CN114875096B - 一种鸡腿菇液体优化培养及多糖提取的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鸡腿菇液体优化培养及多糖提取的方法,该方法为:制备液体培养基,将液体培养基分装到三角瓶中,将鸡腿菇固体菌种接种至三角瓶中进行发酵培养,培养结束后进行离心过滤,得到菌丝体;在菌丝体中加入石油醚洗涤、过滤、烘干,得到脱脂后的鸡腿菇干菌丝体;脱脂后的鸡腿菇干菌丝体粉碎后,用无水乙醇浸泡、过滤、烘干,得到鸡腿菇菌丝体干品;将鸡腿菇菌丝体干品用蒸馏水浸泡,回流提取,过滤后得到提取液,将滤渣再次回流提取,将两次提取液合并浓缩,加入无水乙醇后,静置、过滤、蒸馏水溶解,得到粗多糖提取液,将粗多糖提取液通过聚酰胺树脂柱和AB‑8树脂柱,用乙醇洗脱,蒸馏后得到高纯多糖提取液。本发明方法多糖的收率为78%~85%。
Description
技术领域
本发明属于鸡腿菇技术领域,具体涉及一种鸡腿菇液体优化培养及多糖提取的方法。
背景技术
鸡腿菇(Copyinds comatus),学名毛头鬼伞,别名鸡腿蘑,属担子菌纲,伞菌目,鬼伞科,鬼伞属,是近年来人工开发的具有商业潜力的珍稀菌品。鸡腿菇含有20种氨基酸,具备人体必需的8种氨基酸,占总量的34.83%;其他氨基酸12种,占总量的65.17%。鸡腿菇性平,味甘滑,具有清神益智、益脾胃、助消化、增加食欲等功效。
由于鸡腿菇生长周期短,生物转化率较高,易于栽培,特别适合我国农村种植。近年来种植规模迅速扩大,已成为我国大宗栽培的食用菌之一。在食用菌产业化、规模化生产中液体菌种已成为替代固体菌种的必然趋势,液体菌种生产工艺简便、周期短,是以后菌种研发的必然方向。且鸡腿菇在多糖提取方面的研究较少,且多糖的收率也不高;因此,提供一种鸡腿菇液体优化培养及多糖提取的方法尤为重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足,提供一种鸡腿菇液体优化培养及多糖提取的方法,该方法能够将多糖高度提取,多糖的收率为78%~85%。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案是:鸡腿菇液体优化培养及多糖提取的方法,该方法包括以下步骤:
S1、先制备液体培养基,将所述液体培养基分装至三角瓶中,将鸡腿菇固体菌种接种至所述三角瓶中进行液体发酵培养,所述液体发酵培养的温度为24℃~26℃,摇瓶转速为180r/min,培养结束后,进行离心、过滤,得到菌丝体,将所述菌丝体烘干,得到鸡腿菇干菌丝体;
S2、在S2中得到的鸡腿菇干菌丝体中加入石油醚进行洗涤脱脂,然后过滤、烘干,得到脱脂后的鸡腿菇干菌丝体;
S3、将S3中得到的脱脂后的鸡腿菇干菌丝体粉碎,然后加入无水乙醇浸泡6h,过滤后烘干,进行超微粉碎后过120目筛,得到鸡腿菇菌丝体干品;
S4、在S4中得到的鸡腿菇菌丝体干品中加入蒸馏水,浸泡2h,然后放入温度为95℃的水浴锅中回流提取3h,再进行过滤,得到滤渣和滤液,所述滤液为第一次提取液;在所述滤渣中再加入蒸馏水,放入温度为95℃的水浴锅中回流提取3h,过滤收集滤液,得到第二次提取液;将所述第一次提取液和第二次提取液混合,然后进行减压浓缩,得到多糖二次浓缩液,在所述多糖二次浓缩液中加入无水乙醇,得到混合溶液,将所述混合溶液静置24h后进行过滤,回收乙醇溶液,得到沉淀物,将所述沉淀物加入蒸馏水溶解,得到粗多糖溶液;
