CN104982225A - 新型雄性蚕虫草培育工艺及培养蚕虫草母种的方法 - Google Patents

Abstract

一种新型雄性蚕虫草培育工艺，包括步骤：1)选择蚕虫草菌种；2)培养蚕虫草母种，并制成菌液；3)雄性蚕虫草培育。一种适用于所述新型雄性蚕虫草培育工艺的培养蚕虫草母种的方法，包括步骤：1)分离：将成熟的蚕虫草子实体进行分离操作，在培养皿中培养；2)移植：将培养皿中生长较好的蚕虫草菌种移植到试管的斜面培养基上进行培养；3)复壮：将试管中斜面培养基上的蚕虫草菌种配制成菌液注射到蚕体，促使菌种活性增强；4)将家蚕蚕体上生长的成熟的蚕虫草子实体按照上述步骤1)～3)重新进行分离和移植操作。本发明以雄性家蚕幼虫为寄主人工栽培蚕虫草，利用雄性家蚕幼虫栽培虫草较蚕蛹所需工时短、节省劳动力、成本低。

Description

新型雄性蚕虫草培育工艺及培养蚕虫草母种的方法

技术领域

本发明涉及虫草培育领域，具体涉及一种新型雄性蚕虫草培育工艺。

背景技术

冬虫夏草是一种名贵的中草药,具有滋肺补肾、止血化痰、抗氧化、抗炎症、抗癌等多种显著药用活性，现代医学分析认为，虫草素、虫草多糖、腺苷、虫草酸是虫草的主要活性成分，虫草素具有抗肿瘤、抗衰老、抗菌、抗病毒、免疫调节、改善新陈代谢、清除自由基等多种药理作用；虫草多糖可提高人体免疫功能，升高白细胞，临床已用于治疗恶性肿瘤；腺苷具有扩张冠脉血管，增加血流量的作用；虫草酸可预防与治疗脑血栓、脑出血、心肌梗塞、长期衰竭。冬虫夏草的这些活性成分都具有良好的临床应用前景，市场需求极大。虫草素、虫草多糖、腺苷、虫草酸含量的高低是衡量虫草质量的主要标准之一，一般认为虫草素、虫草多糖、腺苷、虫草酸含量高的虫草的药用价值高。

然而由于受生态环境的限制及过度采挖的影响，这一珍稀资源逐渐枯竭，天然虫草资源已远远不能满足市场需求。采用工厂化培育人工虫草成为最佳的替代选择。人工培育的虫草已被国家卫生部批准为新资源食品。

目前市场上人工栽培虫草主要是利用大米(小麦)和蚕蛹做寄主培养出来的，其中蛹虫草是研究最为广泛的人工虫草。与冬虫夏草相比,蛹虫草对寄主的要求不严,主要药用成分与冬虫夏草相近,因此开展蛹虫草的人工栽培可以为解决冬虫夏草资源紧缺开辟一条有效途径。然而目前虫草人工培育技术中仍然存在以下几个主要问题：(1)菌种资源退化，活性成分含量不稳定；(2)人工培养条件苛刻难以实现规模化生产；(3)人工虫草产品欠缺深度开发。

经过本发明前期研究表明，以家蚕作为寄主接种虫草菌培育得到的蚕虫草，其活性成分虫草素、虫草多糖、腺苷、虫草酸的含量均高于蛹虫草和天然冬虫夏草，且蚕虫草形态比蛹虫草更接近天然虫草，因此蚕虫草具有极为广阔的开发利用价值。然而，蚕虫草的开发与利用上还存在菌种不稳定、人工培养条件苛刻、难以实现规模化生产等问题亟待解决。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提出一种利用雄性家蚕接种北虫草菌生产高营养功能性产品的工艺方法，具体如下：

