ES2303512T3 - Suplemento de echinacea y metodo de fabricacion. - Google Patents
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Abstract
Una composición de Echinacea que comprende de 0,2 mg/ml a 500 mg/ml de ácido cichórico, de 0,02 mg/mL a 50 mg/ml de alquilamidas de Echinacea, y de 5,6 mg/ml a 800 mg/ml de polisacáridos de Echinacea, estando dicha composición en forma líquida.
Description
Suplemento de Echinacea y método de
fabricación.
La presente invención se refiere a suplementos
nutricionales preparados a partir de plantas del género
Echinacea.
Numerosos estudios atestiguan las propiedades
saludables de extractos derivados de plantas del género
Echinacea. Véase, p. ej., A. Awang y D. Kindack, Canadian
Pharmaceutical Journal, 124: 512-516
(1991). Hay un robusto mercado comercial para composiciones de
Echinacea que contienen componentes biológicamente activos
que se cree que favorecen la buena salud. Además, es deseable
formular composiciones de Echinacea que contengan cantidades
estandarizadas de componentes biológicamente activos derivados de
plantas Echinacea. Tales composiciones de Echinacea
estandarizadas proporcionan al consumidor una dosis efectiva
consistente de uno o más componentes de Echinacea
biológicamente activos.
En particular, hay un importante mercado
comercial de extractos de Echinacea que contienen una
elevada concentración de uno o más componentes de Echinacea
biológicamente activos que se cree que promueven la buena salud.
Tales extractos altamente enriquecidos pueden usarse directamente
como suplementos dietéticos o pueden ser mezclados con otros
extractos de Echinacea para preparar suplementos dietéticos
que contienen cantidades estandarizadas de componentes de
Echinacea biológicamente activos.
Hay estudios científicos que indican que los
polisacáridos, las alquilamidas y el ácido cichórico (un derivado
del ácido cafeico también conocido como ácido cichórico, ácido
2,3-o-di-cafeoil-tartárico)
derivados de Echinacea poseen cada uno de ellos propiedades
saludables. Por ejemplo, se ha demostrado que las alquilamidas de
Echinacea estimulan la fagocitosis en granulocitos de ratones
a concentraciones de aproximadamente 0,1 partes por millón (ppm).
Bauer, R. et al., Arzneim.-Forsch./Drug Research,
38: 276-281 (1988). Del mismo modo, se ha
demostrado que el ácido cichórico aumenta la fagocitosis en
granulocitos, y puede estimular el sistema inmunitario a
concentraciones tan bajas como 0,01 ppm. Véase, p. ej., A. Awang
et al., supra. Se ha demostrado que los polisacáridos
de Echinacea inhiben la hialouronidasa, aumentan la
fagocitosis, inducen la liberación de interferón-6 y
potencian la resistencia contra la infección por C. albicans
en ratones. Véase, p. ej., A. Awang et al., supra;
Wagner, H. et al. Arzneim.-Forsch./Drug Research,
35: 1069-1075 (1985).
Numerosos factores han de ser considerados y
optimizados con el fin de producir extractos de Echinacea que
tienen una elevada concentración de polisacáridos, alquilamidas y/o
ácido cichórico. Por ejemplo, las cantidades de polisacáridos,
alquilamidas y ácido cichórico en las plantas de Echinacea
están influidas por la especie de la planta, su edad y sus
condiciones de crecimiento. Adicionalmente, los disolventes y los
parámetros del proceso tales como la temperatura y la duración del
periodo de extracción utilizado para extraer los polisacáridos, las
alquilamidas y el ácido cichórico de las plantas de
Echinacea, pueden afectar en gran medida al rendimiento de
estos componentes.
Así pues, existe la necesidad de métodos para
extraer eficientemente polisacáridos, alquilamidas y ácido
cichórico de las plantas de Echinacea, y de extractos de
Echinacea que contengan una elevada concentración de
polisacáridos, alquilamidas y/o ácido cichórico. Además, existe la
necesidad de composiciones de Echinacea estandarizadas que
contengan una cantidad predeterminada y deseada de extractos de
Echinacea, incluyendo extractos de polisacáridos, alquilamida
y/o ácido cichórico.
En un primer aspecto, la invención proporciona
una composición de Echinacea que comprende de 0,2 mg/ml a
500 mg/ml de ácido cichórico, de 0,02 mg/ml a 50 mg/ml de
alquilamidas de Echinacea, y de 5,6 mg/ml a 800 mg/ml de
polisacáridos de Echinacea, en donde dicha composición está
en forma líquida.
En un segundo aspecto, la presente invención
proporciona una composición de Echinacea que comprende
de
0,01 mg/g a 5,6 mg/g de ácido cichórico, de 0,005 mg/g a 100 mg/g de alquilamidas de Echinacea, y de 5 mg/g a
900 mg/g de polisacáridos de Echinacea, en donde dicha composición está en forma sólida o de gel.
0,01 mg/g a 5,6 mg/g de ácido cichórico, de 0,005 mg/g a 100 mg/g de alquilamidas de Echinacea, y de 5 mg/g a
900 mg/g de polisacáridos de Echinacea, en donde dicha composición está en forma sólida o de gel.
En un tercer aspecto, la presente invención
proporciona un método para preparar una composición de
Echinacea que comprende combinar una cantidad de ácido
cichórico, una cantidad de alquilamidas de Echinacea y una
cantidad de polisacáridos de Echinacea para dar una
composición de Echinacea que incluye de 0,2 mg/ml a 500 mg/ml
de ácido cichórico, de 0,02 mg/ml a 50 mg/ml de alquilamidas de
Echinacea y de 10 mg/ml a 800 mg/ml de polisacáridos de
Echinacea, o de 0,01 mg/g a 500 mg/g de ácido cichórico, de
0,005 mg/g a 100 mg/g de alquilamidas de Echinacea y de 5
mg/g a 900 mg/g de polisacáridos de Echinacea.
Las composiciones de Echinacea de la
presente invención incluyen cantidades estandarizadas de al menos
tres componentes de Echinacea. En este contexto, la
expresión "cantidad estandarizada", o sus equivalentes
gramaticales, significa una cantidad deseada y cuantificada de un
componente de Echinacea. Los componentes de Echinacea
actualmente preferidos son polisacáridos de Echinacea,
alquilamidas de Echinacea y ácido cichórico. Los extractos
de Echinacea actualmente preferidos, útiles para preparar
las composiciones de Echinacea de la presente invención, son
extractos enriquecidos en ácido cichórico (lo más preferentemente
ácido cichórico preparado como se describe en el presente texto),
alquilamidas de Echinacea (lo más preferentemente
alquilamidas de Echinacea preparadas como se describe en el
presente texto) o polisacáridos de Echinacea (lo más
preferentemente polisacáridos de Echinacea preparados como se
describe en el presente texto). Las composiciones de
Echinacea de la presente invención pueden estar en forma
líquida, en forma de gel o en forma sólida, tal como un polvo, o
comprimidos o cápsulas, y preferentemente están adaptadas para la
administración (más preferentemente administración oral) a una
persona.
Los métodos para preparar extractos de
Echinacea enriquecidos incluyen las etapas de elegir una
planta de Echinacea en un estado de desarrollo que tiene una
cantidad mejorada del componente que se desee (tal como ácido
cichórico, alquilamidas o polisacáridos); elegir una porción de la
planta que esté enriquecida en el componente deseado, y poner en
contacto la porción elegida con una cantidad de un disolvente,
elegido entre el grupo consistente en etanol y agua, efectiva para
extraer el componente deseado de la porción de la planta.
Preferentemente, el extracto de Echinacea después se
concentra. Puede utilizarse en la práctica de la presente invención
cualquier especie de planta de Echinacea, pero la especie
actualmente preferida es E. purpurea. La extracción del
material vegetal de Echinacea utiliza una relación (en peso)
de material vegetal a disolvente de no más de aproximadamente dos
partes de material vegetal por aproximadamente una parte de
disolvente. La relación (en peso) de material vegetal a disolventes
actualmente preferida es de aproximadamente una parte de material
vegetal por aproximadamente cuatro partes de
disolvente.
disolvente.
Los extractos líquidos de Echinacea
pueden enriquecerse en uno o más miembros del grupo consistente en
polisacáridos de Echinacea, alquilamidas de Echinacea
y ácido cichórico. Los extractos líquidos de Echinacea
actualmente preferidos enriquecidos en polisacáridos incluyen
polisacáridos a una concentración mayor que aproximadamente 1%
(p/p), más preferentemente mayor que aproximadamente 5% (p/p) y lo
más preferentemente mayor que aproximadamente 10% (p/p). Los
extractos líquidos de Echinacea actualmente preferidos
enriquecidos en alquilamidas incluyen alquilamidas a una
concentración mayor que aproximadamente 0,1% (p/p), más
preferentemente mayor que aproximadamente 1,0% (p/p) y lo más
preferentemente mayor que aproximadamente 3,0% (p/p). Los extractos
líquidos de Echinacea actualmente preferidos enriquecidos en
ácido cichórico incluyen ácido cichórico a una concentración mayor
que aproximadamente 0,2% (p/p), más preferentemente mayor que
aproximadamente 0,5% (p/p) y lo más preferentemente mayor que
aproximadamente 3,0% (p/p).
Los extractos sólidos de Echinacea pueden
enriquecerse en uno o más miembros del grupo consistente en
polisacáridos de Echinacea, alquilamidas de Echinacea
y ácido cichórico. Los extractos sólidos de Echinacea
actualmente preferidos enriquecidos en polisacáridos incluyen
polisacáridos a una concentración mayor que aproximadamente 0,1%
(p/p), más preferentemente mayor que aproximadamente 0,05% (p/p) y
lo más preferentemente mayor que aproximadamente 20% (p/p). Los
extractos sólidos de Echinacea actualmente preferidos
enriquecidos en alquilamidas incluyen alquilamidas a una
concentración mayor que aproximadamente 0,001% (p/p), más
preferentemente mayor que aproximadamente 0,01% (p/p) y lo más
preferentemente mayor que aproximadamente 0,5% (p/p). Los extractos
sólidos de Echinacea actualmente preferidos enriquecidos en
ácido cichórico incluyen ácido cichórico a una concentración mayor
que aproximadamente 0,005% (p/p), más preferentemente mayor que
aproximadamente 0,05% (p/p) y lo más preferentemente mayor que
aproximadamente 1,5% (p/p).
Los extractos de Echinacea descritos en
el presente texto son útiles, por ejemplo, como suplementos
dietéticos y como fuente de polisacáridos, alquilamidas o ácido
cichórico para mezclar para producir las composiciones de
Echinacea de la presente invención. Las composiciones de
Echinacea de la presente invención son útiles, por ejemplo,
como suplementos dietéticos humanos. A título de ejemplo no
limitante, cuando se administran a un mamífero las composiciones de
Echinacea de la presente invención, estimulan uno o más de
los siguientes aspectos del sistema inmunitario: actividad
fagocítica de macrófagos; producción de óxido nítrico por los
macrófagos; producción de
TNF-\alpha por los macrófagos; producción de TNF-\gamma por los esplenocitos; y producción de TNF-\alpha por los esplenocitos.
TNF-\alpha por los macrófagos; producción de TNF-\gamma por los esplenocitos; y producción de TNF-\alpha por los esplenocitos.
En un cuarto aspecto, la presente invención
proporciona el uso de una composición de Echinacea en la
elaboración de un medicamento para potenciar la actividad del
sistema inmunitario en un mamífero, en donde la composición de
Echinacea se formula para que proporcione una dosificación
diaria de 40 \mug/Kg de peso corporal a 2000 \mug/Kg de peso
corporal de ácido cichórico, de 4 \mug/Kg de peso corporal a 200
\mug/Kg de peso corporal de alquilamidas de Echinacea y de
1 mg/Kg de peso corporal a 50 mg/Kg de peso corporal de
polisacáridos de Echinacea. El medicamento puede ser para
potenciar la actividad fagocítica de los macrófagos, potenciar la
producción de óxido nítrico de los macrófagos, potenciar la
producción de TNF-\alpha por los macrófagos,
potenciar la producción de TNF-\gamma por los
esplenocitos, o potenciar la producción de
TNF-\alpha por los esplenocitos.
Una composición de Echinacea puede ser
administrada a un mamífero para proporcionar una dosificación
diaria efectiva de una composición de Echinacea que comprende
cantidades estandarizadas de ácido cichórico de Echinacea,
alquilamidas de Echinacea y polisacáridos de
Echinacea. La expresión "dosificación diaria
estandarizada", y sus equivalentes gramaticales, significa una
dosificación diaria que es efectiva para potenciar la actividad del
sistema inmunitario en un mamífero.
Los aspectos precedentes y muchas de las
ventajas relacionadas de esta invención se hacen más fáciles de
apreciar al ser más comprensibles por referencia a la descripción
detallada que sigue, cuando se toman junto con los dibujos adjuntos,
en los que:
La Figura 1 muestra el efecto de diferentes
dosificaciones de una composición de Echinacea de la presente
invención sobre varios parámetros del sistema inmunitario en ratas.
La composición de Echinacea incluye extractos de ácido
cichórico, alquilamida y polisacárido de Echinacea, como se
exponen en el Ejemplo 8 en el presente texto. Los niveles de
dosificación se exponen en la Tabla 1 en el presente texto. Las
abreviaturas son: IL2 SP: producción de
interleucina-2 en los esplenocitos;
TNF-\alpha SP: producción de factor de necrosis
tumoral alfa en los esplenocitos;
INF-\gamma SP: producción de interferón gamma en los esplenocitos; TNF-\alpha MA: factor de necrosis tumoral alfa en los macrófagos alveolares; NO MA: producción de óxido nítrico en los macrófagos alveolares; PI MA: índice fagocítico en macrófagos alveolares; PA MA: actividad fagocítica en los macrófagos alveolares. Los resultados están normalizados respecto a valores testigo.
