CN105399850A - 一种玉米苞叶多糖的制备方法及其产品和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种玉米苞叶多糖的制备方法,包括多糖的提取，多糖的提取步骤为：玉米苞叶清洗、烘干、粉碎，以料液比1:10~50加入水，在提取温度50℃～80℃条件下回流提取，提取时间1~2h，真空抽滤，减压浓缩，浓缩液用50℅~90℅乙醇沉淀，静置8~14h，离心，沉淀以无水乙醇洗涤，真空干燥得玉米苞叶粗多糖。本发明所制备的多糖具有良好的抗氧化性能，在制备抗氧化的保健食品和功能性化妆品中应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种玉米苞叶多糖的制备方法及其产品和应用，利用该方法制备的玉米苞叶多糖具有抗氧化功效。
背景技术
玉米为一年生禾本科植物，是我国总产量最高的粮食作物之一，种植面积约有3亿亩。玉米苞叶为玉米的外苞叶，每公顷玉米可采集600kg苞叶，资源非常丰富，是常见的农业副产物。在农村玉米苞叶主要应用于燃料、饲料等方面，其功能因子并未得到充分开发，造成大量浪费，综合利用水平偏低。
多糖是一类由单糖通过糖苷键链接而成的大分子有机化合物，广泛存在于植物、微生物及动物体内，在生命体生长、发育过程中扮演着重要角色。很多植物来源的天然多糖具有广泛的药理作用。
目前，关于玉米苞叶多糖的制备及其抗氧化活性评价未见报道，对其进行研究、开发具有较大现实意义，有利于提高农业副产物综合利用水平，促进循环农业发展，为新型天然抗氧化剂的开发提供实验数据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种玉米苞叶多糖的制备方法其产品。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种玉米苞叶多糖的制备方法,包括多糖的提取，多糖的提取步骤为：玉米苞叶清洗、烘干、粉碎，以料液比1:10~50加入水，在提取温度50℃～80℃条件下回流提取，提取时间1~2h，真空抽滤，减压浓缩，浓缩液用50%~90%乙醇沉淀，静置8~14h，离心，沉淀以无水乙醇洗涤，真空干燥得玉米苞叶粗多糖。
进一步的，所述制备方法还包括多糖的纯化，多糖的纯化通过对玉米苞叶粗多糖脱蛋白和透析后得玉米苞叶精多糖，脱蛋白的具体步骤为：将提取所得的玉米苞叶粗多糖配成1%~1.5%的水溶液加入等体积的23%~25%的三氯乙酸水溶液于0~4℃静置10~14h，离心除去沉淀，上清液调至中性得多糖溶液。
进一步的，所述透析的具体步骤为：脱蛋白后的多糖溶液装入透析袋用蒸馏水透析，透析液（多糖溶液）与蒸馏水体积比为1:50，透析时间6~8h，温度28~32℃，透析后的多糖溶液浓缩干燥得玉米苞叶精多糖。
进一步的，提取时间为2.0h、提取温度83℃、料液比1:17、浓缩液用63℅乙醇沉淀。
进一步的，所述玉米苞叶粉碎后过40目筛。
一种使用所述制备方法制备的多糖。
一种使用所述多糖制备的口服液，所述多糖过40目筛，按照质量比1:1比例喷入80%乙醇并搅拌混匀，过20目筛制粒；鼓风干燥箱中60℃干燥45min，再过20目筛整粒，于相对湿度低于75%的环境中装填于空胶囊中。
一种使用所述多糖制备的口服液，取所述多糖按质量比1:50溶于纯化水中，依次加入多糖质量1%的三氯蔗糖、5%的尼泊金乙酯，与50~60℃下混合搅拌均匀，过滤后，高温瞬时灭菌，罐装。
一种使用所述多糖制备的凝胶剂，取所述多糖按质量比1:500溶于纯化水中，依次加入纯化水质量0.6%的卡波姆、5%的甘油、0.5%的三乙醇胺、0.1%的吡咯烷酮、0.05%的EDTA-2Na，混合搅拌均匀。