一种新型雄性蚕虫草培育工艺，包括步骤：

1)选择蚕虫草菌种；

2)培养蚕虫草母种，并制成菌液；

3)雄性蚕虫草培育，步骤包括：

3.1)选择大眠开口2-5天的雄性家蚕活蚕作寄主；

3.2)消毒准备； 

3.3)采用注射的方法进行接种，注射量为每条蚕2±0.2微升；

3.4)对接种后的宿主在无菌环境下进行培养：

3.4.1)死亡僵化期： 

a、清洗：

感染5天左右，有部分家蚕已经硬化，将它们检出，单独存放，干燥保护；感染9～10天，对其余的硬化家蚕去除蚕身上杂物，单独存放，干燥保护；

将已硬化的蚕用水淘洗干净，再用净水冲洗至无浑浊水，而后漂净；

b、晾干：

将洗净硬化的蚕体摊平，在阴凉地方风干，干燥程度以手摸上去感觉不出湿滑，无明显水渍为准；

3.4.2)发菌期(自接种开始的第10～16天)

将晾干的蚕平摊在盒子里，不得叠在一起；装盒完成后，盖上盖子放入黑暗环境里进行黑暗保护5～6天；其中环境的初始温度为17～18℃，然后每隔1～2天加温1℃，直到温度达到22～23℃，当蚕体长满芝麻大小的白菌即可；

3.4.3)转色期(自接种开始的第17～21天)

a、感光：

对蚕体全天、充分利用散射进行光照，光照期间必须在中午时分进行遮阴；

光照期间，光线不充足时必须以日光灯作为补充光源；需要注意观察蚕体的菌丝生长情况，先长白色菌丝，而后长出草；

b、补水：

注意观察盒子里的水分情况，以盖子上有细小水珠为宜，如无水珠，要进行补水；补水采用无菌水喷洒；

3.4.4)出草期

a、生长：(自接种开始的第22～30天)

生长期的温度控制在22～23℃；

b、成熟采摘： 

从接种到收获为30～40天，以不长出子囊孢子为宜；采摘期的温度控制在22～23℃。

所述步骤1)中，蚕虫草母种选用的菌种为麦角菌目，麦角菌科，虫草属，蚕虫草菌。

所述步骤3)中，选用雄性家蚕活蚕作宿主；雄性家蚕活蚕是在家蚕的养殖阶段，采用荧光处理方法，将雄性蚕卵与雌性蚕卵分离，分别进行养殖；

对雄性家蚕活蚕是采用添食抗生素的方式来抵抗病毒和其它杂菌的感染；

抗生素：配置比例1g选用氟苯尼考溶解于1.5～2.5千克斤水，喷施20千克桑叶，添食雄性家蚕；如果第二天有零星死蚕，抗生素浓度增加一倍。

所述步骤3.1)大眠开口是指第四次眠期结束成为五龄蚕后(第四次蜕皮结束后)，并开始活动吃桑叶了；不需进行麻醉，直接将配置好的蚕虫草菌液对雄性家蚕蚕体进行注射。

所述步骤3.2)中，采用的菌液需要在无菌操作台的无菌环境下操作配置完成，只含有步骤1)得到的蚕虫草菌一种菌；注射器注射前高压高温消毒过，并且每注射完针管，用酒精进行一次消毒。

