TW201737793A - 無菌培養牛樟芝子實體之方法 - Google Patents

無菌培養牛樟芝子實體之方法 Download PDF

Info

Publication number
TW201737793A
TW201737793A TW105112108A TW105112108A TW201737793A TW 201737793 A TW201737793 A TW 201737793A TW 105112108 A TW105112108 A TW 105112108A TW 105112108 A TW105112108 A TW 105112108A TW 201737793 A TW201737793 A TW 201737793A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
cultivating
medium
content
antrodia camphorata
fruit body
Prior art date
Application number
TW105112108A
Other languages
English (en)
Inventor
陳秀男
Original Assignee
陳秀男
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 陳秀男 filed Critical 陳秀男
Priority to TW105112108A priority Critical patent/TW201737793A/zh
Priority to US15/342,160 priority patent/US10584311B2/en
Publication of TW201737793A publication Critical patent/TW201737793A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G18/00—Cultivation of mushrooms
    • A01G18/20—Culture media, e.g. compost
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G18/00—Cultivation of mushrooms
    • A01G18/40—Cultivation of spawn
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G18/00—Cultivation of mushrooms
    • A01G18/50—Inoculation of spawn

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

一種培養牛樟芝子實體之方法，係包括：將牛樟芝菌種接菌至經滅菌之洋菜培養基，進行繼代培養，以產生次級菌絲體，並於該繼代培養過程中篩選出無變種及無毒性的次級菌絲體，以及，以該經篩選出無變種及無毒性的次級菌絲體進行該繼代培養，以產生子實體。

