CN106906243A - 一种蛹虫草菌株液态发酵的方法 - Google Patents

一种蛹虫草菌株液态发酵的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种蛹虫草菌株液态发酵的方法，包括如下步骤：将蛹虫草菌株接种于液体发酵培养基中，摇床培养，温度控制在19‑21℃之间，摇床转速控制在200‑220rad/min，暗培养8‑14d；液体发酵培养基由五加科植物的果实或根为原料制备得到。本发明的蛹虫草菌株液态发酵的方法，发酵基质主要采用的为五加科植物的果实或根为原料，这种原料比较容易获得不需要添加其他成分，制备过程简单方便、经济环保，采用这种特定的培养基发酵后的产物不仅虫草素含量有所提升，还使得产物中含有大量稀有皂苷成分，且为蛹虫草菌株液态发酵提供了一种更为新颖的操作路线，值得大力推广应用，也填补了相关技术空白。

Description

一种蛹虫草菌株液态发酵的方法
技术领域
本发明涉及蛹虫草菌株发酵领域，具体而言，涉及一种蛹虫草菌株液态发酵的方法。
背景技术
蛹虫草为子囊亚门，麦角菌目，麦角菌科，虫草属，由地下的子座与地上子实体部分两部分组成的复合体，蛹虫草孢子于秋季散播，感染虫体，菌丝生长早虫体中，吸取营养，幼虫体内充满菌丝而死。到了第二年夏秋之际，自幼虫体之上长出草体，9月中旬左右可采集野生蛹虫草。蛹虫草中含有的虫草素具有多种生理学活性，比如抗肿瘤、抗病毒、增强免疫力的作用。
现有技术中，为了获得虫草素一般采用化学合成以及生物合成两种方式。化学合成的方式生产成本比较高，合成工艺又比较复杂、收率低，产物纯化比较困难。生物合成法制备虫草素有两种途径：固体发酵获得虫草子实体，再从中提取；二是通过蛹虫草液体发酵，从发酵产物中直接提取。由于液体发酵比固体发酵在发酵规模、菌体生长速率、生长密度以及可控性上的优势，蛹虫草液体发酵提取虫草素是现如今制备虫草素的主要应用方法，而且发酵方法也比较成熟，但是现如今的发酵方法所提取的虫草素含量维持在一个稳定的水平，在现有工艺条件限制下很难再有新的突破，所用的发酵培养基配制方法比较繁琐，操作比较困难，无形之中也增加了提取虫草素的工作量，耗费人力物力，不经济环保。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蛹虫草菌株液态发酵的方法，发酵基质主要采用的为五加科植物的果实或根为原料，这种原料比较容易获得不需要添加其他成分，制备过程简单方便、经济环保，采用这种特定的培养基发酵后的产物不仅虫草素含量有所提升，还使得产物中含有大量稀有皂苷成分，增加了后续开发的价值，且为蛹虫草菌株液态发酵提供了一种更为新颖的操作路线，值得大力推广应用，也填补了相关技术空白。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明实施例提供了一种蛹虫草菌株液态发酵的方法，包括如下步骤：将蛹虫草菌株接种于液体发酵培养基中，摇床培养，温度控制在19-21℃之间，摇床转速控制在200-220rad/min，暗培养8-14d；
所述液体发酵培养基由五加科植物的果实或根为原料制备得到。
现有技术中，虽然有采用蛹虫草菌株进行液态发酵的方法，但是传统的培养方法一般是应用葡萄糖、蛋白胨和酵母膏为主要成分的发酵培养基，这些成分其实仅能满足蛹虫草基本的生长和发育需要，虫草素含量相对比较低，但是本发明通过采用五加科植物的果实或根为原料来代替葡萄糖、蛋白胨和酵母膏制备培养基，不仅成分简单制备起来更为方便，并且由于五加科植物中富含多种营养成分，更加适宜蛹虫草的生长和发育需要，增加菌丝生长代谢产物，从而进一步提高了虫草素的含量，并且产物中除了常规虫草素还含有稀有的皂苷，相当于通过本发明特殊的发酵基质得到了更为有利用价值的有效成分，增加了后续开发价值。
当然更为优选的五加科植物最好选择为人参果、人参根、西洋参果、西洋参根、三七、绞股兰，更优的为人参果、人参根、西洋参果、西洋参根，因为发明人经过大量的创造性试验后，发现这几种原料不仅本身容易获得，原料来源广泛比较便宜，而且发酵培养得到的虫草素、皂苷的含量高。因此在实际操作过程中最好选择这几种为原料来制备培养基。