所述多糖在制备抗氧化的保健食品和功能性化妆品中的应用。
本发明的有益效果是：
1）对玉米副产物的功能因子进行开发，有利于提高玉米产业附加值，促进循环农业发展。
2）应用响应面法对经典多糖提取方法进行优化，减少能耗，操作简便，降低成本，产业化潜力较大。
3）本发明提取的玉米苞叶粗多糖具有很强的抗氧化性，故可直接以粗多糖为活性成分用于保健食品或功能性化妆品的配制，缩短操作步骤，降低工业成本。
下面结合附图及具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1提取时间对多糖提取率的影响；
图2提取温度对多糖提取率的影响；
图3料液比对多糖提取率的影响；
图4醇沉浓度对多糖提取率的影响；
图5提取时间和温度对多糖提取率影响的响应面和等高线图；
图6提取时间和液料比对多糖提取率影响的响应面和等高线图；
图7提取时间和醇沉浓度对多糖提取率影响的响应面和等高线图；
图8提取温度和液料比对多糖提取率影响的响应面和等高线图；
图9提取温度和醇沉浓度对多糖提取率影响的响应面和等高线图；
图10料液比和醇沉浓度对多糖提取率影响的响应面和等高线图。
具体实施方式
实施例1
一种玉米苞叶多糖的制备方法,包括多糖的提取，多糖的提取步骤为：玉米苞叶清洗、烘干、粉碎，过40目筛，以料液比1:10~50加入水，在提取温度50℃～80℃条件下回流提取，提取时间1~2h，真空抽滤，减压浓缩，浓缩液用50℅~90℅乙醇沉淀，静置8~14h，离心，沉香用无水乙醇洗涤，真空干燥得玉米苞叶粗多糖。优选的提取条件为：提取时间为2.0h、提取温度83℃、料液比1:17、浓缩液用63℅乙醇沉淀。
玉米苞叶粗多糖的定性检测：
α-萘酚实验：试液与浓硫酸交界面出现紫红色环，呈阳性反应。
菲林试验：析出暗红色结晶性粉末状沉淀，呈阳性反应。
证明为糖类物质。
玉米苞叶粗多糖的含量测定：
多糖含量测定：以萄葡糖为对照品，采用苯酚-硫酸法测定，结果表明，玉米苞叶粗多糖中多糖含量为25.08%。
玉米苞叶多糖提取优化工艺的确定：
1）单因素实验设计
单因素实验设定因素为提取时间、提取温度、料液比、醇沉浓度，分别考察4个因素对多糖得率的影响。固定提取温度80℃、料液比1:30、醇沉浓度80%，提取时间0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h；固定提取时间1.5h、料液比1:30、醇沉浓度80%，温度50、60、70、80、90℃；固定提取时间1.5h、提取温度80℃、醇沉浓度80%，料液比1:10、1:20、1:30、1:40、1:50(g/mL)；固定提取时间1.5h、提取温度80℃、料液比1:30；醇沉浓度50、60、70、80、90%。结果表明，随提取时间延长，多糖得率不断增加，当时间达到2.0h时开始呈现下降趋势，2.0h时多糖提取率达到最高。表明，回流时间过长，可能会破坏多糖结构，提取时间在2.0h为宜（图1）。
50～80℃范围内，随温度升高，多糖提取率也在增加。超过80℃后，随温度升高提取率降低，故提取温度以80℃为宜（图2）。
当液料比（mL/g）在20:1时，提取率最高。此后，随溶剂量增加，多糖得率下降，可能与溶剂过多，分子间碰撞几率小有关系（图3）。
醇沉浓度在60%时提取率增幅最大，提取率也最大。高浓度的乙醇醇沉时，提取率变化幅度不大。因此，醇沉醇沉浓度选为60%（图4）。
2）响应面实验设计
根据BOX-BehnkenDesign(BBD)实验设计原理，综合单因素实验结果，选取提取时间、提取温度、料液比、醇沉浓度作为考察因素。在单因素试验的基础上采用四因素三水平的响应面分析方法进行实验设计（表1）。