S5、将S5中得到的粗多糖溶液放入聚酰胺树脂柱中,用质量分数为5%的乙醇水溶液以2BV/h的流速进行洗脱,洗脱至通过聚酰胺树脂柱内的溶液为无色时停止,然后再通入AB-8树脂柱中,再用质量分数为30%的乙醇水溶液以0.5BV/h的流速洗脱后,收集多糖纯化液;将所述多糖纯化液在温度为15℃~30℃的条件下减压蒸馏1h~2h后,得到高纯多糖纯化液。
优选地,S1中所述液体培养基包括以下的质量组分:玉米粉4.0%、麸皮2.5%、蔗糖2.0%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.15%、MgSO40.05%、FeSO40.01%。
优选地,S1中所述三角瓶的体积为250ml,每瓶分装所述液体培养基的体积为120ml。
优选地,S1中所述液体发酵培养的时间为7~9d;所述离心的转速为4000rpm。
优选地,S2中所述鸡腿菇干菌丝体和石油醚的用量为1:2。
优选地,S3中所述脱脂后的鸡腿菇干菌丝体粉碎至120目。
优选地,S1、S2和S3中所述烘干的温度均为50℃~60℃,烘干后的含水量均为6%~8%。
优选地,S4中所述鸡腿菇菌丝体干品和蒸馏水的用量比为1:(6~8),所述滤渣和蒸馏水的用量比为1:6。
优选地,S4中所述混合溶液中乙醇的浓度为75%。
优选地,S5中所述AB-8树脂柱采用湿法装柱。
本发明S1中使用的鸡腿菇固体菌种的基因库编号为Fjtg1805,所述鸡腿菇固体菌种经中科院微生物所鉴定为鸡腿菇,并在中科院微生物研究所保藏。
本发明与现有技术相比具有以下优点:
1、本发明将粉碎的鸡腿菇干菌丝体用无水乙醇浸泡,是为了进一步去除一些脂溶性的杂质及脂溶性色素,便于后续的纯化,提高多糖含量。
2、本发明采用聚酰胺树脂柱中洗脱粗多糖溶液中的色素,去除弱极性色素,利于后续AB-8大孔树脂分离纯化,提高多糖含量,增加树脂重复利用次数。
3、本发明采用AB-8树脂吸附纯化操作的优势是:可以观察不同分子量和多糖的分离纯化,分子量越小的越后出来,可以分步收集,达到分离的效果。
4、本发明中鸡腿菇固体菌种在液体发酵培养过程中,因培养基中包含玉米粉、蛋白胨等容易起泡的培养材料,若在培养后期有大量泡沫产生时,影响发酵培养的正常进行,加入一定比例的消泡剂(豆油)消泡可以保证发酵生产的正常进行;除豆油外,在液体发酵培养的过程中会产生的油性物质不利于后期的分离,在后续多糖提取过程中含有一定量的脂溶性物质,不利于多糖的提取与纯化,因此需要提前脱脂。
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
具体实施方式
实施例1
本实施例鸡腿菇液体优化培养及多糖提取的方法,包括以下步骤:
通过常规的方法制备鸡腿菇固体菌种:先制备固体斜面培养基,将200g马铃薯去皮、切碎,加入到1000ml的水中煮沸30min,然后过滤收集滤液,在所述滤液中加入葡萄糖、蛋白胨、琼脂,加水至1000ml,然后分装至200mmx20mm的试管中,装量为试管的1/3,然后进行包装、灭菌、摆斜面备用,将鸡腿菇菌种接种于灭菌后的试管内进行培养,得到鸡腿菇固体菌种;
