TWI422680B

TWI422680B - 用以培養牛樟芝子實體之培養基及其培養方法

Info

Publication number: TWI422680B
Application number: TW99147137A
Authority: TW
Inventors: Hung Chi Chang
Original assignee: Oasis Bio Tech Co Ltd
Priority date: 2010-12-31
Filing date: 2010-12-31
Publication date: 2014-01-11
Also published as: TW201226562A

Description

用以培養牛樟芝子實體之培養基及其培養方法

本發明係關於一種用以培養牛樟芝子實體之培養基及其培養方法，尤指一種利用含有特殊配方之培養基以培養牛樟芝子實體之培養方法，以生成牛樟芝子實體具有與野生牛樟芝相同之指標性成分。

牛樟芝(Antrodia cinnamomea)屬於非褶菌目、多孔菌科、薄孔菌屬、樟芝種，乃多年生蕈菌類。樟芝為一種木材腐朽真菌，只生長在台灣本土的老齡牛樟樹上。菇體表面孔狀，初生時鮮紅色，漸長變為乳白色、淡紅褐色、淡褐色或淡黃褐色，子實體於牛樟樹幹的中空內部長出，亦有自倒伏牛樟樹枯木底部長出者，有強烈的牛樟香味，氣芳香、味辛苦，新鮮子實體含於口中久之則令舌尖有辛麻之感，乾品含於口中久之則為辛苦之感。

牛樟芝一直以來被視為珍貴的真菌類藥材，在許多研究中發現，三帖類化合物(Triterpenoids)是牛樟芝最重要的成分之一，而此三帖類化合物使牛樟芝具有獨特的苦味，並且牛樟芝的三帖類化合物含量遠超過靈芝。目前已知三帖類化合物的功能包含了防癌、保肝、降血壓等功效。此外，牛樟芝中所含有的其他化合物，例如多醣體、超氧歧化酵素、線苷、β-D-葡聚醣等生理活性成分，皆對於人體生理機能可發揮均衡保健的功效。

由於野生牛樟芝數量稀少取得不易，並且有遭受環境汙染之虞，因此近年來多以人工栽培方法來培養牛樟芝。習知之人工栽培方法包括椴木栽培法、固態栽培法以及液態發酵法。

椴木栽培法係使用枯死的牛樟樹椴木，將牛樟芝菌體植入椴木中，使牛樟芝在椴木中生長，藉此取得牛樟芝子實體。利用該種方法所得到之牛樟芝子實體，其所含有的成分與野生牛樟芝相似，然而，該種培養方式之成本高、培養時間長(約需2年)，不利於量產與推廣。特別是牛樟樹椴木取得不易，使得牛樟芝相關產品之價格高居不下。

固態培養法主要是利用含有營養物質之太空包來培養牛樟芝(亦即既有栽培香菇之方法)，所得到之牛樟芝其外觀雖然與野生牛樟芝相似，但其三帖類化合物之含量低，並且其他主要成分與野生牛樟芝子實體並不相同。

再者，藉由液態發酵法培養牛樟芝雖然可在短時間內收成牛樟芝液體發酵產品，但其主要產物為多醣類，並不含有三帖類化合物，並且其他主要成分與野生牛樟芝子實體相去甚遠。

有鑑於此，必須提供一種新穎的牛樟芝子實體培養方法，藉以有效的培養出牛樟芝子實體，並且其主要成分如三帖類化合物係與野生牛樟芝相似，以有效達到人體保健的效果。

故，有鑑於前述之問題與缺失，發明人以多年之經驗累積，並發揮想像力與創造力，在不斷試作與修改之後，始有本發明之一種用以培養牛樟芝子實體之培養基及其培養方法。

本發明之主要目的係提供一種用以培養牛樟芝子實體之培養基，藉由將培養基之成份及其含量作適當的調整，以提升牛樟芝之培養效率，並可穩定牛樟芝子實體之內含成分。

為達上述目的，本發明係揭露一種用以培養牛樟芝子實體之培養基，係至少包含：馬鈴薯葡萄糖抽出物(potato dextrose broth,PDB)，其濃度為1%~2%(w/v)；葡萄糖(glucose)，其濃度為2.8%~3.6%(w/v)；瓊脂(agar)，其濃度為2.2%~4%(w/v)；及中藥組合物，其濃度為16.7%~40%(w/v)。

本發明之另一目的係提供一種牛樟芝子實體之培養方法，藉由適當調整之培養基成分以及適當之培養條件，以達到高效率之牛樟芝子實體之培養效果，並可減少培養成本、縮短培養時間，以提升量產及推廣之價值。