INF-\gamma SP: producción de interferón gamma en los esplenocitos; TNF-\alpha MA: factor de necrosis tumoral alfa en los macrófagos alveolares; NO MA: producción de óxido nítrico en los macrófagos alveolares; PI MA: índice fagocítico en macrófagos alveolares; PA MA: actividad fagocítica en los macrófagos alveolares. Los resultados están normalizados respecto a valores testigo.
La Figura 2 muestra el efecto sobre el índice
fagocítico de los macrófagos alveolares de la rata, de diferentes
dosificaciones de una composición de Echinacea de la presente
invención. La composición de Echinacea incluye extractos de
ácido cichórico, alquilamida y polisacárido de Echinacea,
como se expone en el Ejemplo 8 en el presente texto. Los niveles de
dosificación se exponen en la Tabla 1 en el presente texto.
La Figura 3 muestra el efecto de un extracto de
ácido cichórico de Echinacea sobre varios parámetros del
sistema inmunitario en ratas. El extracto de ácido cichórico de
Echinacea se preparó como se describe en el Ejemplo 2 en el
presente texto. Las abreviaturas son: IL2 SP: producción de
interleucina-2 en los esplenocitos;
TNF-\alpha SP: producción de factor de necrosis
tumoral alfa en los esplenocitos; INF-\gamma SP:
producción de interferón gamma en los esplenocitos;
TNF-\alpha MA: factor de necrosis tumoral alfa en
los macrófagos alveolares; NO MA: producción de óxido nítrico en
los macrófagos alveolares; PI MA: índice fagocítico en los
macrófagos alveolares; PA MA: actividad fagocítica en los macrófagos
alveolares. Los resultados están normalizados respecto a valores
testigo.
La Figura 4 muestra el efecto de un extracto de
polisacárido de Echinacea sobre varios parámetros del sistema
inmunitario en ratas. El extracto de polisacárido de
Echinacea se preparó como se describe en el Ejemplo 3 en el
presente texto. Las abreviaturas son: IL2 SP: producción de
interleucina-2 en los esplenocitos;
TNF-\alpha SP: producción de factor de necrosis
tumoral alfa en los esplenocitos; INF-\gamma SP:
producción de interferón gamma en los esplenocitos;
TNF-\alpha MA: factor de necrosis tumoral alfa en
los macrófagos alveolares; NO MA: producción de óxido nítrico en
los macrófagos alveolares; PI MA: índice fagocítico en macrófagos
alveolares; PA MA: actividad fagocítica en los macrófagos
alveolares. Los resultados están normalizados respecto a los
valores testigo.
La Figura 5 muestra el efecto de un extracto de
alquilamida de Echinacea sobre varios parámetros del sistema
inmunitario en ratas. El extracto de alquilamida de Echinacea
se preparó como se describe en el Ejemplo 1 en el presente texto.
Las abreviaturas son: IL2 SP: producción de
interleucina-2 en los esplenocitos;
TNF-\alpha SP: producción de factor de necrosis
tumoral alfa en los esplenocitos; INF-\gamma SP:
producción de inferferón gamma en los esplenocitos;
TNF-\alpha MA: factor de necrosis tumoral alfa en
los macrófagos alveolares; NO MA: producción de óxido nítrico en los
macrófagos alveolares; PI MA: índice fagocítico en los macrófagos
alveolares; PA MA: actividad fagocítica en macrófagos alveolares.
Los resultados están normalizados respecto a los valores
testigo.
La Figura 6 muestra el efecto de una composición
de Echinacea de la presente invención, y el efecto de cada
uno de sus componentes, extractos de ácido cichórico, alquilamida y
polisacárido, sobre el índice fagocítico de los macrófagos
alveolares de rata. La composición de Echinacea incluye
extractos de ácido cichórico, alquilamida y polisacárido de
Echinacea como se expone en el Ejemplo 8 en el presente
texto. La dosificación de la composición de Echinacea fue de
Nivel 4 como se expone en la Tabla 1 en el presente texto, esto es,
la composición de Echinacea proporcionó una dosificación
diaria de ácido cichórico de Echinacea a 800 \mug/kg,
polisacáridos de Echinacea a
20 mg/kg, y alquilamidas de Echinacea a 80 \mug/kg. Se administró por separado ácido cichórico de Echinacea a una dosificación diaria de 800 \mug/kg, se administró por separado polisacáridos de Echinacea a una dosificación diaria de 20 \mug/kg, y se administró por separado alquilamidas de Echinacea a una dosificación diaria de 80 \mug/kg. Se administró a las ratas testigo una mezcla de agua y etanol.
20 mg/kg, y alquilamidas de Echinacea a 80 \mug/kg. Se administró por separado ácido cichórico de Echinacea a una dosificación diaria de 800 \mug/kg, se administró por separado polisacáridos de Echinacea a una dosificación diaria de 20 \mug/kg, y se administró por separado alquilamidas de Echinacea a una dosificación diaria de 80 \mug/kg. Se administró a las ratas testigo una mezcla de agua y etanol.
La Figura 7 muestra el efecto sobre la
producción de TNF-\alpha en los macrófagos
alveolares de rata, de distintas dosificaciones de una composición
de Echinacea de la presente invención. La composición de
Echinacea incluye extractos de ácido cichórico, alquilamida y
polisacárido de Echinacea como se expone en el Ejemplo 8 en
el presente texto. TNF-\alpha MA: factor de
necrosis tumoral alfa en los macrófagos alveolares. Las
concentraciones relativas se obtuvieron normalizando cada una de las
concentraciones de la dosis de la Tabla 1 respecto a las
concentraciones al nivel de dosis 2 expuesto en la Tabla 1.
La Figura 8 muestra el efecto de distintas
dosificaciones de una composición de Echinacea de la presente
invención sobre la producción de Interleucina-2 en
los esplenocitos de rata. La composición de Echinacea incluye
extractos de ácido cichórico, alquilamida y polisacárido de
Echinacea como se expone en el Ejemplo 8 en el presente
texto. La composición de Echinacea se administró a los
niveles de dosificación expuestos en la Tabla 1 en el presente
texto. IL-2 SP: producción de
interleucina-2 de los esplenocitos. Los resultados
están normalizados respecto a los valores testigo. Las
concentraciones relativas se obtuvieron normalizando cada una de las
concentraciones de la dosis de la Tabla 1 respecto a las
concentraciones al nivel de dosis 2 expuesto en la Tabla 1.
Se usan las siguientes abreviaturas: mg/ml (o
mg/mL) es una abreviatura de miligramos por mililitro; mg/g es una
abreviatura de miligramos por gramo.
La presente invención proporciona composiciones
de Echinacea y métodos para preparar las composiciones de la
invención. Cualquier especie de Echinacea puede ser utilizada
en la práctica de la presente invención. La ciencia botánica
reconoce actualmente nueve especies de Echinacea. E.
pallida es una especie tetraploide con pétalos oscuros, hojas
pilosas y polen blanco. E. angustifolia crece típicamente en
zonas secas silvestres y se caracteriza por las hojas pilosas
cortas, y flores marchitas. La E. purpurea prefiere un suelo
rico, tiene flores de color violeta oscuro, y hojas anchas. La E.
atrorubens tiene pelos prensados en el tallo, con lígulas
reflejadas próximas al tallo y hojas no pilosas. La E.
sanguinea es una planta diploide de aspecto similar a la E.
pallida, pero tiene el polen amarillo. La E. simulata
parece ser físicamente idéntica a la E. pallida excepto que
la E. simulata tiene el polen amarillo. La E. paradoxa
tiene flores amarillas o bien rosas y pelos prensados. La E.
teneseensis tiene lígulas curvadas hacia arriba y es la más
pilosa de todas las especies de Echinacea. La E.
laevigata tiene largas lígulas marchitas igual que la E.
pallida, pero sus hojas son anchas como las de la E.
purpurea. Aunque puede utilizarse cualquier especie de
Echinacea en la práctica de la presente invención, la E.
purpurea es la especie de Echinacea preferida
actualmente.
La Echinacea puede propagarse a partir de
semillas, división en la corona y plantando secciones de la raíz,
preferentemente de 10-12 cm de longitud. Las
semillas pueden sembrarse al exterior inmediatamente después de
madurar en otoño y germinar el brote siguiente, pero la velocidad de
emergencia es afectada por el grado de latencia de la semilla, que
varía con la especie. La germinación de la semilla es afectada por
varios factores. El almacenamiento prolongado de la semilla a
temperatura ambiente durante tres años o más reduce la velocidad de
germinación. El tamaño de la semilla y la posición de la
inflorescencia no afecta a la germinación de la semilla, si bien
las semillas recolectadas en la madurez fisiológica, pero antes del
envejecimiento, tienen una velocidad de germinación más alta que
las semillas recolectadas después de la desecación. De acuerdo con
la experiencia de los autores de la presente invención, el origen
de las semillas (es decir, el suministrador de las semillas)
interviene en la mayor parte de la variación de la velocidad de
germinación de la E. purpurea. En particular, la presencia
de de semillas híbridas de Echinacea en lotes de semillas
suministradas en el comercio es indeseable. Un método actualmente
preferido para identificar semillas híbridas de Echinacea es
el siguiente. Las semillas a estudiar se germinan en planteros con
riego diario. Se dejan crecer las plántulas durante una semana
después de la germinación. Después se retiran las plántulas y se
lavan intensamente con agua, y se secan. Las plántulas limpias se
procesan a continuación con un mezclador de cocina hasta que están
finamente mezcladas. El material vegetal se retira filtrando a
través de filtros de 5 \mum. El líquido que queda se concentra
mediante evaporación bajo vacía a la mitad de su volumen original y
después se filtra a través de un filtro de 0,45 \mum para
análisis de HPLC. El análisis de HPLC, usando el método de ensayo
del ácido cichórico descrito en el Ejemplo 6 en el presente texto,
indicará un pico diferenciado de ácido cichórico para semillas no
híbridas, mientras que el pico de ácido cichórico está ausente en
las semillas híbridas.
El brote de las plántulas de campos sembrados
directamente puede no ser tan uniforme como en el interior después
de la estratificación. Un método actualmente preferido para la
estratificación de las semillas es mezclar las semillas con arena
limpia (en una relación de 1:1, v/v) en una bolsa de plástico, y
mantener la humedad en aproximadamente diez por ciento durante un
periodo de cuatro a seis semanas, a una temperatura entre
aproximadamente 1°C y aproximadamente -4°C. Las semillas
estratificadas se separan después de la arena y pueden sembrarse en
la superficie del suelo o a 0,5 cm de profundidad en semilleros de
cajón o tiestos pequeños llenos de una mezcla de turba y perlita
(en una relación de 1:1, v/v). Las semillas plantadas en semilleros
mantenidos a aproximadamente 18-20°C empiezan a
brotar típicamente en el plazo de siete a diez días después de
plantadas. Las plántulas crecen preferentemente en un invernadero o
en interior con luz suplementaria hasta el trasplante al exterior.
Típicamente hay aproximadamente 257.000 semillas/kg para la E.
purpurea y hasta aproximadamente 319.000 semillas/kg para la
E. angustifolia. Aproximadamente se requieren 500 g de
semillas para proporcionar trasplantes para un campo de 0,5
hectáreas (ha).
También es posible la propagación asexual
mediante esquejes y cultivos de células. La propagación asexual
puede producir una población grande de plantas iguales
genéticamente que pueden mejorarse mediante cultivo selectivo o
ingeniería genética para obtener rendimientos más elevados de
compuestos activos.
En la naturaleza, la Echinacea crece
típicamente en terreno pobre y rocoso bajo la luz del sol total.
Sin embargo, también florece cultivándola en suelo de marga o marga
arenosa moderadamente rico y bien drenado, que es entre neutro y
ligeramente ácido (pH 6-7). La Echinacea es
un cultivo de raíces y por tanto debe evitarse un terreno rocoso o
pesado. Aunque la Echinacea es tolerante a la sequía, el agua
es importante para su crecimiento y se recomienda el riego
regular.
La fertilización intensiva produce un elevado
rendimiento herbáceo pero un bajo rendimiento de raíz. Normalmente
es suficiente un fertilizante equilibrado, bajo en nitrógeno y que
incluya una cantidad adecuada de fósforo y potasio. La harina de
huesos o la roca fosfática (14,5 a 20 kg/ha) y la ceniza de madera
(45 a 51,5 kg/ha) aplicadas antes de la siembra, y el estiércol
vacuno o caballar aplicado en 3 aplicaciones después de la
plantación, son una combinación de fertilizante orgánico para el
cultivo de Echinacea preferida en la actualidad. El
fertilizante de pescado (incluyendo
N-P_{2}O_{5}-K_{2}O en una relación de 5-2-2, respectivamente) aplicado a una concentración de trabajo de 4 mL/L favorece el crecimiento de E. purpurea. Además del estiércol y los residuos municipales descompuestos, también es beneficioso un cultivo protector tal como la quinoa, la ortiga o el trébol rojo. También puede usarse un fertilizante químico para cultivo no orgánico. El fertilizante de nitrógeno se usa para la salud general de la planta y, más específicamente, para producir una planta hojosa de color verde oscuro. Los fertilizantes de fosfato harán que aumente la floración.
N-P_{2}O_{5}-K_{2}O en una relación de 5-2-2, respectivamente) aplicado a una concentración de trabajo de 4 mL/L favorece el crecimiento de E. purpurea. Además del estiércol y los residuos municipales descompuestos, también es beneficioso un cultivo protector tal como la quinoa, la ortiga o el trébol rojo. También puede usarse un fertilizante químico para cultivo no orgánico. El fertilizante de nitrógeno se usa para la salud general de la planta y, más específicamente, para producir una planta hojosa de color verde oscuro. Los fertilizantes de fosfato harán que aumente la floración.
Adicionalmente, la separación entre plantas
afecta al rendimiento. Preferentemente, la Echinacea debe
ser plantada separada 30 cm en macizos de 120 cm de ancho, dejando
cinco filas por macizo y dando aproximadamente 74.000 plantas por
hectárea. Esta es una densidad máxima, que puede ser excesiva si se
usa una especie de Echinacea vigorosa, o si las plantas se
cultivan por más de cuatro años.