试管进行包装:试管装入所述固体培养基后,管口盖上胶皮筛子(能透气灭菌),每5~7支试管用牛皮纸包在一起;所述灭菌的温度为121℃,时间为30min;所述葡萄糖的用量是所述滤液质量的2%,蛋白胨的用量是所述滤液质量的0.5%、琼脂的用量是所述滤液质量的1.8%;
S1、先制备液体培养基,将所述液体培养基分装至250ml的三角瓶中,每瓶分装120ml,将鸡腿菇固体菌种接种至三角瓶中进行液体发酵培养,所述液体发酵培养的温度为24℃,摇瓶转速为180r/min,培养结束后,放入离心机进行离心后过滤,得到菌丝体,将所述菌丝体在温度为50℃的条件下烘干至含水量为6%,得到鸡腿菇干菌丝体;
所述液体发酵培养的时间为8d,待菌丝生长相对浓度达35%以上,培养结束;所述液体培养基包括以下的质量组分:玉米粉4.0%、麸皮2.5%、蔗糖2.0%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.15%、MgSO40.05%、FeSO40.01%;离心的转速为4000rpm;在液体发酵培养后期如有大量泡沫产生,加入用量为0.5%的豆油用于消泡,保证发酵的正常进行;
S2、在S1中得到的鸡腿菇干菌丝体中加入石油醚进行洗涤脱脂,然后过滤,在温度为烘干50℃的条件下烘干至含水量为6%后,得到脱脂后的鸡腿菇干菌丝体;所述鸡腿菇干菌丝体和石油醚的用量为1:2;
S3、将S2中得到脱脂后的鸡腿菇干菌丝体粉碎至120目,然后加入无水乙醇浸泡6h,过滤后,将浸泡后的鸡腿菇菌丝体在温度为50℃的条件下烘干至水分含量为6%,进行超微粉碎后过120目筛,得到鸡腿菇菌丝体干品;
S4、在S3中得到的鸡腿菇菌丝体干品中加入蒸馏水中浸泡2h,然后放入温度为95℃的水浴锅中回流提取3h,再进行过滤,得到滤渣和滤液,所述滤液为第一次提取液;在所述滤渣中加入蒸馏水,再放入温度为95℃的水浴锅中回流提取3h,过滤收集滤液,得到第二次提取液;将所述第一次提取液和第二次提取液混合,然后在温度为15℃的旋转薄膜蒸发器上进行减压浓缩2h,得到多糖二次浓缩液,在所述多糖二次浓缩液中加入无水乙醇,得到混合溶液,将所述混合溶液静置24h后进行过滤,回收乙醇溶液,得到沉淀物,将所述沉淀物加入蒸馏水溶解,得到粗多糖溶液;
所述鸡腿菇干菌丝体和蒸馏水的用量比为1:6,所述滤渣和蒸馏水的用量比为1:6;所述混合溶液中乙醇的浓度为75%;
S5、将S4中得到的粗多糖溶液放入聚酰胺树脂柱中,用质量分数为5%的乙醇水溶液以2BV/h的流速进行洗脱,洗脱至通过聚酰胺树脂柱的溶液为透明无色时停止,再用质量分数为30%的乙醇水溶液以0.5BV/h的流速洗脱后,收集多糖纯化液;将所述多糖纯化液在温度为15℃的条件下减压蒸馏2h后,得到高纯多糖纯化液。
经检测:本实施例中多糖的收率为82%。
实施例2
本实施例鸡腿菇液体优化培养及多糖提取的方法,包括以下步骤:
通过常规的方法制备鸡腿菇固体菌种:先制备固体斜面培养基,将200g马铃薯去皮、切碎,加入到1000ml的水中煮沸30min,然后过滤收集滤液,在所述滤液中加入葡萄糖、蛋白胨、琼脂,加水至1000ml,然后分装至200mmx20mm的试管中,装量为试管的1/3,然后进行包装、灭菌备用,将鸡腿菇菌种接种于灭菌后的试管内进行培养,得到鸡腿菇固体菌种;