在培养过程中，为了配合本发明特定的培养基种类，具体培养过程中培养的温度以及培养的时间均有特定的要求，培养温度需要控制在19-21℃之间，暗培养的时间为8-14d，摇床转速控制在200-220rad/min之间，更优的，培养温度控制在20-21℃之间，摇床转速控制在205-215rad/min。
对于不同的发酵培养基暗培养的时间可能会稍微有所差异。将蛹虫草菌株接种于采用人参果、西洋参果制备的液体发酵培养基中，培养的时间优选为8-10d，将蛹虫草菌株接种于采用人参根、西洋参根制备的液体发酵培养基中，培养的时间优选为12-14d。上述操作条件对于本发明的液态发酵方法是特定的，并只能配合本发明的特定的液体发酵培养基，因为发明人是先选择出最为适宜的液体发酵培养基，然后再对蛹虫草菌株进行发酵培养并摸索出了培养条件，如果采用传统的培养方法具体的培养条件可能会有所差异，培养操作步骤上也会有差异性。
在本发明中，如果发酵培养基是采用人参果、西洋参果制备得到的，那么液体发酵培养基的制备方法包括如下步骤：
采摘新鲜的人参果或西洋参果，榨汁过滤得到果汁，120-125℃之间灭菌10-20min，即得。
优选地，灭菌的温度控制在121-124℃之间，灭菌的时间为15-18min。
整个制备方法简单易行，通过采用新鲜的人参果或者西洋参果，直接榨汁后灭菌即可得到，并不需要添加任何其他成分，易于操作。灭菌的温度与灭菌的时间最好控制适宜，以达到理想的灭菌效果。
如果液体发酵培养基是采用人参根、西洋参根制备得到的，那么液体发酵培养基的制备方法包括如下步骤：将人参根或西洋参根切割、粉碎过筛，加水提取得水提液，添加葡萄糖后灭菌，即得。
人参根或西洋参根先进行预处理切割成小块，优选的切割成颗粒大小1-2cm的块状，更优选的切割成1.5-1.8cm的块状。
优选地，粉碎过筛的目粒度控制在80目以上，更优选为100目以上，粉状的根须更有利于后续提取时有效成分的充分浸出，因此最好形成均一的粉状更有利于后续操作。
优选地，加水提取过程中，添加水量为每克西洋参根或人参根配30-40ml水，水量不宜过大也不宜过小，达到提取的效果即可，加量太大反而会造成浪费也不会进一步提高提取率。
优选地，提取时间控制在3-4h，更优选为3.5-3.8h之间，控制在3h左右基本可以将有效成分充分浸提出来。
优选地，提取后离心分离15-20min以纯化，离心分离的速率控制在8000-10000rad/min，经过离心分离之后能够将其中的杂质分离开来，以达到纯化的效果。
另外，最好在120-125℃之间灭菌10-20min，更优选的灭菌的温度控制在121-124℃之间，灭菌的时间为15-18min。
除此之外，其他五加科的植物比如三七、绞股兰可按照人参根或西洋参根(包括人参主根、西洋参主根)的液体发酵培养基的制备方法进行操作，制备液体发酵培养基的方法比较类似，可以互相来借鉴。
总之，发明人在进行蛹虫草菌株液态发酵的过程中，创造性的选择了特殊的液体发酵培养基，摒弃了以往传统类型的培养基，具有开拓性的意义，并摸索了一条适宜蛹虫草发酵培养的操作过程，其中包括具体培养的时间、摇床的速率、各种液体发酵培养基的具体制备过程这些条件均进行了优化，为后续的实施操作提供了可参考的数据，具有一定的指导意义。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明采用蛹虫草菌株进行液态发酵，发酵基质为五加科植物的果实或根，通过本发明的发酵基质发酵后的产物中含有稀有皂苷和虫草素双重有效成分，虫草素较以往的发酵方法含量上有所提升；
(2)蛹虫草菌株液态发酵多以获得虫草素为目的，本发明通过特殊发酵基质可得到其他中药的有效成分，为蛹虫草菌株与其他中药结合开发提供了新思路，发酵产物中含有稀有皂苷和虫草素双重有效成分，能过分离纯化得到稀有皂苷单体及虫草素，后续开发价值大；
