JP4559683B2 - Echinaceaサプリメントおよびその製造方法 - Google Patents
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Description
(発明の分野)
本発明は、Echinacea属の植物から調製される栄養的なサプリメントに関する。
【0002】
(発明の背景)
多数の研究によって、Echinacea属の植物に由来する抽出物の健康を増進(促進)する特性が証明されている。例えば、A.AwangおよびD.Kindack、Canadian Pharmaceutical Journal,124:512−516(1991)を参照のこと。良好な健康状態を促進すると考えられている生物学的に活性な成分を含有しているEchinacea組成物についての強力な商業的な市場が存在している。さらに、Echinacea植物に由来する生物学的に活性な成分の標準化された量を含有するように、Echinacea組成物を処方することが所望される。このような、標準化されたEchinacea組成物は、1つ以上の生物学的に活性なEchinacea成分の有効な用量を一貫して消費者に提供する。
【0003】
詳細には、良好な健康状態を促進すると考えられる1つ以上の生物学的に活性な高濃度のEchinacea成分を含有しているEchinacea抽出物についての強力な商業的な市場が存在している。このような高度に富化された抽出物は、食餌療法のサプリメントとして直接使用され得るか、または生物学的に活性であるEchinacea成分の標準化された量を含有している食餌療法のサプリメントを調製するため他のEchinacea抽出物と混合され得る。
【0004】
Echinaceaに由来するポリサッカライド、アルキルアミド、および、シコリイン酸(cichoric acid)(シコリイン酸、2,3−o−ジ−カフェオイル酒石酸としてもまた公知のコーヒー酸誘導体)が、それぞれ、健康を促進する特性を有することが、化学的な研究によって示される。例えば、Echinaceaに由来するアルキルアミドは、約0.1part per million(ppm)の濃度でマウスの顆粒球中での食作用を刺激することが示されている。Bauer,R.ら、Arzneim.−Forsch./Drug Research,38:276−281(1988)。同様に、シコリイン酸は、顆粒球中での食作用を増大させ、そして0.01ppm程度の低い濃度で免疫系を刺激し得ることが示されている。例えば、A.Awangら、前出を参照のこと。Echinaceaポリサッカライドは、マウスにおいて、ヒアルロニダーゼを阻害し、食作用を増大させ、インターフェロン−6の放出を誘導し、そしてC.albicans感染に対する耐性を増強することが示されている。例えば、A.Awangら、前出、Wanger,H,ら、Arzneim.−Forsch./Drug Research,35:1069−1075(1985)を参照のこと。
【0005】
高濃度のポリサッカライド、アルキルアミド、および/またはシコリイン酸を有しているEchinacea抽出物を産生するために、多数の因子を考慮し、そして最適化しなければならない。例えば、Echinacea植物中のポリサッカライド、アルキルアミド、および/またはシコリイン酸の量は、植物の種類、植物の年齢、および植物の生長条件によって影響を受ける。さらに、溶媒およびプロセスのパラメーター(例えば、Echinacea植物からポリサッカライド、アルキルアミド、およびシコリイン酸を抽出するために利用される、温度、抽出される時間の長さ)は、これらの成分の収量に大きく影響を与え得る。
【0006】
従って、Echinacea植物からポリサッカライド、アルキルアミド、およびシコリイン酸を効率よく抽出するための方法、ならびに高濃度のポリサッカライド、アルキルアミド、および/またはシコリイン酸を含有しているEchinacea抽出物が必要とされている。さらに、ポリサッカライド、アルキルアミド、および/またはシコリイン酸抽出物を含有している、予め決定された所望される量のEchinacea抽出物を含有している標準化されたEchinacea組成物が、必要とされている。
【0007】
(発明の要旨)
1つの局面においては、本発明は、標準化された量の少なくとも2つのEchinacea成分を含有しているEchinacea組成物を提供する。より好ましくは、本発明のEchinacea組成物は、標準化された量の少なくとも3個のEchinacea成分を含有している。この状況においては、用語「標準化された量」またはその文法上の等価物は、所望される定量された量のEchinacea成分を意味する。本発明において好ましいEchinacea成分は、Echinaceaポリサッカライド、Echinaceaアルキルアミド、およびシコリイン酸である。本発明のEchinacea組成物を調製するために有用である本発明において好ましいEchinacea抽出物は、シコリイン酸(最も好ましくは、本発明に従って調製されたシコリイン酸)、Echinaceaアルキルアミド(最も好ましくは、本発明に従って調製されたEchinaceaアルキルアミド)、またはEchinaceaポリサッカライド(最も好ましくは、本発明に従って調製されたEchinaceaポリサッカライド)において富化された抽出物である。本発明のEchinacea組成物は、液体の形態、ゲルの形態、または固体の形態(例えば、散剤、または錠剤、またはカプセル剤)であり得、そして好ましくは、ヒトに対する投与(より好ましくは、経口投与)のために適合させられる。
【0008】
別の局面においては、本発明は、Echinacea組成物を調製するための方法を提供する。この方法は、少なくとも2つのEchinacea成分(好ましくは、3個のEchinacea成分)の、混合されたEchinacea組成物のそれぞれの標準化された量を含有しているEchinacea成分を生じるために十分な量を混合する工程を包含する。この状況においては、用語「標準化された量」またはその文法上の等価物は、所望される定量された量のEchinacea成分を意味する。本発明において好ましいEchinacea成分は、Echinaceaポリサッカライド、Echinaceaアルキルアミド、およびシコリイン酸である。本発明のEchinacea組成物を調製するために有用である本発明において好ましいEchinacea抽出物は、シコリイン酸(最も好ましくは、本発明に従って調製されたシコリイン酸)、Echinaceaアルキルアミド(最も好ましくは、本発明に従って調製されたEchinaceaアルキルアミド)、またはEchinaceaポリサッカライド(最も好ましくは、本発明に従って調製されたEchinaceaポリサッカライド)において富化された抽出物である。
【0009】
別の局面においては、本発明は、少なくとも1つのEchinacea成分において富化されたEchinacea抽出物を調製するための方法を提供する。富化されたEchinacea抽出物を調製するための本発明の方法は、以下の工程を包含する:増強された量の所望される成分(例えば、シコリイン酸、アルキルアミド、またはポリサッカライド)を有している発達段階でEchinacea植物を選択する工程;所望される成分において富化されている選択された植物の一部を選択する工程;および選択された一部を、植物の一部から所望される成分を抽出するために有用である、エタノールおよび水ならなる群より選択される一定量の溶媒と接触させる工程。好ましくは、Echinacea抽出物は次いで濃縮される。任意の種のEchinacea植物が、本発明の実施において利用され得るが、本発明においては、好ましい種はE.purpureaである。Echinacea植物材料の抽出は、約1部の溶媒に対して約2部未満の、溶媒に対する植物材料の比(重量)を利用する。本発明において好ましい、溶媒に対する植物材料の比(重量)は、約4部の溶媒に対する約1部の植物材料である。
【0010】
なお別の局面においては、本発明は、Echinaceaポリサッカライド、Echinaceaアルキルアミド、およびシコリイン酸からなる群の1つ以上のメンバーにおいて富化された、液体のEchinacea抽出物を提供する。本発明において好ましい、ポリサッカライドにおいて富化された液体のEchinacea抽出物は、約1%(w/w)より大きい濃度、より好ましくは、約5%(w/w)より大きい濃度、最も好ましくは、約10%(w/w)より大きい濃度で、ポリサッカライドを含む。本発明において好ましい、アルキルアミドにおいて富化された液体のEchinacea抽出物は、約0.1%(w/w)より大きい濃度、より好ましくは、約1.0%(w/w)より大きい濃度、最も好ましくは、約3.0%(w/w)より大きい濃度で、アルキルアミドを含む。本発明において好ましい、シコリイン酸において富化された液体のEchinacea抽出物は、約0.2%(w/w)より大きい濃度、より好ましくは、約0.5%(w/w)より大きい濃度、最も好ましくは、約3.0%(w/w)より大きい濃度で、シコリイン酸を含む。
【0011】
なお別の局面においては、本発明は、Echinaceaポリサッカライド、Echinaceaアルキルアミド、およびシコリイン酸からなる群の1つ以上のメンバーにおいて富化された、固体のEchinacea抽出物を提供する。本発明において好ましい、ポリサッカライドにおいて富化された固体のEchinacea抽出物は、約0.01%(w/w)より大きい濃度、より好ましくは、約0.05%(w/w)より大きい濃度、最も好ましくは、約20%(w/w)より大きい濃度で、ポリサッカライドを含む。本発明において好ましい、アルキルアミドにおいて富化された固体のEchinacea抽出物は、約0.001%(w/w)より大きい濃度、より好ましくは、約0.01%(w/w)より大きい濃度、最も好ましくは、約0.5%(w/w)より大きい濃度で、アルキルアミドを含む。本発明において好ましい、シコリイン酸において富化された固体のEchinacea抽出物は、約0.005%(w/w)より大きい濃度、より好ましくは、0.05%(w/w)より大きい濃度、最も好ましくは、約1.5%(w/w)より大きい濃度で、シコリイン酸を含む。
【0012】
本発明のEchinacea抽出物は、例えば、食餌療法のサプリメントして、混合して、そして本発明のEchinacea組成物を生じるための、ポリサッカライド、アルキルアミド、またはシコリイン酸の供給源として、有用である。本発明のEchinacea組成物は、例えば、ヒトの食餌療法のサプリメントとして有用である。限定的ではない例として、哺乳動物に対して投与されると、本発明のEchinacea組成物および抽出物は、免疫系の以下の局面の1つ以上を刺激する:マクロファージの食作用活性;マクロファージによる一酸化窒素の産生;マクロファージによるTNF−αの産生;脾臓細胞によるIFN−γの産生;および脾臓細胞によるTNF−αの産生。
【0013】
なお別の局面においては、本発明は、哺乳動物中の免疫系の活性を増強するための方法を提供する。1つの実施態様においては、この方法は、哺乳動物に対して、標準化された量のEchinaceaシコリイン酸、Echinaceaアルキルアミド、およびEchinaceaポリサッカライドを含有しているEchinacea組成物の毎日の有効投与量を投与する工程を包含する。別の実施態様においては、この方法は、EchinaceaアルキルアミドおよびEchinaceaポリサッカライドからなる群より選択されるEchinacea抽出物の毎日の有効投与量を哺乳動物に投与する工程を包含する。用語「毎日の有効投与量」およびその文法上の等価物は、哺乳動物中の免疫系の活性を増強するために有効である毎日の投与量を意味する。
【0014】
(好ましい実施態様の詳細な説明)
以下の略号が、本明細書中で使用される:mg/ml(またはmg/mL)は、1ミリリットルあたりのミリグラムについての略号である;mg/gは、1グラムあたりのミリグラムについての略号である。
【0015】
本発明は、Echinacea組成物、Echinacea抽出物、ならびに本発明の組成物および抽出物を調製するための方法を提供する。任意の種のEchinaceaが、本発明の実施において利用され得る。植物科学は、現在、9個のEchinacea種を認識している。E.pallidaは、黒っぽい花弁、毛状の葉、および白色の花粉を有する四倍体種である。E.angustifoliaは、代表的には、野生では乾燥した地面で生長し、そして短い毛状の葉および垂れた花によって特徴付けられる。E.purpureaは、豊かな土壌を好み、黒っぽい紫色の花、および広い葉を有する。E.atrorubensは、茎の上に平たい毛を有し、茎に対して近くで折れ曲がった舌状花冠、および毛のない葉を有する。E.sanguineaは、E.pallidaの見た目と似ているが、黄色の花粉を有する二倍体の植物である。E.simulataは、E.stimulataが黄色の花粉を有することを除いて、E.pallidaと物理的に同一であるようである。E.paradoxaは、黄色またはピンク色のいずれかの花を有し、そして平たい毛を有する。E.teneseensisは、上方へ曲がった舌状花冠を有し、そして全てのEchinacea種の毛深い種である。E.laevigataは、E.pallidaのような長い垂れた舌状花冠を有するが、その葉はE.purpureaのものと同様に広い。Echinaceaの任意の種が、本発明の実施において利用され得るが、E.purpureaが、本発明において好ましいEchinacea種である。