Description

無菌培養牛樟芝子實體之方法
本發明係關於一種培養牛樟芝子實體之方法，尤指一種無菌培養牛樟芝子實體之方法。
牛樟芝(Antrodia cinnamomea)屬於非褶菌目、多孔菌科、薄孔菌屬、樟芝種，乃多年生蕈菌類。樟芝為一種木材腐朽真菌，只生長在台灣本土的老齡牛樟樹上。菇體表面孔狀，初生時鮮紅色，漸長變為乳白色、淡紅褐色、淡褐色或淡黃褐色，子實體於牛樟樹幹的中空內部長出，亦有自倒伏牛樟樹枯木底部長出者，有強烈的牛樟香味。
牛樟芝一直以來被視為珍貴的真菌類藥材，在許多研究中發現，三帖類化合物(Triterpenoids)是牛樟芝最重要的成分之一，並且牛樟芝的三帖類化合物含量遠超過靈芝。此外，牛樟芝中所含有的其他化合物，例如多醣體、超氧歧化酵素、線苷、β-D-葡聚醣等生理活性成分，皆對於人體生理機能可發揮均衡保健的功效。三萜類的主要功能有抑制癌細胞的生長、抑制組織胺的釋放，防止過敏、促進肝功能、促進血小板凝集、以及降血脂等作用。三萜類的 含量及種類愈多，則愈有醫療價值。從實驗證實：三萜類化合物能抑制肝癌細胞的增殖。高血壓患者往往因為血壓高，導致腦血管破裂而中風，三萜類化合物能有效的抑制Angiotensin Converting Enzyme(ACE)的活性，進而降低血壓。另外三萜類也具有抗發炎之功用。
由於牛樟樹已列入國家保育類植物，不准砍伐，牛樟芝採集不易，且品質不一。另外由於環境污染日漸嚴重，天然野生樟芝可能多少含有重金屬污染。因此近年來多以人工栽培方法來培養牛樟芝。根據第I422680號台灣專利之揭示，習知之人工栽培方法包括椴木栽培法、固態栽培法以及液態發酵法。
然而，椴木栽培法無法在無菌的環境中進行，因此容易受到其他微生物的污染，且椴木來源不易控管，也有受到污染的可能。椴木栽培法的牛樟芝在動物實驗結果中顯示具有腎上腺毒性，也會造成老鼠肝臟與卵巢的重量增加。
固態培養法主要是利用含有營養物質之太空包來培養牛樟芝(亦即既有栽培香菇之方法)，所得到之牛樟芝其外觀雖然與野生及/或椴木栽培的牛樟芝相似，但其三帖類化合物之含量低，並且其他主要成分與野生及/或椴木栽培的牛樟芝子實體並不相同。
再者，一般藉由液態發酵法培養牛樟芝雖然可在短時間內收成牛樟芝液體發酵產品，但其主要產物為多醣類，並不含有三帖類化合物，並且其他主要成分與野生及/或椴木栽培的牛樟芝子實體相去甚遠。
有鑑於此，必須提供一種新穎的牛樟芝子實體培養方法，在無菌的環境下可有效的培養出牛樟芝子實體，並且其主要成分如三帖類化合物係與野生及/或椴木栽培的牛樟芝相似，以有效達到人體保健的效果。
本發明提供一種培養牛樟芝子實體之方法，係包括：將牛樟芝菌種接菌至經滅菌之洋菜培養基，以繼代培養產生次級菌絲體，並於該繼代培養過程中篩選出無變種及無毒性的次級菌絲體，以及，以該經篩選出無變種及無毒性的次級菌絲體進行該繼代培養，以產生子實體。
前述洋菜培養基包含：YM洋菜培養基質；食用油，且以該洋菜培養基總重計，該食用油之含量係大於0%至1%；以及酵母抽出物，且以該洋菜培養基總重計，該酵母抽出物之含量係大於3%至5%。前述洋菜培養基中之其餘組份為水。
本發明復提供一種培養牛樟芝子實體之方法，係於該洋菜培養基繼代培養，以產生無變種及無毒性的次級菌絲體及子實體以後，復自該洋菜培養基篩選出該無變種及無毒性的次級菌絲體及/或子實體，並接種該無變種及無毒性的次級菌絲體及/或子實體至容器內之經滅菌之固態培養基繼續培養出次級菌絲體及子實體。
前述固態培養基包含至少一種穀物之固態部分；以及含有糖類化合物、酵母抽出物、及食用油之液態部分，其中，以該液態部分總重計，該糖類化合物之含量係3%至5 %，該酵母抽出物之含量係3%至5%，及該食用油之含量係大於0%至1%，且該液態部分在該容器內之高度係自該固態部分之半高處至與該固態部分頂面等高處。前述固態培養基中之其餘組份為水。
本發明復提供一種培養牛樟芝子實體之方法，係於該洋菜培養基繼代培養，以產生無變種及無毒性的次級菌絲體以後，自該洋菜培養基取出該無變種及無毒性的次級菌絲體，並接種該無變種及無毒性的次級菌絲體至容器內之經滅菌之液態培養基培養出子實體，其中，該液態培養基包含：糖類化合物；酵母抽出物；以及食用油，其中，以該液態培養基總重計，該糖類化合物之含量係3%至5%，該酵母抽出物之含量係3%至5%，及該食用油之含量係大於0%至1%。
本發明復提供一種培養牛樟芝子實體之方法，係包括將該固態培養基培養出之無變種及無毒性的次級菌絲體接種至容器內之經滅菌之液態培養基培養出子實體，其中，該液態培養基包含：糖類化合物；酵母抽出物；以及食用油，其中，以該液態培養基總重計，該糖類化合物之含量係3%至5%，該酵母抽出物之含量係3%至5%，及該食用油之含量係大於0%至1%。
