TWI396546B

TWI396546B - 一種自牛樟菇製備牛樟菇子實體特有成分胺蕈k、樟菇酸a、樟菇酸b、或樟菇酸c的方法

Info

Publication number: TWI396546B
Application number: TW097107406A
Authority: TW
Inventors: Yu Lung Wang; Shu Chun Chung
Original assignee: Coject Biotech Inc
Priority date: 2008-03-04
Filing date: 2008-03-04
Publication date: 2013-05-21
Also published as: US20090227001A1; US7838264B2; TW200938213A

Description

一種自牛樟菇製備牛樟菇子實體特有成分胺蕈K、樟菇酸A、樟菇酸B或樟菇酸C的方法

本發明提供一種牛樟菇化合物成份、一種牛樟菇混合物成份，另提供一種真菌的混合物及其製備方法，詳言之本發明係以膠體培養基大量生產真菌。

樟菇又稱牛樟芝或牛樟菇，屬於非褶菌目、多孔菌科、薄孔菌屬多年生蕈菌類，學名為Antrodia cinnamomea ，其是台灣特有一種真菌，僅生長於台灣特有之牛樟樹。樟菇是獨特且珍貴的藥用真菌，也是目前台灣最昂貴的野生真菌。樟菇的第一次新種發表是在1990年，當年臧穆、蘇慶華以污染靈芝孢子的牛樟菇子實體，將牛樟菇歸屬於靈芝屬下的新種Ganoderma comphoratum Zang & Su(樟靈芝)。到了1995年有第二次的新種發表，張東柱、周文能根據牛樟菇的型態及培養特性，尤其發現牛樟菇是木材褐腐菌，而將它命名在薄孔菌屬之新種Antrodia cinnamomea Chang TT & W N Chou。1997年有了第三次的新種發表，吳聲華將樟菇重新命名為Antrodia camphorata 。2004年，張東柱、周文能根據國際植物命名法規ICBN Article 9.12(Greuter et al.2000)將Ganoderma comphoratum 與Antrodia camphorata 認定為混淆學名，且不再被使用，並恢復使用Antrodia cinnamomea 的學名。

已經有研究顯示，樟菇子實體之抽出物中含有三種三萜類化合物，其分別是胺蕈A(antcin A)、胺蕈B(antcin B)以及胺蕈C(antcin C)。之後，又有研究報告指出，從子實體之抽出物中更發現了三種新的三萜類化合物，其分別是胺卓蕈(antrocin)、4,7－雙甲氧基－5－甲基－1,3雙氧苯(4,7－dimethoxy－5－methyl－1,3－benzodioxole)、2,2’,5,5’－四甲氧基－3,4,3’,4’－雙甲基－內雙氧－6,6’－聯苯(2,2’,5,5’－tetramethoxy－3,4,3’,4’－bimethyl－enedioxy－6,6’－dimethylbiphenyl)。到了1996年，又有研究顯示另外四種新的三萜類化合物，其分別是胺蕈E(antcin E)、胺蕈F(antcin F)、甲基胺蕈酯G(methylantcinate G)、甲基胺蕈酯H(methylantcinate H)。在1996，另外又從子實體之抽出物中發現了兩種以珥果胋(ergostane)為骨架的新化合物，其分別是樟菇酸(zhankuic acid D)與樟菇酸E(zhankuic acid E)；以及三種以羊毛固烷(lanostane)為骨架的新化合物，其分別是15α－乙醯－去氫亞硫酸(15α－acetyl－dehydro－sulphurenic acid)、去氫齒孔酸(dehydroeburicoic acid)、去氫亞硫酸(dehydro－sulphurenic acid)。

由以上可知，樟菇成分非常複雜，其除了三萜類化合物，另還含有很多生理活性物質，例如多醣體、超氧歧化酵素(SOD)、腺苷、小分子蛋白質、維生素、微量元素、核酸、固醇類、血壓穩定物質等。從先前的研究結果得知，樟菇含有獨特的三萜類化合物，而這些化合物的抗癌細胞生長能力、活化神經細胞生長能力等生理活性機轉仍待釐清。

