TW202328428A

TW202328428A - 米蕈松露之固態植菌栽培方法、栽培米蕈松露之培植基及米蕈松露營養補充品之製法

Info

Publication number: TW202328428A
Application number: TW111140767A
Authority: TW
Inventors: 孫得凱; 孫渝雯; 林美珠
Original assignee: 材得生技有限公司
Priority date: 2021-11-01
Filing date: 2022-10-26
Publication date: 2023-07-16

Abstract

本發明係提供一種米蕈松露之固態植菌栽培方法、栽培米蕈松露之培植基及米蕈松露營養補充品之製法，其方法係先備取胚芽米、黃豆粉、米糠粉及糖蜜、純水，混合攪拌均勻以作為培植基，再將培植基加熱蒸煮，降溫後置入菇包袋，再將菇包袋與培植基進行殺菌，滅菌後將松露菌絲發酵液加入菇包袋，繼而將菇包袋置於農場中培植數個月，即可收成米蕈松露，其次，將米蕈松露水萃取後乾燥並研磨成粉末，再將該米蕈松露粉末製成複數米蕈松露顆粒，使各該米蕈松露顆粒吸附水萃取之萃取液，繼而將吸附萃取液之各該米蕈松露顆粒與複數包覆粉末製成複數顆粒狀之米蕈松露營養補充品。

Description

米蕈松露之固態植菌栽培方法、栽培米蕈松露之培植基及米蕈松露營養補充品之製法

本發明係與米蕈有關，更詳而言之是指一種米蕈松露之固態植菌栽培方法、栽培米蕈松露之培植基及米蕈松露營養補充品之製法者。

按，食藥用蕈菇類(菌絲體與子實體)的營養價值高且脂質含量低，近代科學研究報告指出，食藥用蕈菇類含有多種生理活性物質，例如蛋白質、多醣體、超氧歧化酵素(SOD)等，具有提高免疫調節等功效，因此，食藥用蕈菇類成為近年來備受注目機能性保健食品，米蕈為食藥用蕈菇類之一，意指利用米為主要培植原料栽培之蕈菇類。

習知米蕈之培育方式係利用米糠作為培養基，利用酵母菌發酵而獲得米蕈菌絲體。近年來亦有業者利用香菇菌等菌種於米糠上培育成菌絲體(塊狀)後，再將其置於一液態發酵設備內經過複數日發酵後，即可透過液態發酵之方式培育出米蕈菌絲體。此外，亦有固態發酵培育米蕈之技術，如中國公開CN110074398號專利所示，其主要係將乾燥之米糠和紫米打碎後加入濃縮香菇菌發酵液以獲得基礎原料，再將基礎原料區分為數份後分別植入出芽酵母菌、牛樟菇菌與北蟲草菌，分別經過不同天數之發酵後，即可獲得不同成分之原料以組成米蕈。

由上可知，目前所見之米蕈培育方式不論是液態發酵或固態發酵，皆屬於發酵之技術範疇，雖然發酵技術培育米蕈之速度較快，不過，培育出之米蕈僅為菌絲體，營養價值不如子實體。其次，前述專利之基礎原料中米糠與紫米僅打碎，其營養成分並不會被酵母菌、牛樟菇菌與北蟲草菌有效、完全地吸收，會影響所培育米蕈之營養價值。

其次，松露屬於蕈類，常見的有黑松露、白松露等，富含多醣、三萜、多酚、類黃酮、γ-胺基丁酸、牛磺酸、神經醯胺、α-雄烷醇、植物固醇、多元不飽和脂肪酸等生理活性代謝物，並且具有抗氧化活性、降血糖、抗發炎、抗菌活性、抗腫瘤活性、免疫調節和舒緩神經等作用，營養價值甚高。松露一般係於野外適當的土壤環境下與松樹等樹木共生，目前人工種植松露之技術，大多是將松露菌種與小樹苗的根融合成菌根苗後，再將菌根苗移栽植樹，並不易大量生產。

基此，若能研發出可大量生產之松露栽培技術，並將其製作為人體易吸收之米蕈松露營養補充品，將對人們甚有助益。

本發明之主要目的即在提供一種米蕈松露之固態植菌栽培方法、栽培米蕈松露之培植基及米蕈松露營養補充品之製法，其利用蕈菇類之固態栽培法栽培出松露子實體，營養成分遠高於習知液態發酵及固態發酵培育之米蕈菌絲體，且，栽培過程安全衛生、品質穩定，易於量產，甚具實用價值。

