美国Thermo Labsystems Multiskan MK3型)，倒置相差显微镜(德国Leica DMIRB型)，数码相机(德国Leica DC300型)，紫外分光光度计(日本岛津UV-2450)。

2.方法

2.1培养基的配制

基础培养基：MEM和F12培养基按照公司说明书分别以三蒸水配制而成，用HEPES调整pH值为7.4，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃下保存。

完全培养基的配置：90％基础培养基(MEM和F12的比例为1∶1)，10％胎牛血清，同时还含有0.1％非必需氨基酸和青、链霉素各10万u/L。

2.2Aβ_25-35溶液的配制

用无菌的三蒸水溶解Aβ_25-35，配成1mmol/L浓度的母液，保存于-20℃冰箱。实验时取出融解后，用不含血清和双抗的基础培养基稀释至所需浓度，至CO2培养箱内37℃孵育48h后使用。

2.3SH-SY5Y细胞的培养

SH-SY5Y细胞按照美国模式培养集存库(ATCC)的方法进行培养，即细胞以完全培养基置于37℃，5％CO2培养箱中孵育，2天换液，3-4天传代。

2.4MTT比色测定方法

方法按照文献操作，但略有改动。具体操作为：取对数生长期的SH-SY5Y细胞，使用0.25％的胰酶消化液消化细胞后，用完全培养基将细胞悬液浓度调整至2.5×104个/ml，接种于96孔板内，每孔200ul。置于CO₂培养箱内孵育36h后，更换含一定浓度Aβ_25-35的培养基，继续培养24h，然后吸取并保存细胞培养液以备LDH测定，迅速加入含MTT(终浓度为50μg/ml)的培养基100μl，置CO₂培养箱内孵育4h，加入裂解液(5％异丙醇(v/v)，10％SDS(十二烷基硫酸钠)(m/v)，0.01mol/L HCl)100μl，在CO2培养箱内过夜培养，酶标仪(双波长检测：570-630nm)读取OD值。所收集的数据以细胞的存活率(公式：细胞存活率＝所测细胞的OD值/空白组细胞的OD值×100％)表示。

2.5LDH活性测定方法

取细胞培养液，按照LDH试剂盒的说明进行操作。

2.6统计方法

实验数据以平均值±标准差

表示，采用SPSS13.0软件做统计分析，ANOVA检验进行统计。

3.结果

3.1不同浓度的Aβ_25-35对SH-SY5Y细胞影响的形态观察

光镜下可见随Aβ_25-35浓度的增加SH-SY5Y细胞活力降低，胞浆混浊，细胞突起明显减少。Aβ_25-35浓度达到40μmol/L时大部分细胞萎缩坏死，细胞贴壁不充分，有脱落(见附图1)。

3.2不同浓度的Aβ_25-35对SH-SY5Y细胞影响的活性检测

选取不同浓度的Aβ_25-35作用于SH-SY5Y细胞，通过MTT比色法检测SH-SY5Y细胞的存活率，选择较为合适者作为老年性痴呆细胞模型的Aβ_25-35浓度(附图2、表1)。SH-SY5Y细胞的存活率随着Aβ_25-35的浓度增高而呈下降趋势。同时，测定经处理后的细胞外液的LDH含量，发现LDH的漏出量也随着Aβ_25-35的浓度增高而上升，说明了细胞的受损程度在加重(附图3)。

表1  不同浓度Aβ_25-35对SH-SY5Y细胞活性的影响

注：与Aβ浓度0μmol/L组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.0

实验例2 红芪和红芪多糖对Aβ致SH-SY5Y细胞损伤模型的影响

1.材料

1.1细胞来源

同实验例1。

1.2药品与试剂

红芪和红芪多糖由兰州大学中西医结合研究所提供。

1.3试验仪器

同实验例1。

2.方法

2.1药物溶液的配制

红芪水煎液的制备步骤：

称取300g红芪饮片，加蒸馏水至800ml，浸泡3小时，微火煮沸30min，提取滤液后再将残渣加水至800ml，微火煮沸30min，合并两次滤液，蒸馏浓缩至200ml，制成667g/ml的红芪水煎剂，过滤除菌，4℃冰箱贮存。