本發明無菌培養牛樟芝子實體之方法係於無菌環境中將牛樟芝菌種接種於洋菜培養基，繼代培養，產生無變種及無毒性的次級菌絲體後，藉此可由該無變種及無毒性的次級菌絲體直接培養得到無毒和無汙染之牛樟芝子實 體，且該牛樟芝子實體具有與野生及/或椴木栽培的牛樟芝相同之指標性成分。
第1圖為繼代培養所得之牛樟芝子實體的照片；第2圖為固態培養所得之牛樟芝子實體的照片；第3圖為固態培養所得之牛樟芝子實體的照片；第4圖為液態培養所得之牛樟芝子實體的照片；第5圖為市售牛樟芝子實體標準品(含11種標準品)之HPLC圖譜；第6圖為野生(及/或椴木培養)5.5年齡牛樟芝子實體之HPLC圖譜；第7圖為本案實施例2固態培養所得之牛樟芝子實體之HPLC圖譜；第8圖為本案實施例3固態培養所得之牛樟芝子實體之HPLC圖譜；第9圖為本案實施例4液態培養所得之牛樟芝子實體之HPLC圖譜。
以下係藉由特定的具體實施例說明本發明之實施方式，熟習此專業之人士可由本說明書所揭示之內容輕易地瞭解本發明之優點及功效。本發明亦可藉由其它不同之實施方式加以施行或應用，本說明書中的各項細節亦可基於不同觀點與應用，在不悖離本發明所揭示之精神下賦予不同之修飾與變更。
本文所述「基質」係指在整體重量含量中佔50%以上者。
一般，當菌種於適當的環境時可萌發出菌絲，此菌絲細胞含單細胞核，即為初級菌絲體。本文所述「次級菌絲體」係指，當兩個可親和的單核菌絲相遇時，接觸的菌絲壁會融解，雙方的一個細胞核會相互移動到對方的細胞內，進行有絲分裂，形成雙核的菌絲，並以共軛分裂的方式成長，即稱為次級菌絲體。
本發明提供之培養牛樟芝子實體之方法，係可於繼代培養時獲得牛樟芝子實體，或者在繼代培養後，接續進行固態培養或液態培養，皆可獲得牛樟芝子實體。
在繼代培養的部分，係包括：將牛樟芝菌種接菌至經滅菌之洋菜培養基，進行繼代培養以產生次級菌絲體，並於該繼代培養過程中篩選出無變種及無毒性的次級菌絲體，以及，以該經篩選出無變種及無毒性的次級菌絲體進行該繼代培養，以產生子實體。
洋菜培養基之準備，係以YM洋菜培養基質為基底，混合食用油及酵母抽出物，使該洋菜培養基中所含之食用油以該洋菜培養基總重計之含量大於0%至1%；而該酵母抽出物以該洋菜培養基總重計之含量係大於3%至5%。此外，前述酵母抽出物可選擇一般市售的產品，並無特別限制。
接著將洋菜培養基之溶液置入可滅菌容器中，進行一般常用之滅菌程序，如使用一般實驗室微生物培養常見之 滅菌釜，藉由於密閉高壓下，產生高溫飽和之蒸汽進行濕熱滅菌，滅菌後，將該洋菜培養基之溶液倒入至少一個培養皿中，靜置及待冷卻後，形成固態之洋菜培養基。之後，將牛樟芝菌種接菌至該洋菜培養基進行繼代培養，發明人意外地發現於特定環境下繼代培養，可生長出牛樟芝的次級菌絲體，接著生長出顆粒狀牛樟芝子實體，該牛樟芝子實體所含之三萜類成份，非常接近於野生及/或椴木培養的牛樟芝之三萜類成份。
於繼代培養過程中，該無變種及無毒性的次級菌絲體係於培養出至少第1繼代後(包含第1繼代)篩選者，並繼續進行該繼代培養以產生牛樟芝子實體。
於繼代培養的過程中，例如在第1繼代時，即可篩選出無變種及無毒性的次級菌絲體，繼續進行該繼代培養以產生牛樟芝子實體。
此外，本發明培養牛樟芝子實體之方法中，該食用油為任何可食用之油脂，如植物油、動物油或食用精油，較佳為牛樟芝精油。較佳地，以該洋菜培養基總重計，該食用油之含量係0.5%。
於一具體實施例中，係於該洋菜培養基繼代培養，以產生無變種及無毒性的次級菌絲體及子實體以後，自該洋菜培養基篩選出該無變種及無毒性的次級菌絲體及/或子實體，並接種該無變種及無毒性的次級菌絲體及/或子實體至容器內經滅菌之固態培養基，培養出無變種及無毒性的次級菌絲體及子實體。此外，係可自該洋菜培養基取出不 同繼代之無變種及無毒性的次級菌絲體及/或子實體進行雜交培養。
前述固態培養基包含至少一種穀物之固態部分；以及含有糖類化合物、酵母抽出物、及食用油之液態部分。於一具體實施例中，該固態部分包含複數種穀物，例如二種穀物，且以該固態部分總重計，各該穀物的含量係40至60%。在非限制性的實例中，穀物係選自如黑糯米之米或可選自燕麥米。
於一具體實施例中，該固態部分包含40至60%黑糯米及40至60%燕麥米，較佳為50%黑糯米及50%燕麥米。
該糖類化合物的選擇上並沒有特別限制，可選自單糖或雙糖，於一具體實施例中，該糖類化合物係選自葡萄糖、甘露糖及海藻糖所組成群組的至少一者。
該固態培養基中，以該液態部分總重計，該糖類化合物之含量係3%至5%，該酵母抽出物之含量係3%至5%，及該食用油之含量係大於0%至1%，且該液態部分在該容器內之高度係自該固態部分之半高處至與該固態部分頂面等高處。於一具體實施例中，該液態部分包含20%酵母抽出物、20%葡萄糖、20%甘露糖、20%海藻糖及0.5%牛樟芝精油。