结果表明，共29个实验点，其中24个为析因点，5个为零点，析因点为自变量取值在X1、X2、X3、X4所构成的三维顶点；零点为区域的中心点，其中零点试验重复5次，用以估计实验误差（表2）。
利用Design-ExpertV8.0.6.1软件对表2实验数据进行多元回归拟合，得到玉米苞叶多糖对提取时间（X1）、提取温度（X2）、液料比（X3）、醇沉浓度（X4）的二次多项回归模型为：
Y=0.56+0.0095X1+0.064X2-0.026X3+0.066X4+0.043X1X2+0.026X1X3-0.00275X1X4-0.055X2X3+0.00375X2X4-0.00875X3X4-0.13X1 2-0.13X2 2-0.08X3 2-0.13X4 2
对该模型进行显著性检验和回归模型系数显著性检验（表3）。
由表3中的二次回归模型的方差分析结果可知，该模型能很好的解释数据的变异性。一次项、平方项对多糖提取率的影响均极显著，提取时间和温度、提取时间和液料比的交互作用极显著，提取温度和液料比的交互作用达到显著水平，提取时间和醇沉浓度、提取温度和醇沉浓度、液料比和醇沉浓度的交互作用不显著。
模型的调整确定系数R2 adj=0.9829，表明该模型能解释98.29%试验数据的变异性。因而该模型拟合程度良好，实验误差效小，适合对玉米苞叶多糖提取率进行分析和预测。从模型的失拟项方差分析可以看出，失拟项不显著（P>0.05），表明该模型是稳定的，能很好地预测实际玉米苞叶多糖提取率的变化。
响应面分析的图形是特定的响应值对应自变量构成的一个三维空间图，可以直观地反映出各自变量对响应值的影响。根据回归模型作出相应的响应曲面和等高线图，见图5～10。
当液料比为20（mL/g）、醇沉浓度为60%时，提取时间和提取温度对多糖提取率的影响见图5。在1.5～2.5h范围内多糖提取率先变大后减小。在温度为70～90℃的范围内，提取率不断增加，之后随着提取时间的延长，多糖提取率有下降的趋势，表明提取时间和温度对提取率的交互作用显著。
当提取温度为80℃、醇沉浓度为60%时，提取时间和液料比对多糖提取率的影响见图6。当液料比一定时，随时间增加多糖提取率呈现先增加后降低的趋势。时间1.5～2.5h范围内，随液料比增加多糖的提取率先上升后下降，对多糖的提取率影响显著。
由图7可知当时间一定时，多糖提取率随醇沉浓度的变化先增加后下降，上升时增幅较大，达到最大值后缓慢下降，与单因素试验吻合。时间对提取率影响的变化趋势平缓，表明提取时间和醇沉浓度的交互作用不显著。
在提取时间为2.0h、醇沉浓度为60%时，提取温度和液料比对多糖提取率的影响见图8。从图8中可以看出，提取温度对多糖的提取率影响较大，而且响应面显示坡度较陡，表明提取温度和液料比的交互作用极显著。
当提取时间为2.0h、液料比为20（mL/g）时，提取温度和醇沉浓度对多糖提取率的影响结果见图9，由图9可知响应面坡度比较平缓，说明其交互作用不显著。
当提取时间为2.0h、提取温度为80℃时，液料比和醇沉浓度对多糖提取率的影响见图10。液料比一定时，醇沉浓度较低时多糖提取率较小，醇沉效果不明显，同时，低浓度乙醇增加液料比时多糖提取率变化平缓，交互作用不显著。
通过软件分析，得到苞叶多糖提取的最佳条件为：提取时间2.03h、提取温度83.16℃、液料比17.22:1、醇沉浓度62.79%。在此条件下，多糖提取率理论值为0.579%。为检验响应曲面法所得结果的可靠性，采用上述优化提取条件进行玉米苞叶多糖提取，考虑到实际操作的便利，将提取工艺参数修正为：提取时间为2.0h、提取温度83℃、液料比1:17、醇沉浓度63%。实际测得的平均提取率为0.552%，与理论预测相比，其相对误差约为4.7%，因此，基于响应曲面法所得的优化提取工艺参数准确可靠，具有实用价值。