由於野生樟萜的生長環境均屬於幽暗、潮濕且溫度稍低之中海拔地區，且生長緩慢(生長期為1年以上)，因此要產生子實體的時間相當長。牛樟樹及野生樟菇為保育類植物，目前人工培養的技術仍無法兼具大量栽培與生物活性，且樟菇盜採情形嚴重，有瀕臨滅種的危機。目前樟菇人工培養方式主要有三種：液體醱酵、固體培養及椴木栽培。液體醱酵：早先時期，產學界多數以液體醱酵為主，醱酵槽能大量生產，培養時間短、產量大，普遍上可以獲得較高的多醣體含量，但一直無法令其產生有效成分三萜類化合物，以致於研發內容受限，大都以多醣的功能性為主，發展潛力有限。固體培養：以太空包或器皿裝入五穀雜糧為培養基的方式生產，產量更大，可產出部份三萜類，性能也比液態完整，但是生產穩定性不佳，且此法不易將菌絲與五穀雜糧的培養基分離，所以常將五穀雜糧的培養基一併收起，樟菇達不到實質的5%，導致整體的活性下降，且培養時間較長，一般需耗時3~4個月。椴木栽培：以牛樟椴木來培育樟菇，說是可以解決牛樟樹及牛樟菇濫伐盜採的問題，但實在不是好方法，除生長期長需1~2年、椴木來源受限之外，批次間的品質差異極大，造成品質上穩定性的不佳。有鑑於目前樟菇培養方式的缺點及限制，本發明以膠體生成培育法培養牛樟菇，配合篩檢平台，藉由培養基的調整，以得到具抑制癌細胞生長、保肝及其他功效性的樟菇，其優點除了不受培養基影響功效性的判斷、菌絲純度更高外，培養時間縮短為1~1.5個月，可減少長時間培養造成雜菌污染的機會，同時增加空間產能的循環性，提升單位產能，降低成本。

現行樟菇培養方式主要有三種：液體醱酵、固體培養及椴木栽培。液體醱酵：早先時期，產學界多數以液體醱酵為主，醱酵槽能大量生產，培養時間短、產量大，普遍上可以獲得較高的多醣體含量，但一直無法令其產生有效成分三萜類化合物，以致於研發內容受限，大都以多醣的功能性為主，發展潛力有限。固體培養：以太空包或器皿裝入五穀雜糧為培養基的方式生產，產量更大，可產出部份三萜類，性能也比液態完整，但是生產穩定性不佳，且此法不易將菌絲與五穀雜糧的培養基分離，所以常將五穀雜糧的培養基一併收起，樟菇達不到實質的5%，導致整體的活性下降，且培養時間較長，一般需耗時3~4個月。椴木栽培：以牛樟椴木來培育樟菇，說是可以解決牛樟樹及牛樟菇濫伐盜採的問題，但實在不是好方法，除生長期長需1~2年、椴木來源受限之外，批次間的品質差異極大，造成品質上穩定性的不佳。

為改善以上現象，使樟菇量產化，其藥理特性又得以維持相當活性，因而產生此本發明。

是以，本發明係關於一種來自膠體培養之牛樟菇菌絲體萃取物，其具有如圖七(c)之HPLC的特性。

本發明另係關於一種混合物，其包括本發明之萃取物。

於一混合物較佳具體實施例中，該萃取物包括下式I之化合物：其中R₁ 係α －OH或＝O；R₂ 係β －OH或H；R₃ 係β －OH或＝O；R₄ 係α －OH或H；且R₅ 係H。

本發明之混合物可抑制癌細胞(例如人類肝癌細胞)生長或具有護肝功能(例如抑制細胞釋放門冬氨酸氨基轉移酶(GOT)、丙氨酸氨基轉移酶(GPT)、減少肝纖維化或降低肝細胞病變發生)。

該混合物中較佳化合物分別係(a)胺蕈(Antcin)K，其中該R₁ 係α －OH；R₂ 係β －OH；R₃ 係β －OH；R₄ 係H；且R₅ 係H；(b)樟菇酸A，其中R₁ 係O；R₂ 係H；R₃ 係＝O；R₄ 係H；且R₅ 係H。(c)樟菇酸B，其中該R₁ 係α －OH；R₂ 係H；R₃ 係＝O；R₄ 係H；且R₅ 係H或(d)樟菇酸C，其中該R₁ 係α －OH；R₂ 係H；R₃ 係＝O；R₄ 係α －OH；且R₅ 係H。