在進行固態培養前，先將該固態培養基置入可滅菌容器中，進行一般常用之滅菌程序，接著，自該洋菜培養基篩選出無變種及無毒性的次級菌絲體及/或子實體，並接種該無變種及無毒性的次級菌絲體及/或子實體至容器內該 經滅菌之固態培養基繼續培養出子實體。通常，自該洋菜培養基篩選出之無變種及無毒性的次級菌絲體，經固態培養20天至1個月，可繼續生成次級菌絲體，進行變種及毒性之篩選，僅篩選出無變種及無毒性的次級菌絲體再繼續培養1個月到3個月，可生成牛樟芝子實體。若自該洋菜培養基篩選出無變種及無毒性的子實體，經培養3個月至6個月，可生成牛樟芝子實體。
於另一具體實施例中，係於該洋菜培養基繼代培養，以產生無變種及無毒性的次級菌絲體後，自該洋菜培養基取出該無變種及無毒性的次級菌絲體，並接種該無變種及無毒性的次級菌絲體至容器內經滅菌之液態培養基培養出子實體，其中，該液態培養基包含：糖類化合物；酵母抽出物；以及食用油，其中，以該液態培養基總重計，該糖類化合物之含量係3%至5%，該酵母抽出物之含量係3%至5%，及該食用油之含量係大於0%至1%。
於又一具體實施例中，係包括將該固態培養基培養出之無變種及無毒性的次級菌絲體接種至容器內經滅菌之液態培養基培養出子實體，其中，該液態培養基包含：糖類化合物；酵母抽出物；以及食用油，其中，以該液態培養基總重計，該糖類化合物之含量係3%至5%，該酵母抽出物之含量係3%至5%，及該食用油之含量係大於0%至1%。
於該容器內之液態培養基培養出子實體的步驟包括：在培養至停止期前，攪拌該液態培養基；以及停止攪拌該液態培養基，提升該液態培養基濃度，使該無變種及 無毒性的次級菌絲體浮至該液態培養基之液面，以靜置培養出子實體。
該停止期係指一般咸知之菌絲體的生長隨時間變化呈現菌絲體數目無淨增加的期間，根據本發明之方法，可於培養過程檢測以判斷是否達到停止期。於部分具體實施例中，該停止期係培養後之第20天至1個月。
另外，可使用各種方法提升該液態培養基濃度，於一具體實施例中，係藉由提升該酵母抽出物及糖類的濃度，使該無變種及無毒性的次級菌絲體浮至該液態培養基之液面，以靜置培養出子實體。此外，於非限制性實施例中，係提升該液態培養基濃度5倍，並可經3個月至6個月的培養，生成牛樟芝子實體。
另外，於一具體實施例中，該液態培養基包含4%之酵母抽出物、4%之糖類及0.5%之食用油，較佳為4%之酵母抽出物、4%之葡萄糖及0.5%之牛樟芝精油。由於牛樟芝精油含量較低，提升該液態培養基濃度時，亦可僅提高酵母抽出物及糖類的濃度，例如使酵母抽出物和葡萄糖的濃度提升為20%之酵母抽出物和20%之葡萄糖。
根據本發明之方法，該特定環境係指於60至70%之相對濕度環境進行該繼代培養。
於一具體實施例中，該特定環境係指於60至70%之相對濕度環境進行培養，且每天至少10至14小時的時間控制培養的溫度在24至27℃；每天至少10至14小時的時間控制培養的溫度在19至23℃。
於另一具體實施例中，該特定環境係指於60至70%之相對濕度環境進行培養，且每天至少10至14小時的時間控制培養的溫度在24至27℃，較佳地，令該溫度對應在日照，例如白天的時間；每天至少10至14小時的時間控制培養的溫度在19至23℃，並令該溫度對應在非日照，例如晚上的時間。
於一具體實施例中，不以地理位置不同所造成的差異為限制，當白天的時間為6點至18點，則對應該時段，每天至少10至14小時的時間控制培養的溫度在24至27℃，並施以天然或人工日照，尤其至少90%的控溫時間對應在白天的時間。
於一具體實施例中，不以地理位置不同所造成的差異為限制，當晚上的時間為18點至6點，則對應該時段，每天至少10至14小時的時間控制培養的溫度在19至23℃，且不施以日照，尤其至少90%的控溫時間對應在晚上的時間。
此外，本發明之培養牛樟芝子實體之方法中，可於任何步驟中針對牛樟芝次級菌絲體及/或牛樟芝子實體進行無變種及無毒性的篩選。
實施例1-繼代培養
以YM洋菜培養基質(YM agar，購自acumedia)作為基底，混合食用油及酵母抽出物(購自豐味通)，使洋菜培養基包含0.5%牛樟芝精油及4%酵母抽出物(其餘組份為 水)，將混合後之洋菜培養基之溶液置入可滅菌容器中，將可滅菌容器及其內含之洋菜培養基之溶液以滅菌釜進行滅菌程序，將滅菌後之洋菜培養基之溶液倒入多個培養皿中，靜置該洋菜培養基之溶液，待冷卻後便形成固態洋菜培養基。
將牛樟芝菌種接菌至該固態洋菜培養基，接著將含有該牛樟芝菌種之固態洋菜培養基放置於特定環境下培養，以生成牛樟芝次級菌絲體，該特定環境為白天(6點至18點)時保持溫度24至27℃，晚上(18點至6點)時保持溫度19至23℃，且相對濕度範圍為60至70%。
在該繼代的過程中，在第1繼代就進行變種及毒性之篩選，僅挑出無變種及無毒性的次級菌絲體繼續進行繼代，其中，繼代1代需要20天至1個月。最後由該無變種及無毒性的次級菌絲體長出子實體，並於採收時，再次進行變種及毒性之篩選。第1圖為繼代培養所得之牛樟芝子實體的照片。