為達上述目的，本發明係揭露一種牛樟芝子實體之培養方法，至少包含以下步驟：(1)依比例預先混合培養基之各組成成分，該培養基之組成成分包括濃度為1%~2%(w/v)之PDB、濃度為2.8%~3.6%(w/v)之glucose、濃度為2.2%~4%(w/v)之agar以及濃度為16.7%~40%(w/v)之中藥組合物；(2)將混合後之組成成分置入一可滅菌容器中；(3)將二次水加入至該可滅菌容器中，使培養基之各組成成分達到所需之濃度；(4)將可滅菌容器及其內含之培養基溶液進行一滅菌程序；(5)將滅菌後之培養基溶液以一特定體積倒入至少一培養皿中；(6)靜置培養基溶液，待冷卻後便形成一固態培養基；(7)將一牛樟芝菌種接菌至該固態培養基上；以及(8)將含有該牛樟芝菌種之固態培養基放置於一特定環境下培養一特定時間，以生成牛樟芝子實體。

為達前述之目的與功效，發明人利用皿培式培養法來培養牛樟芝子實體，並將培養基之成分及其含量作適當的調配，在不斷的修正與調整之下，始得到本發明之一種用以培養牛樟芝子實體之培養基及其培養方法。

首先對於本發明之該種用以培養牛樟芝子實體之培養基做詳細介紹。本發明所提供之培養基係包含以下成分：馬鈴薯葡萄糖抽出物(potato dextrose broth,PDB)，其濃度為1%~2%(w/v)；葡萄糖(glucose)，其濃度為2.8%~3.6%(w/v)；瓊脂(agar)，其濃度為2.2%~4%(w/v)；及中藥組合物，其濃度為16.7%~40%(w/v)。其中，該培養基之pH值為5.5~7，而該中藥組合物可由黃蓍、山藥、白參、細辛、赤芍、茯苓、黃柏、陳皮、柴胡、葛根、麥門冬、黃精、當歸、紫蘇、羌活、芡實、延胡索、檳榔、蓁艽、金銀花以及黃麻等中藥材料中選擇一或多種成分而搭配使用。

接著對於本發明之該種牛樟芝子實體之培養方法進行詳細介紹。請參照如第一圖所示，係本發明牛樟芝子實體之培養方法步驟圖示。此方法係包含以下步驟：依比例預先混合培養基之各組成成分，該培養基之組成成分包括濃度為1%~2%(w/v)之PDB、濃度為2.8%~3.6%(w/v)之glucose、濃度為2.2%~4%(w/v)之agar以及濃度為16.7%~40%(w/v)之中藥組合物(步驟101)，其中，該中藥組合物可由黃蓍、山藥、白參、細辛、赤芍、茯苓、黃柏、陳皮、柴胡、葛根、麥門冬、黃精、當歸、紫蘇、羌活、芡實、延胡索、檳榔、蓁艽、金銀花以及黃麻等中藥材料中選擇一或多種成分而搭配使用；將混合後之組成成分置入一可滅菌容器中(步驟102)；將二次水加入至該可滅菌容器中，使培養基之各組成成分達到所需之濃度(步驟103)；將培養基溶液之pH值調整至5.5~7(步驟104)；將可滅菌容器及其內含之培養基溶液進行一滅菌程序(步驟105)，其中，該滅菌程序係採用一高溫高壓滅菌法，其溫度為121℃，壓力為15磅/平方英吋，時間為20~30分鐘；將滅菌後之培養基溶液以一特定體積倒入一培養皿中(步驟106)，其中，該特定體積為18~25ml；靜置培養基溶液，待冷卻後便形成一固態培養基(步驟107)；將一牛樟芝菌種接菌至該固態培養基上(步驟108)；以及將含有該牛樟芝菌種之固態培養基放置於一特定環境下培養一特定時間，以生成牛樟芝子實體(步驟109)，其中，該特定環境包括培養溫度為14℃~30℃、培養濕度為65%~95%、空氣進氣量為5-30m³ /min、空氣排氣量為3-10m³ /min，而該特定時間為120天~150天，並且培養溫度、培養濕度、空氣進氣量以及空氣排氣量係依據日夜之變化而加以轉換，藉以模擬野生牛樟芝之生長狀態。

在上述之牛樟芝子實體之培養條件中，培養溫度以及培養濕度更可依培養階段的不同而進行階段性之調整。以總培養時間為120天至150天為例，培養溫度可被區分為前期培養溫度、中期培養溫度以及後期培養溫度，而每一時期包含了40天至50天，其中，前期培養溫度為24℃~30℃、中期培養溫度為20℃~30℃、後期培養溫度為14℃~30℃。培養溼度可被區分為前期培養濕度以及後期培養溼度，而每一時期包含了60天至75天，其中，前期培養濕度為85%~95%、後期培養濕度為65%~95%。

