TWI440716B - 培育北冬蟲夏草之方法 - Google Patents

Description

培育北冬蟲夏草之方法

本發明係提供一種培育北冬蟲夏草之方法，特定言之，係關於以發光二極體(LED)燈作為光源，培育北冬蟲夏草(Cordyceps militari s)之方法。

『新華本草綱目』上記載：冬蟲夏草性味甘平入肺、腎二經，具有「補而不峻、滋而不膩」之特性，對於虛不受補的體質亦可取代人參、當歸等藥材，集天地陰陽之精氣於一身，既可滋陰、亦可助陽，是極為高貴細緻的珍品，各種體質均可適用，所以古人云：「寧要蟲草一把，不要金玉滿堂」，在傳統中藥中，冬蟲夏草被譽為漢方中之王者，日本人更稱之為終極漢方，其珍貴由此可見一斑。

根據研究，冬蟲夏草之前述珍貴特性，主要係來自所包含之蟲草素(Cordycepin)與多醣(polysaccharide)。其中，蟲草素為一種腺嘌呤(adenine)的類似物，具有清除自由基、抗菌性、抗原蟲性、抗腫瘤、抗病毒等功效，且可防止脂質、蛋白質、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)之氧化，進而降低動脈硬化(arteriosclerosis)、冠狀動脈心臟病(coronary heart disease)等疾病的發生。多醣則為一種由葡萄糖(glucose)為基本單位所形成之葡聚糖(glucan)，無法藉由人工方式合成；多醣對於人體細胞具有特殊之活化作用(例如活化巨噬細胞)，且具有增強免疫系統、抗老化、清除自由基、解毒、降低膽固醇、調整血壓、降低紫外線傷害、以及促進腸道內益生菌生長等功效。而在冬蟲夏草400多種品系中，又以北冬蟲夏草(Cordyceps militaris ，又名蛹蟲草)中蟲草素之含量最高、也最為珍貴。

北冬蟲夏草為一種蟲生真菌，在生物學上的分類為：真菌界、真菌群、子囊菌亞群、核菌綱、球殼菌目、麥角科、冬蟲夏草屬。在夏天時，成熟的北冬蟲夏草會釋放出真菌孢子，感染蝙蝠蛾之幼蟲並寄生於其體內，以蟲體為營養來源持續生長；到冬天時，真菌於幼蟲體內生長成為菌絲體(mycelia)，逐漸佈滿蟲體，因而導致幼蟲枯死，但幼蟲之外殼完整無損，仍呈蟲體之外形，故此階段被稱為「冬蟲」。到翌年春夏時，幼蟲體內之菌絲體生長成熟時，受環境因子之刺激，即自枯死幼蟲的頭部發芽，長出棒狀之子實體(hymenophore，fruit body)並穿出地面，此階段即稱為「夏草」。於北冬蟲夏草中，蟲草素與多醣主要存在於子實體部分，北冬蟲夏草之下端則為枯死幼蟲，其體內為餘存之菌絲體。

野生之北冬蟲夏草必須在夏至前後積雪融化前採摘，因枯死幼蟲體內的菌絲體會開始分解退化，子實體所含之蟲草素與多醣亦會逐漸流失。然而，由於野生之北冬蟲夏草均為隨機發現、難以掌握採摘時間，因此，目前野生之北冬蟲夏草現貨的有效成分品質不一。此外，北冬蟲夏草之年產量受環境變遷明顯逐年減少，目前已不敷市場的需求。

目前已開發出各種人工培育北冬蟲夏草之技術，以得到有效成分(即，蟲草素與多醣)品質穩定之北冬蟲夏草，諸如：固態洋菜靜置培養、液態旋轉震盪培養、液相靜置培養及深層液態發酵培養等等，該等培養技術之相關細節可參考，例如，台灣專利公告第I231825號所揭露者；此外，台灣專利公開第200833836號及台灣專利公開第200600006號亦有提及北冬蟲夏草之培育方法，主要涉及暗室(避光)培養與光照培養，前述專利文獻之內容均併於此處以供參考。

