CN105294395A - 一种同步提取-组合柱层析-结晶纯化制备虫草酸、虫草素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种同步提取-组合柱层析-结晶纯化制备虫草酸、虫草素的方法；以新鲜的虫草花（子实体）为起始原料，包括剪切、破碎、酶解、提取、层析分离、结晶、精制纯化。本发明以品相比较差的虫草花为原料，采用现代分离纯化技术，获得较高纯度的功能成分，制备出含量高达98.5的虫草酸、虫草素高纯物质，是一条较优的开发途径，可促进虫草类中药新药的研发，实现虫草的升级换代，工艺环保。

Description

一种同步提取-组合柱层析-结晶纯化制备虫草酸、虫草素的方法

技术领域

本发明涉及生物化工技术领域，尤其涉及一种同步提取-组合柱层析-结晶纯化制备虫草酸、虫草素的方法。

背景技术

虫草是我国的一种名贵中药材，自古以来与人参、鹿茸一起列为中国三大补药。早在1757年《本草从新》中就有“冬虫夏草甘平保肺，益肾，补精髓，止血化痰，已劳咳，治膈症皆良”的记载。中国传统医学认为：冬虫夏草性味甘、平，入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚总体而言，虫草不但对人体各种脏器的功能有调节作用，还存在某些直接抗病功能，相对于其他补品，冬虫夏草药性温和，比其他种类的滋补品具有更加广泛的药用和食用性，它一年四季均可服用，老、少、病、虚皆可服用。

虫草是指包括冬虫夏草在内的广义的虫草属真菌的总称。虫草的种类基本上是以其有性世代的形态特征、寄主、地名、人名而取名的，所以虫草属的各个种名就是各单一虫草真菌的名称，已经发现的虫草有400多种，而“冬虫夏草”就是特指以青藏高原为主产地、中国特有的冬虫夏草Cordycepssinensis（Berk.）Sacc。虫草真菌属于生物界中真菌界、真菌门、子囊菌亚门、核菌纲、麦角菌目、麦角菌科、虫草属，寄生在昆虫、蛛类、大团囊菌以及麦角菌上并形成子实体，构成了种类繁多的一大类群，在世界范围内分布广泛。虫草分很多种，分别有冬虫夏草、山虫草、新疆虫草、蛹虫草、武夷山虫草、龙洞虫草、张家界虫草、尖头虫草、发丝虫草、金针虫虫草、日本虫草、双梭孢虫草、古尼虫草等很多种，广泛意义上的虫草，已发现有报道的四百多种。其中完全野生的冬虫夏草又被专业人士分为青海草、藏草、川草、滇草、甘肃草、炉草、灌草等。冬虫夏草中含水分10.85%，脂肪8.50%，粗蛋白25.3%，粗纤维18.55%，碳水化物28.90%，灰分4.80%。脂肪含饱和脂肪酸13.00%，不饱和脂肪酸82.2%。此外，还含虫草酸约7%，是奎宁酸的异构物。又含冬虫夏草素，是一种淡黄色结晶粉末，在试管内能抑制链球菌、鼻疽杆菌、炭疽杆菌、猪出血性败血症杆菌及葡萄状球菌的生长。另含维生素B120.29μg/100g。

还有一种“虫草花”，其并非是冬虫夏草，它是人工培养的虫草子实体，培养基是仿造天然虫子所含的各种养分，包括谷物类、豆类、蛋奶类等，属于一种真菌类。虽然完整形态的人工冬虫夏草没有培植成功，但在蛹虫草（北冬虫夏草）上进行人工培植已获得成功，已能在蛹体上接种北冬虫夏草菌，长出带蛹体的北冬虫夏草子实体（子座），并能在人工培养基（谷物类）上培植北冬虫夏草子实体，利用最先进的微生物技术和分子层面技术将虫草素萃取富集，实现规模工厂化生产。我国已开发出第一例纯天然虫草素含片。这种科学技术的研制成功，使得以前难以问津的名贵药材成了一般百姓的保健食品。

冬虫夏草非常适合人们用来提高免疫力，或者是术后、产后身体的恢复，可是如果食用方法不当，往往不能充分发挥它的营养作用。关于冬虫夏草的吃法，网上流传着很多种说法，有的说泡水喝，有的说炖着吃，有人说研成粉末，还有的说可以直接嚼着吃。到底冬虫夏草怎么吃比较好呢？

