CN102860494B - 一种鸡腿菇子实体多糖与呈味物质及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鸡腿菇子实体多糖与呈味物质及其制备方法，该多糖与呈味物质是通过复合酶提取、水提、醇沉的方法制备得到的。该方法实现了多糖和呈味物质的同时制备，提高了鸡腿菇子实体原料的利用率，且制备的鸡腿菇子实体多糖能够显著地刺激巨噬细胞产生NO活性。

Description

一种鸡腿菇子实体多糖与呈味物质及其制备方法

技术领域

本发明涉及食用菌提取及深加工领域，具体地涉及一种鸡腿菇子实体多糖与呈味物质及其制备方法。

背景技术

毛头鬼伞[Coprinus comatus(Mueller.ex Fr.)S.F.Gray]，俗称鸡腿菇、鸡腿蘑，是一种食、药用真菌，其肉质细嫩，鲜美可口，色香味俱全。药用味甘滑，性平，有益脾胃，清心安神，治痔等功效。据文献报道，毛头鬼伞主要具有降血糖、降血脂、增强免疫、抗肿瘤、抑菌等作用。鸡腿菇多糖作为鸡腿菇中最重要的活性成分之一，具有多种生物活性和药理作用，具有增强机体免疫、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗氧化等作用。

目前关于鸡腿菇提取及深加工的研究，大多集中在鸡腿菇多糖的提取、分离纯化、结构及生物活性作用探讨等方面，而对鸡腿菇中香气、鲜味等风味物质的研究较少，风味成分丢弃，造成鸡腿菇原料利用率低、产品附加值低的现状。

发明内容

本发明首先提供了一种鸡腿菇子实体多糖与呈味物质，其是用如下方法制备得到的：

复合酶提取：将鸡腿菇子实体粉碎，按料液比1:15-1:20加入水，然后加入0.5%-3.0%（w/v）的复合酶，于50℃-60℃反应1-4h；酶灭活，过滤得到滤渣和滤液1；

水提：滤渣再按1:15-1:20添加水，于90-120℃反应1-2h，过滤；收集滤液并与滤液1合并作为滤液2；

醇沉：将滤液2进行浓缩，然后添加无水乙醇，至乙醇的质量百分比浓度达到40-80%，4-20℃下，静置8-12h，离心，沉淀即为鸡腿菇多糖；上清液回收乙醇，水相部分即为呈味物质。

具体的说，本发明的鸡腿菇子实体多糖与呈味物质，是用如下方法制备得到的：

①提取：将鸡腿菇子实体于50-60℃烘干后粉碎过200目筛网，按料液比1:15-1:20加入蒸馏水充分浸泡20-30min，然后添加0.5%-3.0%（w/v）的复合酶，于50℃-60℃反应1-4h，沸水灭酶活15-20min，过滤得到滤渣和滤液1；

②滤渣再按1:15-1:20添加蒸馏水，于100℃反应1-2h，过滤，收集滤液并与滤液1合并作为滤液2；

③提取液浓缩：将滤液2按照浓缩比1:3进行浓缩；

④乙醇醇沉：向上述浓缩液里添加无水乙醇，至乙醇的质量百分比浓度达到40-80%，充分搅匀后于4-20℃，静置8-12h，离心，沉淀用70%乙醇洗涤1-2次，即为鸡腿菇多糖；上清液回收乙醇，水相部分即得鸡腿菇中呈味物质；

⑤干燥：将沉淀用5-10倍蒸馏水溶解后，水浴挥去残留乙醇，冷冻干燥即得鸡腿菇粗多糖；呈味物质按料液比1:25浓缩备用。

其中所述的复合酶为风味酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶三种酶的复合酶，三者复合的质量比例为1:1-2:1-9。

本发明具体的说提供了一种鸡腿菇子实体多糖，其是用如下方法制备得到的：

复合酶提取：将鸡腿菇子实体粉碎，按料液比1:15-1:20加入水，然后加入0.5%-3.0%（w/v）的复合酶，于50℃-60℃反应1-4h；酶灭活，过滤得到滤渣和滤液1；