所述步骤3.3)中，注射位置在蚕背侧部第三个环节处，将针尖平势插入蚕体的节间膜皮肤，刺入深度以确保家蚕不会死亡为准；拔出时用手轻按压一下伤口，防止体液流出。

一种适用于所述新型雄性蚕虫草培育工艺的培养蚕虫草母种的方法，包括步骤：

1)分离：将成熟的蚕虫草子实体进行分离操作，在培养皿中培养；

培养基采用的是固体培养基，配方为：

1、200g土豆加水煮20分钟得到的过滤液；

2、葡萄糖20g；

3、琼脂20g；

4、蛋白胨2g；

5、磷酸二氢钾1g；

6、硫酸镁0.3g；

7、加水定容于1000ml，

蚕虫草菌种分离的操作步骤是：1、挑选生长旺盛的、较长较粗的菌种较多的蚕虫草子实体进行分离

2、用镊子和小剪刀剪下子实体放入无菌的培养皿中

3、先用70％-75％酒精浸泡剪下来的子实体进行消毒

4、再用0.1％升汞浸泡消毒，升汞可回收重复利用

5、消毒完成后用无菌水冲洗三遍，使消毒剂不残留

6、将剪下来的一小段子实体从中间再分开，分为三小丁

7、一个培养皿中放三个小丁，呈三角分布放置剪下的菌种

8、盖上培养皿，写上菌种编号和日期，用密封条封好装入保鲜袋

9、将培养皿连同保鲜袋一起放入生化培养箱进行培养，温度设定为23℃，湿度因为是在密封的培养皿中所以不进行控制。一般2天时间菌丝可以长出来，4-5天白色菌丝长成，呈小的圆形菌群，直径在5mm左右是正常的。

2)移植：移植的操作步骤：1、将移植器在酒精灯上消毒，消毒距离要长一些，手拿的手柄也要进行消毒。

2、去掉培养皿上的封口条，选择生长较好的菌群进行移植

3、打开培养皿用消过毒的移植器在选择的生长较好的菌群上刮一下，移植器上就带上菌种

4、将移植器伸入试管内，在斜面培养基上由内向外呈“Z”字型均匀涂抹完整

5、移植完成后将试管口和试管塞在酒精灯上过一下，消下毒。

6、将试管塞塞上，外面用报纸包好并用线扎好。写明菌种编号和移植的日期

7、放入生化培养箱进行培养，约5-7天左右试管内的斜面培养基上长满菌丝

8、大约再过10天左右，菌丝就长的较为厚实

9、放入5℃冰箱，冷藏20-25天左右，然后才能用于复壮接种使用。

将培养皿中生长较好的蚕虫草菌种移植到试管的斜面培养基(培养基和步骤1)中的培养基相同)上进行培养；

3)复壮：将试管中斜面培养基上的蚕虫草菌种配制成菌液注射到蚕体，注射量是2±0.2微升/条蚕，促使菌种活性增强；

菌液的制备方法为：

1)对研钵进行消毒灭菌；

2)对药匙及其手柄进行消毒；

3)将药匙手柄伸入试管内将菌种刮干净；

4)将菌种刮到研钵内研磨，然后加入无菌水，再研磨一下；

5)取滤纸放在菌液液面上，用滴管吸取菌液，置于无菌瓶中；

6)最后，倒水在试管中，将试管中的碎菌种冲洗下来，研磨后再吸取；

7)加水——研磨——吸取重复操作，期间应将絮状物过滤干净；

8)最后按照浓度要求补充无菌水到无菌瓶中；

9)吸取无菌瓶中的菌液置入离心管中，菌液制作完成可以使用。

菌液的保存温度为4±0.5℃；菌液的浓度为：蚕虫草菌种的质量占9～12％。

4)将家蚕蚕体上生长的成熟的蚕虫草子实体按照上述步骤1)～3)重新进行分离和移植操作。

所述蚕体为雄性家蚕的活体；蚕体的生长期要求为第四次眠期结束成为五龄蚕后(第四次蜕皮结束后)，并开始活动吃桑叶。

本发明以雄性家蚕幼虫为寄主人工栽培蚕虫草，利用雄性家蚕幼虫栽培虫草较蚕蛹所需工时短、节省劳动力、成本低。前期研究表明，蚕虫草的活性成分虫草酸和虫草素的含量均高于蛹虫草和天然冬虫夏草，且蚕虫草形态比蛹虫草更接近天然虫草，因此蚕虫草具有更为广阔的开发利用价值，蚕虫草的规模化生产可以取得显著的社会和经济效益。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本技术方案进一步说明如下：

1、蚕虫草菌种的选用：

高品质的虫草产品应该至少保证两点：菌种的纯正性以及足够高的虫草素、虫草多糖、腺苷、虫草酸等有效成分含量。本技术方案选用的菌种为麦角菌目，麦角菌科，虫草属，蚕虫草菌，采用本菌种作为母种。