为开发高效的保健食品或中药产品，提高虫草产品的保健/药用价值，有必要对虫草进行精深加工，其中通过分离纯化，获得较高纯度的功能成分将是一条较优的开发途径。经由国家知识产权局网站检索，截至2015年6月30日，与虫草素、虫草酸等深加工直接相关的发明专利主要归结如下：

1)CN104327139A(申请人西北农林科技大学，《虫草素晶体的制备方法》)：本发明公开了一种虫草素晶体的制备方法，包括下述步骤：1)以培养蛹虫草子座剩余的基质为原料，将基质粉碎后以有机溶剂进行浸提，离心收集上清液；2)利用大孔树脂吸附色谱柱对离心后的粗液进行纯化；3)步骤2)所得虫草素采用乙醇、硫酸铵组成的双水相体系进行富集并收集样品；4)装层析柱，甲醇溶液洗脱，洗脱液减压蒸馏浓缩，浓缩的洗脱液甲醇洗脱，洗脱液结晶得到虫草素晶体。本发明公开的虫草素晶体的制备方法降低了生产成本，并且提高了虫草素纯度，避免了有机溶剂残留。

2)CN104447926A(申请人哈尔滨墨医生物技术有限公司，《一种虫草素的提取方法》)：本发明为一种虫草素的提取方法，该提取方法的具体步骤为：（1）粉碎；（2）提取；（3）活性炭吸附色素；（4）去除乙酸乙酯层、去除氯仿；（5）吸附层析、洗脱、干燥；本发明的一种虫草素的提取方法，应用热水提取法对虫草素进行提取，避免了醇提过程，溶剂对虫草素结构的破会，也避免微波、超声等造成虫草素断裂，应用活性炭、乙酸乙酯和氯仿去除虫草素中色素，黄酮类化合物，多糖和蛋白等杂志，使虫草素的纯度得到了提高，具有操作简单、虫草素提取率高、纯度高的特点，适合工业化大生产。。

3)CN104592336A(申请人芝圣（天津）生物科技有限公司，《一种蛹虫草中虫草素的提取方法》)：本发明提供一种蛹虫草中虫草素的提取方法，虫草素是一种天然来源的药物，具有抗肿瘤、抗菌抗病毒、免疫调节、清除自由基等多种药理作用外，有良好的临床应用前景，但总是受原料、纯化过程等因素影响，本发明通过将蛹虫草培养基或菌体样品充分粉碎，水溶后超声以提高虫草素溶出量，过滤得粗滤液，再通过对滤液的富集、提纯，滤液经反相ODS填料柱吸附，洗脱，浓缩后可得到纯净的虫草素晶体。本发明具有的有益效果是：这种方法能够提高虫草素提取效率，减少提取时间；对虫草素的提取和纯化工艺进行了优化，工艺步骤与选用的设备简单，可操作性强，能耗低。。

4)CN103936806A（申请人邓华，《从蛹虫草中提取虫草素的工艺方法》）：本发明公开了一种从蛹虫草中提取虫草素的工艺方法，通过醇提、浓缩、脱蜡、纯化、液膜萃取、精制和干燥。与现有技术相比，本发明工艺最为简单、生产周期短，有机溶剂用量少且可重复使用，产品得率高，特别是采用FEP高分子聚合物填料的液膜萃取系统，材料重复使用期长，在理论上可以无限期地重复使用，因而可以大大节约生产成本，特别是所生产的产品纯度高，所提取的精品虫草素含量可达98%以上，为大规模工业化生产提供了条件。

5)CN104072559A（申请人宁波广发文博生物科技有限公司，《一种从蛹虫草中提取虫草素的方法》）：本发明公开了一种从蛹虫草中提取虫草素的方法，解决了现有技术的虫草素提取方法能耗高，操作时间长，提取效率低，得到的虫草素纯度低的问题，主要步骤包括：真空超声水提→二次732型阳离子反吸附除杂→精滤→第一次反渗透浓缩→732型阳离子纯化→717型阴离子树脂纯化→第二次反渗透浓缩→蒸发重结晶。本发明对虫草素的提取和纯化工艺进行了优化，工艺步骤与选用的设备简单，可操作性强，能耗低，适合大规模工业化生产，虫草素的得率与纯度高，为虫草素产业化生产提供了技术依据。