緣是，為達成前述之目的，本發明係提供一種米蕈松露之固態植菌栽培方法，其步驟係包含備取培植基並攪拌均勻：備取重量比為5：1：1：1之胚芽米、黃豆粉、米糠粉及純水，以及與純水體積比為1：100之糖蜜，並混合攪拌均勻以作為培植基；蒸煮：將攪拌均勻之培植基加熱蒸煮以熟成胚芽米、黃豆粉及米糠粉；第一次靜置：將蒸煮完成之培植基靜置降溫；裝袋：將降溫後之培植基置入若干菇包袋；滅菌：將該菇包袋與培植基進行殺菌；第二次靜置：靜置滅菌後之該菇包袋；添加菌絲發酵液：將培養真菌子實體之松露菌絲發酵液加入該菇包袋內之培植基中；培植：將該菇包袋置於農場中培植4至5個月，使真菌子實體之松露菌絲吸收該培植基之養分而生長；收成：於該菇包袋收成米蕈松露。

較佳地，添加菌絲發酵液之步驟中，該松露菌絲發酵液係白松露菌絲發酵液。

此外，本發明更提供一種栽培米蕈松露之培植基，包含有混合均勻之胚芽米、黃豆粉、米糠粉、糖蜜及純水，且胚芽米、黃豆粉、米糠粉與純水之重量比為5：1：1：1，糖蜜及純水之體積比為1：100。

再者，本發明更提供一種米蕈松露營養補充品之製法，係以固態植菌栽培方法所栽培之米蕈松露為原料製備，其製法至少包含有以下步驟：備取米蕈松露：採收利用胚芽米為主要原料所栽培之若干米蕈松露；水萃取：利用水萃法對若干米蕈松露進行萃取以獲得萃取液，該萃取液中包含米蕈松露營養成分之水萃物；乾燥並研磨：將經過水萃取之米蕈松露予以乾燥、去除水分後研磨成粉末；第一次造粒：將該米蕈松露粉末製成複數米蕈松露顆粒；加入萃取液：將該萃取液加入各米蕈松露顆粒，使各該米蕈松露顆粒吸附萃取液；第二次造粒：將吸附萃取液之各該米蕈松露顆粒與複數包覆粉末製成複數顆粒狀之米蕈松露營養補充品；過篩：篩選出預定粒徑之米蕈松露營養補充品；檢測：進行該米蕈松露營養補充品之含水量及微生物檢測；包裝：將符合含水量及微生物檢測之米蕈松露營養補充品進行包裝。

較佳地，水萃取之步驟中，係先將米蕈松露切削後加水並加熱以進行水萃取。

較佳地，米蕈松露與水之固液比為1：10。

較佳地，乾燥並研磨之步驟中，係利用熱風烘乾方式將米蕈松露乾燥。

較佳地，第二次造粒之步驟中，各該包覆粉末係噴灑結合於各米蕈松露顆粒表面。

較佳地，各該包覆粉末係米蕈松露粉末或/及其他營養成分之一。

較佳地，係包含至少13%之蛋白質及至少19%之多醣體等營養成分。

100:米蕈松露之固態植菌栽培方法

110:備取培植基並攪拌均勻

120:蒸煮

130:第一次靜置

140:裝袋

150:滅菌

160:第二次靜置

170:添加菌絲發酵液

180:培植

190:收成

200:米蕈松露營養補充品之製法

210:備取米蕈松露

220:水萃取

230:乾燥並研磨

240:第一次造粒

250:加入萃取液

260:第二次造粒

270:過篩

280:檢測

290:包裝

第一圖係本發明米蕈松露之固態植菌栽培方法一較佳實施例之流程圖。

第二圖係本發明米蕈松露營養補充品之製法一較佳實施例之流程圖。

第三圖係本發明米蕈松露營養補充品中多醣體之組成定量分析圖。

第四圖係本發明米蕈松露營養補充品中腺苷之HPLC圖譜。

第五圖係本發明米蕈松露營養補充品抑制ACE2和TMPRSS2表現的底片顯影圖。

第六圖(A)、(B)係本發明米蕈松露營養補充品活化CD4和CD8活性之流式細胞檢測結果圖。

第七圖(A)、(B)、(C)、(D)係小鼠肝、腎及肺正常組織與口服本發明米蕈松露營養補充品後之肝、腎及肺組織染色顯微放大圖，顯示大量抑制ACE2和TMPRSS的蛋白質表現。