實施例2-固態培養
預先準備固態培養基至可滅菌容器中，該固態培養基包括固態部分及液態部分，該固態部分包含50%黑糯米及50%燕麥米，該液態部分包含20%酵母抽出物、20%葡萄糖、20%甘露糖、20%海藻糖及0.5%牛樟芝精油，其中，該液態部分在該容器內之高度係達該固態部分頂面等高處。將可滅菌容器及其內含之固態培養基以滅菌釜進行滅 菌程序，自實施例1取出無變種及無毒性的次級菌絲體於該固態培養基培養，該固態培養基係放置於如實施例1之環境下培養20天至1個月，以生成牛樟芝次級菌絲體，僅篩選出無變種及無毒性的牛樟芝次級菌絲體再繼續培養1個月到3個月，以生成牛樟芝子實體。最後長出子實體要採收時，再次進行變種及毒性之篩選。第2圖為固態培養所得之牛樟芝子實體的照片。
實施例3-固態培養
使用與實施例2相同之固態培養基及滅菌步驟，自實施例1篩選出無變種及無毒性的子實體於該固態培養基培養，該固態培養基係放置於如實施例1之環境下培養3個月至6個月，以生成牛樟芝子實體。最後長出子實體要採收時再次進行變種及毒性之篩選。第3圖為固態培養所得之牛樟芝子實體的照片。
實施例4-液態培養
預先準備液態培養基，該液態培養基包含4%酵母抽出物、4%葡萄糖及0.5%牛樟芝精油，將該液態培養基置入可滅菌容器中，將可滅菌容器及其內含之液態培養基以滅菌釜進行滅菌程序，自實施例1取出無變種及無毒性的次級菌絲體於該液態培養基攪拌培養，該液態培養基係放置於如實施例1之環境下培養至停(靜)止期時(20天至1個月)停止攪拌，接著將該液態培養基濃度提高5倍(即提高酵母 抽出物之濃度至20%，提高葡萄糖之濃度至20%，且不增加牛樟芝精油脂濃度)，此時該無變種及無毒性的次級菌絲體因液體濃度增加而浮至液面，再繼續培養3個月至6個月，以生成牛樟芝子實體。最後長出子實體要採收時，再次進行變種及毒性之篩選。第4圖為液態培養所得之牛樟芝子實體的照片。
測試例1-三萜類化合物之種類與含量測試
為了證實經由本發明培養方法所得到之牛樟芝子實體確實具有功能性成分之三帖類化合物，藉由HPLC圖譜比對市售牛樟芝子實體標準品(a)及野生及/或椴木培養5.5年齡牛樟芝子實體(b)、本案實施例2固態培養所得之牛樟芝子實體(c)、本案實施例3固態培養所得之牛樟芝子實體(d)與本案實施例4液態培養所得之牛樟芝子實體(e)。
受試樣本三萜類化合物之萃取
分別秤取50毫克的(a)至(e)，加入5毫升去離子水，至於80℃水浴槽中取萃兩次(每次3小時)。接著進行離心並去除上清液(含水溶性物質)，將下層固體物進行冷凍乾燥並秤重。乾燥後的物質，加入50倍體積的絕對乙醇(購自SIGMA NO.32221))，進行三萜類化合物萃取1.5小時，再離心收集上清液(含三萜類化合物)，重複進行三次。將收集的上清液，進行冷凍乾燥，乾燥後以10毫升絕對乙醇覆溶成水溶液(a)至(e)，使用HPLC儀器進行三萜類化合物種類分析。
HPLC分析方法
吸取2微升(ul)的水溶液(a)至(e)，打入HPLC儀器中，以流速200微升/分鐘(ul/min)的速率，通過C18管柱(2.1 x 100mm，粒徑3微米)，以偵測波長244奈米進行分析比對。
HPLC分析結果 市售牛樟芝子實體標準品-水溶液(a)：
市售牛樟芝子實體標準品包含11種標準品，如第5圖所示各標準品滯留時間為(1)樟芝酸K(Antcin K)為22.94與23.43分鐘，(2)苯並二噁茂(Benzodioxole)為25.82分鐘，(3)樟芝甲酯K(Methyl antcinate K)為31.47與31.77分鐘，(4)樟芝酸C(Antcin C)為35.34與36.27分鐘，(5)樟芝酸H(Antcin H，Zhankuic acid C)為36.99與37.49分鐘，(6)去氫硫色多孔菌酸(Dehydrosulphurenic acid)為41.86分鐘，(7)樟芝酸B(Antcin B)為44.82與45.10分鐘，(8)齒孔酸(Eburicoic acid)為50.17分鐘，(9)樟芝酸A(Antcin A)為52.41分鐘，(10)樟芝甲酯b(Methyl antcinate b)為57.40分鐘，(11)去氫齒孔酸(Dehydroeburicoic acid)為73.05分鐘。
野生(及/或椴木培養)5.5年齡牛樟芝子實體-三萜類萃取液(b)：