6)CN103772460A（申请人江苏省中国科学院植物研究所，《蚕虫草(活性物质)虫草素的提取工艺》）：本发明公开了蚕虫草中活性物质虫草素的提取工艺。虫草素系从冬虫夏草中提取出来的一种天然核甙类新药，具有抑制肿瘤、抗疟原虫、抗真菌、抗HⅣ-I型病毒和选择性抑制梭菌的活性，引起医药学界的高度重视。但其虽能够人工合成，也能从冬虫夏草中提取，但产量很低，价格昂贵，目前其提取、纯化方法不仅操作麻烦，而且有毒有机溶剂会带来污染，不易进行大批量生产。本发明是采用双水相萃取法提取蚕虫草虫草素，不仅提取物含量高，提取率高，且省时，省力，适合工业化大规模提取。

7)CN103467551A（申请人上海市农业科学院，《一种虫草素和虫草多糖及其制备方法》）：本发明公开了一种虫草素和虫草多糖及其制备方法，该虫草素和虫草多糖是先对虫草废弃培养基进行热水提，然后用NKA-II树脂进行吸附和分离，分别得到虫草素和虫草多糖，该制备方法简单，虫草素和虫草多糖的提取率高。

8)CN102936271A（申请人石家庄藏诺生物股份有限公司，《一种虫草素的提取方法》）：本发明涉及一种虫草素的提取方法，该方法包括以下步骤：虫草素发酵液减压浓缩，然后分别在微波和光波组合下超声提取，得到的提取液进一步分离纯化，即得。与传统的提取方法相比，本发明提供的提取方法提高了提取率，节省了提取时间，增加了纯度。。

9)CN103059086A（申请人西藏金稞集团有限责任公司，《一种蛹虫草固体培养基虫草素的提取纯化方法》）：本发明公开了一种蛹虫草固体培养基虫草素的提取纯化方法。本发明以蛹虫草固体培养基为原料，经粉碎、渗漉提取、除杂、活性炭脱色、阴离子交换树脂纯化、结晶、干燥等提取纯化技术，获得虫草素，纯度可达99.0％以上。本发明以蛹虫草固体培养基为原料，变废为宝，同时具有提取率高、操作简单、可行性强、节约能源等特点，适于工业化生产。

10)CN102850419A（申请人南京泽朗农业发展有限公司，《一种从蛹虫草提取虫草素和多糖的方法》）：本发明公开了一种从蛹虫草提取虫草素和多糖的方法。方法是：蛹虫草原料粉碎，装入亚临界萃取釜，通入去离子水，在温度100~200℃、压力1~15MPa条件，逆流提取10-60分钟，得提取液；提取液浓缩后，加入5-6倍体积95%乙醇，充分搅拌充分沉淀，沉淀物再次用水溶解，加入浓度3%-10%的三氯乙酸除去蛋白，再次醇沉，干燥即得虫草多糖；合并两次醇沉液，减压浓缩至无醇，加入活性炭柱吸附，乙醇溶液洗脱，洗脱液减压浓缩，放置结晶，结晶物干燥即得虫草素。本方法具有提取周期短、产品得率高及工艺操作简单的优势，适合工业化推广。

11)CN102746355A（申请人吉林省起泰科技有限公司，《一种提取和分离虫草素的方法》）：本发明提供一种提取和分离虫草素的方法，属于农产品深加工技术领域。解决现有的虫草素提取方法过程中容易产生热量造成虫草素提取率低、纯度低、只能对干燥样品进行加工，对含水高的样品加工困难的问题。该方法是将雪花冬虫夏草低温粉碎后以料水1:5-1:20混合，在超生频率20-30kHz条件下超声提取后，与大孔树脂混合平衡，用反向高效液相色谱进行纯化，经纳滤脱盐、干燥最终得到虫草素的浓缩物。本发明采用低温液氮研磨，并且结合低频超生低输出功率促溶，使虫草素的质量含量最高可达到98-99%，回收率可达到88-90%。