红芪粗多糖的提取及纯化：

取红芪饮片4000g，粉碎后，加入20L的蒸馏水，68℃共浸提3h，合并过滤液，置旋转蒸发器于45℃浓缩至过滤液原体积的30％，将浓缩液3000r/min离心15min，取上清液，加入2倍体积的95％乙醇沉淀粗多糖，收集沉淀，加入适量蒸馏水，充分复溶，透析，Sevag法按5∶1的氯仿—正丁醇溶液脱去蛋白质，离心去蛋白质沉淀，重复8次，上清液用蒸馏水透析48h，除去小分子杂质及色素，透析后浓缩至适当体积，加乙醇，醇析多糖，水溶解后再醇析，重复3次，至280nm紫外检测无明显蛋白吸收峰，再以2倍体积的95％乙醇沉淀多糖，最后经无水乙醇脱水，丙酮，乙醚洗涤，干燥，得淡黄色红芪粗多糖193g，得率为4.8％。

将红芪粗多糖充分复溶于蒸馏水中，先后加入95％乙醇至乙醇终浓度分别为40％，60％，80％，分别在4℃件下静置4h，3000r/min离心15min，收集沉淀，乙醇终浓度为40％时无沉淀，60％时沉淀较多，80％时有少量沉淀，沉淀均为白色粉末。将60％乙醇分离所得的沉淀以无水乙醇，丙酮，乙醚相继洗涤，室温干燥。精密称取1.0g红芪粗粗多糖溶解双蒸水中，过sephadexG-200层析柱，上样量5mL，0.05mol/L NaCl洗脱，自动分部收集，5ml/管，苯酚一硫酸法检测，经sephadexG200层析纯化得一主峰，将主峰收集液装入透析袋，以双蒸水透析72h，每6h换水一次，透析液经冷冻干燥，得纯化的白色红芪多糖。经测定其纯度为94.4％。

2.2分组及给药

分为空白组、模型组、红芪、红芪多糖低、中、高浓度组。(红芪和红芪多糖以PBS倍比稀释配制成不同浓度，红芪水煎液浓度以生药量来计算分别为5mg/L、50mg/L、500mg/L；红芪多糖为1μg/L、10μg/L、100μg/L)

2.3MTT比色的测定方法

方法同实验例1。

2.4细胞培养液LDH漏出量的测定

方法同实验例1。

2.5统计方法

实验数据以平均值±标准差

表示，采用SPSS13.0软件做统计分析，ANOVA检验进行统计。

3.结果

由表2的结果可知，三个浓度的红芪和红芪多糖与受损的SH-SY5Y细胞共孵育后，SH-SY5Y细胞的存活率增加，细胞外液LDH的含量减少，证明红芪和红芪多糖具有保护受损SH-SY5Y细胞的作用。

表2 红芪和红芪多糖对经Aβ_25-35处理的SH-SY5Y细胞活性的影响

分组               n    MTT细胞存活率(％)    LDH漏出量(U/L)

空白               6    -                    120.56±3.77^**

模型               6    76.83±0.61          417.88±6.22

红芪：5mg/L        6    81.42±1.83^*         374.32±6.48^*

50mg/L             6    83.28±1.35^**        355.78±12.04^**

500mg/L            6    88.54±1.03^**        312.16±8.56^**

红芪多糖：1μg/L   6    85.38±1.04^**        306.93±3.84^**

10μg/L            6    89.60±1.65^**        350.17±8.94^**

100μg/L           6    95.73±1.73^**        285.28±11.16^**

注：与模型组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01

实验例3 红芪和红芪多糖干预快速脑老化鼠认知功能障碍的实验研究

1.材料

1.1研究对象

健康的SAMR1老化鼠15只，SAMP8 8月龄老化鼠45只，雌雄各半。

1.2药品

红芪和红芪多糖由兰州大学中西医结合研究所提供，红芪多糖纯度大于90％(提取方法同前实验例2)，安理申在天津中医药大学第一附属医院购买。

1.3试验仪器及设备

Morris水迷宫(Morris water maze)的组成：水迷宫由圆形水池、平台和记录系统三部分组成。水池直径90cm，高50cm，随意将水池分为四个象限(东北、东南、西南和西北象限)。每天实验开始，水池注水30cm深，并加入1斤奶粉，使水成不透明乳白色，水温保持在24℃±1℃左右。水池四周存在丰富的空间参照物(门、灯、桌椅、摄像头及实验者等)，且位置保持不变，以供小鼠定位平台。圆柱形平台直径9cm，高28cm，置于任一象限中央，平面没于水面下2cm。一摄像头置于水池中央的上方约2m处，自动采集动物游泳图像，所收集信号直接输入计算机，由图像自动采集和分析系统(中国医学科学院药物研究所提供)自动分析和处理，包括动物的逃避潜伏期、游泳路径、不同象限的停留时间、初始角度及游泳路线的长度、搜索策略及中、外环游泳距离百分比等参数。