第八圖(A)係小鼠注射人類肝癌HepG2細胞之控制組與餵食本發明米蕈松露營養補充品之低劑量組、高劑量組之腫瘤大小變化圖。

第八圖(B)係小鼠注射人類肝癌HepG2細胞之控制組與低劑量組、高劑量組之腫瘤重量變化圖。

第八圖(C)係小鼠注射人類肝癌HepG2細胞之控制組與低劑量組之腫瘤相片。

第八圖(D)係小鼠注射人類肝癌HepG2細胞之控制組與低劑量組、高劑量組之Ki67和C-caspase-3組織染色顯微放大圖。

第八圖(E)係小鼠注射人類肝癌HepG2細胞之控制組與低劑量組、高劑量組之肝、腎組織染色顯微放大圖。

第九圖(A)係小鼠注射人類結腸直腸癌細胞株HCT-116之控制組與餵食本發明米蕈松露營養補充品之低劑量組、高劑量組之腫瘤大小變化圖。

第九圖(B)係小鼠注射人類結腸直腸癌細胞株HCT-116之控制組與低劑量組、高劑量組之腫瘤重量變化圖。

第九圖(C)係小鼠注射人類結腸直腸癌細胞株HCT-116之控制組與低劑量組之腫瘤相片。

第九圖(D)係小鼠注射人類結腸直腸癌細胞株HCT-116之控制組與低劑量組、高劑量組之Ki67和C-caspase-3組織染色顯微放大圖。

第九圖(E)係小鼠注射人類結腸直腸癌細胞株HCT-116之控制組與低劑量組、高劑量組之肝、腎組織染色顯微放大圖。

以下，茲舉本發明數個較佳實施例，並配合圖式作進一步之詳細說明如後：

請參閱第一圖所示，本發明一較佳實施例之米蕈松露之固態植菌栽培方法100，其第一步驟係備取培植基並攪拌均勻110：備取重量比為5：1：1：1之胚芽米、黃豆粉、米糠粉與純水，及與純水體積比為1：100之糖蜜置入一鍋具中混合攪拌均勻，以作為培植基，培植基之酸鹼值PH約5.8。前述胚芽米、黃豆粉、米糠粉及糖蜜、純水皆為可食用之原料，各原料之量係視米蕈之栽培量而定，例如備取10公斤之胚芽米時，黃豆粉與米糠粉係取2公斤，此時糖蜜係取20cc，純水係備取2公升。另，調整該培植基酸鹼值之方式乃屬習知技術(例如添加醫療級之碳酸鈣等配方)，此處不予贅述。

本發明之第二步驟係蒸煮120：將攪拌均勻之培植基加熱蒸煮3小時，使胚芽米、黃豆粉、米糠粉熟成並使養分溶出。

本發明之第三步驟係第一次靜置130：將蒸煮完成之培植基靜置3小時以降溫。

本發明之第四步驟係裝袋140：將降溫後之培植基分別置入數個習知之菇包袋，如同習知栽培菇類之方式。

本發明之第五步驟係滅菌150：將各菇包袋與培植基置於一習知殺菌釜中滅菌1小時以進行殺菌。

本發明之第六步驟係第二次靜置160：將滅菌後之菇包袋靜置4小時。

本發明之第七步驟係添加菌絲發酵液170：將培養真菌子實體之松露菌絲發酵液加入各菇包袋內之培植基。該松露菌絲發酵液係白松露菌絲發酵液，當然，其亦可為其他種類之松露菌絲發酵液。

本發明之第八步驟係培植180：將各結包袋置於農場中培植4至5個月，使菌絲可將培植基分解、代謝而吸收培植基之營養成長。該農場概如習知蕈菇類之室內栽培場所，溫度、光照強度與濕度等環境條件要求亦概如習知蕈菇類栽培場所，此處不予贅述。