【0016】
Echinaceaは、種子、クラウン部分から、そして植物の根の切片(好ましくは、10〜12cmの長さ)から繁殖させられ得る。種子は、秋の熟成後すぐに屋外に種を蒔かれ得、そして春以降に発芽するが、発生の速度は、種によって変化する種子の休眠の程度によって影響を受ける。種子の発芽は、いくつかの因子によって影響を受ける。3年以上にわたる室温での長期間の種子の保存は、発芽の速度を低下させる。種子の大きさおよび開花位置は種子の発芽には影響を与えない。しかし、生理学的な成熟時であるが老化の前に回収された種子は、乾燥後に回収された種子よりも速い発芽速度を有する。本発明の実験においては、種子の供給源(すなわち、種子の供給者)は、E.purpureaの発芽速度のバリエーションの主要なものを説明する。詳細には、種子の商業的に購入されたバッチにおけるEchinaceaハイブリッド種子の存在は所望されない。本発明において好ましい、Echinaceaのハイブリッド種子を同定する方法は、以下のとおりである。試験される種子は、毎日水やりされながらプランター中で発芽させられる。芽は、発芽の1週間後、生長させられる。次いで、芽が回収され、そして水で洗浄され、そして乾燥させられる。清潔な芽が、次いで、それらが微細に混合されるまで、キッチンブレンダーで処理される。植物材料は、5μmのフィルターを通じる濾過によって回収される。残存している液体が、その最初の容量の半分まで、減圧下で蒸発によって濃縮され、次いで、0.45μmのフィルターを通じてHPLC分析のために濾過される。本明細書中の実施例6に記載されるシコリイン酸アッセイ方法を使用するHPLC分析は、ハイブリッドではない種子についての異なるシコリイン酸ピークを示すが、一方、シコリイン酸ピークはハイブリッドの種子においては存在しない。
【0017】
直接播種された場所からの芽の出現は、成層(stratification)後の室内での発芽のようには均一ではない場合がある。種子の成層のための1つの本発明において好ましい方法は、プラスチックバッグの中で清潔な砂と種子を混合(1:1 v/vの比で)すること、そして約1℃から約−4℃の間の温度で4から6週間の間約10パーセントの湿度に維持することである。成層した種子を、次いで、砂から分離し、そして土壌の表面または表面から0.5cmの深さに、またはピートおよび真珠岩(パーライト)の混合物(1:1 v/vの比で)で満たされた小さい穴の中に、種を蒔く。平地に蒔かれた種子は、約18〜20℃で維持され、代表的には、播種の7から10日以内に発生を開始する。芽は、好ましくは、屋外に移植されるまで、光を補って温室または室内で、生長させられる。代表的には、E,purpureaについての約257,000個の種子/kgから、E.angustifoliaについての約319,000個の種子/kgまでである。約500gの種子が、0.5ヘクタール(ha)の平地への移植を提供するために必要とされる。
【0018】
切断から細胞培養までの無性の生長もまた可能である。無性の生長は、活性な化合物の高い収量のために、選択的な品種改良または遺伝子操作を通じて、改善され得る、遺伝的に同一の植物の大きな集団を産生し得る。
【0019】
野生では、Echinaceaは、代表的には、豊かではない、岩だらけの土壌でも、十分な太陽の光があれば生長する。しかし、中程度に豊かな、そして十分に水抜きされた土または砂の多い土の土壌(これは、中性からわずかに酸性(pH6〜7)である)における培養下でも、これはまた、生長する。Echinaceaは、根菜作物であり、従って、岩だらけのまたは重たい土壌が避けられるべきである。Echinaceaは、乾燥耐性であるので、水がその生長には重要であり、そして調節灌流が推奨される。
【0020】
集中的な肥沃化は高い草本の収量を生じるが、根の収量は低くなる。バランスの取れた肥沃化(窒素は少なく、そして適切な量のリンおよびカリウムを含む)が、通常は十分である。骨粉またはリン酸の石(14.5〜20kg/ha)および木炭(45〜51.5kg/ha)が播種の前に適用され、そしてウシまたはウマの堆肥が、播種の後に3回適用され、これらは、Echinaceaの生長のために有機肥沃化の本発明においてこのましい組合せである。4mL/Lの作業濃度で適用された魚による肥沃化(それぞれ、5−2−2の比でN−P2O5−K2Oを含む)は、E.purpureaの生長を促進する。これらに加えて、堆肥および腐敗した地方自治体の廃棄物、緑色の被覆作物(例えば、キノア、イラクサ)、または赤色の被覆作物もまた有用である。化学的な肥沃化もまた、非有機的な培養のために使用され得る。窒素の肥沃化が、一般的な植物の健康状態について使用され、そしてより詳細には、葉の多い、暗い緑色の植物を産生するために、使用される。リン酸塩の肥沃化は、開花を増大する。
【0021】
さらに、植物の面間隔が収量に影響を与える。好ましくは、Echinaceaは、120cmの土台において30cm離して植えられるべきである。これによって、1つの土台あたり5つの並びとなり、そして約74,000本の植物/haを生じる。これは、活発なEchinacea種が使用されるか、または植物が4年間より長い間生長させられる場合には、いっぱいの密度であり得る、最大の密度である。
【0022】
根被い(マルチ)は、土壌の湿度および温度を維持する目的のために、そしてより重要なことは、雑草を制御する目的のために提供される。芽は、黒色のプラスチックの根被い(マルチ)または暗い根被い(マルチ)の下で生長する。芽が屋外である場合は、芽に清潔なストロー(2〜3cm)をかぶせる根被いが必須であると考えられる。Echinaceaは、雑草には耐性ではなく、従って、雑草のコントロールは重要な因子である。本発明の実験においては、Echinaceaを有機的に生長させる局面に関して、黒色のプラスチック、または暗い根被いは、特に、新しく確立される植物についての、最良の雑草のコントロール手段である。プラスチックの根被いは、70から80パーセントで雑草のコントロールのための労働コストを減少させ得る。暗い根被いは、播種後すぐに行われるべきであり、そして表面が乾燥し、そして雑草の発芽に好ましくない条件を作成することを可能にするためには、目の粗いものであるべきである(すなわち、約2cm×2cmより大きい直径を有する暗い根被いの断片を利用する。播種の少なくとも1年前の、土地の獲得は、多年生の雑草を除き、そして一年草の雑草の集団を減少させるための別の方法である。土地の調製の好ましい方法は、雑草が成長する春に、Echinacea植物を播種する前に土地を耕すことである。この方法では、雑草は、それらの根を曝すことによって駆除される。
【0023】
徹底的な土壌の肥沃化が、Echinaceaの増殖および収量を最適にするために必須である。通常は、根は、種まきの3〜4年後まででは所望される大きさには到達しない。注意深く調節された生長条件を用いて、E.angustifoliaからの収量が、2.5トン/haに達し得る。E.purpureaの収量は、代表的には、E,angustifoliaのものよりも多い。
【0024】
本発明のEchinacea組成物は、標準化された量の少なくとも2つのEchinacea成分を含む。より好ましくは、本発明のEchinacea組成物は、標準化された量の少なくとも3個のEchinacea成分を含む。この状況においては、用語「標準化された量」またはその文法上の等価物は、所望される定量された量のEchinacea成分を意味する。標準化された量のEchinacea成分を含むEchinacea組成物を処方することが所望される。なぜなら、このような標準化されたEchinacea組成物は、生物学的に活性な成分(単数または複数)の有効な用量を、一貫して(すなわち、バッチ間で変化しない)消費者に提供するからである。
【0025】
本発明のEchinacea組成物を調製するために有用である本発明において好ましいEchinacea抽出物は、生存している生物体中に導入した場合に、免疫機能の刺激のような、生物学的な応答を誘導し得る少なくとも1つのEchinacea成分において富化されている。限定的ではない例として、本発明のEchinacea組成物を調製するために有用であるEchinacea成分として、以下が挙げられる:揮発性油、アルカミド(アルキルアミドを含む)、シコリイン酸、ポリサッカライド、ポリアルキン、およびポリアルケン。Echinaceaの揮発性油の代表的な例として、ボルネオール、ボルニルアセテート、ペンタデカ−8−エン−2−オン、ゲルマクレン(germacrene)D、カリオフィレン、カリオフィレンエポキシド、およびパルミチン酸が挙げられる。Echinaceaの揮発性油は、例えば、本明細書中で参考として援用されているA.AwangおよびD.Kindack、Canadian Pharmaceutical Journal,124:512−516(1991)、およびBauer.R,「Echinacea Species as Potential Immunostimulatory Drugs」、Economic and Medicinal Plant Research、第5巻、261−267頁(1991)に記載されている。本発明のEchinacea組成物を調製するために有用である本発明において好ましいEchinacea成分は、シコリイン酸(最も好ましくは、本発明に従って調製されたシコリイン酸)、Echinaceaアルキルアミド(最も好ましくは、本発明に従って調製されたEchinaceaアルキルアミド)、またはEchinaceaポリサッカライド(最も好ましくは、本発明に従って調製されたEchinaceaポリサッカライド)である。
【0026】
1つの好ましい実施態様においては、本発明は、標準化された量の第1のEchinacea成分、および標準化された量の第2のEchinacea成分を含有しているEchinacea組成物を提供する。ここでは、第1および第2のEchinacea成分は、それぞれ、シコリイン酸(最も好ましくは、本発明に従って調製されたシコリイン酸)、Echinaceaアルキルアミド(最も好ましくは、本発明に従って調製されたEchinaceaアルキルアミド)、およびEchinaceaポリサッカライド(最も好ましくは、本発明に従って調製されたEchinaceaポリサッカライド)からなる群より別々に選択され、そしてここでは、シコリイン酸の標準化された量は、約0.2mg/mlから約500mg/mlまでであり、より好ましくは、約0.3mg/mlから約30mg/mlまでであり、最も好ましくは、約5mg/mlから約30mg/mlまでである;Echinaceaアルキルアミドの標準化された量は、約0.02mg/mlから約50mg/mlまでであり、より好ましくは、約0.05mg/mlから約50mg/mlまでであり、最も好ましくは、約0.8mg/mlから約50mg/mlまでである;そして、Echinaceaポリサッカライドの標準化された量は、約10mg/mlから約800mg/mlまでであり、より好ましくは、約20mg/mlから約800mg/mlまでであり、最も好ましくは、約50mg/mlから約800mg/mlまでである。
【0027】
第2の本発明において好ましい実施態様においては、本発明は、標準化された量のシコリイン酸(最も好ましくは、本発明に従って調製されたシコリイン酸)、Echinaceaアルキルアミド(最も好ましくは、本発明に従って調製されたEchinaceaアルキルアミド)、およびEchinaceaポリサッカライド(最も好ましくは、本発明に従って調製されたEchinaceaポリサッカライド)を含有しているEchinacea組成物を提供する。そしてここでは、シコリイン酸の標準化された量は、約0.2mg/mlから約500mg/mlまでであり、より好ましくは、約0.3mg/mlから約30mg/mlまでであり、最も好ましくは、約5mg/mlから約30mg/mlまでである;Echinaceaアルキルアミドの標準化された量は、約0.02mg/mlから約50mg/mlまでであり、より好ましくは、約0.05mg/mlから約50mg/mlまでであり、最も好ましくは、約0.8mg/mlから約50mg/mlまでである;そして、Echinaceaポリサッカライドの標準化された量は、約10mg/mlから約800mg/mlまでであり、より好ましくは、約20mg/mlから約800mg/mlまでであり、最も好ましくは、約50mg/mlから約800mg/mlまでである。