2、蚕虫草母种的培养：

蚕虫草母种的培养方法，包括步骤：

1)分离：将成熟的蚕虫草子实体进行分离操作，在培养皿中培养；

培养基采用的是固体培养基，配方为：

1、200g土豆加水煮20分钟得到的过滤液；

2、葡萄糖20g；

3、琼脂20g；

4、蛋白胨2g；

5、磷酸二氢钾1g；

6、硫酸镁0.3g；

7、加水定容于1000ml，

蚕虫草菌种分离的操作步骤是：1、挑选生长旺盛的、较长较粗的菌种较多的蚕虫草子实体进行分离

2、用镊子和小剪刀剪下子实体放入无菌的培养皿中

3、先用70％-75％酒精浸泡剪下来的子实体进行消毒

4、再用0.1％升汞浸泡消毒，升汞可回收重复利用

5、消毒完成后用无菌水冲洗三遍，使消毒剂不残留

6、将剪下来的一小段子实体从中间再分开，分为三小丁

7、一个培养皿中放三个小丁，呈三角分布放置剪下的菌种

8、盖上培养皿，写上菌种编号和日期，用密封条封好装入保鲜袋

9、将培养皿连同保鲜袋一起放入生化培养箱进行培养，温度设定为23℃，湿度因为是在密封的培养皿中所以不进行控制。一般2天时间菌丝可以长出来，4-5天白色菌丝长成，呈小的圆形菌群，直径在5mm左右是正常的。

2)移植：移植的操作步骤：1、将移植器在酒精灯上消毒，消毒距离要长一些，手拿的手柄也要进行消毒。

2、去掉培养皿上的封口条，选择生长较好的菌群进行移植

3、打开培养皿用消过毒的移植器在选择的生长较好的菌群上刮一下，移植器上就带上菌种

4、将移植器伸入试管内，在斜面培养基上由内向外呈“Z”字型均匀涂抹完整

5、移植完成后将试管口和试管塞在酒精灯上过一下，消下毒。

6、将试管塞塞上，外面用报纸包好并用线扎好。写明菌种编号和移植的日期

7、放入生化培养箱进行培养，约5-7天左右试管内的斜面培养基上长满菌丝

8、大约再过10天左右，菌丝就长的较为厚实

9、放入5℃冰箱，冷藏20-25天左右，然后才能用于复壮接种使用。

将培养皿中生长较好的蚕虫草菌种移植到试管的斜面培养基(培养基和步骤1)中的培养基相同)上进行培养；

3)复壮：将试管中斜面培养基上的蚕虫草菌种配制成菌液注射到蚕体，注射量是2±0.2微升/条蚕，促使菌种活性增强；

菌液的制备方法为：

1)对研钵进行消毒灭菌；

2)对药匙及其手柄进行消毒；

3)将药匙手柄伸入试管内将菌种刮干净；

4)将菌种刮到研钵内研磨，然后加入无菌水，再研磨一下；

5)取滤纸放在菌液液面上，用滴管吸取菌液，置于无菌瓶中；

6)最后，倒水在试管中，将试管中的碎菌种冲洗下来，研磨后再吸取；

7)加水——研磨——吸取重复操作，期间应将絮状物过滤干净；

8)最后按照浓度要求补充无菌水到无菌瓶中；

9)吸取无菌瓶中的菌液置入离心管中，菌液制作完成可以使用。

菌液的保存温度为4±0.5℃；菌液的浓度为：蚕虫草菌种的质量占9～12％。

4)将家蚕蚕体上生长的成熟的蚕虫草子实体按照上述步骤1)～3)重新进行分离和移植操作。

所述蚕体为雄性家蚕的活体；蚕体的生长期要求为第四次眠期结束成为五龄蚕后(第四次蜕皮结束后)，开始活动吃桑叶。

母种培养基对菌种的品质起着重要的作用。经检测，采用本方法培养得到的母种，其虫草素的含量为1.2mg/g、虫草多糖的含量为3.94g/100g、腺苷的含量为85mg/100g、虫草酸的含量13.2％。