El pajuzo o mantillo sirve para mantener la
humedad y la temperatura del suelo, y, lo que es más importante,
para controlar las malezas. Las plántulas medran bajo mantillo
plástico negro o mantillo de corteza. Si la plántula está al aire
libre, se considera esencial un mantillo de paja limpia (2 a 3 cm)
sobre la semilla. La Echinacea no es tolerante a las malezas,
por lo que es un factor importante el control de las mismas. En la
experiencia de los autores de la presente invención, con respecto
al cultivo orgánico de Echinacea, el mantillo plástico negro
o de corteza es la mejor medida de control de malezas,
especialmente para plantas recién establecidas. El mantillo
plástico puede hacer disminuir los costes de trabajo del control de
las malezas entre un setenta y un ochenta por ciento. La aplicación
del mantillo debe hacerse inmediatamente después de plantar y debe
ser grueso (es decir, utilizando trozos de mantillo de corteza que
tengan unas dimensiones mayores que aproximadamente 2 cm por 2 cm)
para permitir que la superficie se seque y cree condiciones
desfavorables para la germinación de malezas. La preparación del
terreno, al menos un año antes de plantar, es otra forma de
deshacerse de malezas perennes y de reducir la población anual de
malezas. Un método preferido de preparación del terreno es revolver
la tierra en primavera, cuando las malezas han crecido, pero antes
de plantar las plantas de Echinacea. De esta forma, las
malezas se destruyen por exposición de sus raíces.
El cultivo meticuloso del suelo es esencial para
optimizar el crecimiento y el rendimiento de la Echinacea.
Normalmente, las raíces no alcanzan el tamaño deseado hasta
3-4 años después de la siembra. Con unas condiciones
de cultivo reguladas cuidadosamente, el rendimiento de E.
angustifolia puede alcanzar hasta 2,5 ton/ha. Los rendimientos
para E. purpurea son típicamente más elevados que los de
E. angustifolia.
Las composiciones de Echinacea de la
presente invención incluyen cantidades estandarizadas de al menos
tres componentes de Echinacea. En este contexto, la
expresión "cantidad estandarizada", o los equivalentes
gramaticales de la misma, significa una cantidad deseada y
cuantificada de un componente de Echinacea. Es deseable
formular composiciones de Echinacea que contengan cantidades
estandarizadas de componente de Echinacea porque tales
composiciones estandarizadas de Echinacea proporcionan al
consumidor una dosis efectiva constante (es decir, que no varía de
unos lotes a otros) del componente o de los componentes
biológicamente activos.
Los extractos de Echinacea actualmente
preferidos, útiles para preparar las composiciones de
Echinacea de la presente invención, están enriquecidos en al
menos un componente de Echinacea que es capaz de inducir una
respuesta biológica, tal como la estimulación de la función
inmunitaria, cuando se introduce en un organismo vivo. A título de
ejemplo no limitante, los componentes de Echinacea útiles
para preparar las composiciones de Echinacea de la presente
invención incluyen: aceites esenciales, alcamidas (incluyendo
alquilamidas), ácido cichórico, polisacáridos, polialquinos y
polialquenos. Los ejemplos representativos de aceites esenciales de
Echinacea incluyen borneol, acetato de bornilo,
pentadeca-8-en-2-ona,
germacreno D, cariofileno, cariofileno epóxido y ácido palmítico.
Los aceites esenciales de Echinacea se describen, por
ejemplo, en A. Awang y D. Kindack, Canadian Pharmaceutical
Journal 124: 512-516 (1991), y en Bauer,
R., "Echinacea Species as Potencial Immunostimulatory
Drugs", Economic and Medicinal Plant Research, vol. 5, p.
261-267 (1991). Los componentes de Echinacea
útiles para preparar las composiciones de Echinacea de la
presente invención son ácido cichórico (lo más preferentemente
ácido cichórico preparado como se describe en el presente texto),
alquilamidas de Echinacea (lo más preferentemente
alquilamidas de Echinacea preparadas como se describe en el
presente texto) y polisacáridos de Echinacea (lo más
preferentemente polisacáridos de Echinacea preparados como se
describe en el presente texto).
Las composiciones de Echinacea pueden
incluir una cantidad estandarizada de un primer componente de
Echinacea y una cantidad estandarizada de un segundo
componente de Echinacea, en donde el primero y el segundo
componentes de Echinacea se eligen cada uno de ellos
independientemente entre el grupo consistente en ácido cichórico
(lo más preferentemente ácido cichórico preparado como se describe
en el presente texto), alquilamidas de Echinacea (lo más
preferentemente alquilamidas de Echinacea preparadas como se
describe en el presente texto) y polisacáridos de Echinacea
(lo más preferentemente polisacáridos de Echinacea preparados
como se describe en el presente texto), y en donde la cantidad
estandarizada de ácido cichórico es de aproximadamente 0,2 mg/ml a
aproximadamente 500 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente
0,3 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, lo más preferentemente de
aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml; la cantidad
estandarizada de alquilamidas de Echinacea es de
aproximadamente 0,02 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, más
preferentemente de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 50
mg/ml, lo más preferentemente de aproximadamente 0,8 mg/ml a
aproximadamente 50 mg/ml; y la cantidad estandarizada de
polisacáridos de Echinacea es de aproximadamente 10 mg/ml a
aproximadamente
800 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 800 mg/mi, lo más preferentemente de aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 800 mg/ml.
800 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 800 mg/mi, lo más preferentemente de aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 800 mg/ml.
\newpage
La presente invención proporciona composiciones
de Echinacea que incluyen una cantidad estandarizada de
ácido cichórico (lo más preferentemente ácido cichórico preparado
como se describe en el presente texto), alquilamidas de
Echinacea (lo más preferentemente alquilamidas de
Echinacea preparadas como se describe en el presente texto),
y polisacáridos de Echinacea (lo más preferentemente
polisacáridos de Echinacea preparados como se describe en el
presente texto), y en donde la cantidad estandarizada de ácido
cichórico es de aproximadamente 0,2 mg/ml a aproximadamente 500
mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 0,3 mg/ml a
aproximadamente 30 mg/ml, lo más preferentemente de aproximadamente
5 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml; la cantidad estandarizada de
alquilamidas de Echinacea es de aproximadamente 0,02 mg/ml a
aproximadamente 50 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente
0,05 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, lo más preferentemente de
aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml; y la cantidad
estandarizada de polisacáridos de Echinacea es de
aproximadamente
10 mg/ml a aproximadamente 800 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 800 mg/ml, lo más preferentemente de aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 800 mg/ml.
10 mg/ml a aproximadamente 800 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 800 mg/ml, lo más preferentemente de aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 800 mg/ml.
Las composiciones de Echinacea pueden
incluir una cantidad estandarizada de un primer componente de
Echinacea y una cantidad estandarizada de un segundo
componente de Echinacea, en donde el primero y el segundo
componentes de Echinacea se eligen cada uno de ellos
independientemente entre el grupo consistente en ácido cichórico
(lo más preferentemente ácido cichórico preparado como se describe
en el presente texto), alquilamidas de Echinacea (lo más
preferentemente alquilamidas de Echinacea preparadas como se
describe en el presente texto) y polisacáridos de Echinacea
(lo más preferentemente polisacáridos de Echinacea preparados
como se describe en el presente texto), y en donde la cantidad
estandarizada de ácido cichórico es de aproximadamente 0,01 mg/g a
aproximadamente
500 mg/g, más preferentemente de aproximadamente 0,05 mg/g a aproximadamente 500 mg/g, lo más preferentemente de aproximadamente 15 mg/g a aproximadamente 500 mg/g; la cantidad estandarizada de alquilamidas de Echinacea es de aproximadamente 0,005 mg/g a aproximadamente 100 mg/g, más preferentemente de aproximadamente
0,1 mg/g a aproximadamente 100 mg/g, lo más preferentemente de aproximadamente 5 mg/g a aproximadamente
100 mg/g; y la cantidad estandarizada de polisacáridos de Echinacea es de aproximadamente 5 mg/g a aproximadamente 900 mg/g, más preferentemente de aproximadamente 10 mg/g a aproximadamente 900 mg/g, lo más preferentemente de aproximadamente 200 mg/g a aproximadamente 900 mg/g.
500 mg/g, más preferentemente de aproximadamente 0,05 mg/g a aproximadamente 500 mg/g, lo más preferentemente de aproximadamente 15 mg/g a aproximadamente 500 mg/g; la cantidad estandarizada de alquilamidas de Echinacea es de aproximadamente 0,005 mg/g a aproximadamente 100 mg/g, más preferentemente de aproximadamente
0,1 mg/g a aproximadamente 100 mg/g, lo más preferentemente de aproximadamente 5 mg/g a aproximadamente
100 mg/g; y la cantidad estandarizada de polisacáridos de Echinacea es de aproximadamente 5 mg/g a aproximadamente 900 mg/g, más preferentemente de aproximadamente 10 mg/g a aproximadamente 900 mg/g, lo más preferentemente de aproximadamente 200 mg/g a aproximadamente 900 mg/g.
La presente invención proporciona composiciones
de Echinacea que incluyen una cantidad estandarizada de
ácido cichórico (lo más preferentemente ácido cichórico preparado
como se describe en el presente texto), alquilamidas de
Echinacea (lo más preferentemente alquilamidas de
Echinacea preparadas como se describe en el presente texto),
y polisacáridos de Echinacea (lo más preferentemente
polisacáridos de Echinacea preparados como se describe en el
presente texto), y en donde la cantidad estandarizada de ácido
cichórico es de aproximadamente 0,01 mg/g a aproximadamente 500
mg/g, más preferentemente de aproximadamente 0,05 mg/ml a
aproximadamente 500 mg/g, lo más preferentemente de aproximadamente
15 mg/g a aproximadamente 500 mg/g; la cantidad estandarizada de
alquilamidas de Echinacea es de aproximadamente 0,005 mg/g a
aproximadamente 100 mg/g, más preferentemente de aproximadamente
0,1 mg/g a aproximadamente 100 mg/g, lo más preferentemente de
aproximadamente 5 mg/g a aproximadamente 100 mg/g; y la cantidad
estandarizada de polisacáridos de Echinacea es de
aproximadamente 5 mg/g a aproximadamente 900 mg/g, más
preferentemente de aproximadamente 10 mg/g a aproximadamente 900
mg/g, lo más preferentemente de aproximadamente 200 mg/g a
aproximadamente 900 mg/g.
En el tercer aspecto, la presente invención
proporciona métodos para preparar composiciones de Echinacea,
incluyendo los métodos la etapa de combinar cantidades de tres
componentes de Echinacea suficientes para dar una composición
de Echinacea que incluye cantidades estandarizadas de cada
uno de los componentes de Echinacea combinados. En este
contexto, la expresión "cantidad estandarizada", o los
equivalentes gramaticales de la misma, significa una cantidad
deseada y cuantificada de un componente de Echinacea. Los
componentes de Echinacea actualmente preferidos, útiles para
preparar las composiciones de Echinacea de acuerdo con la
presente invención, son capaces de inducir una respuesta biológica,
tal como la estimulación de la función inmunitaria, cuando se
introducen en un organismo vivo. Los componentes de Echinacea
útiles para preparar las composiciones de Echinacea
incluyen: aceites esenciales, alcamidas (incluyendo alquilamidas),
ácido cichórico, polisacáridos, polialquinos y polialquenos. Los
componentes de Echinacea útiles para preparar composiciones
de Echinacea, de acuerdo con los métodos de la presente
invención, son ácido cichórico (lo más preferentemente ácido
cichórico preparado como se describe en el presente texto),
alquilamidas de Echinacea (lo más preferentemente
alquilamidas de Echinacea preparadas como se describe en el
presente texto) y polisacáridos de Echinacea (lo más
preferentemente polisacáridos de Echinacea preparados como
se describe en el presente texto). Las composiciones de
Echinacea preparadas de acuerdo con la presente invención
pueden estar en forma líquida, en forma de gel o en forma sólida,
tal como polvo o cápsulas, y preferentemente se adaptan para su
administración (más preferentemente administración oral) a una
persona.
Los métodos para preparar composiciones de
Echinacea pueden incluir la etapa de combinar una cantidad
de un primer componente de Echinacea y una cantidad de un
segundo componente de Echinacea, siendo elegidos cada uno de
dichos primero y segundo componentes de Echinacea
independientemente entre el grupo consistente en ácido cichórico (lo
más preferentemente ácido cichórico preparado como se describe en
el presente texto), alquilamidas de Echinacea (lo más
preferentemente alquilamidas de Echinacea preparadas como se
describe en el presente texto) y polisacáridos de Echinacea
(lo más preferentemente polisacáridos de Echinacea
preparados como se describe en el presente texto), siendo dicha
cantidad de ácido cichórico una cantidad suficiente para dar una
composición de Echinacea que incluye una cantidad
estandarizada de ácido cichórico de aproximadamente 0,2 mg/ml a
aproximadamente
500 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 0,3 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, lo más preferentemente de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml; siendo dicha cantidad de alquilamidas de Echinacea una cantidad suficiente para dar una composición de Echinacea que incluye una cantidad estandarizada de alquilamidas de aproximadamente 0,02 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, lo más preferentemente de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml; y siendo dicha cantidad de polisacáridos de Echinacea una cantidad suficiente para dar una composición de Echinacea que incluye una cantidad estandarizada de polisacáridos de Echinacea de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 800 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 800 mg/ml, lo más preferentemente de aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 800 mg/ml.
500 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 0,3 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, lo más preferentemente de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml; siendo dicha cantidad de alquilamidas de Echinacea una cantidad suficiente para dar una composición de Echinacea que incluye una cantidad estandarizada de alquilamidas de aproximadamente 0,02 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, lo más preferentemente de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml; y siendo dicha cantidad de polisacáridos de Echinacea una cantidad suficiente para dar una composición de Echinacea que incluye una cantidad estandarizada de polisacáridos de Echinacea de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 800 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 800 mg/ml, lo más preferentemente de aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 800 mg/ml.