接著以前述之培養基成分以及牛樟芝子實體之培養方法為基礎，提出一較佳實施例之用以培養牛樟芝子實體之培養基及其培養方法，藉由一實際例子以對於本發明之技術精神作更加詳細之介紹。

在本發明之該較佳實施例中，該種用以培養牛樟芝子實體之培養基係包含以下成分：PDB，其濃度為1.5%(w/v)；glucose，其濃度為3.2%(w/v)；agar，其濃度為3.1%(w/v)；中藥組合物，其濃度為28.35%(w/v)，該中藥組合物係包括等量之黃蓍、山藥、白參、細辛以及赤芍等中藥材。以一培養基之體積為20ml為例，每一培養基包含了0.3克之PDB、0.64克之glucose、0.62克之agar、5.67克之中藥組合物，而黃者、山藥、白參、細辛以及赤芍等中藥材分別為1.134克。

接著對於本發明較佳實施例之牛樟芝子實體之培養方法進行詳細介紹。請參照如第二圖所示，係本發明較佳實施例之牛樟芝子實體之培養方法步驟圖示。在本較佳實施例中，係以一個培養基之體積為20ml為例，而各成份便列出一個培養基中的所需含量。此方法係包含以下步驟：預先混合培養基之各組成成分，包括0.3克之PDB、0.64克之glucose、0.62克之agar、5.67克之中藥組合物(步驟201)，其中，黃蓍、山藥、白參、細辛以及赤芍等中藥材分別為1.134克；將混合後之組成成分置入一血清瓶中(步驟202)；將20ml之二次水加入至該血清瓶中(步驟203)；將培養基溶液之pH值調整至7(步驟204)；將血清瓶及其內含之培養基溶液進行一高溫高壓滅菌法(步驟205)，其溫度為121℃，壓力為15磅/平方英吋，時間為20分鐘；將滅菌後之培養基溶液20ml倒入一培養皿中(步驟206)；靜置培養基溶液，待冷卻後便形成一固態培養基(步驟207)；將一牛樟芝菌種接菌至該固態培養基上(步驟208)；以及將含有該牛樟芝菌種之固態培養基培養於前期培養溫度為24℃~30℃、中期培養溫度為20℃~30℃、後期培養溫度為14℃~30℃、前期培養濕度為85%~95%、後期培養濕度為65%~95%、空氣進氣量為5-30m³ /min、空氣排氣量為3-10m³ /min，並且培養時間為135天，以生成牛樟芝子實體(步驟209)。

在野生牛樟芝的成分當中，其包含了25%~30%之酒萃成分，而酒萃成分中又包含了三帖類化合物、單酚類化合物以及二酚類化合物，其中，三帖類化合物已被證實為牛樟芝中苦味以及有效成分的主要來源。而三帖類化合物又包括了麥角甾烷(Ergostane)以及羊毛甾烷(Lanostane)等成分，其中該羊毛甾烷不論在牛樟芝菌絲體或是牛樟芝子實體皆會形成，但是麥角甾烷只會出現於牛樟芝子實體中，由於麥角甾烷中的樟芝酸A(zhankuic acid A)、樟芝酸B(zhankuic acid B)、樟芝酸C(zhankuic acid C)以及antcin K等成分對於抗癌、提升免疫力有很大的功效，因此牛樟芝子實體比牛樟芝菌絲體具有更多方面的功效。

為了證實經由本發明所提供之培養基以及培養方法所得到之牛樟芝子實體確實具有功能性成分之三帖類化合物，即樟芝酸A、B、C以及antcin K，因此將牛樟芝子實體利用高解析液相層析儀(High performance liquid chromatography,HPLC)進行分析，並比對標準品，以確認牛樟芝子實體是否含有前述之成份。請參照如第三圖所示，係利用本發明之培養基以及培養方法所得到之牛樟芝子實體之成份圖示。如圖中所示，本發明之牛樟芝子實體經分析後證實具有樟芝酸A(圖中之元件標號A)、樟芝酸B(圖中之元件標號B)、樟芝酸C(圖中之元件標號C)以及antcin K(圖中之元件標號K)，因此本發明所培養得到之牛樟芝子實體所含有之三帖類化合物與野生牛樟芝非常相似，應具有相當的保健效果。