3、蚕虫草培育：

选择大眠开口2-5天活雄性家蚕作寄主，一方面此时幼蚕体大肥硕，所得蚕虫草也大；另一方面此时的蚕还未吐丝。占体重40％左右的丝腺蛋白成为虫草菌的营养，所得蚕虫草的营养和活性成分最高。但大眠开口2-5天活蚕抗病力很强，很难接种感染虫草菌。因此有必要改进蚕虫草的接种工具和接种方法。另外建立生态培养蚕虫草的标准化车间，建立一套无菌化操作方法，从而实现蚕虫草的规模化生产。

虫草的营养价值与培养基密切相关，市场上目前一般为：①用大米、小麦皮、琼脂等为培养基生产虫草，只能餐桌之用，营养价值较低，②蚕蛹高温灭菌接种，产量高，但杀死活蛹后，因丝蛋白在60度以上高温会变性，酶也失去活性。③活蚕蛹接种，因蚕吐完丝才能变蛹，这样蛋白质含量较少。

本方法的优势：①用大眠开口2-5天活蚕接种，虫草中蛋白质、活性酶较高。②本品采用大眠开口2-5天雄性蚕接种(雌雄蚕采用荧光技术处理筛选)，生产的虫草，据测试：虫草素含量达到2.3％，比野生冬虫夏草高8倍，其它有益物质含量均超过或相当于野生冬虫夏草，具有阴阳双补的作用，尤其男士补肝、补肾功能更佳。

本蚕虫草的有效成分与天然虫草基本一致，有的甚至优于天然虫草。而家蚕是世界上饲养最多的昆虫，利用家蚕幼虫栽培虫草有着丰富的可利用资源。现以大眠开口2-5天活蚕接种为寄生接种虫草菌,以期找到最佳的培养方式。与用蚕蛹接种虫草菌比较，所需时间短,节省大量人力物力,成本低,减少盲目采集天然虫草资源，可取得更可观的经济效益,从而为蚕业资源循环利用开拓一个新领域。

本发明创造的重点与难点

(1)蚕虫草菌种的退化问题

因为蚕虫草对生长基质及生态环境要求与一般食用菌有所不同，而且长期采用无性繁殖及多次转管的蚕虫草菌种，其母种基因容易变异，表现为出草畸形甚至不出草，产量和质量都不稳定。

因此，而本发明技术方案研究和摸索出一种有效防止虫草菌种退化的方法，成功解决了蚕虫草菌易退化的问题，极大地增强了蚕虫草菌的活力和感染力，接种感染率达到100％,宿主成活率能达到90％以上)

(2)批量生产时接种的蚕容易发生败血病

实践中发现，批量生产时接种的蚕容易发生败血病，如何从菌种培养、接种及环境控制等各方面采取措施解决这一问题，本发明在蚕虫草进一步仿生培养设施条件的确立上有所创新，既达到了国家医药、食品生产管理上要求无菌操作的条件，又满足了蚕虫草生长对温、光、湿等要求。具体解决办法：(一)选择大眠开口2-5天活蚕接种为寄生接种虫草菌，此时蚕种健壮不易得病；(二)注射接种前选择适当的消毒剂对蚕体进行消毒，尽量杀灭附着在蚕体上的各种病原微生物，特别是引起败血病的致病细菌。(对蚕体不消毒，因为消毒很难彻底，并且容易感染。采用的是进行对桑叶喷洒抗生素然后给蚕喂食的方法，增强蚕对疾病的抵抗能力)

对接种后的宿主在无菌环境下进行培养：

3.4.1)死亡僵化期： 

清洗：

到感染5天左右，有部分家蚕硬化，将其检出，置于塑料盒内，干燥保护。等硬化蚕僵硬程度较好时(一般9～10天)去除硬化蚕身上杂物，置于塑料盒保护。将已硬化的蚕拾起用水淘洗干净，再用水龙头冲洗无浑浊水，而后漂净，以不具杂质为宜。需要注意尽量挑选出感染不好和受杂菌污染的蚕体。