【0028】
第3の本発明において好ましい実施態様においては、本発明は、標準化された量の第1のEchinacea成分、および標準化された量の第2のEchinacea成分を含有しているEchinacea組成物を提供する。ここでは、第1および第2のEchinacea成分は、それぞれ、シコリイン酸(最も好ましくは、本発明に従って調製されたシコリイン酸)、Echinaceaアルキルアミド(最も好ましくは、本発明に従って調製されたEchinaceaアルキルアミド)、およびEchinaceaポリサッカライド(最も好ましくは、本発明に従って調製されたEchinaceaポリサッカライド)からなる群より別々に選択され、そしてここでは、シコリイン酸の標準化された量は、約0.01mg/gから約500mg/gまでであり、より好ましくは、約0.05mg/gから約500mg/gまでであり、最も好ましくは、約15mg/gから約500mg/gまでである;Echinaceaアルキルアミドの標準化された量は、約0.005mg/gから約100mg/gまでであり、より好ましくは、約0.1mg/gから約100mg/gまでであり、最も好ましくは、約5mg/gから約100mg/gまでである;そして、Echinaceaポリサッカライドの標準化された量は、約5mg/gから約900mg/gまでであり、より好ましくは、約10mg/gから約900mg/gまでであり、最も好ましくは、約200mg/gから約900mg/gまでである。
【0029】
第4の本発明の好ましい実施態様においては、本発明は、標準化された量のシコリイン酸(最も好ましくは、本発明に従って調製されたシコリイン酸)、Echinaceaアルキルアミド(最も好ましくは、本発明に従って調製されたEchinaceaアルキルアミド)、およびEchinaceaポリサッカライド(最も好ましくは、本発明に従って調製されたEchinaceaポリサッカライド)を含有しているEchinacea組成物を提供する。そしてここでは、シコリイン酸の標準化された量は、約0.01mg/gから約500mg/gまでであり、より好ましくは、約0.05mg/gから約500mg/gまでであり、最も好ましくは、約15mg/gから約500mg/gまでである;Echinaceaアルキルアミドの標準化された量は、約0.005mg/gから約100mg/gまでであり、より好ましくは、約0.1mg/gから約100mg/gまでであり、最も好ましくは、約5mg/gから約100mg/gまでである;そして、Echinaceaポリサッカライドの標準化された量は、約5mg/gから約900mg/gまでであり、より好ましくは、約10mg/gから約900mg/gまでであり、最も好ましくは、約200mg/gから約900mg/gまでである。
【0030】
別の局面においては、本発明は、Echinacea組成物を調製するための方法を提供する。この方法は、少なくとも2つのEchinacea成分(好ましくは、3個のEchinacea成分)の、混合されたEchinacea成分のそれぞれの標準化された量を含有しているEchinacea成分を生じるために十分な量を混合する工程を包含する。この状況においては、用語「標準化された量」またはその文法上の等価物は、所望される定量された量のEchinacea成分を意味する。本発明に従って、Echinacea成分を調製するために有用である、本発明において好ましいEchinacea組成物は、生存している生物体中に導入された場合に、免疫機能の刺激のような、生物学的な応答を誘導し得る。限定的ではない例として、本発明の方法に従って、Echinacea組成物を調製するために有用であるEchinacea成分として、以下が挙げられる:揮発性油、アルカミド(アルキルアミドを含む)、シコリイン酸、ポリサッカライド、ポリアルキン、およびポリアルケン。本発明の方法に従って、Echinacea組成物を調製するために有用である、本発明において好ましいEchinacea成分は、シコリイン酸(最も好ましくは、本発明に従って調製されたシコリイン酸)、Echinaceaアルキルアミド(最も好ましくは、本発明に従って調製されたEchinaceaアルキルアミド)、およびEchinaceaポリサッカライド(最も好ましくは、本発明に従って調製されたEchinaceaポリサッカライド)である。本発明に従って調製されたEchinacea組成物は、液体の形態、ゲルの形態、または固体の形態(例えば、散剤、またはカプセル剤)であり得、そして好ましくは、ヒトに対する投与(より好ましくは、経口投与)のために適合させられる。
【0031】
1つの本発明において好ましい実施態様においては、本発明は、Echinacea組成物を調製するための方法を提供する。この方法は、第1のEchinacea成分および第2のEchinacea成分の量を混合する工程を包含する。上記の第1および第2のEchinacea成分のそれぞれは、シコリイン酸(最も好ましくは、本発明に従って調製されたシコリイン酸)、Echinaceaアルキルアミド(最も好ましくは、本発明に従って調製されたEchinaceaアルキルアミド)、およびEchinaceaポリサッカライド(最も好ましくは、本発明に従って調製されたEchinaceaポリサッカライド)からなる群より別々に選択される。上記のシコリイン酸の量は、約0.2mg/mlから約500mg/mlまで、より好ましくは、約0.3mg/mlから約30mg/mlまで、最も好ましくは、約5mg/mlから約30mg/mlまでのシコリイン酸の標準化された量を含有しているEchinacea組成物を生じるために十分な量である;上記のEchinaceaアルキルアミドの量は、約0.02mg/mlから約50mg/mlまで、より好ましくは、約0.05mg/mlから約50mg/mlまで、最も好ましくは、約0.8mg/mlから約50mg/mlまでのアルキルアミドの標準化された量を含有しているEchinacea組成物を生じるために十分な量である;そして、上記のEchinaceaポリサッカライドの量は、約10mg/mlから約800mg/mlまで、より好ましくは、約20mg/mlから約800mg/mlまで、最も好ましくは、約50mg/mlから約800mg/mlまでのEchinaceaポリサッカライドの標準化された量を含有しているEchinacea組成物を生じるために十分な量である。
【0032】
第2の本発明において好ましい実施態様においては、本発明は、Echinacea組成物を調製するための方法を提供する。この方法は、シコリイン酸(最も好ましくは、本発明に従って調製されたシコリイン酸)、Echinaceaアルキルアミド(最も好ましくは、本発明に従って調製されたEchinaceaアルキルアミド)、およびEchinaceaポリサッカライド(最も好ましくは、本発明に従って調製されたEchinaceaポリサッカライド)の量を混合する工程を包含する。上記のシコリイン酸の量は、約0.2mg/mlから約500mg/mlまで、より好ましくは、約0.3mg/mlから約30mg/mlまで、最も好ましくは、約5mg/mlから約30mg/mlまでのシコリイン酸の標準化された量を含有しているEchinacea組成物を生じるために十分な量である;上記のEchinaceaアルキルアミドの量は、約0.02mg/mlから約50mg/mlまで、より好ましくは、約0.05mg/mlから約50mg/mlまで、最も好ましくは、約0.8mg/mlから約50mg/mlまでのアルキルアミドの標準化された量を含有しているEchinacea組成物を生じるために十分な量である;そして、上記のEchinaceaポリサッカライドの量は、約10mg/mlから約800mg/mlまで、より好ましくは、約20mg/mlから約800mg/mlまで、最も好ましくは、約50mg/mlから約800mg/mlまでのEchinaceaポリサッカライドの標準化された量を含有しているEchinacea組成物を生じるために十分な量である。
【0033】
第3の本発明において好ましい実施態様においては、本発明は、Echinacea組成物を調製するための方法を提供する。この方法は、第1のEchinacea成分および第2のEchinacea成分の量を混合する工程を包含する。上記の第1および第2のEchinacea抽出物のそれぞれは、シコリイン酸(最も好ましくは、本発明に従って調製されたシコリイン酸)、Echinaceaアルキルアミド(最も好ましくは、本発明に従って調製されたEchinaceaアルキルアミド)、およびEchinaceaポリサッカライド(最も好ましくは、本発明に従って調製されたEchinaceaポリサッカライド)からなる群より別々に選択される。上記のシコリイン酸の量は、約0.01mg/gから約500mg/gまで、より好ましくは、約0.05mg/gから約500mg/gまで、最も好ましくは、約15mg/gから約500mg/gまでのシコリイン酸の標準化された量を含有しているEchinacea組成物を生じるために十分な量である;上記のEchinaceaアルキルアミドの量は、約0.005mg/gから約100mg/gまで、より好ましくは、約0.1mg/gから約100mg/gまで、最も好ましくは、約5mg/gから約100mg/gまでのアルキルアミドの標準化された量を含有しているEchinacea組成物を生じるために十分な量である;そして、上記のEchinaceaポリサッカライドの量は、約5mg/gから約900mg/gまで、より好ましくは、約10mg/gから約900mg/gまで、最も好ましくは、約200mg/gから約900mg/gまでのEchinaceaポリサッカライドの標準化された量を含有しているEchinacea組成物を生じるために十分な量である。
【0034】
第4の本発明において好ましい実施態様においては、本発明は、Echinacea組成物を調製するための方法を提供する。この方法は、シコリイン酸(最も好ましくは、本発明に従って調製されたシコリイン酸)、Echinaceaアルキルアミド(最も好ましくは、本発明に従って調製されたEchinaceaアルキルアミド)、およびEchinaceaポリサッカライド(最も好ましくは、本発明に従って調製されたEchinaceaポリサッカライド)の量を混合する工程を包含する。上記のシコリイン酸の量は、約0.01mg/gから約500mg/gまで、より好ましくは、約0.05mg/gから約500mg/gまで、最も好ましくは、約15mg/gから約500mg/gまでのシコリイン酸の標準化された量を含有しているEchinacea組成物を生じるために十分な量である;上記のEchinaceaアルキルアミドの量は、約0.005mg/gから約100mg/gまで、より好ましくは、約0.1mg/gから約100mg/gまで、最も好ましくは、約5mg/gから約100mg/gまでのアルキルアミドの標準化された量を含有しているEchinacea組成物を生じるために十分な量である;そして、上記のEchinaceaポリサッカライドの量は、約5mg/gから約900mg/gまで、より好ましくは、約10mg/gから約900mg/gまで、最も好ましくは、約200mg/gから約900mg/gまでのEchinaceaポリサッカライドの標準化された量を含有しているEchinacea組成物を生じるために十分な量である。
【0035】
本発明に従って調製されるEchinacea組成物は、液体の形態、ゲルの形態、または固体の形態(例えば、散剤、またはカプセル剤)であり得、そして好ましくは、ヒトに対する投与(より好ましくは、経口投与)のために適合させられる。代表的には、本発明のEchinacea組成物を形成するための混合の前に、Echinacea抽出物のアリコートが、効力について試験される。抽出物は、濃縮または適切な増量剤もしくは溶媒(水、アルコール、ダイズ油、または他の油、レシチン、グリセリンなど)での稀釈によって、所望される濃度(単数または複数)に調節される。混合のための容器は、窒素ガスでパージされ得、そして混合が、酸化を防ぐために窒素下で行われ得る。Echinacea組成物または個々のEchinacea抽出物が、アルコールまたはグリセリン基剤中で処方され得る。粉末にされたEchinacea抽出物または組成物は、スプレー乾燥または凍結乾燥を通じて製造され得る。液体のEchinacea抽出物または組成物もまた、自由に流れる粉末の形態にマイクロカプセル化され得る。液体のEchinacea組成物または抽出物は、軟らかいゼラチンの液体のカプセルおよび硬いゼラチンのカプセル中の成分として直接使用され得、そして錠剤は、粉末状にされた材料から作成され得る。
【0036】