最优提取条件下玉米苞叶粗多糖的抗氧化作用测定
1）总还原力
依次在10mL试管中加入系列浓度（0.2mg/mL、0.8mg/mL、1.4mg/mL、2.0mg/mL、2.6mg/mL）的玉米苞叶粗多糖样品溶液1.0mL，磷酸盐缓冲溶液（0.2mol/L，pH=6.6）2.5mL和1%铁氰化钾2.5mL，置于50℃水浴中反应20min，然后加入10%的三氯乙酸（TCA）2.5mL，混匀后以3000r/min离心10min，取上清液2.5mL，加入0.1%三氯化铁溶液0.5mL和2.5mL的蒸馏水，摇匀后在700nm处测定吸光值。
结果表明，粗多糖具有一定的还原能力，其还原力随样品浓度增大而增大，且呈量效关系。0.2mg/mL时，粗多糖在700nm处的吸光度为0.24。
2）清除羟基自由基
在10mL试管中加入8.8mmol/LH2O2、9mmol/LFeSO4、9mmol/L水杨酸和系列浓度（1.2mg/mL、2.4mg/mL、3.6mg/mL、4.8mg/mL、6.0mg/mL）的玉米苞叶粗多糖溶液，其体积都为1mL。以蒸馏水为参比，最后加H2O2启动反应，37℃反应30min。在510nm处测量反应体系的吸光度Ax。将粗多糖换成水，测定模型对照组的吸光度A0。考虑到多糖本身的吸光度值、以等体积的9mmol/LFeSO4、9mmol/L水杨酸-乙醇、不同浓度的多糖溶液和蒸馏水的混合物做为多糖的本底吸收值Ax0。
玉米苞叶多糖具有较强的清除羟基自由基的能力，且随浓度增加，呈良好量效关系。经线性拟合计算出粗多糖的IC50为：1.424mg/mL。
3）清除DPPH自由基
取系列浓度（0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.2mg/mL、1.6mg/mL、2.0mg/mL）的玉米苞叶粗多糖溶液2mL，加入等体积的浓度为0.1mmoL/L的DPPH无水乙醇溶液，混匀后室温下避光反应30min，在517nm下测定吸光度Ai；并以2mL无水乙醇和2mL蒸馏水作为空白调零。空白对照组为2mL样品液，加上2mL无水乙醇，在517nm处的吸光值为Aj。模型对照组为2mLDPPH溶液加上2mL无水乙醇，其在517nm处的吸光值为A0。
玉米苞叶多糖具有较强的清除DPPH自由基的能力，且随浓度增加，呈良好量效关系。经线性拟合计算出粗多糖的IC50为：1.162mg/mL。
实施例2
对实施例1提取得到的玉米苞叶粗多糖进行纯化。
通过对玉米苞叶粗多糖的脱蛋白和透析步骤后得玉米苞叶精多糖。本实施例的具体操作如下：
脱蛋白：称取10.0g粗多糖，配成1.25%的溶液。将多糖进行分批脱蛋白：量取一定体积的多糖溶液，加入等体积的24%的三氯乙酸于4℃冰箱静置12h，离心除去沉淀，上清液用氢氧化钠溶液调至中性，取样测多糖及蛋白质的含量，脱蛋白后的多糖剩余率及蛋白质去除率计算公式如下：
多糖的剩余率（%）=脱蛋白后多糖质量/脱蛋白前多糖质量×100%
蛋白去除率（%）=(脱蛋白前蛋白质量-脱蛋白后蛋白质量)/脱蛋白前蛋白质量×100%
透析：对脱蛋白后的粗多糖进行分批透析：先取20mL多糖溶液装入透析袋用蒸馏水透析。最佳透析条件为透析液与缓冲液体积比为1:50，透析时间6h，温度30℃，更换缓冲液次数为5次。透析完后体积由20mL变为30mL。取1mL用蒸馏水定容至10mL，用苯酚-硫酸法测定多糖吸光度A值，将分批透析完的多糖溶液浓缩、干燥，称重。