本發明之最後步驟係收成190：當各該菇包袋長滿米蕈松露菇體(米蕈培植之白松露)時即可收成(通常是指長出初菇、子實體時，菇包袋內會充滿米蕈松露之子實體)，米蕈松露可直接食用，亦可供萃取營養成分再製為其他營養食品或營養補充品，如後所述。

本發明更提供栽培米蕈松露之培植基，該培養基包含有混合均勻之胚芽米、黃豆粉、米糠粉、糖蜜及純水，且胚芽米、黃豆粉、米糠粉與純水之重量比為5：1：1：1，且糖蜜及純水之體積比為1：100。

再者，本發明亦提供一種米蕈松露栽培包，包含有一菇包袋；一培植基，置於該菇包袋內，包含混合均勻並熟成之胚芽米、黃豆粉、米糠粉、糖蜜及純水，且胚芽米、黃豆粉、米糠粉及純水之重量比為5：1：1：1，且糖蜜及純水之體積比為1：100。

前述培植基中採用之胚芽米是指糙米(日本稱為玄米)去除表面之米糠後所剩帶有胚乳、胚芽的米粒，而胚芽米去除胚芽後即為一般人常食用之精米/精白米(僅剩胚乳部分)，經研究，米的營養成分佔比胚芽約佔65%、米糠佔30%、胚乳佔5%，亦即，米的營養成分大多集中在胚芽、其次為米糠，胚芽蘊含豐富的蛋白質、澱粉、膳食纖維、多種維生素及鈣、鐵、鋅、硒等微量元素以及生物活性物質，能發育成胚葉並生長，因此，胚芽米習稱為具有生命力的活米，當然，就營養價值而言，糙米高於胚芽米(糙米表面有米糠)、胚芽米高於精米，如前述，米糠之營養成分亦不少，但糙米表面之米糠僅佔整體5%、含量不高，是以，本發明之培植基以胚芽米為主要原料並搭配含量更多之米糠粉，營養成分較糙米更高，並搭配富含蛋白質、脂肪、碳水化合物、膳食纖維、礦物質、維生素與胺基酸等營養成分之黃豆粉，具備松露菌絲生長所需之各種營養成分，供松露菌絲健康地生長，配合該蒸煮120步驟使培植基之營養成分更易釋出被松露菌絲吸收。

由上可知，本發明係運用固態植菌寄宿栽培法栽培出米蕈松露(本實施例係白松露)之子實體，不僅有別於習知利用發酵(液態與固態發酵)培育米蕈之菌絲體之技術，由於培植基採用胚芽米、營養成分高，栽培出之米蕈松露營養成分遠高於習知米蕈之菌絲體，且，本發明栽培松露之方式較習知結合松露菌種與小樹苗為菌根苗後移栽植樹之方式簡便，便於量產而具經濟效益。其次，經分析，本發明栽培之米蕈松露包含約13.1%之蛋白質及約19.4%之多醣體等營養成分，多醣體之比例甚高，可具有很高的免疫調節效果，食用本發明米蕈松露可使免疫異常及免疫低下狀態恢復到正常，並產生其他保健效果，且本發明栽培過程安全衛生、品質甚為穩定，甚具實用價值。

此外，如前所述，本發明所栽培之米蕈松露除了可直接食用，更可作為原料供萃取營養成分再製為營養食品或營養補充品，如第二圖所示，本發明更提供一種米蕈松露營養補充品之製法200，其第一步驟係備取米蕈松露210：係採收前述利用胚芽米為主要原料所栽培之新鮮米蕈松露(子實體)。

該製法200之第二步驟係水萃取220：係先將米蕈松露切削為片狀或塊狀後置於一容器中(圖中未示)，再以米蕈松露與水之固液比為1：10之比例加入純水，加熱適當時間(沸騰後約30分鐘至1小時之間)後可獲得萃取液，再加以過濾、收集濾液，藉以可利用水萃法萃取米蕈松露之營養成分，該萃取液中係包含米蕈松露營養成分之水萃物，包含蛋白、多醣體及腺苷等。

該製法200之第三步驟係乾燥並研磨230：將經過水萃取之米蕈松露予以乾燥、去除水分後研磨成粉末。乾燥之方式可為日曬、熱風烘乾或冷凍乾燥等技術均可，本實施例係採用熱風烘乾。