一般的には、本発明に従って調製されたEchinacea抽出物および組成物は、1つ以上の賦形剤を含み得る。適切な薬学的に受容可能な賦形剤としては、処理剤、および薬物送達の改変因子およびエンハンサー(例えば、植物油の粉末、クロスカルメロースナトリウム(croscarmellose sodium)、アカシアガム、およびグアーガム)が挙げられる。他の適切な薬学的に受容可能な賦形剤は、本明細書中で参考として援用されている、「Remington’s Pharmaceutical Sciences」、Mack Pub.Co.,New Jersey(1991)に記載されている。
【0037】
別の局面においては、本発明は、富化されたEchinacea抽出物を調製するための方法を提供する。本発明において好ましい本発明のEchinacea抽出物は、Echinaceaアルキルアミド、Echinaceaポリサッカライド、またはシコリイン酸において富化されている。本発明の方法は、以下の工程を包含する:増強された量の所望される成分(例えば、Echinaceaアルキルアミド、Echinaceaポリサッカライド、またはシコリイン酸)を有している発達段階でEchinacea植物を選択する工程;所望される成分において富化されている植物の一部を選択する工程;および選択された一部を、植物の一部から所望される成分を抽出するために有用である、エタノールおよび水からなる群より選択される一定量の溶媒と接触させる工程。好ましくは、Echinacea抽出物は次いで濃縮される。任意の種のEchinacea植物が、本発明の実施において利用され得るが、本発明においては、好ましい種はE.purpureaである。本発明に従って、Echinacea植物から抽出される本発明において好ましい成分は、ポリサッカライド、アルキルアミド、およびシコリイン酸である。本発明の方法が、ポリサッカライドを抽出するために使用される場合は、抽出されるEchinacea植物は、好ましくは、約1年齢から4年齢までである。好ましいポリサッカライドは、Echinacea植物の花、葉、茎、および/または根から抽出される。本発明の方法が、アルキルアミドを抽出するために使用される場合は、抽出されるEchinacea植物は、好ましくは、約2年齢から4年齢までである。好ましいアルキルアミドは、Echinacea植物の成熟した花および根から抽出される。本発明の方法が、シコリイン酸を抽出するために使用される場合は、抽出されるEchinacea植物は、好ましくは、約1年齢から3年齢までである。好ましいシコリイン酸は、若いEchinacea植物から、Echinacea植物の葉から、および未成熟の花から抽出される。Echinacea植物材料の抽出は、約1部の溶媒に対して約2部未満の植物材料の溶媒に対する植物材料の比(質量)を利用する。本発明において好ましい、溶媒に対する植物材料の比(質量)は、約4部の溶媒に対して約1部の植物材料である。
【0038】
本発明の1つの局面に従うと、ポリサッカライドは、植物材料を、約0.1%(w/w)のエタノールから約50%(w/w)のエタノールまで(好ましくは、約5%のエタノールから約20%のエタノールまで)を含有しているエタノールと水の混合物と接触させることによって、選択されたEchinacea植物材料から抽出され得る。ポリサッカライドは、好ましくは、Echinacea植物の花、葉、茎、および根から抽出される。植物の空中部分は、代表的には、根よりも高い濃度のポリサッカライドを含有し、そして成熟した花は、代表的には、未成熟の花よりも高い濃度を含む。ポリサッカライドを抽出するための好ましい抽出温度は、約20℃から約80℃まで、より好ましくは、約30℃から約70℃まで、最も好ましくは、約30℃から約50℃までである。ポリサッカライドの抽出の期間は、約48時間から約14日間の間、より好ましくは、約3日間から約12日間、最も好ましくは、約4日間から約8日間である。上昇させられた温度での拡大された抽出時間は、ポリサッカライドが可能な限り完全に抽出されることを確実にするが、ポリサッカライドのいくらかの加水分解が、高温で生じる、しかし、低温では、抽出プロセスは有意に遅くなる。低いエタノール濃度を含有しているポリサッカライド抽出物は、細菌、酵母、または真菌の増殖、およびその結果である腐敗を妨げるために、しっかりとモニターされなければならない。
【0039】
本発明に従って調製されたポリサッカライド抽出物は、代表的には、約0.5mg/mLから約20.0mg/mLまでの濃度でポリサッカライドを含む。本発明の実施においては、ポリサッカライド抽出物は、好ましくは、約1mg/mLから約900mg/mLまでの最終ポリサッカライド濃度に、より好ましくは、約60mg/mLから約900mg/mLまでのポリサッカライド濃度に、最も好ましくは、約100mg/mLから約900mg/mLまでのポリサッカライド濃度に、濃縮される。本発明において好ましい、ポリサッカライド抽出物を濃縮するための方法は、蒸発である。蒸発は、好ましくは、約20℃から約85℃の温度で、約5時間から約6日間までの間、行われる。適用される減圧は、代表的には、約5ミリバール(mbar)から約320mbarまでの絶対真空である。
【0040】
本発明の1つの局面に従うと、アルキルアミドは、植物材料を、約50%のエタノールから約95%のエタノール(w/w)まで、好ましくは、約65%のエタノールから約85%のエタノールまで、より好ましくは、約70%のエタノールから約80%のエタノールまでを含有している、エタノールと水の混合物と接触させることによって、選択されたEchinacea植物材料から抽出され得る。アルキルアミドは、全てのEchinacea種において見出され、そして全アルキルアミド濃度(およびアルキルアミドの画分の複雑性)は、葉よりも根において大きい。イソブチルアミドは、E.angustifoliaおよびE.purpuresの根のアルキルアミド画分の主要な成分であるが、これらは、E.pallidaの根においては、アルキルアミド画分の主要ではない成分である。イソブチルアミドは、E.angustifolia、E.purpures、およびE.pallidaの空気中の部分に存在する。Echinacea植物の成熟した花および根は、好ましくは、アルキルアミド抽出物を調製するための出発材料として使用される。なぜなら、これらの植物材料は、最も多い量のアルキルアミドを含有しているからである。アルキルアミドは好ましくは、約2年齢以上であるEchinacea植物から抽出される。
【0041】
Echinaceaアルキルアミドを抽出するための好ましい抽出温度は、約4℃から約85℃まで、より好ましくは、約30℃から約70℃まで、最も好ましくは、約40℃から約60℃までである。アルキルアミドの抽出の時間は、好ましくは、約24時間から約7日間の間、より好ましくは、約1日間から約4日間、最も好ましくは、約2日間から約3日間である。選択されたアルキルアミドの抽出温度は、一部は、出発物質の生の植物材料中の他の化合物の内容物に依存する。大部分のアルキルアミドおよびわずかなシコリイン酸を含有している植物材料の場合においては、抽出は、85℃で行われ得る;しかし、有意な量のシコリイン酸もまた出発物質である植物材料中に存在し、そして最終的な抽出物中にシコリイン酸を保存することが所望される場合には、抽出温度は、シコリイン酸の分解を避けるために、40℃未満に下げられるべきである。
【0042】
本発明に従って調製されたアルキルアミド抽出物は、代表的には、約0.1mg/mLから約3.0mg/mLまでの濃度でアルキルアミドを含む。本発明の実施においては、アルキルアミド抽出物は、好ましくは、約0.1mg/mLから約300mg/mLまでの最終アルキルアミド濃度に、より好ましくは、約1mg/mLから約300mg/mLまでのアルキルアミド濃度に、最も好ましくは、約20mg/mLから約300mg/mLまでのアルキルアミド濃度に、濃縮される。本発明において好ましい、アルキルアミド抽出物を濃縮するための方法は、蒸発である。蒸発は、代表的には、約10℃から約90℃の温度で、約3時間から約3日間までの間、行われる。適用される減圧は、代表的には、約5ミリバール(mbar)から約320mbarまでの絶対真空である。
【0043】
本発明に従うと、シコリイン酸は、植物材料を、約40%のエタノール(w/w)から約95%のエタノール(w/w)まで、好ましくは、約40%のエタノール(w/w)から約85%のエタノール(w/w)まで、より好ましくは、約50%のエタノール(w/w)から約70%のエタノール(w/w)までを含有している、エタノールと水の混合物と接触させることによって、選択されたEchinacea植物材料から抽出され得る。最も高い濃度のシコリイン酸を含有しているEchinacea植物の部分が、好ましくは、高い濃度のシコリイン酸を含有している抽出物を生じるために抽出される。E.purpureaにおいては、最も高い濃度のシコリイン酸は、根、花、および葉において見出されるが、E.angustifoliaにおいては、シコリイン酸は、根だけにおいて見出される。一般的にはシコリイン酸は、好ましくは、若い植物、葉、および未成熟の花から抽出される。本発明のこの局面においては、好ましくは1年齢未満であるEchinacea植物が、選択される。
【0044】
シコリイン酸を抽出するための好ましい抽出温度は、約4℃から約45℃まで、より好ましくは、約4℃から約30℃までである。シコリイン酸の抽出の時間は、好ましくは、約24時間から約3日間の間、より好ましくは、約24時間から約40時間、最も好ましくは、約24時間から約36時間である。シコリイン酸の分解は、40℃よりも高い温度での抽出で有意となる。植物材料中に最初に存在するシコリイン酸の95%程度の量が、抽出が40℃以上で48時間以上行われた場合に、失われ得る。さらに延長された抽出は、シコリイン酸を完全に欠失している抽出物を生じ得る。本発明に従って調製されたシコリイン酸抽出物は、代表的には、約0.2mg/mLから約2.0mg/mLまでの濃度でシコリイン酸を含有する。本発明の実施においては、シコリイン酸抽出物は好ましくは、約1mg/mLから約700mg/mLまでの最終シコリイン酸濃度に、より好ましくは、約5mg/mLから約700mg/mLまでのシコリイン酸濃度に、最も好ましくは、約30mg/mLから約700mg/mLまでのシコリイン酸濃度に、濃縮される。本発明において好ましいシコリイン酸抽出物を濃縮するための方法は、蒸発である。蒸発は、好ましくは、約10℃から約45℃の温度で、約5時間から約2.5日間までの間、行われる。適用される減圧は、代表的には、約5ミリバール(mbar)から約320mbarまでの絶対真空である。
【0045】
Echinacea抽出物を調製するための本発明の方法においては、Echinacea抽出条件は、好ましくは、ポリサッカライド、アルキルアミド、およびシコリイン酸の分解を最少にする。Echinacea中の多くの生物学的に活性な化合物は、分解に対して敏感であり、そしてそれぞれの化合物または化合物のグループは、分解を引き起こし得る種々の条件に対して敏感である。例えば、シコリイン酸は、溶液中で安定ではない。シコリイン酸の分解は、フェノールオキシダーゼによって媒介される酸化によって、加水分解によって、そして化学的な分解によって迅速に生じ得る。熱もまた、シコリイン酸の分解を引き起こし得る。同様に、内因成の植物の酵素(例えば、グリコシドヒドロラーゼおよびアミラーゼ)は、加水分解によってポリサッカライドを分解し得る。さらに、ポリサッカライド抽出物は、糸状菌、酵母、および真菌の増殖によって容易に腐敗させられる。アルキルアミドは、一旦乾燥または精製されると、迅速に分解する。
【0046】
抽出の間の生物学的に活性な化合物の分解を減少させる1つの方法は、窒素またはアルゴンを多く含む空気を利用することであり、それによって、酸素が排除される。窒素は、任意の液体が導入される前に、全ての機器および容器をそれを徹底的にパージすることによって適用され得る。さらに、窒素ガスは、保存および抽出の間にEchinaceaの液体抽出物を通じて持続的に泡立てられ得る。プロセスのパラメーター(例えば、温度および濃度)の正確な制御もまた、酸化および加水分解を減少させることを助け得る。例えば、ポリサッカライドのモノサッカライド残基への酵素的な加水分解は、40℃よりも74℃ではるかにより容易に生じ得る。化学的な加水分解は、75℃から120℃で生じる。処理の間、温度を低く維持することによって、加水分解が最少にされ得る。酸化もまた、低い処理温度によって減少させられる。内因性の酵素活性を減少させることにおけるさらなる補助は、水含有量を最少にするために液体抽出物を濃縮することである。
【0047】