(3)通过本发明的发酵方法很好的利用了人参果果汁、西洋参果汁，因为一般人参果和西洋参果主要用途是获得种子即参籽，其果汁是附加产物没有其他用途，本发明的方法实现了资源的合理化配置，提高了果汁的附加值，为果汁提供了其利用的新途径和新方法。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
蛹虫草菌株液态发酵的方法如下：
1)于每年的9月上中旬，在吉林市左家山区采集野生蛹虫草子实体，选取健壮子实体进行分离纯化，培养基为PDA培养基，分离纯化成功后进行液态发酵；
2)配制液体发酵培养基：新鲜采摘的成熟人参果经榨汁机进行榨汁，粗滤除去人参籽及果皮，滤液经均质即得到人参果果汁，250mL三角瓶装入100mL人参果果汁，120℃，灭菌20min，得到人参果果汁发酵基质；
3)将步骤1)得到的菌种接种于步骤2)中制备好的人参果果汁发酵基质中，摇床中进行培养，温度控制在19℃，摇床转速控制在200rad/min，暗培养8d后，对发酵产物进行虫草素、皂苷含量的测定。
虫草素的具体测定方法：发酵产物与水按比例为1:15，将水加入发酵产物中，进行细胞破碎10min，然后10000r/min，离心10分钟，取上清液无菌滤膜过滤，检测虫草素，色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3(2.1mm×50mm，1.8μm)；流动相：甲醇－水(15∶85，v/v)；流速：0.3mL/min；柱温：35℃；检测波长：260nm；进样量：2μL。经检测后虫草素含量为2.8g/L，
皂苷含量的具体测定方法：发酵产物通过高效液相色谱测定单体皂苷的含量，具体方法为，发酵产物与甲醇按比例为1:5，将甲醇加入发酵产物中，进行细胞破碎10min，超声30min，然后10000r/min，离心10分钟，取上清液无菌滤膜过滤，检测单体皂苷，色谱条件：Acquity UPLC BEHC18色谱柱(2.1mm×50mm，1.7μm)，流动相乙腈－水，梯度洗脱：0-5min，17％-19％乙腈；5-7min，19％-21％乙腈；7-11min，21％-26％乙腈；11-13min，26％-27％乙腈，13-15min，27％-32％乙腈，15-17min，32％-43％乙腈，17-19min，43％-60％乙腈，流速0.5mL/min，检测波长为203nm，柱温35℃，进样量2μL。经检测单体皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、F2、Rg3含量依次为0.13g/L、0.23g/L、1.56g/L、0.22g/L、0.67g/L、0.02g/L、0.14g/L。
实施例2
蛹虫草菌株液态发酵的方法如下：
1)于每年的9月上中旬，在吉林市左家山区采集野生蛹虫草子实体，选取健壮子实体进行分离纯化，培养基为PDA培养基，分离纯化成功后进行液态发酵；
2)配制液体发酵培养基：新鲜采摘的成熟西洋参果经榨汁机进行榨汁，粗滤除去人参籽及果皮，滤液经均质即得到人参果果汁，250mL三角瓶装入100mL人参果果汁，125℃，灭菌10min，得到西洋参果果汁发酵基质；
3)将步骤1)得到的菌种接种于步骤2)中制备好的人参果果汁发酵基质中，摇床中进行培养，温度控制在21℃，摇床转速控制在220rad/min，暗培养10d后，对发酵产物进行虫草素、皂苷含量的测定。
具体测定方法与实施例1的方法一致，经检测后虫草素含量为2.6g/L，单体皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、F2、Rg3含量依次为0.23g/L、0.31g/L、1.16g/L、0.32g/L、0.77g/L、0.03g/L、0.24g/L。
实施例3
蛹虫草菌株液态发酵的方法如下：
1)于每年的9月上中旬，在吉林市左家山区采集野生蛹虫草子实体，选取健壮子实体进行分离纯化，培养基为PDA培养基，分离纯化成功后进行液态发酵；
2)配制液体发酵培养基：人参直须处理成2cm左右的小段，然后用中药粉碎机粉碎，粉末过80目筛，1g人参粉加入30mL水，回流提取3h，然后8000rad/min离心15min，取上清液，1L水提液加入葡萄糖8g，250mL三角瓶装入100mL水提液，120℃，灭菌20min，得到人参直须粉水提液发酵基质；