該製法200之第四步驟係第一次造粒240：係運用噴霧造粒技術將部分米蕈松露粉末製成複數米蕈松露顆粒，詳言之，係將70%至80%之米蕈松露粉末混合純水呈漿狀後，於一習知流動床噴霧造粒乾燥設備內以微滴狀噴灑而出(利用流動床噴霧造粒乾燥設備之噴槍噴灑)，使各該米蕈松露粉末可受熱空氣乾燥成顆粒狀，以獲致複數米蕈松露顆粒。前述流動床噴霧造粒乾燥設備乃屬習知技術，此處不予贅述其詳細構成。其次，將各該米蕈松露粉末製成顆粒狀之技術並不限於前述之噴霧造粒技術，亦可為其他造粒技術。

該製法200之第五步驟係加入萃取液250：係將該萃取液加入各米蕈松露菇體顆粒，使各該米蕈松露顆粒吸附萃取液，加入萃取液之動作可在一容器(圖中未示)內進行。

該製法200之第六步驟係第二次造粒260：係運用噴霧造粒技術將吸附萃取液之各該米蕈松露顆粒製成複數顆粒狀之米蕈松露營養補充品，詳言之，係將吸附萃取液之各該米蕈松露顆粒置於習知流動床噴霧造粒乾燥設備中，使各該米蕈松露顆粒可受熱風吹動而浮動，再將複數包覆粉末(例如第一次造粒240使用剩下的20%至30%米蕈松露粉末)噴灑於均勻浮動狀態之米蕈松露顆粒上(利用流動床噴霧造粒乾燥設備之噴槍噴灑)，使各該包覆粉末可結合於複數米蕈松露顆粒表面，然後乾燥至所需之含水量，以獲致複數顆粒狀之米蕈松露營養補充品。當然，將各該塗佈材料粉末設置於米蕈松露顆粒表面之技術並不限於前述之噴霧造粒技術，亦可為其他技術。其次，該包覆粉末不限為米蕈松露粉末，亦可包含其他營養成分或為其他營養成分。

該製法200之第七步驟係過篩270：以80目篩網過篩各該顆粒狀之米蕈松露營養補充品，以獲得低於80目粒徑之米蕈松露營養補充品。

該製法200之第八步驟係檢測280：將各該米蕈松露營養補充品進行含水量及微生物檢測，含水量需低於1至5%(視後續步驟之包裝材料類型而調整)，微生物則須為無檢出。

該製法200之最後步驟係包裝290：將符合含水量及微生物檢測之米蕈松露營養補充品進行包裝，例如裝袋或填裝為膠囊。

藉此，該製法200所製備之米蕈松露營養補充品是利用整顆米蕈松露菇體(子實體)製成，不僅含有米蕈松露的完整營養成分(包含約13.1%之蛋白質及約19.4%之多醣體等營養成分)，且，透過前述萃取水萃物、使各米蕈松露顆粒吸附水萃物後再噴粉造粒之方式，可使營養成分更快速地被人體分解與吸收，獲致提高免疫功能等保健效果。

以下，茲就本發明所製備之米蕈松露營養補充品之營養成分分析及保健功效進行相關實驗與說明：

首先，分析米蕈松露營養補充品中多醣體之組成，使用一習知高效陰離子交換層析儀搭配脈衝式電流偵測法(pulsed amperometric detection,PAD)，可在短時間內完成醣類分子的分析。可先進行標準溶液之配製，係取預先經烘箱70℃乾燥4小時以上之半乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖及麥芽糖對照用標準品各約2.5g，分別以50%乙醇溶液溶解並定容至50mL，作為標準原液，再取適量的各標準原液混合，以去離子水稀釋至0.5~30μg/mL，作為標準溶液。接著，再進行檢液之配製，係將該米蕈松露營養補充品混勻後，取約1g置於一離心管中，加入50%乙醇溶液10mL，以超音波振盪20分鐘，再經一振盪器振盪10分鐘，再以50%乙醇溶液定容至20mL，於9000×g離心30分鐘，取適量的上清液，以去離子水稀釋50倍，經一濾膜過濾供作檢液。

接著，精確量取檢液及標準溶液各10μL，分別注入高效陰離子交換層析儀中進行分析，就檢液與標準溶液所得波峰之滯留時間比較鑑別之，並依下列計算式求出檢體中各糖類之含量(g/100g)：