本發明另係關於一種培養真菌之方法，其包含：(a)於培養基對真菌進行小量培養，以進行真菌繁殖；(b)將含真菌之培養基塊接種至可容納至少兩個真菌培養基塊之膠體培養基；(c)靜置膠體培養基至真菌熟成；及(d)由熟成真菌培養基中收成真菌。

本發明方法中所用真菌係取自野生或人工培養的樟菇(Antrodia cinnamomea )。

本發明方法中膠體培養基包含基材(如洋菜膠)、碳源(如葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、澱粉、纖維素、蔗糖或上述糖類之任一種組合)、氮源(如蛋白腖、三蛋白腖、牛肉抽出物、麥芽抽出物、酵母抽出物或上述物質之任一種組合)、增量劑(如葵花油、橄欖油、維生素B6或上述物質之任一種組合)及無機酸鹽(如磷酸鹽、氯化鈉、硫酸鎂、氯化鉀或上述物質之任一種組合)。磷酸鹽可選自包括但不限於K₂ HPO₃ 、K₃ PO₃ 、KH₂ PO₃ 、NaH₂ PO₃ 、Na₂ HPO₃ 或上述化合物之任一種組合。

本發明方法中膠體培養基各成份重量百分比如下：基材重量百分比係0.5%~3%。

碳源重量百分比係0.5%~30%。

氮源重量百分比係0.05%~5%。

增量劑重量百分比係0.005%~0.05%。

無機酸鹽重量百分比係0.01%~2.5%。

本發明方法中膠體培養基係於16℃~32℃培養20~45天。

本發明係經過抗癌細胞生長測試、抗自由基測試、抑制細胞釋放門冬氨酸氨基轉移酶(GOT)、丙氨酸氨基轉移酶(GPT)測試、活體模式護肝活性測試，均顯示卓越樟菇藥性。

培養方法

圖1是依照本發明一較佳實施例之樟菇培養的方法的流程圖。請參照圖1，首先對樟菇進行預培養步驟，其例如是在一斜面培養基上預培養樟菇。在此，樟菇例如是取自野生樟菇或是人工培養的樟菇。而預培養之目的是為了保留樟菇菌種，以作為日後需再進行人工培養樟菇時的菌種來源。在此，預培養的條件與方式可以採用已知的任何一種方法。

之後，將樟菇接種於一膠體培養基中。換言之，取出一部份由預培養出的樟菇，並將其接種於一膠體培養基中進行培養。本發明之膠體培養基包括一基材、一碳源、一氮源、一增量劑以及一無機鹽。上述之基材例如洋菜膠。洋菜膠的重量百分例如是介於0.5%至3%之間，其係以膠體培養基總重量為100%而言。

此外，膠體培養基中的碳源例如選自葡萄糖(glucose或Dextrose)、果糖(fructose)、半乳糖(galactose)、乳糖(lactose)、澱粉(starch)、纖維素(cellulose)、蔗糖(Sucrose)及其組合其中之一。碳源的重量百分比是0.5%至30%，其係以膠體培養基的總重量為100%而言。

另外，膠體培養基中的氮源例如是選自蛋白腖(peptone)、三蛋白腖(tripeptone)、牛肉抽出物(beef extract)、麥芽抽出物(malt extract)、酵母抽出物(yeast extract)及其組合其中之一。氮源的重量百分比是0.05%至5%，其係以膠體培養基的總重量為100%而言。

另外，膠體培養基中的增量劑例如是選自葵花油、橄欖油、維生素B6及其組合其中之一。增量劑的重量百分比是0.005%至0.05%，其係以膠體培養基的總重量為100%而言。

另外，膠體培養基中的無機酸鹽例如是選自磷酸鹽、氯化鈉、硫酸鎂、氯化鉀及其組合其中之一。其中，磷酸鹽例如是選自K₂ HPO₃ 、K₃ PO₃ 、KH₂ PO₃ 、NaH₂ PO₃ 、Na₂ HPO₃ 及其組合其中之一。無機鹽的重量百分比例如是介於0.01%至2.5%之間，其係以膠體培養基的總重量為100%而言。