12)CN102643318A（申请人辽宁大学，《一种从蛹虫草子实体中提取精制虫草素的方法》）：本发明涉及一种从蛹虫草子实体中提取精制虫草素的方法。采用的技术方案是：将蛹虫草子实体粉碎，过16目筛备用；取粉碎后的原料加3倍体积的70%乙醇浸泡24小时；将浸泡后的混悬液加入回流装置中，加热回流2～4小时，过滤；滤液用正丁醇萃取2～5次；将上清液60℃减压浓缩至无醇味的浸膏；浸膏经硅胶柱洗脱，流动相为按体积比，乙酸乙酯：95%乙醇为5:3，回收洗脱液，TLC跟踪检测；将回收的洗脱液，再次减压蒸馏浓缩为接收洗脱液体积的1/5；浓缩后的洗脱液在室温下结晶。本发明可减少有机溶剂用量，减少分离步骤，提高提取率，降低毒性，可以使蛹虫草中虫草素富集，生产成本低，虫草素纯度高。

13)CN103288909A（申请人中国科学院沈阳应用生态研究所，《一种虫草鲜培养基中虫草素的提取方法》）：本发明属于医药领域，具体涉及一种虫草鲜培养基中虫草素的提取方法。具体为，将未经干燥和粉碎，水分含量在40-70％的虫草培养后废弃的鲜培养基或经过干燥粉碎的虫草培养后废弃的鲜培养基采用阳离子交换柱提取，即得到重结晶得虫草素。本发明直接应用虫草培养基提取，省去了通常的烘干和粉碎步骤，不使用强碱性溶液，减少了对产品的破坏，使产品达到合格，有机溶剂用量少，使生产工艺更简单，有利于工业化生产。

14)CN102977172A（申请人中国科学院沈阳应用生态研究所，《一种提取虫草素的方法》）：本发明属于医药领域，具体涉及一种提取虫草素的方法。将蛹虫草固体培养残基或菌体样品经粉碎，与水混合，浸提即为粗提液；或蛹虫草液态培养发酵液过滤后，即得粗提液；将上述所得粗提液过滤后，待用；将上述所得粗提液过滤，滤液经反相ODS填料柱吸附，而后依次用水、甲醇水溶液和甲醇洗脱，同时使柱子再生；将所得粗虫草素采用高效液相色谱进行纯化，即得到纯度约95％的虫草素。本发明是一个低污染的绿色环保化工生产过程；制备过程是在常温下完成的，节省了大量能源；产品纯度高。

15)CN102070690A（申请人中国科学院大连化学物理研究所，《一种同时制备腺苷、虫草素、N6-(2-羟乙基)腺苷化学对照品的方法》）：本发明涉及一种同时制备腺苷、虫草素、N6-(2-羟乙基)腺苷三个化学对照品的制备新工艺。蛹虫草提取物，经树脂柱分离及制备高效液相色谱两步高效纯化，即可获得纯度大于98％的腺苷、虫草素、N6-(2-羟乙基)腺苷三种化学对照品。本发明工艺步骤简单、纯度高，易于放大规模生产。

16)CN102060898A（申请人中山大学，《一种虫草素的提取方法》）：本发明公开了一种虫草素的提取方法。它是通过行星球磨法将冬虫夏草子实体研磨成粉末状，可使冬虫夏草粉末粒度达到0.1μm左右，从而增大颗粒的比表面积，有利于虫草素的溶出，利用超声溶解法，在合适的条件下，促进虫草素的溶解，提高提取率，再用活性炭和有机溶剂去除虫草素中色素，黄酮类化合物，多糖和蛋白质等杂质，得到了虫草素产品。相比现有提取虫草素的技术，利用本发明的虫草素提取方法其提取率可高达0.31‰以上，虫草素的纯度达到98％以上，并且本发明操作简便。因此本发明具有操作简便、虫草素提取效率高，纯度高的优点，为虫草素的有效利用创造了条件。

17)CN101475620（申请人华南师范大学，《高效节能的高纯度虫草素提取与生产方法》）：本发明是一种高效节能的高纯度虫草素提取与生产方法。包括从虫草子实体、菌丝体和虫草固体发酵培养基中提取、分离、精制和干燥虫草素四个步骤，其中提取步骤采用柱层析循环提取法；分离步骤采用大孔吸附树脂吸附法；精制步骤采用聚酰胺树脂吸附和沉淀与结晶的方法；干燥步骤采用真空干燥法。本发明由于采用了以上新的方法和工艺；提取过程中不需加热，提取液不需要离心或过滤分离，也不需要浓缩而直接上大孔吸附树脂吸附，使用简单的提取分离设备和最少量的提取溶剂，可使提取率达到95％以上；生产的虫草素产品纯度达到98％以上。是一种提取率高、设备投资低、高效节能的高纯度虫草素的提取与生产方法。