比對市售標準品，如第6圖所示，野生(及/或椴木培養)5.5年齡牛樟芝子實體的三萜類種類包含9種(1)Antcin K為24.15與24.65分鐘，(3)Methyl antcinate K為32.61與32.64分鐘，(4)Antcin C為36.67與37.62分鐘，(5)Antcin H(Zhankuic acid C)為38.29與38.78分鐘，(6) Dehydrosulphurenic acid為43.17分鐘，(7)Antcin B為46.28分鐘，(8)Eburicoic acid為51.20分鐘，(9)Antcin A為54.03分鐘，(11)Dehydroeburicoic acid為74.97分鐘。
比對出之三萜類化合物之種類含量百分比。計算方式為，圖譜中每個高峰(peak)進計算出其面積大小，將每個高峰(peak)面積相加後為總含量。將比對到的三萜化合物面積除以總含量面積，即可得含量百分比。所得之三萜含量約為：(1)13.26%、(3)1.32%、(4)3.98%、(5)11.94%、(6)33.16%、(7)4.14%、(8)1.32%、(9)2.65%以及(11)21.22%。
本案實施例2固態培養所得之牛樟芝子實體-三萜類萃取液(c)：
比對市售標準品，如第7圖所示，本案實施例2固態培養所得之牛樟芝子實體的三萜類種類包含7種(1)Antcin K為25.28與25.95分鐘，(4)Antcin C為36.83與38.01分鐘，(5)Antcin H(Zhankuic acid C)為38.69與38.94分鐘，(6)Dehydrosulphurenic acid為43.35分鐘，(7)Antcin B為46.53分鐘，(9)Antcin A為54.18分鐘，(11)Dehydroeburicoic acid為75.05分鐘。
比對出之三萜類化合物之種類含量百分比，計算方式如前述。所得之三萜含量約為：(1)27.62%，(4)24.86%，(5)15.19%，(6)6.90%，(7)5.52%，(9)1.65%以及(11)2.76%。
本案實施例3固態培養所得之牛樟芝子實體-三萜類萃取液(d)：
比對市售標準品，如第8圖所示，本案實施例3固態培養所得之牛樟芝子實體的三萜類種類包含7種(1)Antcin K為24.533與25.179分鐘，(2)Benzodioxole 4.97%為26.88分鐘，(5)Antcin H(Zhankuic acid C)為39.57與40.06分鐘，(6)Dehydrosulphurenic acid為43.95分鐘，(7)Antcin B為47.21分鐘，(8)Eburicoic acid為51.58分鐘，(10)Methyl antcinate b為61.87分鐘(11)Dehydroeburicoic acid為75.42分鐘。
比對出之三萜類化合物之種類含量百分比，計算方式如前述。所得之三萜含量約為：(1)Antcin K 3.98%，(2)Benzodioxole 4.97%，(5)Antcin H(Zhankuic acid C)4.97%，(6)Dehydrosulphurenic acid 9.95%，(7)Antcin B 7.96%，(8)Eburicoic acid 5.97%，(10)Methyl antcinate b 1.99%以及(11)Dehydroeburicoic acid 8.95%。本案實施例4液態培養所得之牛樟芝子實體-三萜類萃取液(e)： 比對市售標準品，如第9圖所示，本案實施例4液態培養所得之牛樟芝子實體的三萜類種類包含8種(1)Antcin K為23.15與23.65分鐘，(3)Methyl antcinate K為34.51與34.78分鐘，(4)Antcin C為37.58與37.72分鐘，(5)Antcin H(Zhankuic acid C)為39.14與39.52分鐘，(6)Dehydrosulphurenic acid為44.09分鐘，(7)Antcin B為47.32分鐘，(9)Antcin A為55.16分鐘，(11)Dehydroeburicoic acid為75.85分鐘。
比對出之三萜類化合物之種類含量百分比，計算方式 如前述。所得之三萜含量約為：(1)22.76%，(3)5.20%，(4)20.81%，(5)11.38%，(6)16.26%，(7)1.62%，(9)1.30%以及(11)6.50%。
藉由本發明所提供之培養方法，可有效控制牛樟芝子實體在無菌的環境下生長，並藉由模擬野生及/或椴木培養的牛樟芝之生長環境，使本發明之牛樟芝子實體之內含最重要的三萜類成份能非常接近於野生及/或椴木培養的牛樟芝，以達到與野生及/或椴木培養的牛樟芝同樣的功效，具相當的保健效果。
上述實施例僅例示性說明本發明之原理及其功效，而非用於限制本發明。任何熟習此項專業之人士均可在不違背本發明之精神及範疇下，對上述實施例進行修飾與改變。因此，舉凡所屬技術領域中具有此項專業知識者，在未脫離本發明所揭示之精神與技術原理下所完成之一切等效修飾或改變，仍應由後述之申請專利範圍所涵蓋。