在膠體培養基中培養樟菇的溫度例如是介於16至32℃之間。於膠體培養基上進行培養時的培養震盪條件為靜止。而於膠體培養基上進行培養的時間例如是介於20至45天。

以本發明之方法所培養出的樟菇具有與野生樟菇子實體相同之生理活性，因而能用於抑制人類癌細胞生長，亦可以降低肝損傷的GOT、GPT上升。

以下將舉出一些測試結果，以證明利用本發明之方法所培養出的樟菇具有抑制人類癌細胞生長以及降低肝損傷的GOT、GPT上升的能力。

抗人類癌細胞生長測試

此測試方法是根據美國國家癌症研究所(National Cancer Institution,NCI)所訂定的抗腫瘤藥物篩檢模式進行的測試。此測試方法是以人類肝癌細胞株(Hep 3B)以進行離體測試。人類肝癌細胞株(Hep 3B)是於含有胎牛血清之培養基中培養24小時之後再更換新的培養基，然後加入待測試樣品後培養72小時。之後再以MTT呈色分析法評估細胞的存活率。測試以本發明之方法所培養出的樟菇對人類肝癌細胞之生長抑制作用時，是以計算96孔微量盤各孔中之細胞存活率，以MTT呈色分析法評估癌細胞的存活率。

MTT呈色分析法：MTT(3－〔4,5－Dimenthylthialzol－2－yl〕2,5－diphenyltetrazolium bromide)是一種四唑藍，為黃色染劑，可被活細胞吸收並在粒腺體中被琥珀酸脫氫T(succinate－tetrazolium reductase)，還原成藍色的甲臢(formazan)，常用於篩檢物質對細胞之生長及增生的影響。

由圖2之結果顯示，膠體培養出的樟菇其抑制人類肝癌細胞生長的能力比液態或固體培養出的樟菇要好，與野生樟菇的活性最相近。

抗自由基測試

此測試方法是以清除二苯代苦味肼基自由基(DPPH)以進行離體測試。取DPPH溶液加入不同濃度之樟菇酒精抽取物，經均勻混和後室溫避光反應30分鐘，以分光光度計測其517 nm之吸光值，吸光值越低表示清除能力越強。

由圖3之結果顯示，膠體培養出的樟菇其清除二苯代苦味肼基自由基的能力比液態或固體培養出的樟菇及野生樟菇強。

抑制細胞釋放GOT測試

此測試方法是以人類肝癌細胞株(Hep G2)以進行離體測試。人類肝癌細胞株(Hep G2)是於含有胎牛血清之培養基中培養24小時之後再更換新的培養基，然後加入待測試樣品及四氯化碳(CCl₄ )後培養1小時。之後取上清液加入4% MTS之無血清培養基，40分鐘之後以ELISA reader讀取其490 nm吸光值。測試以本發明之方法所培養出的樟菇對細胞釋放GOT之抑制作用時，是以計算24孔微量盤各孔中吸光值，吸光值越低表示抑制效果越好。

由圖4之結果顯示，膠體培養出的樟菇(CAC101)其抑制細胞釋放GOT的能力比其他方式培養出的樟菇(CJ50005、CJ50013)及野生樟菇(AC)強。

活體模式護肝活性測試

以四氯化碳誘發大鼠慢性肝損傷為動物模式。

採用之動物為12週齡，體重約250~300 g之雄性WISTAP為實驗動物模式。動物經馴養後，分成6組，經口服投與四氯化碳誘導肝疾病，再以管餵投與樟菇來測試樟菇對四氯化碳誘導肝損傷的治療效果如表1所示。

實驗第8星期，將全部大鼠犧牲，從下腔靜脈抽血測GOT、GPT。將血液放乾後，取肝臟右大葉，固定一地方切取長寬各1公分的肝組織放入10%中性福馬林內作病理切片。

圖5繪示出樟菇對四氯化碳誘導肝損傷的治療效果，由圖5之結果顯示，膠體培養出的樟菇可有效抑制四氯化碳誘導肝損傷GOT、GPT的上升。實驗動物犧牲後，肝臟進行切片，如圖6所示，第一組－正常組，可見肝組織正常。第二組－負向控制組，可見大量肝細胞發生變性及大量纖維結締組織切入肝小葉區。第三組－正向控制組，可見少量肝細胞發生變性及少量纖維結締組織切入肝小葉區。第四組－低劑量組，可見極少量肝細胞發生變性。第五組－中劑量組，可見大量肝細胞發生變性及少量纖維結締組織切入肝小葉區。第六組－高劑量組，可見大量肝細胞發生變性。顯示本發明的膠體生成培育出的樟菇具有降低GOT、GPT上生、減少肝纖維化及肝細胞病變的發生。