La presente invención proporciona métodos para
preparar composiciones de Echinacea que incluyen la etapa de
combinar una cantidad de ácido cichórico (lo más preferentemente
ácido cichórico preparado como se describe en el presente texto),
una cantidad de alquilamidas de Echinacea (lo más
preferentemente alquilamidas de Echinacea preparadas como se
describe en el presente texto) y una cantidad de polisacáridos de
Echinacea (lo más preferentemente polisacáridos de
Echinacea preparados como se describe en el presente texto),
siendo dicha cantidad de ácido cichórico una cantidad suficiente
para dar una composición de Echinacea que incluye una
cantidad estandarizada de ácido cichórico de aproximadamente 0,2
mg/ml a aproximadamente 500 mg/ml, más preferentemente de
aproximadamente
0,3 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, lo más preferentemente de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml; siendo dicha cantidad de alquilamidas de Echinacea una cantidad suficiente para dar una composición de Echinacea que incluye una cantidad estandarizada de alquilamidas de aproximadamente 0,02 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, lo más preferentemente de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml; y siendo dicha cantidad de polisacáridos de Echinacea una cantidad suficiente para dar una composición de Echinacea que incluye una cantidad estandarizada de polisacáridos de Echinacea de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 800 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 800 mg/ml, lo más preferentemente de aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 800 mg/ml.
0,3 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, lo más preferentemente de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml; siendo dicha cantidad de alquilamidas de Echinacea una cantidad suficiente para dar una composición de Echinacea que incluye una cantidad estandarizada de alquilamidas de aproximadamente 0,02 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, lo más preferentemente de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml; y siendo dicha cantidad de polisacáridos de Echinacea una cantidad suficiente para dar una composición de Echinacea que incluye una cantidad estandarizada de polisacáridos de Echinacea de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 800 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 800 mg/ml, lo más preferentemente de aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 800 mg/ml.
Los métodos para preparar composiciones de
Echinacea pueden incluir la etapa de combinar una cantidad
de un primer componente de Echinacea y una cantidad de un
segundo componente de Echinacea, siendo elegidos cada uno de
dichos primero y segundo componentes de Echinacea
independientemente entre el grupo consistente en ácido cichórico (lo
más preferentemente ácido cichórico preparado como se describe en
el presente texto), alquilamidas de Echinacea (lo más
preferentemente alquilamidas de Echinacea preparadas como se
describe en el presente texto) y polisacáridos de Echinacea
(lo más preferentemente polisacáridos de Echinacea
preparados como se describe en el presente texto), siendo dicha
cantidad de ácido cichórico una cantidad suficiente para dar una
composición de Echinacea que incluye una cantidad
estandarizada de ácido cichórico de aproximadamente 0,01 mg/g a
aproximadamente 500 mg/g, más preferentemente de aproximadamente
0,05 mg/g a aproximadamente 500 mg/g, lo más preferentemente de
aproximadamente 15 mg/g a aproximadamente 500 mg/g; siendo dicha
cantidad de alquilamidas de Echinacea una cantidad
suficiente para dar una composición de Echinacea que incluye
una cantidad estandarizada de alquilamidas de aproximadamente 0,005
mg/g a aproximadamente 100 mg/g, más preferentemente de
aproximadamente
0,1 mg/g a aproximadamente 100 mg/g, lo más preferentemente de aproximadamente 5 mg/g a aproximadamente
100 mg/g; y siendo dicha cantidad de polisacáridos de Echinacea una cantidad suficiente para dar una composición de Echinacea que incluye una cantidad estandarizada de polisacáridos de Echinacea de aproximadamente 5 mg/g a aproximadamente 900 mg/g, más preferentemente de aproximadamente 10 mg/g a aproximadamente 900 mg/g, lo más preferentemente de aproximadamente 200 mg/g a aproximadamente 900 mg/g.
0,1 mg/g a aproximadamente 100 mg/g, lo más preferentemente de aproximadamente 5 mg/g a aproximadamente
100 mg/g; y siendo dicha cantidad de polisacáridos de Echinacea una cantidad suficiente para dar una composición de Echinacea que incluye una cantidad estandarizada de polisacáridos de Echinacea de aproximadamente 5 mg/g a aproximadamente 900 mg/g, más preferentemente de aproximadamente 10 mg/g a aproximadamente 900 mg/g, lo más preferentemente de aproximadamente 200 mg/g a aproximadamente 900 mg/g.
La presente invención proporciona métodos para
preparar composiciones de Echinacea, que incluyen la etapa de
combinar una cantidad de ácido cichórico (lo más preferentemente
ácido cichórico preparado como se describe en el presente texto),
una cantidad de alquilamidas de Echinacea (lo más
preferentemente alquilamidas de Echinacea preparadas como se
describe en el presente texto) y una cantidad de polisacáridos de
Echinacea (lo más preferentemente polisacáridos de
Echinacea preparados como se describe en el presente texto),
siendo dicha cantidad de ácido cichórico una cantidad suficiente
para dar una composición de Echinacea que incluye una
cantidad estandarizada de ácido cichórico de aproximadamente 0,01
mg/g a aproximadamente 500 mg/g, más preferentemente de
aproximadamente
0,05 mg/g a aproximadamente 500 mg/g, lo más preferentemente de aproximadamente 15 mg/g a aproximadamente 500 mg/ml; siendo dicha cantidad de alquilamidas de Echinacea una cantidad suficiente para dar una composición de Echinacea que incluye una cantidad estandarizada de alquilamidas de aproximadamente 0,005 mg/g a aproximadamente 100 mg/g, más preferentemente de aproximadamente 0,1 mg/g a aproximadamente 100 mg/g, lo más preferentemente de aproximadamente 5 mg/g a aproximadamente 100 mg/g; y siendo dicha cantidad de polisacáridos de Echinacea una cantidad suficiente para dar una composición de Echinacea que incluye una cantidad estandarizada de polisacáridos de Echinacea de aproximadamente 5 mg/g a aproximadamente 900 mg/g, más preferentemente de aproximadamente 10 mg/g a aproximadamente 900 mg/g, lo más preferentemente de aproximadamente 200 mg/g a aproximadamente 900 mg/g.
0,05 mg/g a aproximadamente 500 mg/g, lo más preferentemente de aproximadamente 15 mg/g a aproximadamente 500 mg/ml; siendo dicha cantidad de alquilamidas de Echinacea una cantidad suficiente para dar una composición de Echinacea que incluye una cantidad estandarizada de alquilamidas de aproximadamente 0,005 mg/g a aproximadamente 100 mg/g, más preferentemente de aproximadamente 0,1 mg/g a aproximadamente 100 mg/g, lo más preferentemente de aproximadamente 5 mg/g a aproximadamente 100 mg/g; y siendo dicha cantidad de polisacáridos de Echinacea una cantidad suficiente para dar una composición de Echinacea que incluye una cantidad estandarizada de polisacáridos de Echinacea de aproximadamente 5 mg/g a aproximadamente 900 mg/g, más preferentemente de aproximadamente 10 mg/g a aproximadamente 900 mg/g, lo más preferentemente de aproximadamente 200 mg/g a aproximadamente 900 mg/g.
Las composiciones de Echinacea preparadas
de acuerdo con la presente invención pueden estar en forma líquida,
en forma de gel o en forma sólida, tal como un polvo, o comprimidos
o cápsulas, y preferentemente están adaptadas para la
administración (más preferentemente administración oral) a una
persona. Típicamente, antes de mezclar para formar composiciones de
Echinacea de la presente invención, se analiza la potencia
de partes alícuotas de Echinacea. Los extractos se ajustan a
la concentración o a las concentraciones deseadas, mediante
concentración o dilución con cargas o disolventes apropiados
(incluyendo agua, alcohol, aceite de soja u otros aceites,
lecitina, glicerina, etc.). Los recipientes para hacer la mezcla
pueden purgarse con gas nitrógeno y la mezcla puede llevarse a cabo
bajo nitrógeno para prevenir la oxidación. Las composiciones de
Echinacea, o los extractos de Echinacea individuales,
pueden formularse en una base de alcohol o de glicerina. Los
extractos o composiciones de Echinacea en polvo pueden ser
elaborados mediante secado por pulverización o secado por
liofilización. Los extractos o composiciones líquidas de
Echinacea pueden también ser microencapsulados en forma de
polvo suelto o fluible. Las composiciones o extractos de
Echinacea líquidas pueden usarse directamente como
ingredientes en cápsulas de gelatina blanda y cápsulas de gelatina
dura, y pueden hacerse comprimidos a partir del material en
polvo.
En general, los extractos de Echinacea
preparados como se describe en el presente texto, y las
composiciones preparadas de acuerdo con la presente invención,
pueden incluir uno o más excipientes. Los excipientes adecuados
aceptables farmacéuticamente incluyen agentes de procesado y
modificadores y potenciadores de suministro de fármacos tales como,
por ejemplo, polvo de aceite vegetal, croscaramelosa sódica, goma
acacia y goma guar. Otros excipientes adecuados aceptables
farmacéuticamente se describen en "Remington's Pharmaceutical
Sciences", Mack Pub. Co, New Jersey (1991).
Los métodos para preparar extractos enriquecidos
de Echinacea se describen en el presente texto. Los
extractos de Echinacea preferidos están enriquecidos en
alquilamidas de Echinacea, polisacáridos de Echinacea
o ácido cichórico. Los métodos incluyen las etapas de elegir una
planta de Echinacea en un estado de desarrollo que tenga una
cantidad potenciada del componente que se desee (tal como
alquilamidas de Echinacea, polisacáridos de Echinacea
o ácido cichórico); seleccionar una porción de la planta que esté
enriquecida en el componente deseado, y poner en contacto la
porción seleccionada con una cantidad de un disolvente, elegido
entre el grupo consistente en etanol y agua, efectiva para extraer
el componente deseado de la porción de la planta. Preferentemente,
se concentra entonces el extracto de Echinacea. Puede
utilizarse cualquier especie de planta de Echinacea, pero la
especie actualmente preferida es E. purpurea. Los
componentes actualmente preferidos extraídos de plantas de
Echinacea son polisacáridos, alquilamidas y ácido cichórico.
Cuando se usan los métodos para extraer polisacáridos, las plantas
de Echinacea extraídas tienen preferentemente una edad de
aproximadamente uno a aproximadamente cuatro años. Preferentemente
los polisacáridos se extraen de las flores, las hojas, los tallos
y/o las raíces de las plantas de Echinacea. Cuando se usan
los métodos para extraer alquilamidas, las plantas de
Echinacea extraídas tienen preferentemente una edad de
aproximadamente dos a aproximadamente cuatro años. Preferentemente,
las alquilamidas se extraen de las flores maduras y raíces de las
plantas de Echinacea. Cuando los métodos se usan para extraer
ácido cichórico, las plantas de Echinacea extraídas tienen
preferentemente una edad de aproximadamente uno a aproximadamente
tres años. Preferentemente, el ácido cichórico se extrae de plantas
de Echinacea jóvenes, de las hojas de las plantas de
Echinacea y de las flores inmaduras. La extracción del
material vegetal de la Echinacea utiliza una relación (en
peso) de material vegetal a disolvente de no más de aproximadamente
dos partes de material vegetal a aproximadamente una parte de
disolvente. La relación (en peso) actualmente preferida de material
vegetal a disolvente es aproximadamente una parte de material
vegetal a aproximadamente cuatro partes de disolvente.
Los polisacáridos pueden ser extraídos de
material vegetal de Echinacea seleccionado poniendo en
contacto el material vegetal con una mezcla de etanol y agua que
contiene de aproximadamente 0,1% de etanol a aproximadamente 50% de
etanol (p/p), preferentemente de aproximadamente 5% de etanol a
aproximadamente 20% de etanol. Los polisacáridos se extraen
preferentemente de las flores, hojas, tallos y/o raíces de las
plantas de Echinacea. Las partes aéreas de la planta
contienen típicamente concentraciones de polisacáridos más elevadas
que las raíces, y las flores maduras contienen típicamente
concentraciones de polisacáridos más elevadas que las flores
inmaduras. La temperatura de extracción preferida para extraer los
polisacáridos es de aproximadamente 20°C a aproximadamente 80°C,
más preferentemente de aproximadamente 30°C aproximadamente 70°C, y
lo más preferentemente de aproximadamente 30°C a aproximadamente
50°C. La duración de la extracción de los polisacáridos es
preferentemente de aproximadamente 48 horas a aproximadamente 14
días, más preferentemente de aproximadamente de aproximadamente 3
días a aproximadamente 12 días, y lo más preferentemente de
aproximadamente 4 días a aproximadamente 8 días. Los tiempos de
extracción prolongados a temperaturas elevadas aseguran que los
polisacáridos son extraídos de la forma más completa posible,
aunque tiene lugar cierta hidrólisis de los polisacáridos a
temperaturas más altas, pero las temperaturas bajas retardan el
proceso de extracción de forma significativa. Los extractos de
polisacárido que contienen bajas concentraciones de etanol han de
ser vigilados estrechamente para evitar el crecimiento de bacterias,
levaduras u hongos, y el consiguiente deterioro.
Los extractos de polisacáridos preparados como
se describe en el presente texto contienen típicamente polisacáridos
en unas concentraciones de aproximadamente 0,5 mg/mL a
aproximadamente 20,0 mg/mL. Los extractos de polisacáridos se
concentran preferentemente a una concentración final de
polisacáridos de aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 900
mg/mL, más preferentemente a una concentración de polisacáridos de
aproximadamente
60 mg/mL a aproximadamente 900 mg/mL, lo más preferentemente a una concentración de polisacáridos de aproximadamente 100 mg/mL a aproximadamente 900 mg/mL. El método actualmente preferido para concentrar extractos de polisacáridos es la evaporación. La evaporación se realiza preferentemente a una temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 85°C, durante un periodo de tiempo de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 6 días. El vacío aplicado es típicamente de aproximadamente 5 milibares (mbar) a aproximadamente 320 mbar absolutos de vacío.