2.方法

2.1动物分组

小鼠随机分为生理盐水组、模型组、红芪治疗组、红芪多糖治疗组及安理申治疗组，每组15只，雌雄各半。红芪、红芪多糖和安理申配置成1g/ml的浓度。红芪按、红芪多糖、安理申的给药剂量分别为3.33g/kg、1g/kg、0.05g/kg；模型组及空白对照组给与等体积的双蒸水，均每日一次。八周后进行行为学测试。

2.2行为学测试

2.1.1隐蔽平台试验(Hidden Platform Trial)

试验前1d，让动物在不含平台的水池中自由游泳90s，上午、下午各一次，使其熟悉迷宫环境。试验时平台位置固定不变，置于东北象限中央，平台中点离池壁22.5cm。在平台对侧选两个与之距离相等的点作为入水点，训练时将动物面朝池壁轻轻放入水中，记录小鼠从入水至找到平台的游泳路线的长度及找到平台的时间(逃避潜伏期，escape latency)，然后让小鼠在平台上停留10s。如果90s内找不到平台，潜伏期记为90s，并将小鼠置于平台上休息10s。每天在2个入水点各训练1次，以两次潜伏期的算术均值作为这一天的成绩进行统计分析。所有实验小鼠均进行隐蔽平台试验5d，反向试验3d及可视平台试验1d，以评价不同治疗组学习记忆能力的变化。

2.1.2反向试验(Reversal Trial)

操作基本同隐蔽平台试验，只是将平台位置移至对面象限(西南象限的中央，平台中点离池壁22.5cm)。

2.1.3可视平台试验(Visible Platform Trial)

为排除感觉、视觉或运动功能障碍对空间学习记忆的影响，最后1d进行可视平台试验。让平台位置露出水面2cm，并帖上黄色胶带，其余操作同隐蔽平台试验。

2.3数据处理

所有数据用均数±标准差

表示，并用SPSS10.0统计软件处理。隐蔽平台试验及反向试验中所获得的数据采用重复测量数据的双因素方差分析(two-way ANOVA with repeated measures)，以组别作为组间因素，不同的训练天数作为组内因素。在探索试验及可视平台试验中样本间比较用单因素方差分析(one-way ANOVE)。检验水准定为P＜0.05为差异有显著性。

3.结果

由表3可以看出：隐蔽平台实验和反向实验红芪多糖治疗组，红芪和红芪多糖治疗组，阳性对照药安理申治疗组在训练第三天学习成绩稳步提高，与模型组比较有显著性差异。可视平台试验；同月龄SAMP8和SAMR1以及各治疗组逃避潜伏期的比较均无显著性差异。提示动物在感觉、视觉或运动功能方面的差异未对其空间学习记忆产生明显的影响。

表3  Morris水迷宫实验结果

注：与模型组比较 ^*P＜0.05，^**P＜0.01

实验例4：红芪和红芪多糖对海马注射Aβ致AD大鼠认知功能障碍的影响

1.材料

1.1实验动物

二级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠50只(鼠龄8～10月，体重380～400g)，由北京维通利华实验动物中心提供。

1.2药品及试剂

红芪和红芪多糖由兰州大学中西医结合研究所提供，红芪多糖纯度大于90％(提取方法同实验例2)，安理申在天津中医药大学第一附属医院购买，Aβ_1-42购自SIGMA公司。

2.方法

2.1动物分组

大鼠置于SPF环境(Specific pathogen free)即屏障系统(barriersystem)中饲养。实验过程中动物自由摄食和饮水(术前禁食除外)，室温20℃～22℃，相对湿度为60％～70％，光照周期为12h(7:00～19:00光照；19:00～7:00黑暗)。SD大鼠适养一周后随机分为生理盐水组、模型组、红芪治疗组、红芪多糖治疗组和安理申治疗组，每组10只，雌雄各半。于造模后3天开始给药。红芪、红芪多糖和安理申配置成1g/ml的浓度。红芪按、红芪多糖、安理申的给药剂量分别为3.33g/kg、1g/kg、0.03g/kg；模型组及空白对照组给与等体积的双蒸水，均每日一次。八周后进行行为学测试。