结果表明，玉米苞叶粗多糖经三氯乙酸脱蛋白、透析后，多糖含量达到55.48%。
实施例3
实施例1或2所得的玉米苞叶多糖可用于制备抗氧化的保健食品和功能性化妆品，起到很好的抗氧化化作用。其中未经纯化的粗多糖已经达到很好的抗氧化活性可直接用于制备保健食品和化妆品的原料，操作步骤简便，成本低，具有开发为工业产品的广阔前景。
本实施例中制备一种玉米苞叶多糖胶囊，取实施例1中制备玉米苞叶粗多糖2g，过40目筛，然后按照1:1比例喷入80%乙醇并搅拌混合均匀，过20目筛制粒。鼓风干燥箱中60℃干燥45min，再过20目筛整粒，于相对湿度低于75%的环境中装填于3号空胶囊中，每粒平均装量为110mg。
实施例4
本实施例中制备一种玉米苞叶多糖口服液，取实施例1或2中制备的玉米苞叶多糖10g，溶于500mL纯化水中，依次加入0.1g三氯蔗糖、0.5g尼泊金乙酯，与50~60℃下混合搅拌均匀，过滤后，高温瞬时灭菌，罐装。
实施例5
本实施例中制备一种玉米苞叶多糖凝胶剂，取实施例1或2中制备的玉米苞叶多糖0.2g溶于100mL纯化水中，依次加入0.6g卡波姆、5.0g甘油、0.5g三乙醇胺、0.1g吡咯烷酮、0.05gEDTA-2Na，混合搅拌均匀。
Claims (10)
1.一种玉米苞叶多糖的制备方法,其特征在于：包括多糖的提取，多糖的提取步骤为：玉米苞叶清洗、烘干、粉碎，以料液比1:10~50加入水，在提取温度50℃～80℃条件下回流提取，提取时间1~2h，真空抽滤，减压浓缩，浓缩液用50%~90%乙醇沉淀，静置8~14h，离心，沉淀以无水乙醇洗涤，真空干燥得玉米苞叶粗多糖。
2.根据权利要求1所述的玉米苞叶多糖的制备方法，其特征在于：所述制备方法还包括多糖的纯化，多糖的纯化通过对玉米苞叶粗多糖脱蛋白和透析后得玉米苞叶精多糖，脱蛋白的具体步骤为：将提取所得的玉米苞叶粗多糖配成1%~1.5%的水溶液加入等体积的23%~25%的三氯乙酸水溶液于0~4℃静置10~14h，离心除去沉淀，上清液调至中性得多糖溶液。
3.根据权利要求2所述的玉米苞叶多糖的制备方法，其特征在于：所述透析的具体步骤为：脱蛋白后的多糖溶液装入透析袋用蒸馏水透析，透析液与蒸馏水体积比为1:50，透析时间6~8h，温度28~32℃，透析后的多糖溶液浓缩干燥得玉米苞叶精多糖。
4.根据权利要求1所述的玉米苞叶多糖的制备方法，其特征在于：提取时间为2.0h、提取温度83℃、料液比1:17、浓缩液用63%乙醇沉淀。
5.根据权利要求1所述的玉米苞叶多糖的制备方法，其特征在于：所述玉米苞叶粉碎后过40目筛。
6.一种使用权利要求1~5中任意一项所述制备方法制备的多糖。
7.一种使用权利要求6所述多糖制备的口服液，其特征在于：所述多糖过40目筛，按照质量比1:1比例喷入80%乙醇并搅拌混匀，过20目筛制粒；鼓风干燥箱中60℃干燥45min，再过20目筛整粒，于相对湿度低于75%的环境中装填于空胶囊中。
8.一种使用权利要求6所述多糖制备的口服液，其特征在于：取所述多糖按质量比1:50溶于纯化水中，依次加入多糖质量1%的三氯蔗糖、5%的尼泊金乙酯，与50~60℃下混合搅拌均匀，过滤后，高温瞬时灭菌，罐装。
9.一种使用权利要求6所述多糖制备的凝胶剂，其特征在于：取所述多糖按质量比1:500溶于纯化水中，依次加入纯化水质量0.6%的卡波姆、5%的甘油、0.5%的三乙醇胺、0.1%的吡咯烷酮、0.05%的EDTA-2Na，混合搅拌均匀。
10.权利要求6中所述多糖在制备抗氧化的保健食品和功能性化妆品中的应用。
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