晾干：

将洗净硬化的蚕体摊平，晾干，不可晒太阳，在阴凉地方风干。(对时间没有严格要求，以手摸上去感觉不出湿滑，无明显水渍就可，不能太干)。需要注意尽量挑选出感染不好和受杂菌污染的蚕体。

3.4.2)发菌期

黑暗保护： 

将晾干的蚕平摊在盒子里，可以挤一些，但不要叠在一起，以免影响菌丝发育。装盒完成后盖上盖子放入黑暗的屋子里的架子上进行黑暗保护(一般5-6天)，初始温度为17-18℃(不可高于20℃)，然后每隔1-2天加温1℃，直到温度达到22-23℃为出草最适宜温度(这个过程一般持续5-6天左右)，当蚕体长满芝麻大小的白菌即可。需要注意尽量挑选出感染不好和受杂菌污染的蚕体。

3.4.3)转色期

这个时期菌丝由白向黄转化，并长出细小的子实体。

1、感光：

这个时期对光线要求高，需要充分光照。可充分利用散射光，但不能太阳光直射，必须在中午时分进行遮阴。这时需要24小时感光，光线不充足时必须以日光灯作为补充光源(最好日光灯24小时开着，白天光线充足时可适当关闭一会)。需要注意观察盒子里的菌丝生长情况，先长白色菌丝(有点像发霉)，而后长出草。需要注意尽量挑选出感染不好和受杂菌污染的蚕体。

2、补水：

注意观察盒子里的水分情况，以盖子上有细小水珠为宜，如无水珠，要进行补水。补水采用无菌水，可直接购买或用开水冷却后灌入瓶中喷洒使用。

3.4.4)出草期

这个时期子实体开始生长发育

1、生长：

生长的温度控制在22-23℃，温度过低则发育缓慢，温度过高则老化。水分可适当补充。本阶段注意观察子实体的生长情况。

2、成熟采摘： 

从接种到收获一般30-40天(一般以35天为准)，不超过45天，以不长出子囊孢子为宜。长出子囊孢子的过老了。期间温度稳定控制在22-23℃。

菌液的制备方法为：

器具准备：无菌瓶、碾砵、滴管、药匙、菌种、滤纸、无菌水、消毒酒精、烧杯、离心管、酒精灯等。消毒：无菌瓶、碾砵、药匙、无菌水、离心管、烧杯等进行高压高温灭菌。

配置菌种悬浮液：

1)将研钵倒入75％消毒酒精进行消毒，然后用无菌水冲洗一下

2)将药匙在酒精灯上消毒，长柄上也要在火焰上过一下。

3)将药匙手柄伸入试管内将菌种刮干净。

4)将菌种刮到研钵内，轻轻研磨，加入10-20ml无菌水，再研磨一下

5)取滤纸放在菌液液面上，用滴管吸取菌液，置于无菌瓶中

6)等菌液较少时，倒水在试管中，将试管中的碎菌种冲洗下来，轻轻研磨后再吸取

7)加水—研磨—吸取可重复操作，注意将絮状物过滤干净

8)最后看无菌瓶中有多少容量的菌液，加水至225ml左右。

9)吸取无菌瓶中的菌液置入离心管中，菌液制作完成可以使用。

菌液的保存温度为4℃为宜；菌液的浓度为：蚕虫草菌种的质量占10％左右。

“冬虫夏草”与采用本发明技术生产的“蚕虫草”检测结果见表1

表1：蚕虫草与冬虫夏草活性成分比较

成分	蚕虫草的含量	冬虫夏草的含量	检测方法
				虫草素	1.2mg/g	0.001mg/g	GF245板层析法
虫草酸	13.2％	6.94％	TLC分析法
				腺苷	85mg/100g	39.6mg/100g	GF245板层析法
虫草多糖	3.94g/100g	2.5g/100g	裴林试剂滴定法
				麦角甾醇	2.28mg/g	1.22mg/g	TLC分析法
SOD	78u/g	30u/g	磷苯三酚自氧化法
				硒	0.6ppm	0.42ppm	原子吸收光谱法

Claims (10)