18)CN101124988（申请人江苏瑞迪生科技有限公司，《从蛹虫草中提取精制虫草素和虫草多糖的方法》）：本发明涉及一种从蛹虫草中提取精制虫草素和虫草多糖的方法，属于医药保健、化工领域。将蛹虫草粉末以冷渗法提取过滤，滤渣与乙醇混合，超声波辅助提取、离心，上清液浓缩、醇析。醇析上清液减压浓缩、洗脱，洗脱液浓缩结晶，用正丁醇重结晶，得到精制虫草素；醇析沉淀进行酶解脱蛋白处理、离心，上清液浓缩、洗脱，流出液浓缩、醇析，冷冻干燥后得到精制多糖。本发明的制备过程中只以水和乙醇为溶剂，减少污染，所用树脂可数次重复使用，成本低。本发明方法充分开发利用蛹虫草生物活性成分，实现虫草素和虫草多糖的共同提取，保证了虫草素和虫草多糖的生物活性。最大限度地增加了原料的利用率，降低了生产成本，适合大规模工业化生产。

19)CN101157712（申请人上海市农业科学院，《一种虫草素的分离纯化方法》）：本发明公开了一种虫草素的分离纯化方法，该方法采用蛹虫草固体干燥培养基为原料，用NKA-II型大孔树脂柱和C18柱进行纯化，最后用蒸馏水进行反复重结晶。获得的虫草素纯度达到95％以上。该方法原料来源丰富、成本低廉、工艺简单、纯度高，适合工业化生产。

20)CN104478978A（申请人黑龙江众生生物工程有限公司，《一种蛹虫草腺苷的提取方法》）：本发明公开了一种蛹虫草腺苷的提取方法，其提取方法的具体步骤为：（1）超微粉碎：（2）蛹虫草腺苷的超声仿生提取、酶解提取。本发明的一种蛹虫草腺苷的提取方法，应用酶解技术破除了蛹虫草坚硬的细胞壁，有利于细胞内容物的溶出，有利于提取过程的顺利进行，在保证腺苷的生物活性的同时，提高腺苷的提职率，减少浪费；应用该方法提取得到的腺苷，不仅提取率高，易于后续的分离纯化，而且易于吸收，能够充分发挥腺苷在体内的功效。

21)CN101580755（申请人湖南农业大学，《从蛹虫草中连续提取虫草挥发油、虫草素、虫草酸与虫草多糖的工艺》）：本发明公开了一种从蛹虫草中连续提取虫草挥发油、虫草素、虫草酸与虫草多糖的工艺。是将过40～60目筛的蛹虫草菌丝体粉加入到超临界CO2流体萃取仪中；在压力15-25MPa，温度35-40℃，CO2流量为50-150L/min的条件下，萃取1-3h，在分离釜中分离出蛹虫草挥发油；再用蛹虫草菌丝体粉质量1-3倍的酯类或酮类有机夹带剂继续萃取1-3h萃取分离出虫草素；再用蛹虫草菌丝体粉质量1-3倍的蒸馏水作为夹带剂，萃取1-3h，采用一级分离方式分离出含虫草酸和虫草多糖的水溶液。本发明降低了有机溶剂的使用，提高了生产效率，降低了生产成本。所得到的蛹虫草挥发油的提取得率为6.5％左右，虫草素的提取率为0.049％左右，虫草素的纯度为45％左右，虫草酸的提取率为2％左右。

22)CN102432432A（申请人苏州瑞蓝博中药技术开发有限公司，《一种虫草酸的制备方法》）：本发明涉及一种虫草酸的制备方法，工艺以冬虫夏草为原料，15-20倍量(V/W)的去离子水提取2-3次，提取液通过超滤膜纳滤膜系统除杂，透过液加热浓缩至相对密度为1.30-1.32时，静置结晶，粗结晶用无水乙醇重结晶2-3次，烘干，得到产品。该工艺操作简单，成本较低，纯度较高，循环经济低碳环保。