2.2动物造模方法

根据文献选择Aβ海马注射大鼠模型。用跳台实验筛选学习记忆功能正常大鼠入选实验。Aβ_1-42用二甲基亚枫溶解后在37℃恒温箱中孵育7天(二甲基亚砜不超过5％)后备用。

模型制备：用10％水合氯醛按0.35ml/kg的剂量进行腹腔麻醉，脑立体定位仪固定，平颅头位，按大鼠脑定位图谱，于前囱后3.0mm，中线右侧2.0mm处，用牙科钻钻开颅骨，暴露硬脑膜，微量注射器自脑表面垂直进针2.8mm，选择大鼠右侧海马缓慢注入2μlAβ_1-42(10μg/μl，溶于生理盐水中)，每侧注射时间为5min，留针5min，缓慢起针，局部消毒后缝合皮肤，肌注青霉素预防感染。假手术组注射等体积的生理盐水(含与模型组等比例的二甲基亚枫)。

2.3行为学观察

采用Morris水迷宫测试大鼠的学习、记忆能力。具体方法同实验例3。

3.结果

双侧海马CA1区注射Aβ_1-406周后，模型组大鼠在Morris水迷宫中的游泳持续时间、游泳路径长度延长，与假手术组比较均有显著差异(P＜0.05)，搜索策略多为边缘式或随机式。给药6周后，与模型组比较，红芪组、红芪多糖组、安理申治疗组大鼠游泳持续时间、游泳路径长度均显著缩短(P＜0.05)，搜索策略多为趋向式。结果见表4、5。

表4  各组大鼠造模治疗6周后Morris水迷宫隐平台试验中的平均潜伏期(s)

注：与假手术组比较^#表示P＜0.05，^##表示P＜0.01；与模型组比较，^*表示P＜0.05，^**表示P＜0.01

表5  各组大鼠造模6周后Morris水迷宫反转试验中的平均潜伏期(s)

注：与模型组比较，^*表示P＜0.05，^**表示P＜0.01

实验例5 红芪和红芪多糖对快速老化鼠脑内中枢单胺类神经递质的影响

1.材料

1.1仪器与器材

582型二元泵、ACH-3(5μm，150mm×3mm ID)层析柱、柱前固定化酶反应器、柱后固定化酶反应器、542型自动进样器、CH150型柱温箱、库伦阵列II 5600A型电化学检测器、5040型固态微孔电级(铂电极、固态钯电极)：ESA公司，美国。

超纯水净化系统：Purelab Plus公司，美国。

超速低温离心机：55P-72型，日立公司，日本。

-80℃冰箱：VXE380型，Jouan公司，法国。

针筒式微孔滤膜过滤器：水系(0.2μm)、有机系(0.45μm)，天津市腾达过滤器厂。

1.2药品与试剂

氯化ACh、NE、DA、2，4-二羟基乙酸(dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC)、5-HT、5-羟吲哚乙酸(5-hydroxyindole acetic acid，5-HIAA)、高香草酸(homovanillic acid，HVA)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、四甲基氯化铵(tetramethylammonium chloride，TMACl)、辛基磺酸钠(octanesulfonicacid sodium salt，OSA)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、柠檬酸、硫代硫酸钠(Na2S2O5)、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetracetate，EDTA)、Aβ_1-40(HPLC级)：Sigma公司，美国。磷酸(85％)、高氯酸、乙腈(HPLC级)：FisherScientific公司，美国。“MB”试剂：ESA公司，美国。

2.方法

2.1标本制备

将实验四行为学测试完成后的快速脑老化鼠断头处死，冰台上迅速取出全脑，称重，液氮快速冷冻，-80℃保存。提取时全脑置冰冷的0.1mol/L高氯酸中匀浆20s(每0.1g脑重加入高氯酸1mL)。高氯酸中含0.04％(w/v)Na2S2O5和0.04％(w/v)EDTA。脑匀浆于4℃离心(14000×g)20min。上清液以0.2μm滤膜滤过、分装，-80℃冷藏，用于单胺类递质及其代谢产物检测。