已知之北冬蟲夏草之培育方法中，幾乎皆使用日光燈或太陽光作為培育光源。惟於利用太陽光時，會大幅受限於難以控制的自然因素，不易提供穩定的光照環境；而當使用日光燈時，則會有耗電量大、產生大量熱能、光度弱及使用壽命短等缺點。因此，亟待進一步改良現有之北冬蟲夏草之培育方法。

本發明之一目的在於提供一種培育北冬蟲夏草之方法，其係包含讓含有北冬蟲夏草之菌種的培養基經歷以下二階段：a)暗處培育階段；以及b)照光培育階段，其中該照光階段係以LED燈為光源，該LED燈係選自以下群組：白光LED燈、藍光LED燈、綠光LED燈、及其組合。

本發明之詳細技術及較佳實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬領域具有通常知識者具以明瞭本發明之特徵。

本發明方法所涉之含有北冬蟲夏草之菌種的培養基，可以任何已知之合宜方法製備。舉例言之，先自一斜面菌種取出北冬蟲夏草之菌種，並於一液體培養基中，在約20℃至約30℃之溫度與約100rpm至約200rpm之條件下，進行液態培育約4至約5天，再將所得菌種接種至一固體培養基上，接著進行a)暗處培養階段。

可用之液體培養基之配方並無任何特殊的限制，通常係包含碳源(例如澱粉、葡萄糖、果糖、麥芽糖等)、氮源(例如硝酸鹽、玉米漿、黃豆餅粉、花生餅粉、酵母粉、蛋白腖、尿素等)、無機鹽與微量元素(例如碳、氫、氧、氮、磷、鉀等)及水等，其中，液體培養基之水分含量係佔培養基總重量之約80重量%至約90重量%且其碳氮比為約3:1至約10:1。舉例言之，可如下製備一合宜之液體培養基：先混合馬鈴薯醣粉、酵母抽出物(yeast extract)、硫酸鎂(MgSO₄ )及磷酸二氫鉀(KH₂ PO₄ )，再以去離子水溶解所得混合物以得到一水溶液，接著於一高壓滅菌釜(autoclave)中對該水溶液進行消菌程序，提供所欲之液體培養基。

至於可用之固體培養基，其成份與碳氮比大致上與上述液體培養基相同，但所含之水分的比例則相對較低，約為50重量%至約60重量%。一可用於本發明方法中之固體培養基，例如可藉由混合澱粉(如白米)及上述液體培養液，再以高壓滅菌釜進行消菌而得。

於將液體培養基所培育之北冬蟲夏草之菌種接種到固態培養基之後，接著對該含有北冬蟲夏草之菌種的固態培養基進行a)暗處培育步驟。咸知如培育溫度、周圍環境的相對溼度、培養基之pH值等皆會影響北冬蟲夏草之菌體生長，尤其北冬蟲夏草喜好低溫及濕潤之環境。根據本發明方法之一具體實施態樣，於a)暗處培育階段中，所採用之培育溫度約18℃至約25℃，較佳約20℃至約22℃；相對濕度約60%至約80%，較佳約65%至約75%；且固體培養基之pH值約5至約7，較佳約5.5至約6.5。

於進行完a)暗處培育階段之後，接著進行b)照光培育階段。相同地，培育溫度、周圍環境的相對溼度、培養基之pH值等因素，亦會影響照光培育階段之北冬蟲夏草之菌體生長。根據本發明方法之一具體實施態樣，係於b)照光培育階段採用如下培育條件：培育溫度約18℃至約25℃，較佳約20℃至約22℃；相對濕度約60%至約80%，較佳約65%至75%；以及固體培養基之pH值約5至約7，較佳約5.5至約6.5。

除培育溫度、周圍環境的相對溼度、以及培養基之pH值等因素之外，咸知光照條件亦會影響b)照光培育階段下北冬蟲夏草的生長。特定言之，在「夏草」階段之北冬蟲夏草，係需要一光照充足的生長環境。於本發明方法中，係以LED燈作為光源來進行光照培育，通常可視需要來選用LED燈的光源色。於本發明方法之部分具體實施態樣中，係選用白光LED燈、藍光LED燈、綠光LED燈、及其組合，較佳係選用白光LED燈。其中，每日照光時間約15至約20小時，以約17至約19小時較佳；且照明度係控制為約300Lux至約500Lux，以約350Lux至約450Lux較佳，以約380Lux至約420Lux最佳。於此光照條件之範圍下，可培育出相對而言令人滿意之北冬蟲夏草，例如具有厚實、健康的子實體。