针对当前虫草仍然以初始原料为主销形式，深加工技术落后，原料利用率低，每年有10-15%品相较差的虫草原料被低值利用或丢弃，造成极大的浪费，经济效益差，农户或企业急需需找实用、有效的开发途径；而以品相比较差的虫草花为原料，采用现代分离纯化技术，获得较高纯度的功能成分将是一条较优的开发途径，可促进虫草类中药新药的研发，实现虫草的升级换代。

发明内容

本发明旨在为开发中药新药或保健食品提供高质量的原料－高纯虫草酸、虫草素，所要解决的技术问题是虫草酸、虫草素的同步高效提取与分离纯化。

为了解决现有技术存在的问题，本发明采用以下具体技术方案：

一种同步提取-组合柱层析-结晶纯化制备虫草酸、虫草素的方法，其特征在于，包括下列步骤：

（1）原料选择：选择品相较差、利用率低的新鲜虫草花为原料，来源于GAP种植基地，具有绿色、稳定等特征；

（2）清洗、除杂：用清水洗涤虫草花表面的灰尘、杂草等附作物，拣选肉眼可见的杂质；

（3）剪切、破碎：沥干后的虫草花先通过切割机将原料长度分切至2cm以下的虫草花碎段，再将虫草花碎段放于胶体磨中，同时向胶体磨中添加虫草花碎段1-1.5倍量的水协同破碎、细胞破壁，转速控制在2500～2800r/mi，得到虫草花浆料；

（4）酶解：将步骤（3）获得的虫草花浆料置于酶解罐中，再添加浆料体积2-3倍的纯净水，虫草花原料质量1-2%的复合酶酶解，酶解温度38-40℃，酶解时间150~180min，得到酶解过的虫草花混合液；

（5）提取、浓缩：将上述酶解过的虫草花混合液用4-5倍体积的0.5-0.8%的醋酸水于50~60℃下动态提取至少两次，再通过200目的滤网过滤，获得提取液，提取液浓缩至1/2体积后准备上柱；

（6）层析分离：将步骤（5）获得的浓缩液上柱，采用组合柱层析分离法，进行分离，选择填料XAD-2型树脂与聚酰胺按质量比为（5-6）：（5-4）的比例搭配，上下组合装柱的形式；流动相选择水、20%乙醇水洗脱；分段收集水洗脱液、真空干燥含量大于70%的虫草酸流份、可获得高纯虫草酸粗品；分段收集20%乙醇洗脱液、真空干燥含量大于70%的虫草素流份、可获得高纯虫草素粗品；

（7）结晶：将上述真空浓缩后虫草酸粗品、虫草素粗品分别在95%乙醇中重结晶2-3次，得到纯度高达90%以上的虫草酸、虫草素；

（8）精制纯化：对纯度90%以上的高纯虫草酸、虫草素，通过亚临界CO2进行逆萃取结晶，控制压力5~6MPa、温度45~55℃、时间40~50min，得到纯度高达98.5%的虫草酸、虫草素。

所述的一种同步提取-组合柱层析-结晶纯化制备虫草酸、虫草素的方法，其特征在于：步骤（4）所述的复合酶由ZN7232中性蛋白酶、GP5814果胶酶、纤维素酶按比例混合配制而得，三者的质量比为：ZN7232中性蛋白酶：GP5814果胶酶：纤维素酶=（1.5-2）：1：1.5。

本发明的优点是：

本发明以品相比较差的虫草花为原料，采用现代分离纯化技术，获得较高纯度的功能成分，是一条较优的开发途径，可促进虫草类中药新药的研发，实现虫草的升级换代。本发明为相关研究单位、企业提供一种集细胞破壁+酶解+弱酸提取+组合柱层析+结晶+亚临界二氧化碳逆萃取结晶的提取分离方法，获得纯度98.5%的虫草酸、虫草素功效成分，其可用于开发高附加值的虫草类中药新药，或添加到虫草深加工产品中，如虫草片、胶囊、注射剂等，实现有效调控其中功能成分的含量，或可用于检测产品中虫草酸、虫草素的纯度。本发明工艺步骤简单、无有害溶剂残留，产品应用广泛、附加值高。本工艺中的溶剂/流动相采用水、乙酸、乙醇等溶剂，绿色、环保。