Claims (17)

  1. 一種培養牛樟芝子實體之方法，係包括：將牛樟芝菌種接菌至經滅菌之洋菜培養基，進行繼代培養以產生次級菌絲體，並於該繼代培養過程中篩選出無變種及無毒性的次級菌絲體；以及以該經篩選出無變種及無毒性的次級菌絲體進行該繼代培養，以產生子實體，其中，該洋菜培養基包含：YM洋菜培養基質；食用油，且以該洋菜培養基總重計，該食用油之含量係大於0%至1%；以及酵母抽出物，且以該洋菜培養基總重計，該酵母抽出物之含量係大於3%至5%。
  2. 如申請專利範圍第1項所述培養牛樟芝子實體之方法，其中，該無變種及無毒性的次級菌絲體係於該繼代培養過程中培養出至少第1繼代後，自該第1繼代以後之次級菌絲體篩選者。
  3. 如申請專利範圍第1項所述培養牛樟芝子實體之方法，其中，該食用油係食用精油。
  4. 如申請專利範圍第1項所述培養牛樟芝子實體之方法，其中，該食用油係牛樟芝精油。
  5. 如申請專利範圍第1項所述培養牛樟芝子實體之方法，其中，該食用油為植物油或動物油。
  6. 如申請專利範圍第1項所述培養牛樟芝子實體之方法，其中，以該洋菜培養基總重計，該食用油之含量係 0.5%。
  7. 如申請專利範圍第1項所述培養牛樟芝子實體之方法，復包括將該無變種及無毒性的次級菌絲體及/或子實體接種至容器內經滅菌之固態培養基培養出無變種及無毒性的次級菌絲體及子實體，其中，該固態培養基包含：固態部分，係包含至少一種穀物；以及液態部分，係含有糖類化合物、酵母抽出物、及食用油，其中，以該液態部分總重計，該糖類化合物之含量係3%至5%，該酵母抽出物之含量係3%至5%，及該食用油之含量係大於0%至1%，且該液態部分在該容器內之高度係自該固態部分之半高處至與該固態部分頂面等高處。
  8. 如申請專利範圍第7項所述培養牛樟芝子實體之方法，其中，該固態部分包含二種穀物，且以該固態部分總重計，各該穀物的含量係40至60%。
  9. 如申請專利範圍第7項所述培養牛樟芝子實體之方法，其中，該糖類化合物係選自葡萄糖、甘露糖及海藻糖所組成群組的至少一者。
  10. 如申請專利範圍第7項所述培養牛樟芝子實體之方法，其中，該接種之無變種及無毒性的次級菌絲體及/或子實體係取自該洋菜培養基中之不同繼代者。
  11. 如申請專利範圍第1項所述培養牛樟芝子實體之方法，復包括將該無變種及無毒性的次級菌絲體接種至容 器內經滅菌之液態培養基培養出子實體，其中，該液態培養基包含：糖類化合物；酵母抽出物；以及食用油，其中，以該液態培養基總重計，該糖類化合物之含量係3%至5%，該酵母抽出物之含量係3%至5%，及該食用油之含量係大於0%至1%。
  12. 如申請專利範圍第7項所述培養牛樟芝子實體之方法，復包括將該固態培養基培養出之無變種及無毒性的次級菌絲體接種至容器內經滅菌之液態培養基培養出子實體，其中，該液態培養基包含：糖類化合物；酵母抽出物；以及食用油，其中，以該液態培養基總重計，該糖類化合物之含量係3%至5%，該酵母抽出物之含量係3%至5%，及該食用油之含量係大於0%至1%。
  13. 如申請專利範圍第11或12項所述培養牛樟芝子實體之方法，其中，於該容器內之液態培養基培養出子實體的步驟包括：在培養至停止期前，攪拌該液態培養基；以及停止攪拌該液態培養基，提升該液態培養基濃度，使該無變種及無毒性的次級菌絲體浮至該液態培養基之液面，以靜置培養出子實體。
  14. 如申請專利範圍第13項所述培養牛樟芝子實體之方 法，其中，係藉由提升該酵母抽出物及糖類的濃度，使該無變種及無毒性的次級菌絲體浮至該液態培養基之液面。
  15. 如申請專利範圍第1項所述培養牛樟芝子實體之方法，係於60至70%之相對濕度環境進行該繼代培養。
  16. 如申請專利範圍第1項所述培養牛樟芝子實體之方法，其中，於該繼代培養之過程中以每天為單位，至少10至14小時控制該繼代培養的溫度在24至27℃，以及至少10至14小時控制該繼代培養的溫度在19至23℃。
  17. 如申請專利範圍第1項所述培養牛樟芝子實體之方法，其中，對應在日照之時間，控制該繼代培養的溫度在24至27℃，以及對應在非日照之時間，控制該繼代培養的溫度在19至23℃。
TW105112108A 2016-04-19 2016-04-19 無菌培養牛樟芝子實體之方法 TW201737793A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW105112108A TW201737793A (zh) 2016-04-19 2016-04-19 無菌培養牛樟芝子實體之方法
US15/342,160 US10584311B2 (en) 2016-04-19 2016-11-03 Method for aseptically culturing fruiting bodies of Antrodia cinnamomea