3)将步骤1)得到的菌种接种于步骤2)中制备好的人参直须粉水提液发酵基质中，摇床中进行培养，温度控制在20℃，摇床转速控制在205rad/min，暗培养12d后，对发酵产物进行虫草素、皂苷含量的测定。
具体测定方法与实施例1的方法一致，经检测后虫草素含量为3.5g/L，单体皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、F2、Rg3含量依次为0.36g/L、1.56g/L、0.67g/L、0.68g/L、3.87g/L、0.05g/L、0.86g/L。
实施例4
蛹虫草菌株液态发酵的方法如下：
1)于每年的9月上中旬，在吉林市左家山区采集野生蛹虫草子实体，选取健壮子实体进行分离纯化，培养基为PDA培养基，分离纯化成功后进行液态发酵；
2)配制液体发酵培养基：西洋参直须处理成3cm左右的小段，然后用中药粉碎机粉碎，粉末过100目筛，1g西洋参粉加入40mL水，回流提取4h，然后10000rad/min离心20min，取上清液，1L水提液加入葡萄糖10g，250mL三角瓶装入100mL水提液，125℃，灭菌10min，得到西洋参直须粉水提液发酵基质；
3)将步骤1)得到的菌种接种于步骤2)中制备好的西洋参根粉水提液发酵基质中，摇床中进行培养，温度控制在20℃，摇床转速控制在210rad/min，暗培养14d后，对发酵产物进行虫草素、皂苷含量的测定。
具体测定方法与实施例1的方法一致，经检测后虫草素含量为3.3g/L，单体皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、F2、Rg3含量依次为0.76g/L、1.26g/L、0.97g/L、0.78g/L、4.87g/L、0.08g/L、1.36g/L。
实施例5
蛹虫草菌株液态发酵的方法如下：
1)于每年的9月上中旬，在吉林市左家山区采集野生蛹虫草子实体，选取健壮子实体进行分离纯化，培养基为PDA培养基，分离纯化成功后进行液态发酵；
2)配制液体发酵培养基：将三七处理成2cm左右的小段，然后用中药粉碎机粉碎，粉末过110目筛，1g三七粉加入35mL水，回流提取4h，然后9000rad/min离心20min，取上清液，1L水提液加入葡萄糖7g，250mL三角瓶装入100mL水提液，120℃，灭菌20min，得到三七粉水提液发酵基质；
3)将步骤1)得到的菌种接种于步骤2)中制备好的三七粉水提液发酵基质中，摇床中进行培养，温度控制在20℃，摇床转速控制在205rad/min，暗培养12d后，对发酵产物进行虫草素、皂苷含量的测定。
具体测定方法与实施例1的方法一致，经检测后虫草素含量为2.6g/L，单体皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、F2、Rg3含量依次为0.96g/L、1.43g/L、0.67g/L、0.98g/L、4.57g/L、0.12g/L、1.56g/L。
实施例6
蛹虫草菌株液态发酵的方法如下：
1)于每年的9月上中旬，在吉林市左家山区采集野生蛹虫草子实体，选取健壮子实体进行分离纯化，培养基为PDA培养基，分离纯化成功后进行液态发酵；
2)配制液体发酵培养基：将绞股兰处理成2-3cm之间的小段，然后用中药粉碎机粉碎，粉末过100目筛，1g绞股兰粉加入40mL水，回流提取3h，然后9000rad/min离心20min，取上清液，1L水提液加入葡萄糖9g，250mL三角瓶装入100mL水提液，125℃，灭菌10min，得到绞股兰粉水提液发酵基质；
3)将步骤1)得到的菌种接种于步骤2)中制备好的绞股兰粉水提液发酵基质中，摇床中进行培养，温度控制在21℃，摇床转速控制在215rad/min，暗培养13d后，对发酵产物进行虫草素、皂苷含量的测定。
具体测定方法与实施例1的方法一致，经检测后虫草素含量为2.7g/L，单体皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、F2、Rg3含量依次为0.76g/L、0.46g/L、0.77g/L、0.68g/L、3.57g/L、0.05g/L、0.96g/L。