樟菇萃取物之製備

樟菇萃取物，可經由將樟菇乾燥粉末100克壓碎，加入2升乙醇，攪拌萃取1－4小時，將過濾後之萃取液濃縮乾燥，而得到15%的樟菇萃取物，其高效液相層析圖如圖7所示，高效液相層析儀之管柱為Cosmosil Paked Column 5C18－AP，4.6×250 mm；高效液相層析儀之流動相如下表所示；高效液相層析儀之流速為每分鐘一毫升(1毫升/分)；其偵檢儀為DAD，波長設定於210,243,254,280 nm。

圖1樟菇培養的方法的流程圖。

圖2不同培養方式之樟菇抽出物對人類癌細胞抑制效果。

圖3不同培養方式之樟菇抽出物清除二苯代苦味肼基自由基的效果。

圖4樟菇抽出物及四氯化碳對細胞釋放GOT之影響。

圖5樟菇對四氯化碳誘導肝損傷的治療效果。

圖6樟菇對四氯化碳誘導肝損傷之大鼠肝臟病理組織切片照片。

圖7三種樟菇培養方式之HPLC圖。(A－樟菇酸(Zhankuic acid)A；B－樟菇酸B；C－樟菇酸C；K－胺蕈(Antcin)K)

Claims

一種自牛樟菇(Antrodia cinnamomea )製備牛樟菇子實體特有成分胺蕈(Antcin)K、樟菇酸(Zhankuic acid)A、樟菇酸(Zhankuic acid)B或樟菇酸(Zhankuic acid)C的方法，其包含：(a)於培養基對取自野生或人工培養的牛樟菇菌絲體進行小量培養，以進行菌絲體繁殖；(b)將含該菌絲體之培養基塊接種至可容納至少兩個該菌絲體培養基塊之膠體培養基；(c)靜置該膠體培養基至該菌絲體熟成；及(d)由熟成的菌絲體培養基中收成該牛樟菇子實體特有成分：胺蕈(Antcin)K、樟菇酸(Zhankuic acid)A、樟菇酸(Zhankuic acid)B或樟菇酸(Zhankuic acid)C。
根據申請專利範圍第1項之方法，其中該膠體培養基包含基材、碳源、氮源、增量劑及無機酸鹽。
根據申請專利範圍第2項之方法，其中該基材係洋菜膠。
根據申請專利範圍第2項之方法，其中該碳源係葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、澱粉、纖維素、蔗糖或上述糖類之任一種組合。
根據申請專利範圍第2項之方法，其中該氮源係蛋白腖、三蛋白腖、牛肉抽出物、麥芽抽出物、酵母抽出物或上述物質之任一種組合。
根據申請專利範圍第2項之方法，其中該增量劑係葵花油、橄欖油、維生素B6或上述物質之任一種組合。
根據申請專利範圍第2項之方法，其中該無機鹽係磷酸鹽、氯化鈉、硫酸鎂、氯化鉀或上述物質之任一種組合。
根據申請專利範圍第2項之方法，其中該基材重量百分比係0.5%~3%。
根據申請專利範圍第2項之方法，其中該碳源重量百分比係0.5%~30%。
根據申請專利範圍第2項之方法，其中該氮源重量百分比係0.05%~5%。
根據申請專利範圍第2項之方法，其中該增量劑重量百分比係0.005%~0.05%。
根據申請專利範圍第2項之方法，其中該無機酸鹽重量百分比係0.01%~2.5%。
根據申請專利範圍第2項之方法，其中該培養基係於16℃~32℃培養20~45天。
根據申請專利範圍第7項之方法，其中該磷酸鹽係選自K₂ HPO₃ 、K₃ PO₃ 、KH₂ PO₃ 、NaH₂ PO₃ 、Na₂ HPO₃ 或上述化合物之任一種組合。