經由上述內容對於本發明進行詳細說明後，可得知本發明具有以下之優點：

(1)　本發明利用皿培式培養法來培養牛樟芝子實體，不僅可縮短培養時間，更可提升培養成功率(成功率約為90%~95%)以及產量，以增加推廣價值。

(2)　本發明所提供之培養基成份，在進行適當調整之後，可提升牛樟芝之培養效率，並可穩定牛樟芝子實體之三帖類生成量。

(3)　藉由本發明所提供之培養方法，可有效控制牛樟芝子實體之生長狀況，並藉由模擬野生牛樟芝之生長環境，使本發明之牛樟芝子實體之內含成份能非常接近於野生牛樟芝，以達到相當的保健效果。

以上所述之實施例僅係說明本發明之技術思想與特點，其目的在使熟習此項技藝之人士能夠瞭解本發明之內容並據以實施，當不能以之限定本發明之專利範圍，若依本發明所揭露之精神作均等變化或修飾，仍應涵蓋在本發明之專利範圍內。

發明人經過不斷的構想與修改，最終得到本發明之設計，並且擁有上述之諸多優點，實為優良之發明，應符合申請發明專利之要件，特提出申請，盼　貴審查委員能早日賜與發明專利，以保障發明人之權益。

101～109．．．本發明之牛樟芝子實體之培養方法步驟編號

201～209．．．本發明較佳實施例之牛樟芝子實體之培養方法步驟編號

A．．．樟芝酸A

B．．．樟芝酸B

C．．．樟芝酸C

K．．．antcin K

第一圖　係本發明牛樟芝子實體之培養方法步驟圖示；

第二圖　係本發明一較佳實施例之牛樟芝子實體之培養方法步驟圖示；及

第三圖　係利用本發明之培養基以及培養方法所得到之牛樟芝子實體之成份圖示。

101～109．．．本發明之牛樟芝子實體之培養方法步驟編號

Claims

一種用以培養牛樟芝子實體之培養基，係至少包含：一馬鈴薯葡萄糖抽出物(potato dextrose broth,PDB)，其濃度為1.5%(w/v)；一葡萄糖(glucose)，其濃度為3.2%(w/v)；一瓊脂(agar)，其濃度為3.1%(w/v)；及一中藥組合物，其濃度為28.35%(w/v)，且該中藥組合物係包括等量之黃蓍、山藥、白參、細辛以及赤芍；其中，於一培養基之中，每20ml體積的該培養基係包含了0.3克之馬鈴薯葡萄糖抽出物、0.64克之葡萄糖、0.62克之瓊脂、5.67克之中藥組合物，而黃蓍、山藥、白參、細辛以及赤芍則分別為1.134克。
如申請專利範圍第1項所述之該種用以培養牛樟芝子實體之培養基，其中，該培養基之pH值為5.5~7。
一種牛樟芝子實體之培養方法，至少包含以下步驟：(1)依比例預先混合一培養基之組成成分，該培養基之組成成分包括濃度為1.5%(w/v)之一馬鈴薯葡萄糖抽出物(potato dextrose broth,PDB)、濃度為3.2%(w/v)之一葡萄糖(glucose)、濃度為3.1%(w/v)之一瓊脂(agar)以及濃度為28.35%(w/v)之一中藥組合物，其中，該中藥組合物係包括等量之黃蓍、山藥、白參、細辛以及赤芍； (2)將混合後之組成成分置入一可滅菌容器中；(3)將二次水加入至該可滅菌容器中，使培養基之各組成成分達到所需之濃度；(4)將可滅菌容器及其內含之培養基溶液進行一滅菌程序；(5)將滅菌後之該培養基的溶液以一特定體積倒入至少一培養皿中，其中該特定體積為20ml，並且每20ml體積的該培養基係包含了0.3克之馬鈴薯葡萄糖抽出物、0.64克之葡萄糖、0.62克之瓊脂、5.67克之中藥組合物，而黃蓍、山藥、白參、細辛以及赤芍則分別為1.134克；(6)靜置培養基溶液，待冷卻後便形成一固態培養基；(7)將一牛樟芝菌種接菌至該固態培養基上；以及(8)將含有該牛樟芝菌種之固態培養基放置於一特定環境下培養120天~150天，以生成牛樟芝子實體，其中該特定環境包括培養溫度為14℃~30℃、培養濕度為65%~95%、空氣進氣量為5-30m³ /min、空氣排氣量為3-10m³ /min。
如申請專利範圍第3項所述之該種牛樟芝子實體之培養方法，其中，完成步驟(3)之後，更可進行一pH值調整之步驟，以將培養基溶液之pH值調整至5.5~7。
如申請專利範圍第3項所述之該種牛樟芝子實體之培養方法，其中，步驟(4)所述之該滅菌程序係採用一高溫高壓滅菌法，其溫度為121℃，壓力為15磅/平方英吋，時間為20~30分鐘。