草本に由来する生成物が、無毒性の溶媒のみを用いて産生されることを多くの消費者が必要としているので、日常的に研究室で使用される多くの溶媒(例えば、ヘキサン、クロロホルム、エーテル、およびケトン)は、本発明の実施において使用されるには好ましくない。Echinacea抽出物を調製するための本発明の方法は、抽出溶媒として水およびエタノールを利用し、そして種々のエタノールおよび水の混合物が、Echinacea植物から種々の有効成分を抽出するために利用される。好ましくは、植物材料は、4部の液体の溶媒に対して1部の植物材料の比(質量)で、液体の溶媒中で抽出される。しかし、抽出はまた、1部の液体の溶媒に対する2部の植物材料の程度の液体の溶媒に対する植物材料の比を利用して行われ得る。Echinaceaの抽出物はまた、20部の液体の溶媒に対して1部の植物材料の液体の溶媒に対する植物材料の比を利用することによって、本発明に従って調製される。植物材料に対する高い溶媒の比を用いる抽出は、より稀釈された形態で植物からの活性な化合物のより多い量の抽出を生じる。稀釈抽出物は好ましくは、ポリサッカライド、アルキルアミド、および/またはシコリイン酸の所望される濃度に達するように濃縮される。
【0048】
あるいは、超臨界の二酸化炭素が、Echinacea植物から生物学的に活性な化合物を抽出するための無毒性の溶媒として使用され得る。超臨界の液体は、抽出が所望される程度に完全に生じるまで、植物材料を通じて循環させられる。超臨界の液体の二酸化炭素を使用して調製したEchinacea抽出物は、ほとんど無極性の化合物(例えば、油)を含む。種々のさらなる抽出溶媒(例えば、プロパンおよびアセトン)が、より高い割合の極性の化合物を抽出するために、超臨界の液体の二酸化炭素に対して添加され得るが、水およびエタノールの添加だけが、健康を自覚している消費者に対して受容可能である。
【0049】
一般的には、Echinacea抽出物を調製するための本発明の方法において利用される抽出容器は、それを通じて植物材料および抽出溶媒が容易に充填され得そして除去され得る、1つ以上の開口部を有する大きな容器である。攪拌機械は、抽出が抽出時間を減少させるように一定に攪拌しながら生じるように、抽出容器中で組立てられ得る。抽出容器は、500mL程度の大きさであり、そして3000L程度の大きさが、本発明の実施において首尾良く利用されている。容器は、エタノールによる分解に対して耐性である金属(好ましくは、ポリプロピレンおよびステンレス鋼)から構築されるべきである。
【0050】
Echinacea抽出物を調製するための本発明の方法の実施においては、Echinacea抽出物は好ましくは、保存空間を減少させるために、保存の安定性を増大させるために(すなわち、水の量を減少させることによって)、そして所望されるポリサッカライド、アルキルアミド、およびシコリイン酸の濃度を達成するために、濃縮される。濃縮工程は、好ましくは、ポリサッカライド、アルキルアミド、およびシコリイン酸の生物学的活性の損失を最少にするように最適化される。高温が多くの化合物の迅速な分解を引き起こすので、濃縮は通常は、低温で、そして減圧下で行われる、通常は、回転式のエバポレーターが使用される。蒸発反応フラスコは代表的には、20Lから100Lまでの間の大きさの範囲である。抽出のために使用される溶媒の5〜90%が回収され得る。
【0051】
なお別の局面においては、本発明は、Echinaceaポリサッカライド、Echinaceaアルキルアミド、およびシコリイン酸からなる群の1つ以上のメンバーにおいて富化された液体のEchinacea抽出物を提供する。本発明において好ましい、ポリサッカライドにおいて富化された液体のEchinacea抽出物は、約1%(w/v)より大きい濃度、より好ましくは、約5%(w/v)より大きい濃度、最も好ましくは、約10%(w/v)より大きい濃度で、ポリサッカライドを含む。本発明において好ましい、アルキルアミドにおいて富化されたEchinacea抽出物は、約0.1%(w/v)より大きい濃度、より好ましくは、約1.0%(w/v)より大きい濃度、最も好ましくは、約3.0%(w/v)より大きい濃度で、アルキルアミドを含む。本発明において好ましい、シコリイン酸において富化されたEchinacea抽出物は、約0.2%(w/v)より大きい濃度、より好ましくは、約0.5%(w/v)より大きい濃度、最も好ましくは、約3.0%(w/v)より大きい濃度で、シコリイン酸を含む。
【0052】
なお別の局面においては、本発明は、Echinaceaポリサッカライド、Echinaceaアルキルアミド、およびシコリイン酸からなる群の1つ以上のメンバーにおいて富化された、固体のEchinacea抽出物を提供する。本発明において好ましい、ポリサッカライドにおいて富化されたEchinacea抽出物は、約0.01%(w/w)より大きい濃度、より好ましくは、0.05%(w/w)より大きい濃度、最も好ましくは、約20%(w/w)より大きい濃度で、ポリサッカライドを含む。本発明において好ましい、アルキルアミドにおいて富化されたEchinacea抽出物は、約0.001%(w/w)の濃度、より好ましくは、0.01%(w/w)より大きい濃度、最も好ましくは、約0.5%(w/w)より大きい濃度で、アルキルアミドを含む。本発明において好ましい、シコリイン酸において富化された固体のEchinacea抽出物は、約0.005%(w/w)の濃度、より好ましくは、0.05%(w/w)より大きい濃度、より好ましくは、約1.5%(w/w)より大きい濃度で、シコリイン酸を含む。
【0053】
本発明において好ましい本発明のEchinaceaポリサッカライド抽出物は、少なくとも60%(質量で)のアラビノースおよびガラクトースを含み、そしてポリサッカライドの分子は、約10,000より大きい分子量を有する。
【0054】
本発明において好ましい本発明のEchinaceaアルキルアミド抽出物は、約70%(w/w)より多いイソブチルアミドを含む。本発明においてより好ましい本発明のEchinaceaアルキルアミド抽出物は、約70%(w/w)よりも大きいイソブチルアミド濃度を有し、そして約30%(w/w)よりも多い、2E,4E,8E,10E/Zテトラエン−ドデカ−イソブチルアミドを含む。
【0055】
なお別の実施態様においては、本発明は、標準化された用量の、少なくとも2つ、好ましくは3個のEchinacea成分を提供するように処方された栄養的な組成物を提供する。本発明において好ましいEchinacea成分は、シコリイン酸、Echinaceaポリサッカライド、およびEchinaceaアルキルアミドである。本発明において好ましい、標準化された用量のEchinaceaアルキルアミドは、約0.01mgから約100mgまで、より好ましくは、約0.1mgから約40mgまで、最も好ましくは、約0.1mgから約1mgまでである;本発明において好ましい、標準化された用量のシコリイン酸は、約0.01mgから約120mgまで、より好ましくは、約0.1mgから約15mgまで、最も好ましくは、約0.5mgから約3mgまでである;本発明において好ましい、標準化された用量のEchinaceaポリサッカライドは、約1mgから約500mgまで、より好ましくは、約5mgから約100mgまで、最も好ましくは、約10mgから約50mgまでである。
【0056】
なお別の局面においては、本発明は、哺乳動物中の免疫系の活性を増強するための方法を提供する。この方法は、標準化された量のEchinaceaシコリイン酸、Echinaceaアルキルアミド、およびEchinaceaポリサッカライドを含有しているEchinacea組成物の毎日の有効投与量を、哺乳動物に対して投与する工程を包含する。代表的な標準化された量のEchinaceaシコリイン酸は、5μg/Kg体重から2000μg/Kg体重まで、例えば、120μg/Kgから1000μg/Kg体重まで(例えば、800μg/Kg体重)である。代表的な標準化された量のEchinaceaアルキルアミドは、0.5μg/Kg体重から200μg/Kg体重まで、例えば、12μg/Kgから100μg/Kg体重まで(例えば、80μg/Kg体重)である。代表的な標準化された量のEchinaceaポリサッカライドは、125μg/Kg体重から50mg/Kg体重まで、例えば、3mg/Kgから30mg/Kg体重まで(例えば、20mg/Kg体重)である。限定的ではない例として、哺乳動物の免疫系の活性を増強するための方法(上記に記載されるようなEchinacea組成物を利用する)は、マクロファージの食作用活性を増強するため、マクロファージによる一酸化窒素の産生を増強するため、マクロファージによるTNF−αの産生を増強するため、脾臓細胞によるIFN−γの産生を増強するため、および脾臓細胞によるTNF−αの産生を増強するために有用である。
【0057】
さらなる局面においては、本発明は、EchinaceaアルキルアミドおよびEchinaceaポリサッカライドからなる群より選択されるEchinacea抽出物の毎日の有効投与量を哺乳動物に投与する工程を包含する、哺乳動物の免疫系の活性を増強するための方法を提供する。Echinaceaアルキルアミドの代表的な毎日の有効投与量は、0.5μg/Kg体重から200μg/Kg体重まで、例えば、12μg/Kgから100μg/Kg体重まで(例えば、80μg/Kg体重)である。本発明のこの局面に従うと、Echinaceaポリサッカライドの毎日の有効投与量は、マクロファージの食作用活性を増強するため、マクロファージによる一酸化窒素の産生を増強するため、および/またはマクロファージによるTNF−αの産生を増強するために有用である。
【0058】
Echinaceaポリサッカライドの代表的な毎日の有効投与量は、125μg/Kg体重から50mg/Kg体重まで、例えば、3mg/Kgから30mg/Kg体重まで(例えば、20mg/Kg体重)である。本発明のこの局面に従うと、Echinaceaポリサッカライドの毎日の有効投与量は、マクロファージによるTNF−αの産生を増強するために有用である。
【0059】
以下の実施例は、本発明の実施のために意図される最良の態様を単に説明するにすぎず、本発明を限定するように解釈されるべきではない。
【0060】
(実施例1)
(Echinacea植物からのアルキルアミドの抽出)
Echinacea植物を、約2フィート離して生長させ、そして花を回収する1週間前まで、1週間に1回水をやる。好ましくは、2および/または3年齢のEchinacea purpurea植物の花を回収する。完全に成熟しているEchinacea purpureaの花の球花を、好ましくは、8月のおわりに回収し、そして約700kgの花を、代表的には、1エーカーの土壌から回収する。
【0061】
500kgの新しく回収した花を、約1.5cm3またはそれよりも小さい大きさの粒子にするためのハンマーミルを用いて、細かく砕く。次いで、35℃で72時間、約2000kgの75%のエタノールで抽出する。低いエタノール濃度および温度によっては収量が減少するが、高いエタノール濃度および温度ではコストが増大する。液体および植物材料を、約20cm離して間隔を空け、そして抽出容器中の中心の心棒から放射状に配置した回転式の機械的なへら(パドル)を回転させながら、1分間に3回転で攪拌する。抽出時間の最後に、2300kgの液体抽出物を、抽出した花から取り出す。
【0062】
液体の抽出物は、ここで、約0.6mg/mLのアルキルアミドを含む。25mbarおよび40℃で30時間での液体の抽出物の濃縮によって、約10mg/mLのアルキルアミド濃度を有しているアルキルアミドを多く含む液体の濃縮物を約100kg得る。濃縮物を、暗い緑色であるとして特徴づける。なぜなら、植物のクロロフィルの存在、および代表的には、約1mg/mL未満のシコリイン酸および約10mg/mL未満のポリサッカライドを含むからである。
【0063】
(実施例2)
(Echinacea植物からのシコリイン酸の抽出)
芽を、2月のおわりおよび3月のはじめに選択したハイブリッドではない種子から発芽させ、そして3月の中頃およびおわりに土壌に移植する。植物を、約2フィートの間隔を空けて配置し、そして回収するまで1週間に2回水をやる。黒色のプラスチックの根被い(マルチ)を、雑草の成長を減少させ、そして植物の成長をスピードアップさせるために使用する。種子を注意深く選択する。なぜなら、Echinacea angustifoliaの種子(またはE.angustifolia/E.purpureaハイブリッドに由来する種子)の混入は、増大した酵素的分解に起因して20倍以上、シコリイン酸の収量を減少させるからである。植物を、9月のおわりに全植物体として回収し、そして植物の茎、葉、および花を抽出のために取り出す。代表的には、1エーカーのEchinacea purpurea植物によって、約1000kgの植物材料を生じる。好ましくは、1年齢のEchinacea purpurea植物を回収する。
【0064】