1.一种新型雄性蚕虫草培育工艺，其特征是包括步骤：

1)选择蚕虫草菌种；

2)培养蚕虫草母种，并制成菌液；

3)雄性蚕虫草培育，步骤包括：

3.1)选择大眠开口2-5天的雄性家蚕活蚕作寄主；

3.2)消毒准备；

3.3)采用注射的方法进行接种，注射量为每条蚕2±0.2微升；

3.4)对接种后的宿主在无菌环境下进行培养：

3.4.1)死亡僵化期：

a、清洗：

感染5天左右，有部分家蚕已经硬化，将它们检出，单独存放，干燥保护；感染9～10天，对其余的硬化家蚕去除蚕身上杂物，单独存放，干燥保护；

将已硬化的蚕用水淘洗干净，再用净水冲洗至无浑浊水，而后漂净；

b、晾干：

将洗净硬化的蚕体摊平，在阴凉地方风干，干燥程度以手摸上去感觉不出湿滑，无明显水渍为准；

3.4.2)发菌期

将晾干的蚕平摊在盒子里，不得叠在一起；装盒完成后，盖上盖子放入黑暗环境里进行黑暗保护5～6天；其中环境的初始温度为17～18℃，然后每隔1～2天加温1℃，直到温度达到22～23℃，当蚕体长满芝麻大小的白菌即可；

3.4.3)转色期

a、感光：

对蚕体全天、充分利用散射进行光照，光照期间必须在中午时分进行遮阴；

光照期间，光线不充足时必须以日光灯作为补充光源；需要注意观察蚕体的菌丝生长情况，先长白色菌丝，而后长出草；

b、补水：

注意观察盒子里的水分情况，以盖子上有细小水珠为宜，如无水珠，要进行补水；补水采用无菌水喷洒；

3.4.4)出草期

a、生长：

生长期的温度控制在22～23℃；

b、成熟采摘：

从接种到收获为30～40天，以不长出子囊孢子为宜；采摘期的温度控制在22～23℃。

2.根据其权利要求1所述的新型雄性蚕虫草培育工艺，其特征是所述步骤1)中，蚕虫草母种选用的菌种为麦角菌目，麦角菌科，虫草属，蚕虫草菌。

3.根据其权利要求1所述的新型雄性蚕虫草培育工艺，其特征是所述步骤3)中，选用雄性家蚕活蚕作宿主；雄性家蚕活蚕是在家蚕的养殖阶段，采用荧光处理方法，将雄性蚕卵与雌性蚕卵分离，分别进行养殖；

对雄性家蚕活蚕是采用添食抗生素的方式来抵抗病毒和其它杂菌的感染；

抗生素：配置比例1g选用氟苯尼考溶解于1.5～2.5千克斤水，喷施20千克桑叶，添食雄性家蚕；如果第二天有零星死蚕，抗生素浓度增加一倍。

4.根据其权利要求1所述的新型雄性蚕虫草培育工艺，其特征是所述步骤3.1)大眠开口是指蚕第四次眠期结束后，开始活动吃桑叶了，达到五龄蚕了；不需进行麻醉，直接将配置好的蚕虫草菌液对雄性家蚕蚕体进行注射。

5.根据其权利要求1所述的新型雄性蚕虫草培育工艺，其特征是所述步骤3.2)中，采用的菌液均需在无菌操作台的无菌环境下操作配置完成，只含有步骤1)得到的、且不含其它杂菌的蚕虫草菌一种菌；注射器注射前高压高温消毒过，并且每注射完针管，用酒精进行一次消毒。

6.根据其权利要求1所述的新型雄性蚕虫草培育工艺，其特征是所述步骤3.3)中，注射位置在蚕背侧部第三个环节处，将针尖平势插入蚕体的节间膜皮肤，刺入深度以确保家蚕不会死亡为准；拔出时用手轻按压一下伤口，防止体液流出。