水提：滤渣再按1:15-1:20添加水，于90-120℃反应1-2h，过滤；收集滤液并与滤液1合并作为滤液2；

醇沉：将滤液2进行浓缩，然后添加无水乙醇，至乙醇的质量百分比浓度达到40-80%，4-20℃下，静置8-12h，离心，沉淀即为鸡腿菇多糖；

其中所述的复合酶为风味酶、木瓜蛋白酶和纤维素酶的复合酶，三者质量比例为1:1-2:1-9。

本发明还提供了一种鸡腿菇子实体呈味物质，其是用如下方法制备得到的：

复合酶提取：将鸡腿菇子实体粉碎，按料液比1:15-1:20加入水，然后加入0.5%-3.0%（w/v）的复合酶，于50℃-60℃反应1-4h；酶灭活，过滤得到滤渣和滤液1；

水提：滤渣再按1:15-1:20添加水，于90-120℃反应1-2h，过滤；收集滤液并与滤液1合并作为滤液2；

醇沉：将滤液2进行浓缩，然后添加无水乙醇，至乙醇的质量百分比浓度达到40-80%，4-20℃下，静置8-12h，离心，上清液回收乙醇，水相部分即为呈味物质；

其中所述的复合酶为风味酶、木瓜蛋白酶和纤维素酶的复合酶，三者质量比例为1:1-2:1-9。

其中所得到的呈味物质主要为游离氨基酸和可溶性固形物；

其中可溶性固形物是指液体或流体食品中所有溶解于水的化合物的总称。包括糖、酸、维生素、矿物质等，主要是指可溶性糖类，包括单糖、双糖，多糖（除淀粉，纤维素、几丁质、半纤维素不溶于水），本实验中主要用来衡量液体中可溶性糖的含量，因为可溶性糖及糖醇也是风味物质的一部分。

其中的游离氨基酸的量可采用茚三酮比色法测定。

其中的可溶性固形物可采用手持式数显糖度计测定。

本发明还提供了制备上述鸡腿菇子实体多糖与呈味物质的方法，该方法为：

本发明首先提供了一种鸡腿菇子实体多糖与呈味物质，其是用如下方法制备得到的：

复合酶提取：将鸡腿菇子实体粉碎，按料液比1:15-1:20加入水，然后加入0.5%-3.0%（w/v）的复合酶，于50℃-60℃反应1-4h；酶灭活，过滤得到滤渣和滤液1；

水提：滤渣再按1:15-1:20添加水，于90-120℃反应1-2h，过滤；收集滤液并与滤液1合并作为滤液2；

醇沉：将滤液2进行浓缩，然后添加无水乙醇，至乙醇的质量百分比浓度达到40-80%，4-20℃下，静置8-12h，离心，沉淀即为鸡腿菇多糖；上清液回收乙醇，水相部分即为呈味物质。

本发明制备的鸡腿菇多糖提取物得率达7.7%，游离氨基酸的量达34.7mg/g，可溶性固形物1.8°Brix，实现了多糖和呈味物质的同时制备，提高了鸡腿菇子实体原料的利用率，且制备的鸡腿菇子实体多糖能够显著地刺激巨噬细胞产生NO活性。

食用菌中含有丰富的氨基酸、呈味核苷酸等呈味物质，具有浓郁的鲜香风味而且营养丰富、食用安全，作为新型保健食品调味料，具有调味增香的作用，适用于日式、西式和中式烹调的调味料，具有广阔前景，因此此方法制备的呈味物质对于食用菌调味品的开发有极其重要的作用，同时也有利于提高食用菌的经济效益。