500kgの新しく回収した植物を、1.5cm2から約4cm2の粒子の大きさを生じるようにハンマーミルを用いて、細かく砕く。細かく砕いた材料を、25℃で30時間、2000kgの50%のエタノールを用いて抽出する。低いエタノール濃度および高い抽出温度は、分解を増大させ、一方、高いエタノール濃度および低い温度は収量を減少させる。窒素ガスを、シコリイン酸の分解の量を減少させるために、抽出液体中を通じて持続的にパージさせる。抽出液体を、1時間あたり500Lまでの能力を有する回転式ポンプによる植物の押しつぶしによって、循環させる。抽出時間の最後に、約2.0mg/mlのシコリイン酸濃度を有している2100kgの液体の抽出物を得ることができる。
【0065】
10mbarおよび35℃で20時間の液体の抽出物の濃縮によって、30mg/mLのシコリイン酸濃度を有しているシコリイン酸を多く含む100kgの濃縮物を得る。濃縮物は、暗い緑色によって特徴づけられる。これは、植物のクロロフィルの存在、ならびに、約2mg/mL未満のアルキルアミドおよび約20mg/mL未満のポリサッカライドを含むことによって生じる。
【0066】
(実施例3)
(Echinacea植物からのポリサッカライドの抽出)
植物を、約2フィート離して生長させ、そして花を回収する1週間前まで、1週間に1回水をやる。完全に成熟しているEchinacea purpureaの花の球花を、8月のおわりに回収する。代表的には、約700kgの花を、Echinacea purpurea植物の1エーカーの土壌から回収する。好ましくは、2および/または3年齢のEchinacea purpurea植物を回収する。
【0067】
500kgの新しく回収した花を、約1.5cm3またはそれよりも小さい大きさの粒子にするためハンマーミルを用いて、細かく砕く。次いで、55℃で72時間、約2000kgの20%のエタノールで抽出する。高いエタノール濃度および低い温度によっては収量が減少するが、低いエタノール濃度では、最終的な抽出物の微生物による容量を増大させ、そして高い温度ではコストが増大する。液体および植物材料を、約20cm離して間隔を空け、そして抽出容器中の中心の心棒から放射状に配置した回転式の機械的なへらを回転させながら、1分間に3回転で攪拌する。抽出時間の最後に、1900kgの液体抽出物を、抽出した花から取り出す。
【0068】
液体の抽出物は、ここで、代表的には、約15mg/mLのポリサッカライド含む。これは、50mbar、60℃で15時間で濃縮されて、約120mg/mLのポリサッカライド濃度を有している200kgの濃縮物を生じ得る。濃縮物を、暗い茶色によって特徴づけられる。そしてこれは、代表的には、約2mg/mL未満のアルキルアミドおよび約2mg/mL未満のシコリイン酸を含む。
【0069】
(実施例4)
(Echinacea植物から抽出したポリサッカライドのアッセイ)
ポリサッカライドアッセイ方法は、AOAC Official Methods of Analysis(1995)、AOAC Official Method 998.12、「Dextran in Raw Cane Sugar」、44.1.30、「Part E−−Phenol−H2SO4 Test」に示されている方法の改変されたバージョンである。ポリサッカライドアッセイを、13×100mmの使い捨ての培養チューブ中で行うことができる。アッセイの最終的な反応容量は、1.5mlである。蒸留水を、ポリサッカライドサンプルに対して添加して、400μlの、水およびポリサッカライドのサンプルを得る。次いで、100μlの5%(w/v)の試薬グレードのフェノール溶液を、稀釈したポリサッカライドサンプルに対して添加し、そして混合する。次いで、1ミリリットルの濃硫酸(試薬グレード、95〜98%に濃縮された)を添加し、そしてボルテックスすることによって迅速に混合する。次いで、サンプルを含有しているチューブを沸騰している水浴中に2分間置く。次いで、チューブを30分間室温に冷却させ、そして485ナノメートル(nm)でのサンプルの吸光度を、分光光度計を使用して蒸留水のブランクに対して測定する。分光光度計は、0から1.5の範囲でA485での吸光度を正確に読み取ることが可能であるはずである。
【0070】
Echinaceaポリサッカライド濃度の標準を、Echinaceaの花の水抽出物から、以下の様式でエタノール沈殿を用いて調製する。濃縮したEchinaceaポリサッカライド材料を、本明細書中の実施例3に記載するように得る。抽出物を、さらに、約400mg/mLのポリサッカライドにまで濃縮する。次いで、この濃縮物を、4℃で一晩、4容量の95%のエタノールで沈殿させる。沈殿を遠心分離によって取り出し、そして35〜40℃の水浴中で再度溶解させる。この段階で溶解しない材料を廃棄し、そして上清を、1容量の30%(w/v)のトリクロロ酢酸を用いて沈殿させる。再び、沈殿を遠心分離によって取り出し、そして上清を、4容量のエタノールで沈殿させる。沈殿したポリサッカライドを、2%の酢酸ナトリウム溶液中に溶解させ、そしてエタノールで3回沈殿させる。上清を廃棄し、そして沈殿を、Spectra/Por(登録商標10,000MWカットオフ透析チューブを用いる透析のために水中に溶解させる。透析を、3日間にわたって行い、そして残存している材料を、凍結乾燥させて毛羽立った(fluffy)固体の物質を得る。
【0071】
既知の量の凍結乾燥させたポリサッカライドを、既知の濃度のEchinaceaポリサッカライド標準を得るために、既知の容量の水中に溶解させる。Echinaceaポリサッカライド標準溶液の稀釈を行い、そしてそれぞれの稀釈物のA485を、485ナノメートルでの吸光度対ポリサッカライド濃度の標準曲線を構築するために測定する。
【0072】
(実施例5)
(Echinacea植物から抽出したアルキルアミドのアッセイ)
本発明において好ましいアルキルアミドアッセイ方法は、Bauer、Planta Meidca、55、367−371(1989)によって公開されている方法の改変である。この方法の移動相は、サンプルの沈殿の問題に起因して、アセトニトリルからメタノールに変更された。この方法は、勾配ポンプ、自動サンプリング装置、およびUV−Visible検出装置から構成されるHPLC(高速液体クロマトグラフィー)を使用する。好ましくは、Hewlett Packard 1100シリーズHPLCシステムおよびHewlett Packard 1050シリーズHPLCシステムを使用する。適合している4.0×4.0mmのガードカラムとともに、カラムC−18カラム(好ましくは、125×4.0mm Hypersil ODSカラム)を使用する。移動相は、分析の開始時には60%のメタノールおよび40%の水(v/v)からなり、そして直線的な様式で、分析中の12.5分で、95%のメタノールおよび5%の水に変更する。全実行時間は、19.00分であり、4分間の実行後の平衡を伴う。移動相を、1.00mL/分で注入する。10μLのサンプルを注入し、そしてサンプルの254nmでの吸光度を測定する。アルキルアミドは、2.0分から9.0分でカラムから溶出する。より詳細には、ドデカ−2E,4E,8E,10E/Z−テトラエン酸イソブチルアミドが、5.0から8.0分で溶出する。
【0073】
アルキルアミド濃度標準を、室温で500mlの石油エーテルを用いて、本明細書中の実施例3の記載するように調製した、アルキルアミドを多く含む液体の濃縮物の500mlを抽出することによって、好ましくは調製する。石油エーテル画分を1日後に採取し、そして減圧下で乾燥させるために蒸発させ、そして暗い黒色の油状の残渣を得る。残渣を、最小量のメタノール(約20mL)中に溶解させ、そして沈殿を除去するために遠心分離する。オクタデシルで官能化したシリカを、ガラスカラム中にセットする。容量で70%のメタノールおよび30%の水からなる移動相を、溶出のために使用する。液体の濃縮物から調製した材料をカラムに適用し、そして10mLの画分を回収する。画分を、記載する分液方法を使用してアルキルアミド含有量について分析し、そして90%およびそれより高い目的のアルキルアミドの純度を含有している画分を、プールする。プールした画分を、次いで、回転式エバポレーターで45℃で蒸発させて、全容量を減少させる。カラム溶出物から精製したアルキルアミド画分を減圧下で蒸発させて、透明な(黄色に着色した)液体にする。石油エーテルを残渣に対して添加し、そして暖かい水浴中で暖める。残渣および液体を、精製したアルキルアミドで溶液を飽和させるために超音波処理する。飽和させた溶液を回収し、そして室温にまで冷却させる。次いで、溶液を、−20℃の冷凍庫に移す。一晩、結晶を形成させる。500mLの飽和させた溶液は、特異的なアルキルアミドの可溶性に依存して、約0.1〜5gの精製された結晶を生じる。
【0074】
精製されたアルキルアミド標準を種々の濃度で溶解させ、そして本明細書中に記載するようなHPLCカラムを通過させる。検量曲線を、得られたピーク面積対アルキルアミド標準溶液の濃度から構築する。未知の濃度のアルキルアミドサンプルに由来するピーク面積を、それぞれのサンプル中での濃度を決定するために検量曲線に対して比較する。
【0075】
(実施例6)
(Echinacea植物から抽出したシコリイン酸のアッセイ)
シコリイン酸分析方法は、Bauer、Planta Meidca、57、447−449(1991)によって公開されている方法の改変である。この方法の移動相は、サンプルの沈殿の問題に起因して、アセトニトリルからメタノールに変更された。この方法は、勾配ポンプ、自動サンプリング装置、およびUV−Visible検出装置から構成されるHPLC(高速液体クロマトグラフィー)を使用する。この場合においては、Hewlett Packard 1100シリーズHPLCシステムおよびHewlett Packard 1050シリーズHPLCシステムを使用する。適合している4.0×4.0mmのガードカラムとともに、カラムC−18カラム(この場合には、125×4.0mm Hypersil ODSカラム)を使用する。移動相は、分析の開始時には、0.1%のリン酸(v/v)を含有している、7.0%のメタノールおよび93.0%の水からなり、そして直線的な様式で、分析中の11.6分で、0.1%のリン酸(v/v)を含有している、32%のメタノールおよび68%の水に変更する。次いでこれを、19.1分で、0.1%のリン酸を含有している、40.7%のメタノールおよび59.3%の水に変更する。全実行時間は、22.00分であり、3.50分間の実行後の平衡を伴う。移動相を、1.00mL/分で注入する。10μlのサンプルを注入し、そしてデータを330nmで回収する。サンプルのピーク面積を、定量のための精製した化学的な標準に対して比較する。コーヒー酸誘導体が、7.0分から18.0分でカラムを溶出する。より詳細には、コーヒー酸は、14.5.0から17.0分で溶出する。
【0076】
シコリイン酸濃度標準を、以下の様式で調製する。本明細書中の実施例2に記載するように調製したシコリイン酸を多く含む液体の濃縮物を、50℃での減圧蒸留によって容量をさらに減少させる。ポリサッカライドを、2部のイソプロパノールおよび1部の蒸留濃縮物を使用するイソプロパノール沈殿を用いて除去する。上清を取り出し、そしてイソプロパノールを、37℃での減圧蒸留を通じて蒸発させる。濃縮物の2倍容量の蒸留水を添加し、そして濃縮物のpHを、濃塩酸を用いてpH0〜1に調節する。シコリイン酸をさらに、移動相として100%のメタノールを用いる親油性のSephadex LH−20カラムを通じる溶出によって精製する。上記の方法によって分析した場合に、90%より大きいシコリイン酸純度を有する画分をプールする。プールした画分を、減圧下で乾燥させるように減少させ、次いで、最少量の沸騰している熱水中に再溶解させる。シコリイン酸は冷却の際に、すぐに、白色の針状に結晶化する。
【0077】
精製されたシコリイン酸標準を種々の濃度で溶解させ、そして本明細書中に記載するようなHPLCカラムを通過させる。検量曲線を、得られたピーク面積対シコリイン酸標準溶液の濃度から構築する。未知の濃度のシコリイン酸サンプルに由来するピーク面積を、それぞれのサンプル中での濃度を決定するために検量曲線に対して比較する。
【0078】
(実施例7)
(本発明の例示的なEchinacea組成物)
代表的な例として、本発明の混合された市販のEchinacea組成物を、以下の様式で調製する。アルキルアミドを多く含む濃縮物(本明細書中の実施例1に従って調製した)、シコリイン酸を多く含む濃縮物(本明細書中の実施例2に従って調製した)、およびポリサッカライドを多く含む濃縮物(本明細書中の実施例3に従って調製した)を、以下の容量比で混合する:それぞれ、0.4:0.2:0.4。濃縮物を、電動の混合装置を用いて混合して、均質な生成物を得る。本発明の好ましい実施態様においては、この混合した液体の濃縮物は、5.2mg/mLのアルキルアミド、7.2mg/mLのシコリイン酸、および56mg/mLのポリサッカライドを含む。この混合した組成物を、以下のような市販されるEchinacea組成物を調製するために使用する:
(a)アルコールを含まない、市販される液体のEchinacea組成物は、混合したEchinacea組成物をさらにエタノールを除去するために蒸発させ、そして次いで70%(w/w)のグリセリンの9倍容量を添加することにより蒸発させた組成物を10倍に稀釈することによって、調製する。得られた材料を、0.52mg/mLのアルキルアミド、0.72mg/mLのシコリイン酸、および5.6mg/mLのポリサッカライドを含有している生成物にするために、完全に混合する。
【0079】
(b)アルコールを含有している市販される液体のEchinacea組成物は、9倍容量の40%(w/w)のエタノールを添加することにより、混合したEchinacea組成物を10倍に稀釈することによって調製する。得られた材料を、0.52mg/mLのアルキルアミド、0.72mg/mLのシコリイン酸、および5.6mg/mLのポリサッカライドを含有している生成物にするために、完全に混合する。
【0080】
(c)市販される液体のEchinaceaソフトゼラチンカプセルは、9倍容量の、30%のレシチンおよび70%のダイズ油の混合物を添加することにより、混合したEchinacea組成物を10倍に稀釈することによって調製する。得られた材料を完全に混合し、次いで、0.52mg/カプセルのアルキルアミド、0.72mg/カプセルのシコリイン酸、および5.6mg/カプセルのポリサッカライドを含有している生成物にするために、1つのカプセルあたり1.0mLで、ソフトゼラチンカプセル中にカプセル化する。
【0081】
(d)凍結乾燥させたEchinacea粉末を、その9倍容量の水とともに混合したEchinacea組成物を混合し、次いでキャリアとしての10%(w/w)の三リン酸カルシウムとともに凍結乾燥させることによって、調製する。乾燥させたケーキを、凍結乾燥の30時間後に得る。一旦凍結乾燥させたケーキを、100μmの円錐形の粉砕機を通じて粉状にして、2.6mg/gのアルキルアミド、3.6mg/gのシコリイン酸、および2.8mg/gのポリサッカライドを含有している流動性の粉末を得る。
【0082】
(e)マイクロカプセル化したEchinacea粉末を、安定性のために1%(v/v)のビタミンEとともに混合したEchinacea組成物を混合し、次いで平均して100μmの大きさのカプセルでの50%−fill(w/w)でのセルロースおよびワックスコーディングを用いて、混合物をマイクロカプセル化することによって、調製する。マイクロカプセルは、2.6mg/gのアルキルアミド、3.6mg/gのシコリイン酸、および2.8mg/gのポリサッカライドの組成物を有している、流動性の粉末として生じる。
【0083】
(f)ハードゼラチンEchinaceaカプセルは、凍結乾燥させた粉末(この実施例のセクション(d)に記載する)またはマイクロカプセル化した粉末(この実施例のセクション(e)に記載する)を、5部(質量で)の微結晶性セルロースおよび2%(w/w)のステアリン酸マグネシウムと混合することによって調製する。得られる粉末を、0.52mg/カプセルのアルキルアミド、0.72mg/カプセルのシコリイン酸、および5.6mg/カプセルのポリサッカライドを提供するように1000mgのカプセル中にカプセル化する。
【0084】
(g)Echinaceaの錠剤を、凍結乾燥させた粉末(この実施例のセクション(d)に記載する)またはマイクロカプセル化した粉末(この実施例のセクション(e)に記載する)を、3部(質量で)の二リン酸カルシウム、2部(質量で)の微結晶性セルロース、および3%(w/w)のステアリン酸マグネシウムと混合することによって調製する。得られる粉末を、0.52mg/錠のアルキルアミド、0.72mg/錠のシコリイン酸、および5.6mg/錠のポリサッカライドを提供するように1000mgの錠剤に打ち込む。
【0085】
(実施例8)
(免疫機能に対する本発明のEchinacea組成物および抽出物の影響) この実施例に示すデータは、本発明のEchinacea抽出物および組成物が、ラットの免疫系の種々の局面を刺激することを示す。
【0086】
動物の維持および組織のサンプリング:若い、成体の、雄性のSprague−Dawleyラット(それぞれ約240g)を、試験材料の投与の前の1週間、研究室で順応させた。本明細書中に記載する種々の濃度の試験材料の100マイクロリットルをそれぞれの動物に対して、強制栄養針を通じて、4日間の間1日い2回、投与した。血液および組織サンプルを、分析の5日目に動物から採取した。それぞれの試験グループは、試験結果が平均される8匹の動物を含んだ。
【0087】
試験材料:動物に投与したコントロールサンプルは、エタノールと水の混合物であった。以下の試験材料のうちの1つをそれぞれの動物に対して投与した(試験動物の1キログラム(kg)の体重あたりマイクログラム(μg)の試験材料として示した用量レベルを、表1に示す):Echinaceaアルキルアミド抽出物の4つの用量レベルのうちの1つ、Echinaceaシコリイン酸抽出物の4つの用量レベルのうちの1つ、Echinaceaポリサッカライド抽出物の4つの用量レベルのうちの1つ、またはEchinacea組成物(これは、Echinaceaアルキルアミド、シコリイン酸、およびポリサッカライド抽出物を含有している)の4つの用量レベルのうちの1つ。
【0088】
Echinacea組成物は、毎日の用量について特定された量において表1に列挙される3個の抽出物を含んだ。例えば、Echinaces組成物のレベル1の毎日の投与量は、0.5μg/kgのアルキルアミド、5.0μg/kgのシコリイン酸、および125μg/kgのポリサッカライドを提供した。Echinacea組成物を、本明細書中の実施例1〜3に記載するように調製した、3個のEchinacea purpurea抽出物(アルキルアミド、シコリイン酸、およびポリサッカライド)を混合することによって調製した。
【0089】
【表1】
血液の処理:血液を、心臓の穿刺によって試験動物から得、そして血漿を分離するために10分間(min.)3000rpmで遠心分離したEDTAバキュテーナーチュに保存した。血漿を、使用するまで−30℃で、蓋をしたプラスチックチューブ中に保存した。
【0090】
脾臓細胞の調製:動物に由来する脾臓を、0.5%のウシの血清アルブミンを補充した冷却したKrebs−Ringer−HEPES溶液(KRH)中でナイロンメッシュを通じて押し潰し、そして50mLのチューブに回収した。次いで、回収した細胞を、2000rpmで、4℃で10分間遠心分離し、そして上清をデカントした。1ミリリットルの溶解緩衝液ACK(塩化アルミニウムおよびカリウムを含有している)を細胞に添加した。次いで、細胞を、50mLのKRH+BSAで2回洗浄した。次いで、細胞を、1mLのCCM(RPMI−1640および4%のウシの胎児の血清を含有しているComplete Culture Medium)中に再懸濁した。RPMI−1640は、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシン、グルタミン、2−メルカプトエタノール、およびHEPES(これらのそれぞれの成分は、1%(v/v)の濃度で存在する)を有する、Tissue Culture Association Manual,3:503−508(1976))に開示されているようなMooreおよびWoodsによって開発された重炭酸塩に基づく緩衝システムである。細胞を、3.0〜5.0×106/mLに稀釈し、そして20μLのコンカナバリンA(ConA)(10μg/mL)で活性化し、そして48時間インキュベートした。48時間後、細胞を遠心分離し、そして上清を回収し、そしてサイトカインおよび一酸化窒素アッセイのために−30℃で凍結させた。
【0091】
肺胞のマクロファージの調製:肺胞のマクロファージを、40mLのリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)を用いて気管支肺胞を洗浄することによって得た。細胞を、4℃で20分間、2000rpmで遠心分離し、そして上清を廃棄した。1mLのACKを細胞に添加し、次いで、冷却したBSAで3回洗浄した。次いで、細胞を、10%のウシの胎児の血清を補充した1mLのRPMI中に懸濁した。細胞を、5〜10×106細胞/mLに稀釈し、そして100μの稀釈した細胞を、37℃で2時間、V底マイクロタイタープレート中でインキュベートした。上清を廃棄し、そしてマイクロタイタープレートをPBSで3回洗浄した。200μLのLPSを添加して細胞を活性化し、次いで、細胞を24時間インキュベートした。インキュベーション後に上清を回収し、そしてサイトカインおよび一酸化窒素アッセイのために−30℃で凍結させた。
【0092】
食作用アッセイ:マクロファージを、接着のために37℃で3時間インキュベートした。次いで、これらを、10%のRPMIで3回洗浄し、次いでラテックスビーズを2.5×106個のビーズ/200μLの濃度で添加した。細胞を1時間以上インキュベートし、そしてRPMIで5回洗浄した。細胞を染色し、そして食作用を、顕微鏡試験によって決定した。
【0093】
一酸化窒素アッセイ:4mMの硝酸ナトリウムのストック溶液を作成し、そして4%のCCM緩衝液を用いて使用の直前に1mMに稀釈した。硝酸ナトリウムストック溶液を、直線的な検量曲線を構築するために種々の濃度で使用した。Griess試薬を、0.5gのスルファニルアミド、および6mLの85%のリン酸を100mLの水中に溶解させ、そして0.05gのN−(1−ナフチル)エチル−エネジアミンを100mLの水中に溶解させることによって調製した。マクロファージまたは脾臓細胞に由来する上清をGriess試薬に対して添加し、そして10分間放置した。吸光度を540nmで測定し、そして一酸化窒素濃度を、硝酸ナトリウムの標準曲線から計算した。
【0094】
TNF−α、IFN−γ、およびインターロイキン−2アッセイ:抗体を、以下の供給業者のうちの任意の1つから得た:Sigma Chemical,Box 14508 St.Louis,Missouri 63178,U.S.A.;R&D Systems,またはPharMagen,6300 Kitimat Road,Unit 1,Mississauga,Ontario L5N 5M1,Cancda。アッセイを、標準的なELISAプロトコールを使用して行った。
【0095】
肺胞のマクロファージ中の食作用活性および食作用指数に対する本発明のEchinacea組成物および抽出物の影響:図1に示すように、この実施例に記載するEchinacea組成物の全ての投与量レベル(表1に示すレベル2〜5)が、肺胞のマクロファージの食作用活性および食作用指数において増大を生じた。図2により明らかに示すように、投与量が増大する伴って、食作用活性および食作用指数に対する影響の大きさもまた増大する。
【0096】
図3に示すように、本明細書中の実施例2に記載するように調製し、そして表1に示すような投与量レベル1〜4でラットに投与した本発明のEchinaceaシコリイン酸抽出物は、ラットの肺胞のマクロファージの食作用活性または食作用指数に対して有意な影響は有さなかった。同様に、図4に示すように、本明細書中の実施例3に記載するように調製し、そして表1に示すような投与量レベル1〜4でラットに投与した本発明のEchinaceaポリサッカライド抽出物は、ラットの肺胞のマクロファージの食作用活性または食作用指数に対して有意な影響は有さなかった。
【0097】
対照的に、図5に示すように、本明細書中の実施例1に記載するように調製し、そして表1に示すような投与量レベル1〜4でラットに投与した本発明のEchinaceaアルキルアミド抽出物は、エタノールと水との混合物で処理したコントロールラットと比較して、ラットの肺胞のマクロファージの食作用活性および食作用指数の両方を増強した。詳細には、用量レベル3で、アルキルアミド抽出物は、マクロファージの活性および食作用指数の両方を有意に増大させ、コントロールと比較して、活性においては60%、そして指数においては50%増大させた。図6は、この実施例に記載するEchinacea組成物、Echinaceaシコリイン酸、アルキルアミド、およびポリサッカライドのそれぞれの食作用指数に対する影響の比較を示す。図6から、Echinacea組成物が個々の化合物と比較して統計学的に有意な共働作用活性を示したことが明らかである。
【0098】
肺胞のマクロファージによる一酸化窒素の産生に対する本発明のEchinacea組成物および抽出物の影響:図1に示すように、この実施例に記載するEchinacea組成物の表1に示す投与量レベル3〜5が、肺胞のマクロファージによる一酸化窒素の産生の増大を生じた。投与量が増大するに伴って、一酸化窒素のレベルの大きさが増大した。
【0099】