备注：

（1）蛹虫草中虫草酸含量的测定（HPLC-ELS法)

主要仪器：高效液相色谱仪（HPLC-ELS)

色谱条件：色谱柱胺基柱，流动相乙腈-水溶液（80:20），流动相流速0.5ml/min，漂移管温度90℃。

样品处理及样液配制：供试品溶液的制备取本品粉末(过200目分样筛)约1g，精密称定，置烧杯中，精密加入纯净水40ml，摇匀，超声30min，静置30min，用纯净水定容至50ml容量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

虫草素标准曲线：线性回归方程Y=1.3201X+2.3475，R2=0.9996，浓度线形范围59.375-950μg/mL，X-浓度（μg/mL）为横坐标，Y-峰面积值为纵坐标。

（2）虫草中虫草素含量的测定（HPLC-DAD法）

主要仪器：高效液相色谱仪

色谱条件：色谱柱：C18（5μm4.6×250mm），流动相：乙腈-水溶液（5:95，V/V），流速：1.0ml/min，检测波长：260nm。

样品处理及样液配制：供试品溶液的制备取本品粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入90％甲醇40ml，密塞，摇匀，加热回流30分钟，放冷，用90％甲醇定容至50ml容量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

虫草素标准曲线：线性回归方程Y=70.061X+361.33，R2=0.9998，浓度线形范围16.785-540μg/mL，X-浓度（μg/mL）为横坐标，Y-峰面积值为纵坐标。

具体实施方式：

下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。

实施例1：

同步提取-组合柱层析-结晶纯化制备虫草酸、虫草素的方法，具体操作步骤如下：

（1）原料选择：称取2000g品相较差、利用率低的新鲜虫草花（虫草子实体）原料，其来源于按GAP种植大别山区的基地，具有绿色、稳定等特征；

（2）清洗、除杂：用清水洗涤虫草花表面的灰尘、杂草等附作物，拣选肉眼可见的杂质；

（3）剪切、破碎：沥干后的虫草花先通过切割机将原料长度分切至2cm，再放于胶体磨中破碎，同时添加1L水协同破碎、细胞破壁，转速控制在2500r/min；

（4）酶解：将（3）获得的混合液V体积置于酶解罐中，再添加2V体积的纯净水、1%（虫草花原料质量比）复合酶（ZN7232中性蛋白酶：GP5814果胶酶：纤维素酶=2:1:0.5），控制酶解温度38℃、时间150min。

（5）提取、浓缩：将上述酶解过的虫草花混合液用5倍体积的0.5%的醋酸水于50℃下动态提取3次，再通过200目的滤网过滤，获得提取液，提取液浓缩至1/2体积准备上柱。

（6）层析分离：采用组合柱层析分离法，选择填料XAD-2型树脂与聚酰胺5:5质量比搭配，上下组合装柱的形式；流动相选择水、20%乙醇水洗脱；分段收集水洗脱液、真空干燥70%以上虫草酸流份，可获得9.72g高纯虫草酸粗品；分段收集20%乙醇洗脱液、真空干燥70%以上虫草素流份，可获得0.74g高纯虫草素粗品。

（7）结晶：将上述真空浓缩后高纯虫草酸粗品、虫草素粗品分别在95%乙醇中重结晶2次，得到纯度高达90.8%虫草酸和91.2%的虫草素。

（8）精制纯化：对纯度达90.8%虫草酸通过亚临界CO2进行逆萃取结晶，控制压力5MPa、温度55℃、时间50min，得到纯度高达98.6%的虫草酸3.12g；对纯度达91.2%虫草素通过亚临界CO2进行逆萃取结晶，控制压力6MPa、温度50℃、时间45min，得到纯度高达98.5%的虫草素0.28g。

实施例2：

（1）原料选择：称取2000g品相较差、利用率低的新鲜虫草花（虫草子实体）原料，其来源于按GAP种植大别山区的基地，具有绿色、稳定等特征；

（2）清洗、除杂：用清水洗涤虫草花表面的灰尘、杂草等附作物，拣选肉眼可见的杂质；

（3）剪切、破碎：沥干后的虫草花先通过切割机将原料长度分切至2cm，再放于胶体磨中破碎，同时添加1L水协同破碎、细胞破壁，转速控制在2800r/min；

（4）酶解：将（3）获得的混合液V体积置于酶解罐中，再添加3V体积的纯净水、2%（虫草花原料质量比）复合酶（ZN7232中性蛋白酶：GP5814果胶酶：纤维素酶=1.5:1:0.5），控制酶解温度40℃、时间180min。