於本發明之培育方法中，a)暗處培育階段之培育時間一般約10天至約20天，以約13天至約15天較佳；b)照光培育階段之培育則通常歷時約50天至約70天，以約55天至約65天較佳。一般而言，培育時間越長可增加北冬蟲夏草之乾重，但延長培育時間並無法保證可相對提高活性成分之含量，反提高培育北冬蟲夏草之成本；另一方面，若培育時間太短，則可能無法提供令人滿意之北冬蟲夏草之產量。

本發明方法以LED燈取代以往慣用之日光燈作為培育北冬蟲夏草之光源，可降低耗電量、產生較少的熱能、光度夠強且使用壽命較長。此外，本案發明人亦發現，利用LED燈進行北冬蟲夏草之照光培育時，更可提高北冬蟲夏草之產量並同時增加其中之有效成分，即蟲草素及多醣，如下文中實施例所示。

茲以下列具體實施態樣以進一步例示說明本發明。其中該些實施態樣僅提供作為說明，而非用以限制本發明之範疇。

實施例 實施例1：利用LED燈培育北冬蟲夏草

取12公克馬鈴薯醣粉、2公克酵母抽出物、1公克硫酸鎂及2公克磷酸二氫鉀，溶於1公升去離子水中，於121℃下利用高壓滅菌釜殺菌20分鐘後加以冷卻，製得一液體培養基。取20公克台梗九號白米及30毫升所製得之液體培養液，於121℃下利用高壓滅菌釜殺菌20分鐘後加以冷卻，製得一固體培養基。

取12公克馬鈴薯醣粉、2公克酵母抽出物、20公克瓊脂、1公克硫酸鎂及2公克磷酸二氫鉀，溶於1公升去離子水中，於121℃下利用高壓滅菌釜殺菌20分鐘後，分裝至玻璃試管中，並傾斜置放至冷卻凝固，製得固態之斜面培養基。之後於該斜面培養基上培育北冬蟲夏草菌種(寄存編號：BCRC930126)，得一斜面菌種(slant culture)。

自該斜面菌種取出北冬蟲夏草之菌種，並接種於所製得之液體培養基中，在25℃之溫度及150rpm之振盪條件下，培育7天，再接種至所製得之固體培養基上，在20℃至22℃之溫度與60%至80%之相對濕度下於暗室中培育14天；接著於相同條件下，以照明度為400Lux之LED燈(分別使用白光LED燈、綠光LED燈及藍光LED燈，其中LED燈照射裝置係如第1圖所示)作為光源，每日照光18小時，持續照光培育約60天。所培育之北冬蟲夏草係如第2圖所示。

比較實施例1：利用日光燈培育北冬蟲夏草

重複實施例1之步驟，惟於照光培育階段改用日光燈作為培育光源。所培育之北冬蟲夏草係如第2圖所示。

結果分析： (1)　產量：

將所培育之北冬蟲夏草之子實體直接進行秤重，並計算每單位培養面積之子實體重量，如表1中所示。

(2)　蟲草素含量：

將所培育之北冬蟲夏草之子實體在40℃下乾燥並磨成粉末，精秤10公克之該粉末並添加100毫升水，再以60℃水萃取1小時，重複萃取至萃取液無色為止，合併萃取液並真空濃縮至完全乾燥，定量秤取萃取物。

接著，利用一高效能液相層析儀(HPLC)(Hitachi系統，包含Pump：Hitachi L-7100、Detector：Hitachi L-7420、Recorder：Hitachi D-7000、Autosampler：Hitachi L-7200、以及Hitachi D-7000 HSM software)分析每公克北冬蟲夏草之子實體粉末所含之蟲草素含量，如表1所示。