図3および4に示すように、本明細書中の実施例2および3に記載するように調製したEchinaceaシコリイン酸およびポリサッカライド抽出物は、肺胞のマクロファージによる一酸化窒素のレベルを有意には増大させなかった。対照的に、図5に示すように、本明細書中の実施例1に記載するように調製したEchinaceaアルキルアミド抽出物の投与量レベル1〜4(特に、投与量レベル3および4)は、肺胞のマクロファージによって産生される一酸化窒素のレベルの有意な増大を生じた。
【0100】
マクロファージにおけるTNF−αの産生に対する本発明のEchinacea組成物および抽出物の影響:図1に示すように、この実施例に記載するEchinacea組成物は、レベル4までの投与量で肺胞のマクロファージによるTNF−αの産生において増大を生じた。最初に、TNF−αの産生が、Echinacea組成物の投与量の増大に伴って増大し、次いで、応答が減少する。図7に示すように、最適なEchinacea組成物の投与量はレベル3とレベル4との間に存在する。
【0101】
図3に示すように、本明細書中の実施例2に記載するように調製したEchinaceaシコリイン酸抽出物は、肺胞のマクロファージによるTNF−αの酸性のレベルを有意には増大しなかった。対照的に、図4および5に示すように、本明細書中の実施例3および1に記載するように調製したEchinaceaポリサッカライド抽出物およびEchinaceaアルキルアミド抽出物は、両方ともが、肺胞のマクロファージによって産生されるTNF−αのレベルにおける有意な増大を生じた。アルキルアミド抽出物の刺激効果は特に投薬レベル3で強力であった。しかし、アルキルアミドの投与量レベル4では、TNF−αの産生はコントロールの産生にまでもどった。このことは、この用量での一酸化窒素の産生における顕著な増大の結果であり得る。
【0102】
脾臓細胞中でのTFN−γの産生に対する本発明のEchinacea組成物および抽出物の影響:図1に示すように、この実施例に記載するEchinacea組成物の全ての投与量レベル(表1に示すレベル2〜5)が、脾臓細胞によるIFN−γの産生における増大を生じた。この影響は、投与量レベル4および5で最も顕著であった。
【0103】
図3〜5に示すように、Echinaceaシコリイン酸、アルキルアミド、およびポリサッカライド抽出物は、脾臓細胞によるIFN−γの産生において有意な増大は生じなかった。
【0104】
脾臓細胞中でのTFN−αの産生に対する本発明のEchinacea組成物および抽出物の影響:図1に示すように、この実施例に記載するEchinacea組成物の投与量レベル5が、脾臓細胞によるIFN−αの産生における有意な増大を生じた。
【0105】
脾臓細胞中でのIL−2の産生に対する本発明のEchinacea組成物および抽出物の影響:図1に示すように、この実施例に記載するEchinacea組成物の投与量レベル2および3が、脾臓細胞によるIL−2の産生を抑制した。一方、投与量レベル4および5は、IL−2の産生についてのコントロールの値に近い値を生じた。抑制効果は、図8においてより明らかに観察され、これは、Echinacea組成物の相対的な濃度に対するIL−2のラットの脾臓細胞での産生のプロットを示す。IL−2の抑制は、炎症性の疾患の症状の重篤度を軽減し得る、炎症性の応答の抑制を生じる(そして後期に発症する糖尿病の症状を緩和し得る)
図3〜5に示すように、Echinaceaシコリイン酸、アルキルアミド、およびポリサッカライド抽出物は、脾臓細胞中のIL−2の産生には影響を与えなかった。
【0106】
本発明の好ましい実施態様が説明されそして記載されるが、種々の変更が、本発明の精神および範囲を逸脱することなく本明細書中で行われ得ることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
本発明の上記の局面および付随する多くの利点は、添付の図面と組合せた場合に、以下の詳細な記載を参照することによってそれらがより良好に理解されるので、より容易に理解される。
【図1】 図1は、ラットにおける種々の免疫系のパラメーターに対する、本発明のEchinacea組成物の異なる投与量の影響を示す。Echinacea組成物は、Echinaceaシコリイン酸、アルキルアミド、およびポリサッカライド抽出物を、本明細書中の実施例8に示されるように含む。投与量レベルは、本明細書中の表1に示される。略号は、IL2 SP:脾臓細胞中でのインターロイキン−2の産生;TNF−α SP:脾臓細胞中での腫瘍壊死因子αの産生;IFN−γ SP:脾臓細胞中でのインターフェロンγの産生;TNF−α MA:肺胞のマクロファージ中での腫瘍壊死因子α;NO MA:肺胞のマクロファージ中での一酸化窒素の産生;PI MA:肺胞のマクロファージ中での食作用指数;PA MA:肺胞のマクロファージ中での食作用活性。結果は、コントロールの値に対して較正される。
【図2】 図2は、本発明の種々の投与量のEchinacea組成物の、ラットの肺胞マクロファージの食作用指数に対する影響を示す。Echinacea組成物は、本明細書中の実施例8に示されるように、Echinaceaシコリイン酸、アルキルアミド、およびポリサッカライド抽出物を含む。投与量レベルは、本明細書中の表1に示される。
【図3】 図3は、ラットの種々の免疫系のパラメーターに対する、本発明のEchinaceaシコリイン酸抽出物の影響を示す。Echinaceaシコリイン酸抽出物は、本明細書中の実施例2に記載されるように調製された。略号は:IL2 SP:脾臓細胞中でのインターロイキン−2の産生;TNF−α SP:脾臓細胞中での腫瘍壊死因子αの産生;IFN−γ SP:脾臓細胞中でのインターフェロンγの産生;TNF−α MA:肺胞のマクロファージ中での腫瘍壊死因子α;NO MA:肺胞のマクロファージ中での一酸化窒素の産生;PI MA:肺胞のマクロファージ中での食作用指数;PA MA:肺胞のマクロファージ中での食作用活性。結果は、コントロールの値に対して較正される。
【図4】 図4は、ラットの種々の免疫のパラメーターに対する本発明のEchinaceaポリサッカライド抽出物の影響を示す。Echinaceaポリサッカライド抽出物は、本明細書中の実施例3に記載されるように調製された。略号は:IL2 SP:脾臓細胞中でのインターロイキン−2の産生;TNF−α SP:脾臓細胞中での腫瘍壊死因子αの産生;IFN−γ SP:脾臓細胞中でのインターフェロンγの産生;TNF−α MA:肺胞のマクロファージ中での腫瘍壊死因子α;NO MA:肺胞のマクロファージ中での一酸化窒素の産生;PI MA:肺胞のマクロファージ中での食作用指数;PA MA:肺胞のマクロファージ中での食作用活性。結果は、コントロールの値に対して較正される。
【図5】 図5は、ラットの種々の免疫のパラメーターに対する本発明のEchinaceaアルキルアミド抽出物の影響を示す。Echinaceaアルキルアミド抽出物は、本明細書中の実施例1に記載されるように調製された。略号は:IL2 SP:脾臓細胞中でのインターロイキン−2の産生;TNF−α SP:脾臓細胞中での腫瘍壊死因子αの産生;IFN−γ SP:脾臓細胞中でのインターフェロンγの産生;TNF−α MA:肺胞のマクロファージ中での腫瘍壊死因子α;NO MA:肺胞のマクロファージ中での一酸化窒素の産生;PI MA:肺胞のマクロファージ中での食作用指数;PA MA:肺胞のマクロファージ中での食作用活性。結果は、コントロールの値に対して較正される。
【図6】 図6は、ラットの肺胞のマクロファージの食作用指数に対する、本発明のEchinacea組成物の影響、ならびにその成分であるシコリイン酸、アルキルアミド、およびポリサッカライド抽出物のそれぞれの影響を示す。Echinacea組成物は、本明細書中の実施例8に示されるように、Echinaceaシコリイン酸、アルキルアミド、およびポリサッカライド抽出物を含む。Echinacea組成物の投与量は、本明細書中の表1に示されるような、レベル4であった。すなわち、Echinacea組成物は、800μg/kgのEchinaceaシコリイン酸、20mg/kgのEchinaceaポリサッカライド、および80μg/kgのEchinaceaアルキルアミドの毎日の投与量で提供された。Echinaceaシコリイン酸は、800μg/kgの毎日の投与量で別々に投与され、Echinaceaポリサッカライドは、20mg/kgの毎日の投与量で別々に投与され、そしてEchinaceaアルキルアミドは80μg/kgの毎日の投与量で別々に投与された。水およびエタノールの混合物が、コントロールのラットに対して投与された。
【図7】 図7は、本発明のEchinacea組成物の種々の投与量の、ラットの肺胞のマクロファージにおけるTNF−αの産生に対する影響を示す。Echinacea組成物は、本明細書中の実施例8に示されるように、Echinaceaシコリイン酸、アルキルアミド、およびポリサッカライド抽出物を含む。TNF−α MA:肺胞のマクロファージ中での腫瘍壊死因子α。相対的な濃度が、表1に示される用量レベル2の濃度に対して、表1中の用量濃度のそれぞれを較正することによって得られた。
【図8】 図8は、本発明のEchinacea組成物の種々の投与量の、インターロイキン−2のラットの脾臓細胞での産生に対する影響を示す。Echinacea組成物は、本明細書中の実施例8に示されるように、Echinaceaシコリイン酸、アルキルアミド、およびポリサッカライド抽出物を含む。Echinacea組成物は、本明細書中の表1に示される投与量レベルで投与された。IL2 SP:インターロイキン−2の脾臓細胞での産生。結果は、コントロールの値に対して較正される。相対的な濃度が、表1に示される用量レベル2の濃度に対して、表1中の用量濃度のそれぞれを較正することによって得られた。
Claims (9)
- 0.2mg/mlから500mg/mlのシコリイン酸、0.02mg/mlから50mg/mlのEchinaceaアルキルアミドおよび10mg/mlから800mg/mlのEchinaceaポリサッカライドを含む、免疫系を刺激するためのEchinacea組成物。
- 前記シコリイン酸の量が、0.3mg/mlから30mg/mlであり、前記Echinaceaアルキルアミドの量が、0.05mg/mlから50mg/mlであり、そして前記Echinaceaポリサッカライドの量が、20mg/mlから800mg/mlである、請求項1に記載のEchinacea組成物。
- 前記シコリイン酸の量が、5.0mg/mlから30mg/mlであり、前記Echinaceaアルキルアミドの量が、0.8mg/mlから50mg/mlであり、そして前記Echinaceaポリサッカライドの量が、50mg/mlから800mg/mlである、請求項2に記載のEchinacea組成物。
- 0.01mg/gから500mg/gのシコリイン酸、0.005mg/gから100mg/gのEchinaceaアルキルアミドおよび5mg/gから900mg/gのEchinaceaポリサッカライドを含む、免疫系を刺激するためのEchinacea組成物。
- 前記シコリイン酸の量が、0.05mg/gから500mg/gであり、前記Echinaceaアルキルアミドの量が、0.1mg/gから100mg/gであり、そして前記Echinaceaポリサッカライドの量が、10mg/gから900mg/gである、請求項4に記載のEchinacea組成物。
- 前記シコリイン酸の量が、15mg/gから500mg/gであり、前記Echinaceaアルキルアミドの量が、5mg/gから100mg/gであり、そして前記Echinaceaポリサッカライドの量が、200mg/gから900mg/gである、請求項4に記載のEchinacea組成物。
- 前記組成物が、固体、ゲルまたは液体である、請求項4に記載のEchinacea組成物。
- 免疫系を刺激するためのEchinacea組成物を調製するための方法であって、該方法は、ある量のシコリイン酸、ある量のEchinaceaアルキルアミドおよびある量のEchinaceaポリサッカライドを混合して、0.2mg/mlから500mg/mlのシコリイン酸、0.02mg/mlから50mg/mlのEchinaceaアルキルアミドおよび10mg/mlから800mg/mlのEchinaceaポリサッカライドを含むEchinacea組成物を生じる工程を包含する、方法。
- 免疫系を刺激するためのEchinacea組成物を調製するための方法であって、該方法は、ある量のシコリイン酸、ある量のEchinaceaアルキルアミドおよびある量のEchinaceaポリサッカライドを混合して、0.01mg/gから500mg/gのシコリイン酸、0.005mg/gから100mg/gのEchinaceaアルキルアミドおよび5mg/gから900mg/gのEchinaceaポリサッカライドを含むEchinacea組成物を生じる工程を包含する、方法。
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