60 mg/mL a aproximadamente 900 mg/mL, lo más preferentemente a una concentración de polisacáridos de aproximadamente 100 mg/mL a aproximadamente 900 mg/mL. El método actualmente preferido para concentrar extractos de polisacáridos es la evaporación. La evaporación se realiza preferentemente a una temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 85°C, durante un periodo de tiempo de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 6 días. El vacío aplicado es típicamente de aproximadamente 5 milibares (mbar) a aproximadamente 320 mbar absolutos de vacío.
Las alquilamidas pueden extraerse del material
vegetal de Echinacea seleccionado poniendo en contacto el
material vegetal con una mezcla de etanol y agua que contiene de
aproximadamente 50% de etanol a aproximadamente 95% de etanol (p/p),
preferentemente de aproximadamente 65% de etanol a aproximadamente
85% de etanol, más preferentemente de aproximadamente 70% de etanol
a aproximadamente 80% de etanol. Las alquilamidas se encuentran en
todas las especies de Echinacea y la concentración total de
alquilamida (y la complejidad de la fracción de alquilamida) es
mayor en la raíz que en las hojas. Las isobutilamidas son el
componente mayoritario de la fracción de alquilamida en las raíces
de E. angustifolia y E. purpurea, aunque son un
componente minoritario de la fracción de alquilamida en las raíces
de E. pallida. Las isobutilamidas están presentes en las
partes aéreas de E. angustifolia, E. purpurea y E.
pallida. Las flores maduras y las raíces de las plantas de
Echinacea se usan preferentemente como materiales de partida
para preparar extractos de alquilamida, ya que estos materiales
vegetales tienen la cantidad de alquilamidas más elevada. Las
alquilamidas se extraen preferentemente de plantas de
Echinacea que tienen una edad superior a aproximadamente dos
años.
La temperatura de extracción preferidas para
extraer alquilamidas de Echinacea es de aproximadamente 4°C
a aproximadamente 85°C, más preferentemente de aproximadamente 30°C
a aproximadamente 70°C, lo más preferentemente de aproximadamente
40°C a 60°C. La duración de la extracción de alquilamida es
preferentemente de aproximadamente 24 horas a aproximadamente 7
días, más preferentemente de aproximadamente un día a
aproximadamente cuatro días, lo más preferentemente de
aproximadamente dos días a aproximadamente tres días. La temperatura
de extracción de alquilamida elegida depende en parte del contenido
de otros compuestos en el material vegetal de partida. En el caso de
un material vegetal que contiene una gran proporción de
alquilamidas y poco ácido cichórico, las extracciones pueden
llevarse a cabo a 85°C; sin embargo, cuando también está presente
una cantidad significativa de ácido cichórico en el material
vegetal de partida, y es deseable preservar el ácido cichórico en
el extracto final, la temperatura de extracción debe reducirse a
menos de 40°C para evitar la degradación del ácido cichórico.
Los extractos de alquilamida preparados como se
describe en el presente texto contienen típicamente alquilamidas en
una concentración de aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente
3,0 mg/mL. Los extractos de alquilamida se concentran
preferentemente a una concentración final de alquilamida de
aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 300 mg/mL, más
preferentemente a una concentración de alquilamida de
aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 300 mg/mL, lo más
preferentemente a una concentración de alquilamida de
aproximadamente
20 mg/mL a aproximadamente 300 mg/mL. El método actualmente preferido para concentrar extractos de alquilamida es la evaporación. La evaporación se realiza típicamente a una temperatura de aproximadamente 10°C a aproximadamente 90°C, durante un periodo de tiempo de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 3 días. El vacío aplicado es típicamente de aproximadamente 5 milibares (mbar) a aproximadamente 320 milibares absolutos de vacío.
20 mg/mL a aproximadamente 300 mg/mL. El método actualmente preferido para concentrar extractos de alquilamida es la evaporación. La evaporación se realiza típicamente a una temperatura de aproximadamente 10°C a aproximadamente 90°C, durante un periodo de tiempo de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 3 días. El vacío aplicado es típicamente de aproximadamente 5 milibares (mbar) a aproximadamente 320 milibares absolutos de vacío.
El ácido cichórico puede extraerse del material
vegetal de Echinacea seleccionado poniendo en contacto el
material vegetal con una mezcla de etanol y agua que contiene de
aproximadamente 40% de etanol (p/p) a aproximadamente 95% de etanol
(p/p), preferentemente de aproximadamente 40% de etanol (p/p) a
aproximadamente 85% (p/p) de etanol, más preferentemente de
aproximadamente 50% de etanol (p/p) a aproximadamente 70% de etanol
(p/p). Las partes de la planta de Echinacea que contienen las
concentraciones más altas de ácido cichórico se extraen
preferentemente con el fin de dar extractos que tienen una elevada
concentración de ácido cichórico. En la E. purpurea las
concentraciones más altas de ácido cichórico se encuentran en las
raíces, las flores y las hojas, mientras que en la E.
angustifolia el ácido cichórico se encuentra solamente en las
raíces. En general, el ácido cichórico se extrae preferentemente de
plantas jóvenes, hojas y flores inmaduras. Se eligen las plantas de
Echinacea que tengan preferentemente menos de un año de
edad.
La temperatura de extracción preferida para
extraer el ácido cichórico es de aproximadamente 4°C a
aproximadamente 45°C, más preferentemente de aproximadamente 4°C a
aproximadamente 30°C. La duración de la extracción del ácido
cichórico es preferentemente de aproximadamente 24 horas a
aproximadamente 3 días, más preferentemente de aproximadamente 24
horas a aproximadamente 40 horas, lo más preferentemente de
aproximadamente 24 horas a aproximadamente 36 horas. La degradación
del ácido cichórico se hace significativa a temperaturas de
extracción superiores a aproximadamente 40°C. Puede perderse una
cantidad tan elevada como el 95% del ácido cichórico inicialmente
presente en el material vegetal, si la extracción se lleva a cabo a
más de 40°C durante más de 48 horas. Las extracciones más
prolongadas pueden dar extractos completamente carentes de ácido
cichórico. Los extractos de ácido cichórico preparados como se
describe en el presente texto contienen típicamente ácido cichórico
en una concentración de aproximadamente 0,2 mg/mL a aproximadamente
2,0 mg/mL. Los extractos de ácido cichórico se concentran
preferentemente a una concentración final de ácido cichórico de
aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 700 mg/mL, más
preferentemente a una concentración de ácido cichórico de
aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 700 mg/mL, lo más
preferentemente a una concentración de ácido cichórico de
aproximadamente 30 mg/mL a aproximadamente 700 mg/mL. El método
actualmente preferido para concentrar extractos de ácido cichórico
es la evaporación. La evaporación se realiza preferentemente a una
temperatura de aproximadamente 10°C a aproximadamente 45°C, durante
un periodo de tiempo de aproximadamente 5 horas a aproximadamente
2,5 días. El vacío aplicado es típicamente de aproximadamente 5
milibares (mbar) a aproximadamente 320 milibares absolutos de
vacío.
En los métodos de preparación de extractos de
Echinacea, las condiciones de extracción de la
Echinacea minimizan preferentemente la degradación de los
polisacáridos, alquilamidas y ácido cichórico. Muchos compuestos de
la Echinacea biológicamente activos son sensibles a la
degradación y cada compuesto o grupo de compuestos es sensible a
diferentes condiciones que pueden causar degradación. Por ejemplo,
el ácido cichórico no es estable en solución. La degradación del
ácido cichórico puede ocurrir rápidamente por oxidación mediada por
fenol oxidasa, por hidrólisis y por degradación química. El calor
también puede provocar la degradación del ácido cichórico. Del
mismo modo, las enzimas vegetales endógenas (tales como glicosido
hidrolasas y amilasas) pueden degradar los polisacáridos por
hidrólisis. Además, los extractos de polisacárido se estropean
fácilmente por el crecimiento de mohos, levaduras y hongos. Las
alquilamidas se degradan rápidamente una vez secadas y
purificadas.
Un método de reducir la degradación de
compuestos biológicamente activos durante la extracción es utilizar
una atmósfera rica en nitrógeno o argón, excluyendo así el oxígeno.
El nitrógeno puede aplicarse purgando intensamente todo el equipo y
los recipientes antes de que se transfiera cualquier líquido.
Además, el gas nitrógeno puede ser burbujeado continuamente a través
de los extractos líquidos de Echinacea durante el
almacenamiento y la extracción. Un control estricto de los
parámetros de proceso, tales como la temperatura y la
concentración, puede contribuir también a reducir la oxidación y la
hidrólisis. Por ejemplo, la hidrólisis enzimática de polisacáridos
para dar restos de monosacáridos ocurre mucho más fácilmente a 74°C
que a 40°C. La hidrólisis química ocurre a una temperatura entre
75°C y 120°C. Manteniendo temperaturas más bajas durante el
tratamiento, puede reducirse al mínimo la hidrólisis. La oxidación
también se reduce mediante temperaturas de tratamiento más bajas.
Otra ayuda en la disminución de la actividad enzimática endógena es
concentrar los extractos líquidos para minimizar el contenido de
agua.
Dado que muchos consumidores demandan que los
productos derivados de hierbas sean producidos solamente con
disolventes no tóxicos, muchos disolventes usados rutinariamente en
el laboratorio, tales como hexano, cloroformo, éteres y cetonas,
preferentemente no se usan en la práctica de la presente invención.
Los métodos para preparar extractos de Echinacea utilizan
agua y etanol como disolventes de extracción, y se utilizan
diferentes mezclas de etanol y agua para extraer diferentes
ingredientes activos de plantas de Echinacea.
Preferentemente, el material vegetal se extrae en un disolvente
líquido en una relación (en peso) de una parte de material vegetal
por cuatro partes de disolvente líquido. Sin embargo, también pueden
hacerse extractos utilizando una relación de material vegetal a
disolvente líquido tan alta como 2 partes de material vegetal por
una parte de disolvente líquido. También se han preparado extractos
de Echinacea utilizando una relación de material vegetal a
disolvente líquido de una parte de material vegetal por veinte
partes de disolvente líquido. Las extracciones con una relación de
material vegetal a disolvente líquido tienen por resultado la
extracción de una mayor cantidad de compuestos activos de la planta
en una forma más diluida. Los extractos diluidos se concentran
preferentemente para alcanzar las concentraciones deseadas de
polisacáridos, alquilamidas y/o ácido cichórico.
Alternativamente, puede usarse dióxido de
carbono supercrítico como disolvente no tóxico para extraer
componentes biológicamente activos de plantas de Echinacea.
El fluido supercrítico se hace circular a través del material
vegetal hasta que la extracción ha tenido lugar todo lo
completamente que se desee. Los extractos de Echinacea
preparados usando fluido supercrítico de dióxido de carbono
contienen en su mayor parte compuestos no polares (tales como
aceites). Otros diversos disolventes de extracción (tales como
propano y acetona) pueden ser añadidos al fluido supercrítico de
dióxido de carbono con el fin de extraer una elevada proporción de
componentes polares pero, para el consumidor consciente de su
salud, solamente es aceptable la adición de agua y etanol.
En general, los recipientes de extracción
utilizados para preparar extractos de Echinacea son grandes
depósitos con una o más aberturas a través de las cuales los
materiales vegetales y los disolventes de extracción pueden ser
fácilmente cargados y retirados. Puede instalarse un mecanismo de
agitación en el recipiente de extracción para que la extracción
tenga lugar con agitación constante con el fin de reducir el tiempo
de extracción. Se han utilizado con éxito recipientes de extracción
tan pequeños como de 500 mL y tan grandes como de 3000 L. Los
recipientes deben estar construidos de materiales resistentes a la
degradación por etanol, preferentemente polipropileno y acero
inoxidable.
En la práctica de los métodos para preparar
extractos de Echinacea, preferentemente los extractos de
Echinacea se concentran para reducir el espacio de
almacenamiento, para aumentar la estabilidad al almacenamiento (es
decir, reduciendo la cantidad de agua) y para conseguir las
concentraciones deseadas de polisacáridos, alquilamidas y ácido
cichórico. La etapa de concentración se optimiza preferentemente
para reducir al mínimo la pérdida de actividad biológica de los
polisacáridos, alquilamidas y ácido cichórico. Dado que las
temperaturas elevadas causan la rápida degradación de muchos
compuestos, la concentración se realiza normalmente a bajas
temperaturas y bajo presión reducida. Normalmente se utiliza un
evaporador rotatorio. Los recipientes de evaporación y reacción
están típicamente en un tamaño entre 20 L y 100 L. Puede
recuperarse entre el 5% y el 90% del disolvente usado para los
extractos.
Los extractos líquidos de Echinacea
pueden ser enriquecidos en uno o más miembros del grupo consistente
en polisacáridos de Echinacea, alquilamidas de
Echinacea y ácido cichórico. Los extractos de
Echinacea enriquecidos en polisacáridos actualmente
preferidos incluyen polisacáridos a una concentración mayor que
aproximadamente 1% (p/v), más preferentemente mayor que
aproximadamente 5% (p/v), y lo más preferentemente mayor que
aproximadamente 10% (p/v). Los extractos de Echinacea
enriquecidos en alquilamidas actualmente preferidos incluyen
alquilamidas a una concentración mayor que aproximadamente 0, (p/v),
más preferentemente mayor que aproximadamente 1,0% (p/v), y lo más
preferentemente mayor que aproximadamente 3,0% (p/v). Los extractos
de Echinacea enriquecidos en ácido cichórico actualmente
preferidos incluyen ácido cichórico a una concentración mayor que
aproximadamente 0,2% (p/v), más preferentemente mayor que
aproximadamente 0,5% (p/v), y lo más preferentemente mayor que
aproximadamente 3,0% (p/v).