本方法从鸡腿菇综合利用的角度出发，同时制备鸡腿菇多糖和呈味物质，有利于提高鸡腿菇的利用率，提高其原料的附加值。

具体实施方式

本发明使用的鸡腿菇子实体购于上海百信生物科技有限公司；

本发明使用的风味酶购于诺维信（中国）生物技术有限公司；

本发明使用的木瓜蛋白酶购于Sigma-Aldrich公司（批号039k1451）；

本发明使用的纤维素酶购于国药集团化学试剂有限公司（批号F20110526）

实施例1

称取鸡腿菇干粉2g于50mL锥形瓶中，按照料液比1：20加入蒸馏水，充分浸泡25min后，风味酶、木瓜蛋白酶和纤维素酶的复合酶添加量为0.5%（W/V）（1:1:1），50℃反应4h，酶解完毕后沸水浴灭酶活20min，离心过滤，收集滤液，按浓缩比1:3旋转蒸发浓缩滤液，然后加无水乙醇至乙醇终浓度分别为40%、60%、70%，4℃静置12h，4000rpm离心15min，沉淀用相应浓度乙醇洗涤2次，冷冻干燥，测定粗多糖含量与得率。

实验结果：

40%、60%、70%多糖含量分别为89.7%、72.2%、59.9%；得率分别为3.1%、4.6%、6.8%；游离氨基酸的量分别为39.5、28.3、32.2mg/g；可溶性固形物的量分别为1.5、1.2、1.3°Brix。

其中的游离氨基酸的量可采用茚三酮比色法测定。

其中的可溶性固形物可采用手持式数显糖度计测定

实施例2

称取鸡腿菇干粉2g于50mL锥形瓶中，按照料液比1：20加入蒸馏水，充分浸泡30min后，添加风味酶、木瓜蛋白酶和纤维素酶的复合酶进行酶解反应，置于一定温度水浴反应一定时间，酶解完毕后沸水浴灭酶活15min，离心过滤，收集滤液，按浓缩比1:3旋转蒸发浓缩滤液，然后加无水乙醇至乙醇终浓度为70%，4℃静置8h，4000rpm离心15min，上清定容至50mL，测定可溶性固形物的量，然后再稀释至合适浓度测定游离氨基酸的量，沉淀70%乙醇洗涤一次，冷冻干燥，测定粗多糖得率。

按0.5%（W/V）量添加风味酶、木瓜蛋白酶和纤维素酶的复合酶，三种酶的质量比例为1:1:1，先50℃反应2h，沸水灭酶活后，过滤，收集滤液，滤渣按料液比1:15加蒸馏水，于100℃反应2h，4000rpm离心15min合并滤液。

实验结果：

游离氨基酸量为34.7mg/g，可溶性固形物量在1.7°Brix；粗多糖得率为7.7%。

实施例3体外刺激巨噬细胞生成NO实验

本实施例中RAW264.7骨髓巨噬细胞株，购自美国国家菌种保藏中心（ATCC numberTIB-71^TM）；

本实施例中DMEM、RPMI1640购于GIBCO公司。

供试样品的配制

精确称取实例2制备的鸡腿菇子实体粗多糖样品于灭菌的eppendorf管中，用PBS缓冲液配置成浓度5mg/mL。充分溶解后以12000rpm/min离心30min，无菌条件下转移至新的无菌eppendorf管中，将样品稀释成50、200、500μg/mL待用。阴性对照为PBS缓冲液，阳性对照为10μg/mL LPS溶液。

小鼠RAW264.7巨噬细胞的制备

用DMEM培养基在37℃、5%CO₂条件下传代培养后，用0.25%胰蛋白酶消化，混悬液300×g离心3min后收集细胞，用无色RPMI1640培养基将细胞稀释到一定浓度备用。

巨噬细胞释放NO活性的测定

由于NO极不稳定，在体内很快生成亚硝酸基（NO2^-）和硝酸基（NO3^-），故采用Griess法测定样品中的NO2^-/NO3^-作为衡量NO水平的指标。

（1）用亚硝酸钠制标准曲线：

配成不同浓度的亚硝酸钠溶液，浓度梯度为0、5、10、15、20、25、30、35、40μM共9个浓度梯度；取100μL于96孔板，加入50μL Griess试剂，测定543nm吸光值，标准曲线每个浓度3个重复，绘制标准曲线。