试管进行包装:试管装入所述固体培养基后,管口盖上胶皮筛子(能透气灭菌),每5~7支试管用牛皮纸包在一起;所述灭菌的温度为121℃,时间为30min;所述葡萄糖的用量是所述滤液质量的2%,蛋白胨的用量是所述滤液质量的0.5%、琼脂的的用量是所述滤液质量的1.8%;
S1、先制备液体培养基,将所述液体培养基分装至250ml的三角瓶中,每瓶分装120ml,将鸡腿菇固体菌种接种至三角瓶中进行发酵培养,所述发酵培养的温度为26℃,摇瓶转速为180r/min,培养结束后,放入离心机进行离心后过滤,得到菌丝体,将所述菌丝体在温度为60℃的条件下烘干至含水量为8%,得到鸡腿菇干菌丝体;
液体发酵培养时间为7d,待菌丝生长相对浓度达35%以上,培养结束;所述液体培养基包括以下的质量组分:玉米粉4.0%、麸皮2.5%、蔗糖2.0%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.15%、MgSO40.05%、FeSO40.01%;离心的转速为4000rpm;在液体发酵培养后期如有大量泡沫产生,加入用量为0.5%的豆油用于消泡,保证发酵的正常进行;
S2、在S1中得到的鸡腿菇干菌丝体中加入石油醚进行洗涤脱脂,然后过滤,在温度为60℃的条件下烘干至含水量为8%后,得到脱脂后的鸡腿菇干菌丝体;所述鸡腿菇干菌丝体和石油醚的用量为1:2;
S3、将S2中得到脱脂后的鸡腿菇干菌丝体粉碎至120目,然后加入无水乙醇浸泡6h,过滤后,将浸泡后的鸡腿菇菌丝体在温度为60℃的条件下减压烘干至水分含量为8%,进行超微粉碎后过120目筛,得到鸡腿菇菌丝体干品;
S4、将S3中得到的鸡腿菇菌丝体干品放入蒸馏水中浸泡2h,然后放入温度为95℃的水浴锅中回流提取3h,再进行过滤,得到滤渣和滤液,所述滤液为第一次提取液;将所述滤渣再加入蒸馏水,再放入温度为95℃的水浴锅中回流提取3h,过滤收集滤液,得到第二次提取液;将所述第一次提取液和第二次提取液混合,然后在温度为30℃的旋转薄膜蒸发器上进行减压浓缩1h,得到多糖二次浓缩液,在所述多糖二次浓缩液中加入无水乙醇,得到混合溶液,将所述混合溶液静置24h后进行过滤,回收乙醇溶液,得到沉淀物,将所述沉淀物加入蒸馏水溶解,得到粗多糖溶液;
所述鸡腿菇干菌丝体和蒸馏水的用量比为1:8,所述滤渣和蒸馏水的用量比为1:6;所述混合溶液中乙醇的浓度为75%;
S5、将S4中得到的粗多糖溶液通入聚酰胺树脂柱中,用质量分数为5%的乙醇水溶液以2BV/h的流速进行洗脱,洗脱至透过聚酰胺树脂柱的溶液为透明无色时止,然后再放入湿法装柱的AB-8树脂柱中,再用质量分数为30%的乙醇水溶液以0.5BV/h的流速洗脱后,收集多糖纯化液;将所述多糖纯化液在温度为30℃的条件下减压蒸馏1h后,得到高纯多糖纯化液。
经检测:本实施例中多糖的收率为78%。
实施例3
本实施例鸡腿菇液体优化培养及多糖提取的方法,包括以下步骤:
通过常规的方法制备鸡腿菇固体菌种:先制备固体斜面培养基,将200g马铃薯去皮、切碎,加入到1000ml的水中煮沸30min,然后过滤收集滤液,在所述滤液中加入葡萄糖、蛋白胨、琼脂,加水至1000ml,然后至200mmx20mm的试管中,装量为试管的1/3,然后进行包装、灭菌备用,将鸡腿菇菌种接种于灭菌后的试管内进行培养,得到鸡腿菇固体菌种;