Los extractos sólidos de Echinacea pueden
ser enriquecidos en uno o más miembros del grupo consistente en
polisacáridos de Echinacea, alquilamidas de Echinacea
y ácido cichórico. Los extractos de Echinacea enriquecidos
en polisacáridos actualmente preferidos incluyen polisacáridos a
una concentración mayor que aproximadamente 0, más preferentemente
mayor que aproximadamente 0,05% (p/p), y lo más preferentemente
mayor que aproximadamente 20% (p/p). Los extractos de
Echinacea enriquecidos en alquilamidas actualmente preferidos
incluyen alquilamidas a una concentración mayor que aproximadamente
0,001% (p/p), más preferentemente mayor que aproximadamente 0,01%
(p/p), y lo más preferentemente mayor que aproximadamente 0,5%
(p/p). Los extractos de Echinacea enriquecidos en ácido
cichórico actualmente preferidos incluyen ácido cichórico a una
concentración mayor que aproximadamente 0,005% (p/p), más
preferentemente mayor que aproximadamente 0,05% (p/p), y lo más
preferentemente mayor que aproximadamente 1,5% (p/p).
Un extracto de polisacárido de Echinacea
actualmente preferido incluye al menos 60% (en peso) de arabinosa y
galactosa, y las moléculas de polisacárido tienen un peso molecular
mayor que aproximadamente 10.000.
Un extracto de alquilamida de Echinacea
actualmente preferido incluye más de aproximadamente un 70% (p/p)
de isobutilamidas. Un extracto de alquilamida de Echinacea
actualmente más preferido tiene una concentración de isobutilamida
mayor que aproximadamente 70% (p/p) e incluye más de
aproximadamente el 30% (p/p) de 2E, 4E, 8E, 10E/Z
tetraeno-dodeca-isobutilamida.
Pueden formularse composiciones nutricionales
para que proporcionen una dosis estandarizada de al menos dos,
preferentemente tres, componentes de Echinacea. Los
componentes de Echinacea actualmente preferidos son ácido
cichórico, polisacáridos de Echinacea y alquilamidas de
Echinacea. La dosis estandarizada de alquilamidas de
Echinacea actualmente preferida es de aproximadamente 0,01 mg
a aproximadamente 100 mg, más preferentemente de aproximadamente
0,01 mg a aproximadamente 40 mg, lo más preferentemente de
aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 1 mg; la dosis
estandarizada de ácido cichórico actualmente preferida es de
aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 120 mg, más preferentemente
de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 15 mg, lo más
preferentemente de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 3 mg;
la dosis estandarizada de polisacáridos de Echinacea
actualmente preferida es de aproximadamente 1 mg a aproximadamente
500 mg, más preferentemente de aproximadamente 5 mg a
aproximadamente 100 mg, lo más preferentemente de aproximadamente 10
mg a aproximadamente 50 mg.
En el cuarto aspecto, la presente invención
proporciona el uso de una composición de Echinacea en la
elaboración de un medicamento para potenciar la actividad del
sistema inmunitario en un mamífero. La composición se formula para
proporcionar una dosis diaria efectiva de cantidades estandarizadas
de ácido cichórico de Echinacea, alquilamidas de
Echinacea y polisacáridos de Echinacea. Las cantidades
estandarizadas de ácido cichórico de Echinacea son de
40 \mug/Kg de peso corporal a 2000 \mug/Kg de peso corporal, tales como de 120 \mug/Kg de peso corporal a 1000 \mug/Kg de peso corporal (p. ej 800 \mug/Kg de peso corporal). Las cantidades estandarizadas de alquilamidas de Echinacea son de 4 \mug/Kg de peso corporal a 200 \mug/Kg de peso corporal, tal como 12 \mug/Kg de peso corporal a 100 \mug/Kg de peso corporal (p. ej. 80 \mug/Kg de peso corporal). Las cantidades estandarizadas de polisacáridos de Echinacea son de 1 \mug/Kg de peso corporal a 50 mg/Kg de peso corporal, tales como de 3 mg/Kg de peso corporal a 30 mg/Kg de peso corporal (p. ej. 20 mg/Kg de peso corporal). A título de ejemplo no limitante, las composiciones de Echinacea como se describen en el presente texto son útiles para potenciar la actividad fagocítica de los macrófagos, potenciar la producción de óxido nítrico por los macrófagos, potenciar la producción de TNF-\alpha por los macrófagos, potenciar la producción de TNF-\gamma por los esplenocitos, y potenciar la producción de TNF-\alpha por los esplenocitos.
40 \mug/Kg de peso corporal a 2000 \mug/Kg de peso corporal, tales como de 120 \mug/Kg de peso corporal a 1000 \mug/Kg de peso corporal (p. ej 800 \mug/Kg de peso corporal). Las cantidades estandarizadas de alquilamidas de Echinacea son de 4 \mug/Kg de peso corporal a 200 \mug/Kg de peso corporal, tal como 12 \mug/Kg de peso corporal a 100 \mug/Kg de peso corporal (p. ej. 80 \mug/Kg de peso corporal). Las cantidades estandarizadas de polisacáridos de Echinacea son de 1 \mug/Kg de peso corporal a 50 mg/Kg de peso corporal, tales como de 3 mg/Kg de peso corporal a 30 mg/Kg de peso corporal (p. ej. 20 mg/Kg de peso corporal). A título de ejemplo no limitante, las composiciones de Echinacea como se describen en el presente texto son útiles para potenciar la actividad fagocítica de los macrófagos, potenciar la producción de óxido nítrico por los macrófagos, potenciar la producción de TNF-\alpha por los macrófagos, potenciar la producción de TNF-\gamma por los esplenocitos, y potenciar la producción de TNF-\alpha por los esplenocitos.
Los métodos para potenciar la actividad del
sistema inmunitario en un mamífero pueden comprender administrar al
mamífero una dosis diaria efectiva de un extracto de
Echinacea elegido entre el grupo consistente en alquilamidas
de Echinacea y polisacáridos de Echinacea. Las dosis
diarias efectivas representativas de alquilamidas de
Echinacea son de 0,5 \mug/Kg de peso corporal a 200
\mug/Kg de peso corporal, tales como de 12 \mug/Kg de peso
corporal a 100 \mug/Kg de peso corporal (p. ej. 80 \mug/Kg de
peso corporal). Una dosis diaria efectiva de polisacáridos de
Echinacea es útil para potenciar la actividad fagocítica de
los macrófagos, potenciar la producción de óxido nítrico por los
macrófagos y/o potenciar la producción de
TNF-\alpha por los macrófagos.
Las dosis diarias efectivas representativas de
polisacáridos de Echinacea son de 125 \mug/Kg de peso
corporal a
50 mg/Kg de peso corporal, tales como de 3 mg/Kg de peso corporal a 30 mg/Kg de peso corporal (p. ej. 20 mg/Kg de peso corporal). Una dosis diaria efectiva de polisacáridos de Echinacea es útil para potenciar la producción de TNF-\alpha por los macrófagos.
50 mg/Kg de peso corporal, tales como de 3 mg/Kg de peso corporal a 30 mg/Kg de peso corporal (p. ej. 20 mg/Kg de peso corporal). Una dosis diaria efectiva de polisacáridos de Echinacea es útil para potenciar la producción de TNF-\alpha por los macrófagos.
Los ejemplos que siguen simplemente ilustran el
mejor modo que se contempla ahora para llevar a la práctica la
presente invención, pero no han de considerarse como limitantes de
dicha invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Las plantas de Echinacea se cultivan
separadas aproximadamente 61 cm y se riegan una vez por semana hasta
una semana antes de recolectar las flores. Preferentemente se
recolectan las flores de plantas de Echinacea purpurea de
dos y/o tres años de edad. Los conos de la flor de Echinacea
purpurea totalmente madura se recolectan preferentemente a
finales de agosto y típicamente se recogen aproximadamente 700 kg de
flores de un campo de 40,5 áreas (1 acre).
Se maceran 500 kg de flores recién recogidas con
un molino de martillo hasta tamaños de partículas de
aproximadamente 1,5 cm^{3}, o más pequeñas, y después se extraen
con aproximadamente 2000 kg de etanol al 75% durante 72 horas a
35°C. Las concentraciones de etanol y temperaturas más bajas reducen
el rendimiento, mientras que concentraciones de etanol y
temperaturas más altas incrementan los costes. El líquido y el
material vegetal se agitan a 3 revoluciones por minuto con palas
mecánicas rotatorias separadas aproximadamente 20 cm y que salen
radialmente de un eje central en el recipiente de extracción. Al
final del periodo de extracción, se sacan 2300 kg de extracto
líquido de las flores extraídas.
El extracto líquido contiene ahora
aproximadamente 0,6 mg/mL de alquilamidas. La concentración del
extracto líquido a 25 mbar y 40°C durante 30 horas da
aproximadamente 100 kg de concentrado líquido rico en alquilamida
que tiene una concentración de alquilamida de aproximadamente 10
mg/mL. El concentrado se caracteriza por un color verde oscuro,
debido a la presencia de clorofila de la planta, y típicamente
contiene menos de aproximadamente 1 mg/mL de ácido cichórico y
menos de aproximadamente 10 mg/mL de polisacáridos.
Las plántulas se germinan a partir de semillas
seleccionadas no híbridas a finales de febrero y primeros de marzo,
y se trasplantan a campos a mediados o finales de marzo. Las
plantas están separadas aproximadamente 61 cm y se riegan dos veces
por semana hasta la recolección. Se usa mantillo plástico negro
para reducir el crecimiento de malezas y acelerar el crecimiento de
la planta. Las semillas se eligen cuidadosamente ya que la
contaminación con semillas de Echinacea angustifolia (o
semillas de híbridos de E. angustifolia/E. purpurea)
reducirá el rendimiento de ácido cichórico más de 20 veces a causa
del aumento de la degradación enzimática. Las plantas se recolectan
como plantas completas a finales de septiembre y los tallos, hojas
y flores de las plantas se retiran para la extracción. Típicamente,
460 áreas de plantas de Echinacea purpurea dan
aproximadamente 1000 kg de material vegetal. Preferentemente se
recolectan plantas de Echinacea purpurea de un año de
edad.
Se maceran 500 kg de las plantas recién
recolectadas con un molino de martillos para producir tamaños de
partícula de aproximadamente 1,5 cm^{2} a aproximadamente 4
cm^{2}. El material macerado se extrae con 2000 kg de etanol al
50% durante 30 horas a 25°C. Una concentración de etanol más baja
y una temperatura de extracción más alta permiten que aumente la
degradación, mientras que una concentración de etanol más alta y
una temperatura más baja reducen el rendimiento. Continuamente se
purga con gas nitrógeno través del líquido de extracción para
reducir la cantidad de degradación de ácido cichórico. El líquido de
extracción se hace circular a través de la malla vegetal mediante
una bomba rotatoria con una capacidad de hasta 500 L por hora. Al
final del periodo de extracción, pueden obtenerse
2100 kg de extracto líquido que tiene una concentración de ácido cichórico de aproximadamente 2,0 mg/ml.
2100 kg de extracto líquido que tiene una concentración de ácido cichórico de aproximadamente 2,0 mg/ml.
La concentración del extracto líquido a 10 mbar
y 35°C durante 20 horas da 100 kg de concentrado rico en ácido
cichórico que tiene una concentración de ácido cichórico de 30
mg/mL. El concentrado se caracteriza por un color verde oscuro, que
resulta de la presencia de clorofila de la planta, y contiene menos
de 2 mg/mL de alquilamidas y menos de 20 mg/mL de
polisacáridos.
Las plantas se cultivan separadas
aproximadamente 61 cm y se riegan una vez por semana hasta una
semana antes de la recolección. Se recogen los conos de la flor de
Echinacea purpurea totalmente madura a finales de agosto.
Típicamente se recogen aproximadamente 700 kg de flores de un campo
de 40,5 áreas de Echinacea purpurea. Preferentemente se
recogen plantas de Echinacea purpurea de dos o tres
años.
Se maceran 500 kg de flores recién recogidas con
un molino de martillo hasta tamaños de partículas de
aproximadamente 1,5 cm^{3}, o más pequeñas, y después se extraen
con 2000 kg de etanol al 20% durante 72 horas a 55°C. Las
concentraciones de etanol más altas y temperaturas más bajas
reducen el rendimiento, mientras que concentraciones de etanol más
bajas hacen aumentar la carga microbiana del extracto acabado y
temperaturas más altas incrementan los costes. El líquido y el
material vegetal se agitan a 3 revoluciones por minuto con palas
mecánicas rotatorias separadas aproximadamente 20 cm, que salen
radialmente de un eje central en el recipiente de extracción. Al
final del periodo de extracción, se sacan 1900 kg del extracto
líquido de las flores extraídas.
El extracto líquido típicamente contiene ahora
aproximadamente 15 mg/mL de polisacáridos, que pueden concentrarse a
50 mbar y 60°C durante 15 horas para dar aproximadamente 200 kg de
concentrado que tiene una concentración de polisacárido de
aproximadamente 120 mg/mL. El concentrado se caracteriza por un
color marrón oscuro, y típicamente contiene menos de
aproximadamente 2 mg/mL de alquilamidas y menos de aproximadamente
2 mg/mL de ácido cichórico.
El método de ensayo de polisacáridos es una
versión modificada del método expuesto en AOAC Oficial Methods of
Analysis (1995), AOAC Oficial Method 988.12, "Dextran in Raw Cane
Sugar", 44.1.30, "Part E–Phenol-H_{2}SO_{4}
Test". El ensayo de polisacáridos puede llevarse a cabo en tubos
de cultivo desechables de 13 x 100 mm. El volumen final de reacción
del ensayo es 1,5 ml. Se añade a la muestra de polisacárido agua
destilada un volumen de muestra de agua más polisacárido de 400
\mul. Entonces se añaden 100 \mul de una solución al 5% (p/v)
de fenol de calidad reactivo a la muestra de polisacárido diluida,
y se mezcla. Se añade entonces un mililitro de ácido sulfúrico
concentrado (calidad reactivo, 95-98% de
concentración) y se mezcla rápidamente en agitador de vórtice. Los
tubos que contienen las muestras se ponen después en un baño de agua
hirviendo durante dos minutos. Después se deja que los tubos se
enfríen a temperatura ambiente durante 30 minutos y se mide la
absorbancia de las muestras a 485 nanómetros (nm) frente a un
blanco de agua destilada usando un espectrofotómetro. El
espectrofotómetro debe ser capaz de leer con precisión valores de la
absorbancia A_{485} en el margen de 0 a 1,5.