檢體中各糖類之含量(g/100g)=C*V*F/M*10000

C：由標準曲線求得檢液中各糖類之濃度(μg/mL)、V：檢體最後定容之體積(20mL)、M：取樣分析檢體之重量(g)、F：稀釋倍數(50)。

檢驗結果，該米蕈松露營養補充品之多醣體組成分析定量如表一及第三圖所示：

表一：

由上可知，該米蕈松露營養補充品之多醣體之組成為果糖、葡萄糖與麥芽糖。另，前揭該高效陰離子交換層析儀之操作方式、測定條件與脈衝式電流偵測法之分析方法乃習知技術，此處不予贅述。

此外，該米蕈松露營養補充品中亦包含有腺苷，可使用一習知高效液相層析儀(HPLC)進行腺苷含量之分析，係先進行標準溶液之配製，係取腺核苷對照用標準品約10mg，以去離子水溶解並定容至10mL，再以去離子水稀釋至1~200μg/mL，供作標準溶液。接著，再進行檢液之調製，係將米蕈松露營養補充品混勻後，取約0.5g，加入去離子水20mL混合，於60℃超音波振盪30分鐘後靜置冷卻，再以去離子水定容至25mL，於5500×g離心3分鐘，取上清液，經一濾膜過濾後作為檢液。再精確量取檢液及標準溶液各10μL，分別注入該高效液相層析儀中分析腺苷含量，係先製作腺苷標準曲線，再以相同條件下進行腺苷含量的分析：就檢液與標準溶液所得波峰之滯留時間及吸收圖譜比較鑑別之，並依下列計算式求出檢體中腺核苷之含量(mg/g)：

檢體中腺核苷之含量(mg/g)=C*V/M*1000

C：由標準曲線求得檢液中腺核苷之濃度(μg/mL)、V：檢體最後定容之體積、M：取樣分析檢體之重量(g)。

分析後發現，如第四圖所示，該米蕈松露營養補充品之腺苷(Adenosine)含量為0.39(mg/1g)，腺苷常作為增能劑，在傳統醫學中更被認為有利於疾病的治療。

其次，胜肽蛋白除了具有生理調控功能外，近年來其抗菌、抗病毒的活性也逐漸被發現與重視，例如，可抵抗流感病毒A型與B型、反轉錄病毒HIV，B型肝炎與C型肝炎，泡疹病毒以及腸病毒等，相關研究指出，胜肽抗病毒的活性主要有抑制病毒進入細胞、抑制病毒複製、抑制病毒DNA或RNA的合成。其次，自2019年起，冠狀病毒(COVID-19)已在世界各國造成嚴重感染甚至死亡，此種病毒是由嚴重急性呼吸綜合徵冠狀病毒2(SARSCoV-2)帶有一種刺突蛋白的冠狀病毒。SARS-CoV-2病毒包膜上的刺突蛋白結構域可以直接與血管緊張素轉換酶2(ACE2)結合，這是一種膜相關的酶，SARS-CoV-2刺突蛋白可以被切割並被跨膜蛋白酶活化，包括絲氨酸2(TMPRSS2)，從而促進SARS-CoV-2進入宿主細胞。SARS-CoV-2對ACE2的高親和力可能促進人與人之間的傳播傳送。因此，減少ACE2的蛋白質表達和TMPRSS2在宿主細胞中，可能是一種有效的策略預防和治療SARS-CoV-2感染方法。

基此，本發明更進行該米蕈松露營養補充品之抗病毒活性及免疫調節的實驗與分析：

首先，配製好該米蕈松露營養補充品的10mg/mL濃度原液(Stock)後，再進行細胞培養(利用HepG2細胞，即人肝細胞癌細胞系)及細胞存活率試驗，然後，使用習知西方墨點法(Western blot)偵測相關蛋白質變化，其內容包含細胞蛋白質抽取、蛋白質定量、蛋白質電泳等步驟後進行暗房底片顯影。經分析，該米蕈松露營養補充品的蛋白質分子量約為25kDa，水解該米蕈松露營養補充品的分子量約為13kDa。