（2）NO产量测定

巨噬细胞的培养液消化完毕后用无色RPMI1640培养基(含10%胎牛血清、1%抗生素液体)将细胞稀释至5×10⁵/ml，每孔180μL加入96孔板，然后再加入20μL各浓度待测样品和阴性（PBS）、阳性（LPS，10μg/mL）对照，于37℃、含5%的CO2条件下培养48h后，取100μL培养上清于96孔板，加入50μL Griess试剂，显色10min后，于波长543nm处测定吸光度，根据标准曲线计算相应的NO量。

实验结果：

鸡腿菇子实体粗多糖在浓度50μg/mL时，刺激巨噬细胞产生NO的量（单位：μmoL/5.0×10⁵cells）为：23.91；在浓度200μg/mL时，产生NO量为42.61；在浓度500μg/mL时，产生NO量为69.68，阴性对照7.89，阳性对照（浓度1μg/mL）63.26，样品组显著高于阴性对照活性（p<0.05），粗多糖在500μg/mL时活性高于阳性对照LPS，表现出良好的刺激巨噬细胞产生NO活性。

Claims (4)

1.一种鸡腿菇子实体多糖与呈味物质，其特征在于是用如下方法制备得到的：

复合酶提取：将鸡腿菇子实体粉碎，按料液比1:20加入水，然后加入0.5％(w/v)的复合酶，于50℃反应2h；酶灭活，过滤得到滤渣和滤液1；

水提：滤渣再按1:15添加水，于100℃反应2h，过滤；收集滤液并与滤液1合并作为滤液2；

醇沉：将滤液2进行浓缩，然后添加无水乙醇，至乙醇的质量百分比浓度达到70％，4℃下，静置8h，离心，沉淀即为鸡腿菇多糖；上清液回收乙醇，水相部分即为呈味物质；

其中所述的复合酶为风味酶、木瓜蛋白酶和纤维素酶的复合酶，三者质量比例为1:1:1。

2.一种制备权利要求1所述鸡腿菇子实体多糖与呈味物质的方法，其特征在于该方法为：

复合酶提取：将鸡腿菇子实体粉碎，按料液比1:20加入水，然后加入0.5％(w/v)的复合酶，于50℃反应2h；酶灭活，过滤得到滤渣和滤液1；

水提：滤渣再按1:15添加水，于100℃反应2h，过滤；收集滤液并与滤液1合并作为滤液2；

醇沉：将滤液2进行浓缩，然后添加无水乙醇，至乙醇的质量百分比浓度达到70％，4℃下，静置8h，离心，沉淀即为鸡腿菇多糖；上清液回收乙醇，水相部分即为呈味物质；

其中所述的复合酶为风味酶、木瓜蛋白酶和纤维素酶的复合酶，三者质量比例为1:1:1。

3.一种鸡腿菇子实体多糖，其特征在于是用如下方法制备得到的：

复合酶提取：将鸡腿菇子实体粉碎，按料液比1:20加入水，然后加入0.5％(w/v)的复合酶，于50℃℃反应2h；酶灭活，过滤得到滤渣和滤液1；

水提：滤渣再按1:15添加水，于100℃反应2h，过滤；收集滤液并与滤液1合并作为滤液2；

醇沉：将滤液2进行浓缩，然后添加无水乙醇，至乙醇的质量百分比浓度达到70％，4℃下，静置8h，离心，沉淀即为鸡腿菇多糖；

其中所述的复合酶为风味酶、木瓜蛋白酶和纤维素酶的复合酶，三者质量比例为1:1:1。

4.一种鸡腿菇子实体呈味物质，其特征在于是用如下方法制备得到的：

复合酶提取：将鸡腿菇子实体粉碎，按料液比1:20加入水，然后加入0.5％(w/v)的复合酶，于50℃反应2h；酶灭活，过滤得到滤渣和滤液1；

水提：滤渣再按1:15添加水，于100℃反应2h，过滤；收集滤液并与滤液1合并作为滤液2；

醇沉：将滤液2进行浓缩，然后添加无水乙醇，至乙醇的质量百分比浓度达到70％，4℃下，静置8h，离心，上清液回收乙醇，水相部分即为呈味物质；

其中所述的复合酶为风味酶、木瓜蛋白酶和纤维素酶的复合酶，三者质量比例为1:1:1。