比较例1
蛹虫草菌株液态发酵的方法如下：
1)于每年的9月上中旬，在吉林市左家山区采集野生蛹虫草子实体，选取健壮子实体进行分离纯化，培养基为PDA培养基，分离纯化成功后进行液态发酵；
2)配制液体发酵培养基：葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨8g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，溶剂为水，250mL三角瓶装入100mL该发酵培养基，121℃，灭菌20min，制得液体发酵培养基；
3)将步骤1)得到的菌种接种于步骤2)中制备好的液体发酵培养基质中，摇床中进行培养，温度控制在22℃，摇床转速控制在180rad/min，暗培养20d后，对发酵产物进行虫草素、皂苷含量的测定。
具体测定方法与实施例1的方法一致，经检测后虫草素含量为1.3g/L，无皂苷。
从以上的各实施例以及比较例可以看出，本发明实施例的液体发酵培养基不仅本身原料来源广，制备方法简单易行，而且采用该培养基培养发酵后得到的产物中虫草素含量高，还副产有稀有的皂苷，后续开发价值大。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种蛹虫草菌株液态发酵的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将蛹虫草菌株接种于液体发酵培养基中，摇床培养，温度控制在19-21℃之间，摇床转速控制在200-220rad/min，暗培养8-14d；
所述液体发酵培养基由五加科植物的果实或根为原料制备得到。
2.根据权利要求1所述的蛹虫草菌株液态发酵的方法，其特征在于，所述液体发酵培养基由人参果、人参根、西洋参果、西洋参根、三七、绞股兰的其中一种为原料制备得到；
优选地，所述液体发酵培养基由人参果、人参根、西洋参果、西洋参根的其中一种为原料制备得到。
3.根据权利要求2所述的蛹虫草菌株液态发酵的方法，其特征在于，所述人参果、西洋参果的液体发酵培养基的制备方法包括如下步骤：
采摘新鲜的人参果或西洋参果，榨汁过滤得到果汁，120-125℃之间灭菌10-20min，即得。
4.根据权利要求3所述的蛹虫草菌株液态发酵的方法，其特征在于，灭菌的温度控制在121-124℃之间，灭菌的时间为15-18min。
5.根据权利要求2所述的蛹虫草菌株液态发酵的方法，其特征在于，所述人参根、西洋参根的液体发酵培养基的制备方法包括如下步骤：
将人参根或西洋参根切割、粉碎过筛，加水提取得水提液，添加葡萄糖后灭菌，即得。
6.根据权利要求5所述的蛹虫草菌株液态发酵的方法，其特征在于，切割成颗粒大小1-2cm的块状；
优选地，粉碎过筛的目粒度控制在80目以上，更优选为100目以上。
7.根据权利要求5所述的蛹虫草菌株液态发酵的方法，其特征在于，加水提取过程中，添加水量为每克西洋参根或人参根配30-40ml水；
优选地，提取时间控制在3-4h；
优选地，提取后离心分离15-20min以纯化，离心分离的速率控制在8000-10000rad/min；
优选地，120-125℃之间灭菌10-20min。
8.根据权利要求5所述的蛹虫草菌株液态发酵的方法，其特征在于，每升所述水提液添加葡萄糖7-10g，优选的添加葡萄糖8-9g。
9.根据权利要求2-8任一项所述的蛹虫草菌株液态发酵的方法，其特征在于，将蛹虫草菌株接种于采用人参果、西洋参果制备的液体发酵培养基中，培养的时间为8-10d；
将蛹虫草菌株接种于采用人参根、西洋参根制备的液体发酵培养基中，培养的时间为12-14d。
10.根据权利要求2-8任一项所述的蛹虫草菌株液态发酵的方法，其特征在于，培养温度控制在20-21℃之间，摇床转速控制在205-215rad/min。
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