（5）提取、浓缩：将上述酶解过的虫草花混合液用4倍体积的0.8%的醋酸水于60℃下动态提取2次，再通过200目的滤网过滤，获得提取液，提取液浓缩至1/2体积准备上柱。

（6）层析分离：采用组合柱层析分离法，选择填料XAD-2型树脂与聚酰胺6:4质量比搭配，上下组合装柱的形式；流动相选择水、20%乙醇水洗脱；分段收集水洗脱液、真空干燥70%以上虫草酸流份，可获得9.98g高纯虫草酸粗品；分段收集20%乙醇洗脱液、真空干燥70%以上虫草素流份，可获得0.83g高纯虫草素粗品。

（7）结晶：将上述真空浓缩后高纯虫草酸粗品、虫草素粗品分别在95%乙醇中重结晶2次，得到纯度高达90.5%虫草酸和90.9%的虫草素。

（8）精制纯化：对纯度达90.5%虫草酸通过亚临界CO2进行逆萃取结晶，控制压力6MPa、温度45℃、时间40min，得到纯度高达98.5%的虫草酸3.39g；对纯度达90.9%虫草素通过亚临界CO2进行逆萃取结晶，控制压力5MPa、温度55℃、时间50min，得到纯度高达98.5%的虫草素0.29g。

Claims (2)

1.一种同步提取-组合柱层析-结晶纯化制备虫草酸、虫草素的方法，其特征在于，包括下列步骤：

（1）原料选择：选择品相较差、利用率低的新鲜虫草花为原料，来源于GAP种植基地，具有绿色、稳定等特征；

（2）清洗、除杂：用清水洗涤虫草花表面的灰尘、杂草等附作物，拣选肉眼可见的杂质；

（3）剪切、破碎：沥干后的虫草花先通过切割机将原料长度分切至2cm以下的虫草花碎段，再将虫草花碎段放于胶体磨中，同时向胶体磨中添加虫草花碎段1-1.5倍量的水协同破碎、细胞破壁，转速控制在2500～2800r/mi，得到虫草花浆料；

（4）酶解：将步骤（3）获得的虫草花浆料置于酶解罐中，再添加浆料体积2-3倍的纯净水，虫草花原料质量1-2%的复合酶酶解，酶解温度38-40℃，酶解时间150~180min，得到酶解过的虫草花混合液；

（5）提取、浓缩：将上述酶解过的虫草花混合液用4-5倍体积的0.5-0.8%的醋酸水于50~60℃下动态提取至少两次，再通过200目的滤网过滤，获得提取液，提取液浓缩至1/2体积后准备上柱；

（6）层析分离：将步骤（5）获得的浓缩液上柱，采用组合柱层析分离法，进行分离，选择填料XAD-2型树脂与聚酰胺按质量比为（5-6）：（5-4）的比例搭配，上下组合装柱的形式；流动相选择水、20%乙醇水洗脱；分段收集水洗脱液、真空干燥含量大于70%的虫草酸流份、可获得高纯虫草酸粗品；分段收集20%乙醇洗脱液、真空干燥含量大于70%的虫草素流份、可获得高纯虫草素粗品；

（7）结晶：将上述真空浓缩后虫草酸粗品、虫草素粗品分别在95%乙醇中重结晶2-3次，得到纯度高达90%以上的虫草酸、虫草素；

（8）精制纯化：对纯度90%以上的高纯虫草酸、虫草素，通过亚临界CO2进行逆萃取结晶，控制压力5~6MPa、温度45~55℃、时间40~50min，得到纯度高达98.5%的虫草酸、虫草素。

2.根据权利要求1所述的一种同步提取-组合柱层析-结晶纯化制备虫草酸、虫草素的方法，其特征在于：步骤（4）所述的复合酶由ZN7232中性蛋白酶、GP5814果胶酶、纤维素酶按比例混合配制而得，三者的质量比为：ZN7232中性蛋白酶：GP5814果胶酶：纤维素酶=（1.5-2）：1：1.5。