2.2检测方法

2.2.1流动相

NaH₂PO₄：90mmol/L；柠檬酸：50mmol/L；OSA：1.7mmol/L；乙腈：10％；EDTA：100μmol/L。

NaH₂PO₄、柠檬酸及OSA经0.2μm水系膜过滤后，加入经0.45μm有机系膜过滤的乙腈，加入EDTA，重蒸去离子水定容。

2.2.2色谱条件

二元泵体系：ESA 582型；色谱柱：C18，150×4.6mm，5μm；进样量：10μL；流速：0.6mL/min；柱温：室温。

2.2.3检测条件

检测器：5600A型电化学检测器；电极：M5040型分析电极；电势：-150、+450、+500、+550mV。

2.2.4外标的制备

称取NE、DOPAC、DA、5-HIAA、HVA、5-HT各10mg溶于100mL0.1M的HClO4中作为储备液(100μg/mL)，分装，存于-80℃冰箱中。取储备液(100μg/mL)1mL，定容至10mL，浓度为10μg/mL。取稀释液0.5、0.4、0.3、0.2、0.1mL，分别加入0.1M HClO4至10mL，配成500、400、300、200、100ng/mL的混合标准液。

3.结果

从表6可以看出，与SAMP8模型组相比，红芪和红芪多糖药物组小鼠脑中海马5-HT、5-HIAA、NE、DA含量的明显升高，均达到统计学水平。

表6  各组小鼠脑中海马5-HT、5-HIAA、NE、DA的变化(mmol/L，

)

注：与假手术组比较^#表示P＜0.05，^##表示P＜0.01；与模型组比较，^*表示P＜0.05，^**表示P＜0.01

附图说明

附图1：倒置相差显微镜观察SH-SY5Y细胞经不同浓度Aβ_25-35诱导后的形态变化(×100)，其中A、B、C、D分别是空白对照组、Aβ_25-352.5μmol/L组、10μmol/L组、40μmol/L组

附图2：MTT比色法检测不同浓度Aβ_25-35对SH-SY5Y细胞活性的影响，与空白对照组相比，*P＜0.05；每组n＝3

附图3：LDH细胞外液评价不同浓度Aβ_25-35对SH-SY5Y细胞活性的影响，与空白对照组相比，**P＜0.01；每组n＝3

具体实施方式

实施例1：胶囊剂

红芪3340g，粉碎成细粉，过筛，制成胶囊。用于改善认知功能障碍、治疗阿尔茨海默病、提高脑内单胺类神经递质含量。

实施例2：胶囊剂

取红芪多糖33g，加辅料适量，制成胶囊。

实施例3片剂

红芪根粉碎，加入10倍量的水，并加入纤维素酶(1％量)，调节pH到5，煎煮两次，每次2小时，过滤，收集滤液。滤液调PH至中性，浓缩至相对密度1.20以上(60℃测定)，加入乙醇，使含醇量达道60％，静置24小时。顷弃上清液，离心收集沉淀，沉淀用乙醇洗涤两次，冷冻干燥，粉碎成细粉，加辅料适量，制成颗粒，干燥，压制成片，包糖衣，即得。用于改善认知功能障碍、治疗阿尔茨海默病、提高脑内单胺类神经递质含量。

实施例4：缓释制剂

取红芪多糖75g  十八烷醇50g  卡波姆75g  微晶纤维素25g

红芪多糖的制备：红芪根粉碎，加入10倍量的水，并加入纤维素酶(1％量)，调节pH到5，煎煮两次，每次2小时，过滤，收集滤液。滤液调PH至中性，浓缩至相对密度1.20以上(60℃测定)，加入乙醇，使含醇量达道60％，静置24小时。顷弃上清液，离心收集沉淀，沉淀用乙醇洗涤两次，冷冻干燥，

将十八烷醇加热融化，加入红芪多糖、微晶纤维素等辅料，冷却后研磨粉碎过40目筛，加入卡波姆混匀，直接压片制1000片。口服，一次二片，一日二次。

Claims (5)

1.红芪多糖或包含红芪多糖的药物组合物在制备改善认知功能障碍药物中的应用。

2.红芪多糖或包含红芪多糖的药物组合物在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。

3.红芪多糖或包含红芪多糖的药物组合物在制备治疗阿尔茨海默病中保护SH-SY5Y细胞药物中的应用。

4.红芪多糖或包含红芪多糖的药物组合物在制备治疗阿尔茨海默病中提高脑内单胺类神经递质含量药物中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其中脑内单胺类神经递质为5-HT、5-HIAA、NE、DA。

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