试管进行包装:试管装入所述固体培养基后,管口盖上胶皮筛子(能透气灭菌),每5~7支试管用牛皮纸包在一起;所述灭菌的温度为121℃,时间为30min;所述葡萄糖的用量是所述滤液质量的2%,蛋白胨的用量是所述滤液质量的0.5%、琼脂的的用量是所述滤液质量的1.8%;
S1、先制备液体培养基,将所述液体培养基分装至250ml的三角瓶中,每瓶分装120ml,将鸡腿菇固体菌种接种至三角瓶中进行发酵培养,所述发酵培养的温度为25℃,摇瓶转速为180r/min,培养结束后,放入离心机进行离心后过滤,得到菌丝体,将所述菌丝体在温度为55℃的条件下烘干至含水量为7%,得到鸡腿菇干菌丝体;
所述液体发酵培养时间为9d,待菌丝生长相对浓度达35%以上,培养结束;所述液体培养基包括以下的质量组分:玉米粉4.0%、麸皮2.5%、蔗糖2.0%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.15%、MgSO40.05%、FeSO40.01%;离心的转速为4000rpm;在液体发酵培养后期如有大量泡沫产生,加入用量为0.5%的豆油用于消泡,保证发酵的正常进行;
S2、在S1中得到的鸡腿菇干菌丝体中加入石油醚进行洗涤脱脂,然后过滤,在温度为55℃的条件下烘干至含水量为7%后,得到脱脂后的鸡腿菇干菌丝体;所述鸡腿菇干菌丝体和石油醚的用量为1:2;
S3、将S2中得到脱脂后的鸡腿菇干菌丝体粉碎至120目,然后加入无水乙醇浸泡6h,过滤后,将浸泡后的鸡腿菇菌丝体在温度为55℃的条件下减压烘干至水分含量为7%,进行超微粉碎后过120目筛,得到鸡腿菇菌丝体干品;
S4、将S3中得到的鸡腿菇菌丝体干品放入蒸馏水中浸泡2h,然后放入温度为95℃的水浴锅中回流提取3h,再进行过滤,得到滤渣和滤液,所述滤液为第一次提取液;将所述滤渣再放入蒸馏水中,再放入温度为95℃的水浴锅中回流提取3h,过滤收集滤液,得到第二次提取液;将所述第一次提取液和第二次提取液混合,然后在温度为20℃的旋转薄膜蒸发器上进行减压浓缩1.5h,得到多糖二次浓缩液,在所述多糖二次浓缩液中加入无水乙醇,得到混合溶液,将所述混合溶液静置24h后进行过滤,回收乙醇溶液,得到沉淀物,将所述沉淀物加入蒸馏水溶解,得到粗多糖溶液;
所述鸡腿菇干菌丝体和蒸馏水的用量比为1:7,所述滤渣和蒸馏水的用量比为1:6;所述混合溶液中乙醇的浓度为75%;
S5、将S4中得到的粗多糖溶液通入聚酰胺树脂柱中,用质量分数为5%的乙醇水溶液以2BV/h的流速进行洗脱,洗脱至透过聚酰胺树脂柱的溶液为透明无色时停止,然后再放入湿法装柱的AB-8树脂柱中,再用质量分数为30%的乙醇水溶液以0.5BV/h的流速洗脱后,收集多糖纯化液;将所述多糖纯化液在温度为20℃的条件下减压蒸馏1.5h后,得到高纯多糖纯化液。
经检测:本实施例中多糖的收率为85%。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例,并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化,均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
Claims (8)
1.一种鸡腿菇液体优化培养及多糖提取的方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