由表1可知，利用藍、綠、白光LED燈所培育之北冬蟲夏草，其產量約為利用日光燈所培育之北冬蟲夏草的1.1至1.35倍、蟲草素含量約為5.92至7.36倍。根據以上結果，可證明利用藍、綠、以及白光LED燈培育北冬蟲夏草，其產量及蟲草素含量均明顯增加。

(3)　多醣含量 A.　葡萄糖標準曲線之繪製

取0.25、0.50、0.75、1.00及1.25毫升之葡萄糖標準溶液，分別置於10毫升之刻度試管中，各自添加水至1.5毫升，另取一含有1.5毫升蒸餾水之刻度試管作為一空白對照組。每個刻度試管各自添加2毫升之5重量/體積%苯酚溶液及6.5毫升之96重量%濃硫酸，並置於30℃水浴中歷時20分鐘，再取出放置至室溫下，搖晃均勻後，於490奈米處測定吸光值，求出一葡萄糖標準曲線回歸方程式。

B.　北冬蟲夏草之多醣純品的製備

取25公克比較實施例1所培育之北冬蟲夏草之子實體粉末，添加250毫升乙醚，置於一索氏提取器(Soxhlet extractor)中，迴流抽取1小時進行脫脂，將脫脂後之殘渣中的乙醚溶劑揮發移除後，添加250毫升之80重量%乙醇浸泡過夜，隔天迴流抽取2小時進行脫脂，重複2次，過濾後得到一濾液A與殘渣A。添加500毫升水至殘渣A中，於80℃下攪拌提取3次，每次2小時，過濾後得到一濾液B及殘渣B，合併濾液A與濾液B。

接著，將所合併之濾液真空濃縮至約100毫升，並以約100毫升之三氯甲烷與異戊醇之混合溶液(三氯甲烷與異戊醇之體積比為4：1)去除蛋白質，再添加4倍量之95重量%乙醇，靜置過夜。

隔天，進行離心，將離心後之沉澱物分別依序以無水乙醇、丙酮及乙醚洗滌多次，將洗滌後之樣品冷凍至-80℃後，置於一減壓冷凍乾燥器(Kingmech Co. LTD.,FD-6-6P-D)內進行乾燥，設定乾燥條件之溫度為-60℃，壓力為約0至100mmHg，待完全乾燥後取出並進行秤重，所得即為北冬蟲夏草之多醣純品。

C.　換算因子之測定

利用減壓冷凍乾燥器(乾燥溫度為-60℃，壓力範圍為約60至100mmHg)將程序B所得之該多醣純品完全乾燥至恆量後，再將其置於一100毫升之量瓶中，加水溶解稀釋並混勻，得到一多醣純品溶液。取1毫升之該多醣純品溶液，依照上述葡萄糖標準曲線之繪製之操作步驟，測定該多醣純品溶液之吸光值。之後，利用上述葡萄糖標準曲線回歸方程式求出該多醣純品溶液中之葡萄糖濃度後，再依下式計算出換算因子f：

f=W/(C×D)

其中，W為多醣純品溶液中所含之多醣重量(毫克)，C為多醣純品溶液中之葡萄糖濃度(毫克/毫升)，D為多醣純品溶液之稀釋倍數。

D.　北冬蟲夏草之多醣樣品溶液之製備

取5公克實施例1中利用白光LED燈所培育之北冬蟲夏草之子實體粉末置於一圓底燒瓶中，並添加50毫升水，置於一水浴器中煮沸1小時提取，過濾後取濾液，並重複上述煮沸提取過濾之步驟3次，再將所得之濾液合併並減壓濃縮至約100毫升，加入3倍量之乙醇進行沉澱，靜置過夜。

隔天，進行離心，將離心後之沉澱物分別依序以無水乙醇、丙酮及乙醚洗滌多次，再置於該減壓冷凍乾燥器內進行乾燥，設定乾燥條件之溫度為-60℃，壓力範圍為約60至100mmHg，待完全乾燥後取出秤重，所得即為一多醣樣品(即水溶性粗多醣)。取2毫克之該多醣樣品，置於一25毫升之量瓶中，添加水溶解至刻度，混合均勻後製得一多醣樣品溶液X。