Se prepara un patrón de concentración de
polisacáridos de Echinacea a partir de una extracción en
agua de flores de Echinacea con precipitaciones en etanol de
la manera siguiente. Se obtiene material de polisacárido de
Echinacea concentrado como se describe en el Ejemplo 3 en el
presente texto. El extracto se concentra más a aproximadamente 400
mg/mL de polisacáridos. Este concentrado se precipita después con 4
volúmenes de etanol al 95% a 4°C, durante la noche. El precipitado
se separa mediante centrifugación y se redisuelve en un baño de
agua a 35-40°C. El material que no se disuelve en
esta etapa se desecha y el sobrenadante se precipita con un volumen
de 30% (p/v) de ácido tricloroacético. El precipitado se retira de
nuevo mediante centrifugación y el sobrenadante se precipita con
cuatro volúmenes más de etanol. Los polisacáridos precipitados se
disuelven en soluciones al 2% de acetato sódico y se precipitan por
tercera vez con etanol. El sobrenadante se desecha y el
precipitado se disuelve en agua para diálisis con tubos de diálisis
Spectra/Por® de 10000 de peso molecular como valor de corte. Se
lleva a cabo la diálisis durante tres días y el material restante
se liofiliza para dar un material sólido con aspecto de pelusa.
Se disuelve un peso conocido del polisacárido
liofilizado en un volumen conocido de agua, para dar un patrón de
polisacáridos de Echinacea de concentración conocida. Se
hacen diluciones de la solución patrón de polisacáridos de
Echinacea y se mide la A_{485} de cada dilución con el fin
de construir una curva estándar de absorbancia a 485 nanómetros
frente a la concentración de polisacárido.
El método de ensayo de alquilamidas actualmente
preferido es una modificación del método publicado por Bauer en
Planta Medica, 55, 367-371 (1989). La
fase móvil del método se cambió de acetonitrilo a metanol debido a
problemas de precipitación de la muestra. El método utiliza un HPLC
(cromatografía de líquidos de alto rendimiento) consistente en una
bomba de gradiente, un muestreador automático y un detector de
UV-visible. Preferentemente se utiliza un sistema
HPLC Hewlett Packard Serie 1100 y un sistema HPLC Hewlett Packard
Serie 1050. Se usa una columna C-18, preferentemente
una columna ODS Hypersil de 125 x 4,0 mm, con una columna guarda de
4,0 mm x 4,0 mm coincidente. La fase móvil consiste en 60% de
metanol y 40% de agua (v/v) al inicio del análisis, y cambia de
forma lineal a 95% de metanol y 5% de agua en 12,5 minutos en el
análisis. El tiempo total de funcionamiento es 19,0 minutos con 4
minutos de equilibrado post-funcionamiento. La fase
móvil se bombea a 1,0 mL/minuto. Se inyectan muestras de 10 pL y se
mide la absorbancia de la muestra a 254 nm. Las alquilamidas eluyen
de la columna a un tiempo entre 2,0 minutos y 9,0 minutos. Más
específicamente, la isobutilamida del ácido
dodeca-2E, 4E, 8E, 10E/Z-tetranoico
eluye a tiempos entre 5,0 y 8,0 minutos.
Un patrón de concentración de alquilamida se
prepara preferentemente extrayendo 500 ml de concentrado líquido
rico en alquilamida, preparado como se describe en el Ejemplo 3 en
el presente texto, con 500 ml de éter de petróleo, a temperatura
ambiente. La fracción de éter de petróleo se retira al cabo de un
día y se evapora a sequedad bajo vacío, y resulta un residuo oleoso
negro oscuro. El residuo se disuelve en el mínimo de metanol
(aproximadamente 20 mL) y se centrifuga para separar los
precipitados. Sílice funcionalizada con octadecilo se instala en una
columna de vidrio. Se usa para la elución una fase móvil consistente
en 70% de metanol y 30% de agua en volumen. El material preparado a
partir del concentrado líquido se aplica a la columna y se recogen
fracciones de 10 mL. En las fracciones se analiza el contenido de
alquilamida usando el método de análisis descrito y se reúnen las
fracciones que contienen una pureza de la alquilamida de interés
del 90% y superior. Las fracciones reunidas se evaporan en
evaporador rotatorio a 45°C para reducir el volumen total. Las
fracciones de alquilamida purificadas de la elución de la columna se
evaporan bajo vacío para dar un líquido transparente (de color
amarillo). Se añade éter de petróleo al residuo y se calienta en un
baño de agua caliente. El residuo y el líquido se tratan con
ultrasonidos para saturar la solución con la alquilamida
purificada. La solución saturada se recoge y se deja enfriar a
temperatura ambiente. Después la solución se traslada a un
congelador a -20°C. Se forman cristales durante la noche. 500 mL de
solución saturada dan aproximadamente 0,1 a 5 g de cristales
purificados, dependiendo de la solubilidad de la alquilamida
específica.
El patrón de alquilamida purificada se disuelve
a varias concentraciones y se hace pasar por una columna de HPLC
como se describe en el presente texto. Se construye una curva de
calibración a partir de las áreas de los picos resultantes frente a
las concentraciones de las soluciones patrón de alquilamida. Las
áreas de los picos de las muestras de alquilamida de concentración
desconocida se comparan frente a la curva de calibración para
determinar la concentración de cada muestra.
El método de análisis de ácido cichórico es una
modificación del método publicado por Bauer en Planta Medica,
57, 447-449 (1991). La fase móvil del método
se cambió de acetonitrilo a metanol debido a problemas de
precipitación de la muestra. El método utiliza una HPLC
(cromatografía de líquidos de alto rendimiento) consistente en una
bomba de gradiente, un muestreador automático y un detector de
UV-visible. En este caso, se utiliza un sistema HPLC
Hewlett Packard Serie 1100 y un sistema HPLC Hewlett Packard Serie
1050. Se usa una columna C-18, en este caso una
columna ODS Hypersil de 125 x 4,0 mm, con una columna guarda en
coincidencia de 4,0 mm x 4,0 mm. La fase móvil consiste en 7,0% de
metanol y 93,0% de agua con 0,1% de ácido fosfórico (v/v) al inicio
del análisis, y cambia de forma lineal a 32% de metanol y 68% de
agua con 0,1% de ácido fosfórico (v/v) a los 11,6 minutos en el
análisis, que después cambia a 40,7% de metanol y 59,3% de agua con
0,1% de ácido fosfórico a los 19,1 minutos. El tiempo total de
funcionamiento es 22,0 minutos con 3,5 minutos de equilibrado
post-funcionamiento. La fase móvil se bombea a 1,0
mL/minuto. Se inyectan muestras de 10 pL y se recogen los datos a
330 nm. El área de pico de la muestra se compara frente a un patrón
químico purificado para cuantificación. Los derivados del ácido
cafeico eluyen de la columna a tiempos entre 7,0 minutos y 18,0
minutos. Más específicamente, el ácido cichórico eluye entre 14,5 y
17,0 minutos.
Se prepara un patrón de concentración de ácido
cichórico de la siguiente manera. El concentrado líquido de ácido
cichórico, preparado como se describe en el Ejemplo 2 en el
presente texto, se reduce en volumen aún más mediante destilación a
vacío a 50°C. Los polisacáridos se separan por precipitación con
isopropanol usando 2 partes de isopropanol y 1 parte de concentrado
de destilado. Se separa el sobrenadante y se evapora el isopropanol
mediante destilación bajo vacío a 37°C. Se añade agua destilada a
dos veces el volumen del concentrado y se ajusta el pH del
concentrado en pH 0-1 con ácido clorhídrico
concentrado. El ácido cichórico se purifica más mediante elución a
través de una columna lipófila de Sephadex LH-20
con metanol al 100% como fase móvil. Las fracciones con una pureza
en ácido cichórico de más del 90%, según análisis por el método
descrito anteriormente, se reúnen. Las fracciones reunidas se
reducen a sequedad bajo vacío y después se redisuelven en una
cantidad mínima de agua hirviendo. El ácido cichórico se separa por
cristalización en forma de agujas blancas cortas al enfriarse.
El patrón de ácido cichórico purificado se
disuelve a varias concentraciones y se pasa a través de una columna
de HPLC como se describe en el presente texto. Se construye una
curva de calibración a partir de las áreas de los picos resultantes
frente a las concentraciones de las soluciones patrón de ácido
cichórico. Las áreas de los picos de muestras de ácido cichórico de
concentración desconocida se comparan frente a la curva de
calibración para determinar la concentración de cada muestra.
A título de ejemplo representativo, se preparan
composiciones comerciales mezcladas de Echinacea de la
presente invención de la manera siguiente. Un concentrado rico en
alquilamida (preparado de acuerdo con el Ejemplo 1, en el presente
texto), un concentrado rico en ácido cichórico (preparado de
acuerdo con el Ejemplo 2, en el presente texto), y un concentrado
rico en polisacárido (preparado de acuerdo con el Ejemplo 3, en el
presente texto), se combinan en las relaciones en volumen
0,4:0,2:0,4, respectivamente. Los concentrados se mezclan con un
mezclador motorizado para obtener un producto homogéneo. En una
realización actualmente preferida, este concentrado líquido
combinado contiene 5,2 mg/mL de alquilamidas, 7,2 mm/ml de ácido
cichórico y 56 mg/ml de polisacáridos. Esta composición mezclada se
usa para preparar composiciones comerciales de Echinacea de
la forma siguiente:
- (a)
- Se prepara una composición líquida comercial de Echinacea libre de alcohol evaporando más la composición mezclada de Echinacea para eliminar el etanol, y diluyendo después la composición evaporada diez veces añadiendo nueve veces el volumen de glicerina al 70% (p/p). El material resultante se mezcla intensamente para dar un producto que contiene 0,52 mg/mL de alquilamidas, 0,72 mg/mL de ácido cichórico, y 5,6 mg/mL de polisacáridos.
- (b)
- Se prepara una composición líquida comercial de Echinacea diluyendo 10 veces la composición mezclada de Echinacea mediante la adición de 9 veces el volumen de etanol al 40% (p/p). El material resultante se mezcla intensamente para dar un producto que contiene 0,52 mg/mL de alquilamidas, 0,72 mg/mL de ácido cichórico, y 5,6 mg/mL de polisacáridos.
- (c)
- Se preparan cápsulas de gelatina blanda líquida comercial de Echinacea diluyendo 10 veces la composición mezclada de Echinacea mediante la adición de 9 veces el volumen de una mezcla de 30% de lecitina y 70% de aceite de soja. El material resultante se mezcla intensamente y después se encapsula en cápsulas de gelatina blanda a razón de 1,0 mL por cápsula para dar un producto que contiene 0,52 mg de alquilamidas por cápsula, 0,72 mg de ácido cichórico por cápsula, y 5,6 mg de polisacáridos por cápsula.
- (d)
- Se preparan polvos liofilizados de Echinacea mezclando la composición de Echinacea mezclada con 9 veces su volumen de agua, y después liofilizando con fosfato tricálcico al 10% (p/p) como vehículo. Se obtiene una torta seca después de 30 horas de liofilización. Se obtiene un polvo suelto, una vez que las tortas liofilizadas se muelen a través de un molino de cono de 100 pm, que incluye 2,6 mg/g de alquilamidas, 3,6 mg/g de ácido cichórico y 2,8 mg/g de polisacáridos.
- (e)
- Se preparan polvos de Echinacea microencapsulados mezclando la composición de Echinacea mezclada con 1% (v/v) de vitamina E para la estabilidad y después microencapsulando la mezcla con un recubrimiento de celulosa y cera a 50% de llenado (p/p) con cápsulas que tienen un promedio de tamaño de 100 pm. Las microcápsulas aparecen como un polvo suelto (fluible) con una composición de 2,6 mg/g de alquilamidas, 3,6 mg/g de ácido cichórico y 2,8 mg/g de polisacáridos.
- (f)
- Se preparan cápsulas de gelatina dura de Echinacea mezclando el polvo liofilizado (descrito en la sección (d) de este ejemplo) o el polvo microencapsulado (descrito en la sección (e) de este ejemplo) con cinco partes en peso de celulosa microcristalina y 2% (p/p) de estearato de magnesio. El polvo resultante se encapsula en cápsulas de 1000 mg para proporcionar 0,52 mg de alquilamidas por cápsula, 0,72 mg de ácido cichórico por cápsula y 5,6 mg de polisacáridos por cápsula.
- (g)
- Se preparan comprimidos de Echinacea mezclando el polvo liofilizado (descrito en la sección (d) de este ejemplo) o el polvo microencapsulado (descrito en la sección (e) de este ejemplo) con tres partes (en peso) de fosfato dicálcico, dos partes (en peso) de celulosa microcristalina y 3% (p/p) de estearato de magnesio. El polvo resultante se prensa en comprimidos de 1000 mg para proporcionar 0,52 mg de alquilamidas por comprimido, 0,72 mg de ácido cichórico por comprimido y 5,6 mg de polisacáridos por comprimido.
Los datos expuestos en estos ejemplos indican
que los extractos y composiciones de Echinacea de la
presente invención estimulan varios aspectos del sistema inmunitario
de la rata.
Mantenimiento de los animales y muestreo de
los tejidos. Ratas Sprague-Dawley jóvenes,
adultas y machos (de aproximadamente 240 g cada una) fueron
aclimatadas en el laboratorio durante una semana antes de
administrar el material de ensayo. Cien microlitros del material de
ensayo de varias concentraciones, como se especifica en el presente
texto, fueron administrados a cada animal a través de una sonda de
cebado, dos veces al día durante 4 días. Se sacaron muestras de
sangre y tejidos de los animales el quinto día, para su análisis.
Cada grupo de ensayo incluía ocho animales cuyos resultados de
ensayo fueron promediados.