接著，進行COVID-19棘蛋白受體結合抑制劑潛力機制和免疫學研究，係以小黑鼠(C57BL/6mice；18-20g；5-7weeks)為實驗動物，將其分為控制組以及每日口服該米蕈松露營養補充品之口服組，每週三次記錄每隻小鼠的體重，並在第7天犧牲。實驗結束時收集小黑鼠的血液、組織樣品和淋巴結，將血清保持在-80℃，組織固定在10%福爾馬林中，淋巴結放入磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS溶液)中，收集上清液，以750×g離心10分鐘後，棄去上清液，將細胞置於0.5mL PBS中。然後進行習知流式細胞儀(BD biosciences)檢測。

利用西方點墨法分析該米蕈松露營養補充品對ACE2和TMPRSS2所產生的蛋白質變化，經分析發現，該米蕈松露營養補充品在沒有細胞毒性之下在反應24小時候會大量抑制ACE2和TMPRSS蛋白質表現，如第五圖所示。

其次，細胞的表面帶有CD4+的標誌，會協助活化B細胞產生抗體，也可協助細胞毒性T細胞及巨噬細胞發揮免疫功能，且，細胞的表面亦帶有CD8+的標誌，它的功能就像殺手或細胞毒素，會辨識和消滅腫瘤細胞。小黑鼠之淋巴細胞透過流式細胞儀檢測分析口服該米蕈松露營養補充品對CD4和CD8所產生的活性變化，在沒有細胞毒性之下CD4和CD8均會活化，CD4約活化3倍到12倍，CD8會活化3倍到6倍，如第六圖所示。

再者，取小鼠組織肝、腎和肺臟進行H&E染色分析和免疫組織化學分析。用以判斷ACE2和TMPRSS2在小鼠組織肝、腎和肺臟中的表現。利用西方點墨法分析該米蕈松露營養補充品對ACE2和TMPRSS2所產生的蛋白質變化，發現該米蕈松露營養補充品之口服組在H&E染色下不具有毒性，且在肝、腎和肺臟會大量抑制ACE2和TMPRSS的蛋白質表現，如第七圖所示。

據此，由於臨床試驗中證實TMPRSS2抑制劑能阻止SARS-CoV-2進入肺細胞，而口服該米蕈松露營養補充品之小鼠在肝、腎和肺臟可大量抑制ACE2和TMPRSS的蛋白質表現，因此，該米蕈松露營養補充品顯然可以抑制病毒進入細胞，進而提高免疫力、保護人體不受病毒的侵害。

其次，本發明更利用小鼠進行該米蕈松露營養補充品之抗癌(抗人類肝癌HepG2及抗人類結腸直腸癌細胞株HCT-116)動物實驗分析：

小鼠分為對照組、低劑量(150mg/Kg)組與高劑量(300mg/Kg)組，飼養第2週時於所有小鼠左右側臀部分別各一次皮下注射人類肝癌HepG2細胞(細胞數2x106)和人類結腸直腸癌細胞株HCT-116(細胞數2x106)，腫瘤體積成長至50-100mm³時，開始給予低劑量餵食組與高劑量餵食組小鼠每天口服該米蕈松露營養補充品一次，實驗期間紀錄小鼠之體重變化及每週紀錄腫瘤之體積改變，實驗八週後，存活之小鼠以CO₂犧牲，取出肝臟、腎臟等器官與血液、腫瘤並記錄以進行後續之實驗與分析。

一、抗人類肝癌HepG2動物實驗部分：

如第八圖(A)顯示，在36天的觀察期間，與對照組相比，餵食米蕈真菌胜肽的小鼠表現出對人類肝癌HepG2腫瘤體積減小的顯著效果，並呈現濃度依賴性。詳言之，高劑量組的給藥從第15天起顯著減弱了對人類肝癌HepG2腫瘤體積，而低劑量組從第21天起顯示出對腫瘤體積的顯著抑制，且腫瘤重量顯著的抑制，如第八圖(B)、(C)所示。另，為了確定該米蕈松露營養補充品抑制人類肝癌HepG2負瘤小鼠的機制，對肝癌HepG2腫瘤中C-caspase-3(腫瘤細胞凋亡的標誌物)和Ki67(腫瘤細胞增殖的標誌物)的免疫(IHC)染色從經該米蕈松露營養補充品餵食的小鼠和賦形劑對照小鼠中採取檢體。與對照組相比，在該米蕈松露營養補充品餵食組的腫瘤中檢測到C-caspase-3表達顯著增加和Ki67表達降低，如第八圖(D)所示。切片結果顯示，食用該米蕈松露營養補充品可降低癌細胞增殖並誘導肝癌HepG2腫瘤中caspase依賴性凋亡。