取5公克之比較實施例1所培育之北冬蟲夏草之子實體粉末，重複上述步驟，另製得一多醣樣品溶液Y。

E.　多醣樣品溶液之多醣含量測定

分別取1毫升之程序D所得之多醣樣品溶液X及Y，各自置於10毫升之刻度試管中，依照上述葡萄糖標準曲線之繪製之操作步驟，測定多醣樣品溶液X及Y之吸光值。之後，利用上述葡萄糖標準曲線回歸方程式分別求出多醣樣品溶液X及Y之葡萄糖濃度，再依下式分別計算出多醣樣品溶液X及Y中之多醣含量：

多醣含量(%)=(C’×D’×f/W’)×100

其中，C’為多醣樣品溶液中之葡萄糖濃度(毫克/毫升)，D’為多醣樣品溶液之稀釋倍數，f為換算因子，W’為多醣樣品溶液中所含之多醣重量(毫克)，結果如表2所示。

表2結果顯示，以白光LED燈為光源所培育之北冬蟲夏草，其多醣含量約為以日光燈為光源所培育之北冬蟲夏草的1.24倍。

由上可知，本發明以LED燈取代日光燈作為光源進行培育北冬蟲夏草，可提升北冬蟲夏草中之蟲草素及/或多醣之含量；另一方面，LED的耗電量為日光燈的1/3以下、壽命為10倍，更可提升培育方法的整體經濟效益。

上述實施例僅係用以例示說明本發明，而非用於限制本發明。任何熟於此項技藝之人士均可在不違背本發明之技術原理及精神的情況下，對上述實施例進行修改及變化。因此，本發明之權利保護範圍應如後述之申請專利範圍所列者。

第1圖係本案實施例中所用之LED燈照射裝置。

第2圖係本案實施例1與比較實施例1所培育之北冬蟲夏草。

Claims (7)

1. 一種培育北冬蟲夏草之方法，其係包含讓含有北冬蟲夏草(Cordyceps militaris )之菌種的培養基經歷以下二階段：a)暗處培育階段；以及b)照光培育階段，其中，於該二階段中，所採用之培養基係由以下步驟而提供：i)將12公克馬鈴薯醣粉、2公克酵母抽出物、1公克硫酸鎂及2公克磷酸二氫鉀，溶於1公升去離子水中，以提供一混合液；ii)於121℃下利用高壓滅菌釜，對該混合液進行殺菌，歷時20分鐘後加以冷卻，以提供一液體培養基；以及iii)取20公克台梗九號白米及30毫升該液體培養基，於121℃下利用高壓滅菌釜，進行殺菌20分鐘後加以冷卻，以製得一固體培養基；且其中，於該暗處培育階段中，所採用之培育溫度係20℃至22℃，相對溼度係60%至80%，該培養基之pH值係5.5至6.5，培育時間係14天；以及於該照光培育階段中，所採用之培育溫度係20℃至22℃，相對溼度係60%至80%，該培養基之pH值係5.5至6.5，每日照光時間係18小時，且以照明度為400Lux之LED燈為光源，該LED燈係選自以下群組：白光LED燈、藍光LED燈、綠光LED燈、及其組合，培育時間係60天。
2. 如請求項1所述之方法，其中該LED燈係白光LED燈。
3. 如請求項1所述之方法，其中該LED燈之照明度係約300Lux至約500Lux。
4. 如請求項3所述之方法，其中該LED燈之照明度係約350Lux至約450Lux。
5. 如請求項1所述之方法，其中於該暗處培育階段中，所採用之培育溫度係約18℃至約25℃，相對溼度係約60%至約80%，培養基之pH值係約5至約7。
6. 如請求項1所述之方法，其中於該照光培育階段中，所採用之培育溫度係約18℃至約25℃，相對溼度係約60%至約80%，培養基之pH值係約5至約7，每日照光時間係約15至20小時。
7. 如請求項1所述之方法，其中於暗處培育階段中，培育時間係約10天至約20天，且於照光培育階段中，培育時間係約50天至約70天。