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW105112108A TW201737793A (zh) 2016-04-19 2016-04-19 無菌培養牛樟芝子實體之方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW201737793A true TW201737793A (zh) 2017-11-01

Family

ID=60039241

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW105112108A TW201737793A (zh) 2016-04-19 2016-04-19 無菌培養牛樟芝子實體之方法

Country Status (2)

Country Link
US (1) US10584311B2 (zh)
TW (1) TW201737793A (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112831086A (zh) * 2021-01-18 2021-05-25 刘永昶 一种用于液体发酵培养的专用固体菌种制备方法及其应用
CN117737138B (zh) * 2024-02-07 2024-05-28 云南省林业和草原科学院 一种诱导高黎贡牛樟芝产生抑制植物病害细菌化合物的培养方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6558943B1 (en) * 2000-09-05 2003-05-06 Sun Ten Pharmaceutical Co., Ltd. Method for propagating fungi using solid state fermentation
TW200819041A (en) * 2006-10-27 2008-05-01 Da-Ming Tsai Method for cultivating Antrodia camphorate
TWI396546B (zh) * 2008-03-04 2013-05-21 Coject Biotech Inc 一種自牛樟菇製備牛樟菇子實體特有成分胺蕈k、樟菇酸a、樟菇酸b、或樟菇酸c的方法
TWI422680B (zh) 2010-12-31 2014-01-11 Oasis Bio Tech Co Ltd 用以培養牛樟芝子實體之培養基及其培養方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20170295724A1 (en) 2017-10-19
US10584311B2 (en) 2020-03-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI373307B (zh)
Song et al. Identification of Inonotus obliquus and analysis of antioxidation and antitumor activities of polysaccharides
Magday Jr et al. Optimization of mycelial growth and cultivation of fruiting body of Philippine wild strain of Ganoderma lucidum
CN105493887B (zh) 蛹虫草的复壮培养方法
CN106804285A (zh) 提高牛樟芝三萜类成分的培养方法
KR20200025135A (ko) 배암차즈기 추출액을 이용한 기능성 동충하초 자실체의 재배방법
CN104350942A (zh) 一种用桑枝蚕蛹粉制备虫草菌丝体的方法
Dulay et al. Mycelial growth and basidiocarp production of wild hairy sawgill Lentinus strigosus, a new record of naturally occurring mushroom in the Philippines
TWI422680B (zh) 用以培養牛樟芝子實體之培養基及其培養方法
CN114592013A (zh) 一种蝉花虫草酵素制备方法及其应用
CN104381013A (zh) 利用培养基培养牛樟菌的方法
TW201737793A (zh) 無菌培養牛樟芝子實體之方法
CN107302867A (zh) 无菌培养牛樟芝子实体的方法
CN104982225A (zh) 新型雄性蚕虫草培育工艺及培养蚕虫草母种的方法
CN103270890A (zh) 一种牛樟芝皿式培养方法
TWI577797B (zh) Studies on the Culture Methods and Culture Substrate of
KR100361681B1 (ko) 원목을 이용한 목질진흙(상황) 버섯의 재배방법
CN114085781B (zh) 一种灵芝菌gz及其应用
CN103667062A (zh) 一种樟芝无性孢子低温保藏保护剂及其使用方法
CN110305795B (zh) 一株中国被毛孢及其应用
CN104221703A (zh) 牛樟芝菌体培养方法及培养基底成份
CN107099525A (zh) 一种北冬虫夏草菌株g5及其诱变选育和培育方法
CN109328865B (zh) 一种蛹虫草的制备方法及其制备的蛹虫草
JP2016146799A (ja) サナギタケ子実体の人工培養方法
CN109601254A (zh) 一种培养产物与基质完全分离的牛樟芝培养方法