除此之外，檢查了小鼠腎臟和肝臟標本的組織病理學特徵，以評估該米蕈松露營養補充品餵食對負瘤小鼠的一般毒性。在顯微鏡下，與經媒介物處理的小鼠相比，從低劑量組和高劑量組的小鼠採樣的腎臟和肝臟組織中均未觀察到明顯變化，如第八圖(E)所示。組織病理學特徵的結果表明，該米蕈松露營養補充品對帶有肝癌HepG2腫瘤的小鼠沒有明顯的細胞毒性。體內數據共同證明，該米蕈松露營養補充品抑制了皮下肝癌HepG2腫瘤的生長並誘導了細胞凋亡，而在小鼠中未顯示明顯的細胞毒性，這表明該米蕈松露營養補充品可能為安全且有吸引力的抗肝癌藥物候選。

二、抗人類結腸直腸癌細胞株HCT-116動物實驗部分：

如第九圖(A)顯示，在41天的觀察期間，與對照組相比，餵食該米蕈松露營養補充品的小鼠表現出對人類結腸直腸癌細胞株HCT-116腫瘤體積減小的顯著效果，並呈現濃度依賴性。詳言之，高劑量組的給藥從第25天起顯著減弱了對結腸直腸癌細胞株HCT-116腫瘤體積，而低劑量組從第30天起顯示出對腫瘤體積的顯著抑制，且腫瘤重量顯著的抑制，如第九圖(B)、(C)所示。另，為了確定該米蕈松露營養補充品抑制人類結腸直腸癌細胞株HCT-116負瘤小鼠的機制，對結腸直腸癌細胞株HCT-116腫瘤中c-caspase-3(腫瘤細胞凋亡的標誌物)和Ki67(腫瘤細胞增殖的標誌物)的免疫(IHC)染色從經該米蕈松露營養補充品餵食的小鼠和賦形劑對照小鼠中採取檢體。與對照組相比，在低劑量組與高劑量組的腫瘤中檢測到c-caspase-3表達顯著增加和Ki67表達降低，如第九圖(D)所示。切片結果顯示，該米蕈松露營養補充品在體內可降低癌細胞增殖並誘導人類結腸直腸癌細胞株HCT-116腫瘤中caspase依賴性凋亡。

除此之外，檢查小鼠的腎臟和肝臟標本的組織病理學特徵，以評估該米蕈松露營養補充品餵食對負瘤小鼠的一般毒性。在顯微鏡下，與經媒介物處理的小鼠相比，從餵食低劑量和高劑量的小鼠採樣的腎臟和肝臟組織中均未觀察到明顯變化，如第九圖(E)所示。組織病理學特徵的結果表明，該米蕈松露營養補充品對帶有結腸直腸癌細胞株HCT-116腫瘤的小鼠沒有明顯的細胞毒性。體內數據共同證明，該米蕈松露營養補充品抑制了皮下結腸直腸癌細胞株HCT-116腫瘤的生長並誘導了細胞凋亡，而在小鼠中未顯示明顯的細胞毒性。這表明該米蕈松露營養補充品可能為安全且有吸引力的抗前列腺癌藥物候選。

據此，該米蕈松露營養補充品在動物實驗中可以抑制人類肝癌HepG2和結腸直腸癌細胞株HCT-116的生長，藉由腫瘤中組織切片染色後，更發現該米蕈松露營養補充品會促進癌細胞中C-caspase-3的活化，最終導致細胞凋亡而抑制腫瘤生長，對於人體食用應具有正向之效益。

綜上所述，本發明利用蕈菇類之固態栽培法栽培出松露(米蕈松露)之子實體，營養成分遠高於習知液態發酵及固態發酵培育之米蕈菌絲體，且，栽培過程安全衛生、品質穩定，易於量產，甚具實用價值。

以上所述僅為本發明的數個較佳實施例而已，並非用以限制本發明，任何所屬技術領域中具通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之修改、更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。