7.一种适用于权利要求1～6任一所述新型雄性蚕虫草培育工艺的培养蚕虫草母种的方法，其特征是包括步骤：

1)分离：将成熟的蚕虫草子实体进行分离操作，在培养皿中培养；

2)移植：将培养皿中生长较好的蚕虫草菌种移植到试管的斜面培养基上进行培养；

3)复壮：将试管中斜面培养基上的蚕虫草菌种配制成菌液注射到蚕体，注射量是2±0.2微升/条蚕，促使菌种活性增强；

4)将家蚕蚕体上生长的成熟的蚕虫草子实体按照上述步骤1)～3)重新进行分离和移植操作。

8.根据权利要求7所述的培养蚕虫草母种的方法，其特征是所述蚕体为雄性家蚕的活体；蚕体的生长期要求为第四次眠期结束成为五龄蚕后，开始活动吃桑叶。

9.根据权利要求7所述的培养蚕虫草母种的方法，其特征是步骤1)中，

a)蚕虫草菌种分离的操作步骤是：

a-1)挑选生长旺盛的的蚕虫草子实体进行分离；

a-2)用镊子和小剪刀剪下子实体放入无菌的培养皿中；

a-3)先用70％-75％酒精浸泡剪下来的子实体进行消毒；

a-4)再用0.1％升汞浸泡消毒，升汞可回收重复利用；

a-5)消毒完成后用无菌水冲洗三遍，使消毒剂不残留；

a-6)将剪下来的一小段子实体从中间再分开，分为三小丁；

a-7)一个培养皿中放三个小丁，呈三角分布放置剪下的菌种；

a-8)盖上培养皿，写上菌种编号和日期，用密封条封好装入保鲜袋；

a-9)将培养皿连同保鲜袋一起放入生化培养箱进行培养，温度设定为23℃，湿度因为是在密封的培养皿中所以不进行控制。一般2天时间菌丝可以长出来，4-5天白色菌丝长成，呈小的圆形菌群，直径在5mm左右是正常的；

b)在培养皿中的培养基采用的是固体培养基，配方为：

b-1)200g土豆加水煮20分钟得到的过滤液；

b-2)葡萄糖20g；

b-3)琼脂20g；

b-4)蛋白胨2g；

b-5)磷酸二氢钾1g；

b-6)硫酸镁0.3g；

b-7)加水定容于1000ml；

步骤2)中，移植的操作步骤为：

2-1)将移植器在酒精灯上消毒，手拿的手柄也要进行消毒。

2-2)去掉培养皿上的封口条，选择生长好的菌群进行移植；

2-3)打开培养皿用消过毒的移植器在选择的生长较好的菌群上刮一下，移植器上就带上菌种；

2-4)将移植器伸入试管内，在斜面培养基上由内向外呈“Z”字型均匀涂抹完整；

2-5)移植完成后将试管口和试管塞在酒精灯上过一下，消毒；

2-6)将试管塞塞上，外面用报纸包好并用线扎好；写明菌种编号和移植的日期；

2-7)放入生化培养箱进行培养，约5～7天试管内的斜面培养基上长满菌丝：

2-8)再过9～11天，菌丝就长得厚实了：

2-9)放入5℃冰箱，冷藏20～25天，然后才能用于复壮接种使用；

本步骤的培养基与步骤1)的培养基相同；

步骤3)中，菌液的制备方法为：

1)对研钵进行消毒灭菌；

2)对药匙及其手柄进行消毒；

3)将药匙手柄伸入试管内将菌种刮干净；

4)将菌种刮到研钵内研磨，然后加入无菌水，再研磨一下；

5)取滤纸放在菌液液面上，用滴管吸取菌液，置于无菌瓶中；

6)最后，倒水在试管中，将试管中的碎菌种冲洗下来，研磨后再吸取；

7)加水——研磨——吸取重复操作，期间应将絮状物过滤干净；

8)最后按照浓度要求补充无菌水到无菌瓶中；

9)吸取无菌瓶中的菌液置入离心管中，菌液制作完成可以使用。

10.根据权利要求7所述的培养蚕虫草母种的方法，其特征是步骤3)中，菌液的保存温度为4±0.5℃；菌液的浓度为：蚕虫草菌种的质量占9～12％。