S1、先制备液体培养基,将所述液体培养基分装至三角瓶中,将鸡腿菇固体菌种接种至所述三角瓶中进行液体发酵培养,所述液体发酵培养的温度为24℃~26℃,摇瓶转速为180r/min,培养结束后,进行离心、过滤,得到菌丝体,将所述菌丝体烘干,得到鸡腿菇干菌丝体;
S2、在S1中得到的鸡腿菇干菌丝体中加入石油醚进行洗涤脱脂,然后过滤、烘干,得到脱脂后的鸡腿菇干菌丝体;所述鸡腿菇干菌丝体和石油醚的用量为1:2;
S3、将S2中得到的脱脂后的鸡腿菇干菌丝体粉碎,然后加入无水乙醇浸泡6h,过滤后烘干,进行超微粉碎后过120目筛,得到鸡腿菇菌丝体干品;
S4、在S3中得到的鸡腿菇菌丝体干品中加入蒸馏水,浸泡2h,然后放入温度为95℃的水浴锅中回流提取3h,再进行过滤,得到滤渣和滤液,所述滤液为第一次提取液;在所述滤渣中再加入蒸馏水,放入温度为95℃的水浴锅中回流提取3h,过滤收集滤液,得到第二次提取液;将所述第一次提取液和第二次提取液混合,然后进行减压浓缩,得到多糖二次浓缩液,在所述多糖二次浓缩液中加入无水乙醇,得到混合溶液,将所述混合溶液静置24h后进行过滤,回收乙醇溶液,得到沉淀物,将所述沉淀物加入蒸馏水溶解,得到粗多糖溶液;所述混合溶液中乙醇的浓度为75%;
S5、将S4中得到的粗多糖溶液放入聚酰胺树脂柱中,用质量分数为5%的乙醇水溶液以2BV/h的流速进行洗脱,洗脱至通过聚酰胺树脂柱内的溶液为无色时停止,洗脱后再通入AB-8树脂柱中,再用质量分数为30%的乙醇水溶液以0.5BV/h的流速洗脱,然后收集多糖纯化液;将所述多糖纯化液在温度为15℃~30℃的条件下减压蒸馏1h~2h后,得到高纯多糖纯化液。
2.根据权利要求1所述的一种鸡腿菇液体优化培养及多糖提取的方法,其特征在于,S1中所述液体培养基包括以下的质量组分:玉米粉4.0%、麸皮2.5%、蔗糖2.0%、蛋白胨0.5%、KH2PO4 0.15%、MgSO4 0.05%、FeSO4 0.01%。
3.根据权利要求2所述的一种鸡腿菇液体优化培养及多糖提取的方法,其特征在于,S1中所述三角瓶的体积为250ml,每瓶分装所述液体培养基的体积为120ml。
4.根据权利要求1所述的一种鸡腿菇液体优化培养及多糖提取的方法,其特征在于,S1中所述液体发酵培养的时间为7~9d;所述离心的转速为4000rpm。
5.根据权利要求1所述的一种鸡腿菇液体优化培养及多糖提取的方法,其特征在于,S3中所述脱脂后的鸡腿菇干菌丝体粉碎至120目。
6.根据权利要求1所述的一种鸡腿菇液体优化培养及多糖提取的方法,其特征在于,S1、S2和S3中所述烘干的温度均为50℃~60℃,烘干后的含水量均为6%~8%。
7.根据权利要求1所述的一种鸡腿菇液体优化培养及多糖提取的方法,其特征在于,S4中所述鸡腿菇菌丝体干品和蒸馏水的用量比为1:(6~8),所述滤渣和蒸馏水的用量比为1:6。
8.根据权利要求1所述的一种鸡腿菇液体优化培养及多糖提取的方法,其特征在于,S5中所述AB-8树脂柱采用湿法装柱。
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超声波联合酶法提取鸡腿菇菌丝体多糖及纯化;曹向宇等;食品科学;34(16);6-10 * |
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