Material de ensayo: La muestra testigo
administrada a los animales era una mezcla de etanol y agua. Uno de
los siguientes materiales de ensayo fue administrado a cada animal
(los niveles de dosis, expresados como microgramos (jig) de
material de ensayo por kilogramo (kg) de peso corporal del animal de
ensayo, se exponen en la Tabla 1): uno de cuatro niveles de dosis
de extracto de alquilamida de Echinacea, uno de cuatro
niveles de dosis de extracto de ácido cichórico de
Echinacea, uno de cuatro niveles de dosis de extracto de
polisacárido de Echinacea, o uno de cuatro niveles de dosis
de una composición de Echinacea que incluye extractos de
alquilamida, ácido cichórico y polisacáridos de
Echinacea.
La composición de Echinacea contenía los
tres extractos listados en la Tabla 1 en las cantidades
especificadas para la dosis diaria. Por ejemplo, la dosificación
diaria de nivel 1 de la composición de Echinacea, que no
está incluida en el alcance de la presente invención, proporcionó
0,5 \mug/kg de alquilamida, 5,0 \mug/kg de ácido cichórico
y
125 \mug/kg de polisacáridos. La composición de Echinacea se preparó mezclando los tres extractos de Echinacea purpurea (alquilamidas, ácido cichórico y polisacáridos) que fueron preparados como se describe en los Ejemplos 1-3 en el presente texto.
125 \mug/kg de polisacáridos. La composición de Echinacea se preparó mezclando los tres extractos de Echinacea purpurea (alquilamidas, ácido cichórico y polisacáridos) que fueron preparados como se describe en los Ejemplos 1-3 en el presente texto.
Tratamiento de la sangre: Se obtuvo la
sangre de los animales de ensayo mediante punción cardíaca y se
guardó en un tubo vacutainer con EDTA, que se centrifugó a 3000 rpm
durante 10 minutos para separar el plasma. El plasma se almacenó en
un tubo de plástico con tapón a -30°C hasta su uso.
Preparación de los esplenocitos: Los
bazos de los animales se prensaron a través de una malla de nilón en
solución fría de Krebs-Ringer-HEPES
(KRH) suplementada con 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA), y se
recogieron en tubos de 50 mL. Las células recogidas fueron entonces
centrifugadas a 4°C durante 10 minutos a 2000 rpm, y se decantó el
sobrenadante. Se añadió a las células un mililitro de tampón para
lisis ACK (que contiene cloruro de aluminio y potasio). Las células
se lavaron después dos veces con 50 mL de KRH + BSA. Después se
resuspendieron las células en 1 mL de CCM (Complete Culture Médium:
medio de cultivo completo que contiene RPMI-1640 y
4% de suero de ternera fetal. El RPMI-1640 es un
sistema tampón basado en bicarbonato desarrollado por Moore y Woods
como se describe en Tissue Culture Association Manual, 3:
503-508 (1976)) con penicilina, estreptomicina,
anfotericina, glutamina, 2-mercaptoetanol y HEPES,
cada uno de los cuales componentes estaban presentes en una
concentración de 1% (v/v). Las células se diluyeron a
3,0-5,0 x 10^{6}/mL y se activaron con 20 pL de
Concanavalina A (ConA) (10 \mug/mL) y se incubaron durante 48
horas. Al cabo de 48 horas, las células se centrifugaron y el
sobrenadante se recogió y se congeló a -30°C para ensayos de
citosina y óxido nítrico.
Preparación de macrófagos alveolares: Se
obtuvieron los macrófagos alveolares por lavado broncoalveolar con
40 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células
se centrifugaron a 4°C durante 20 minutos a 2000 rpm y se desechó
el sobrenadante. Entonces se añadió 1 mL de ACK y después se lavó
tres veces con PBS fría. Las células se suspendieron después en 1
mL de RPMI suplementado con 10% de suero de ternera fetal. Las
células se diluyeron a 5-10 x 10^{6} células/mL,
y 100 \muL de las células diluidas se incubaron durante 2 horas a
37°C en placas de microtítulo de fondo en V. El sobrenadante se
desechó y las placas de microtitulo se lavaron 3 veces con PBS. Se
añadieron 200 \muL de LPS para activar las células y después se
incubaron las células durante 24 horas. El sobrenadante se recogió
después de la incubación y se congeló a -30°C para ensayos de
citocina y óxido nítrico.
Ensayo de fagocitosis: Los macrófagos se
incubaron durante 3 horas a 37°C para adhesión. Después se lavaron 3
veces con RPMI al 10% y se añadieron esferas de látex a una
concentración de 2,5 x 10^{6} esferas/200 \muL. Las células se
incubaron durante una hora más y se lavaron 5 veces con RPMI. Se
tiñeron las células y se determinó la fagocitosis mediante examen
microscópico.
Ensayo del óxido nítrico: Se preparó una
solución madre de nitrito sódico 4 mM y se diluyó a 1 mM con tampón
de CCM al 4% inmediatamente antes de usarla. La solución madre de
nitrito sódico se usó a varias concentraciones para construir una
curva de calibración lineal. Se preparó reactivo de Griess
disolviendo 0,5 g de sulfanilamida y
6 mL de ácido fosfórico al 85% en 100 mL de agua, y disolviendo 0,05 g de N-(1-naftil)etil-endiamina en 100 mL de agua. Los sobrenadantes de los macrófagos o los esplenocitos se añadieron al reactivo de Griess y se dejaron reposar durante 10 minutos. Se midió la absorbancia a 540 nm y la concentración de óxido nítrico se calculó a partir de la curva estándar de nitrito sódico.
6 mL de ácido fosfórico al 85% en 100 mL de agua, y disolviendo 0,05 g de N-(1-naftil)etil-endiamina en 100 mL de agua. Los sobrenadantes de los macrófagos o los esplenocitos se añadieron al reactivo de Griess y se dejaron reposar durante 10 minutos. Se midió la absorbancia a 540 nm y la concentración de óxido nítrico se calculó a partir de la curva estándar de nitrito sódico.
Ensayos de TNF-\alpha,
INF-\gamma e Interleucina-2.
Los anticuerpos se obtuvieron de uno cualquiera de los
suministradores siguientes: Sigma Chemicals, Box 14508 St. Louis,
Missouri 63178, EE.UU.; R&D Systems, o PharMagen, 6300 Kitimat
Road, Unit 1, Mississauga, Ontario L5N 5M1, Canadá. Los ensayos se
llevaron a cabo usando un protocolo estándar de ELISA.
Efectos de las composiciones de
Echinacea de la invención y extractos sobre la actividad
fagocítica y el índice fagocitico en macrófagos alveolares:
Como se muestra en la Figura 1, todos los niveles de dosificación
(niveles 2 a 5 como se exponen en la Tabla 1) de la composición de
Echinacea descrita en este ejemplo produjeron un aumento en
la actividad fagocítica y el índice fagocítico de macrófagos
alveolares. Como se muestra más claramente en la Figura 2, a medida
que aumenta la dosificación también lo hace la magnitud del efecto
sobre la actividad fagocítica y el índice fagocítico.
Como se muestra en la Figura 3, un extracto de
ácido cichórico de Echinacea, preparado como se describe en
el Ejemplo 2 en el presente texto y administrado a ratas a los
niveles de dosificación 1-4 como se exponen en la
Tabla 1, no tuvo efecto significativo sobre la actividad fagocítica
ni sobre el índice fagocítico de macrófagos alveolares de la rata.
Del mismo modo, como se muestra en la Figura 4, un extracto de
polisacárido de Echinacea, preparado como se describe en el
Ejemplo 3 en el presente texto y administrado a ratas a los niveles
de dosificación 1-4 como se exponen en la Tabla 1,
no tuvo efecto significativo sobre la actividad fagocítica ni sobre
el índice fagocítico de macrófagos alveolares de la rata.
En cambio, como se muestra en la Figura 5, un
extracto de alquilamidas de Echinacea, preparado como se
describe en el Ejemplo 1 en el presente texto y administrado a
ratas a los niveles de dosificación 1-4 como se
exponen en la Tabla 1, potenció tanto la actividad fagocítica como
el índice fagocítico de macrófagos alveolares de la rata,
comparando con ratas testigo tratadas con una mezcla de etanol y
agua. En particular, al nivel de dosis 3 el extracto de alquilamida
incrementó de forma significativa tanto la actividad como el índice
fagocítico de los macrófagos, con un aumento de hasta el 60% de la
actividad y un aumento del índice del 50%, en comparación con los
testigos. La Figura 6 muestra una comparación del efecto sobre el
índice fagocítico de la composición de Echinacea descrita en
este Ejemplo, y los extractos individuales de ácido cichórico,
alquilamida y polisacárido de Echinacea. De la Figura 6 está
claro que la composición de Echinacea mostró una actividad
sinérgica estadísticamente significativa en comparación con los
compuestos individuales.
Efectos de las composiciones de
Echinacea de la presente invención y extractos sobre la
producción de óxido nítrico por los macrófagos alveolares: Como
se muestra en la Figura 1, los niveles de dosificación
3-5, como se exponen en la Tabla 1, de la
composición de Echinacea descrita en este Ejemplo,
produjeron un aumento en la producción de óxido nítrico por los
macrófagos alveolares. A medida que aumentó la dosificación, hizo
lo mismo la magnitud del nivel de óxido nítrico.
Como se muestra en la Figuras 3 y 4, los
extractos de ácido cichórico y polisacárido de Echinacea
preparados como se describe en los Ejemplos 2 y 3 en el presente
texto, no hicieron aumentar significativamente el nivel de
producción de óxido nítrico por los macrófagos alveolares. En
cambio, como se muestra en la Figura 5, los niveles de dosificación
1-4 (especialmente los niveles de dosificación 3 y
4) de un extracto de alquilamidas de Echinacea, preparado
como se describe en el Ejemplo 1 en el presente texto, produjeron
un aumento significativo en el nivel de óxido nítrico producido por
los macrófagos alveolares.
Efectos de composiciones de Echinacea
de la invención y extractos sobre la producción de
TNF-\alpha en macrófagos: Como se muestra en
la Figura 1, la composición de Echinacea descrita en este
Ejemplo produjo un aumento en la producción de
TNF-\alpha por los macrófagos alveolares en
dosificaciones por encima del nivel 4. Inicialmente la producción de
TNF-\alpha aumenta al aumentar la dosificación de
la composición de Echinacea, y después la respuesta
disminuye. Como se muestra en la Figura 7, la dosificación óptima
de composición de Echinacea está entre el Nivel 3 y el Nivel
4.
Como se muestra en la Figura 3, el extracto de
ácido cichórico de Echinacea, preparado como se describe en
el Ejemplo 2 en el presente texto, no aumentó significativamente el
nivel de producción de TNF-\alpha por los
macrófagos alveolares. En cambio, como se muestra en las Figuras 4
y 5, el extracto de polisacárido de Echinacea y el extracto
de alquilamida de Echinacea, preparados como se describe en
los Ejemplos 3 y 1 en el presente texto, causaron ambos un aumento
significativo en el nivel de TNF-\alpha producido
por los macrófagos alveolares. El efecto estimulador del extracto
de alquilamida fue especialmente intenso en el nivel de
dosificación 3. Sin embargo, en el nivel 4 de dosificación de
alquilamida, la producción de TNF-\alpha volvió a
ser la de los testigos. Esto podría ser una consecuencia del
aumento pronunciado de la producción de óxido nítrico a esta
dosis.
Efectos de las composiciones de
Echinacea de la presente invención y extractos sobre la
producción de IFN-\gamma en los esplenocitos:
Como se muestra en la Figura 1, todos los niveles de dosificación
(niveles 2 a 5 como se exponen en la Tabla 1) de la composición de
Echinacea descrita en este Ejemplo causaron un aumento en la
producción de IFN-\gamma por los esplenocitos.
Los efectos más pronunciados fueron en los niveles de dosificación
4 y 5.
Como se muestra en las Figuras 3 a 5, los
extractos de ácido cichórico, alquilamida y polisacárido de
Echinacea no causaron un aumento significativo en la
producción de IFN-\gamma por los
esplenocitos.
Efectos de las composiciones de
Echinacea de la presente invención y extractos sobre la
producción de TNF-\alpha en los esplenocitos:
Como se muestra en la Figura 1, el nivel de dosificación 5 de la
composición de Echinacea descrita en este Ejemplo causó un
aumento significativo en la producción de
TNF-\alpha por los esplenocitos.
Efectos de las composiciones de
Echinacea de la presente invención y extractos sobre la
producción de IL-2 en los esplenocitos: Como se
muestra en la Figura 1, los niveles de dosificación 2 y 3 de la
composición de Echinacea descrita en este Ejemplo suprimió
la producción de IL-2 en los esplenocitos, mientras
que los niveles de dosificación 4 y 5 dieron un valor próximo al de
los testigos para la producción de IL-2. El efecto
supresor se observa con mayor claridad en la Figura 8, que muestra
una representación de la producción de IL-2 por los
esplenocitos de rata frente a la concentración relativa de la
composición de Echinacea. La supresión de la
IL-2 tiene por resultado la supresión de la
respuesta inflamatoria que puede reducir la gravedad de los
síntomas de las enfermedades inflamatorias (y puede mejorar los
síntomas de la diabetes de aparición tardía).
Como se muestra en las Figuras 3 a 5, los
extractos de ácido cichórico, alquilamida y polisacárido de
Echinacea no afectaron a la producción de
IL-2 en los esplenocitos.
Claims (16)
1. Una composición de Echinacea que
comprende de 0,2 mg/ml a 500 mg/ml de ácido cichórico, de 0,02
mg/mL a 50 mg/ml de alquilamidas de Echinacea, y de 5,6
mg/ml a 800 mg/ml de polisacáridos de Echinacea, estando
dicha composición en forma líquida.
2. La composición de Echinacea según la
reivindicación 1ª, que comprende de 0,3 mg/ml a 30 mg/ml de ácido
cichórico, de 0,05 mg/mL a 50 mg/ml de alquilamidas de
Echinacea, y de 20 mg/ml a 800 mg/ml de polisacáridos de
Echinacea.
3. La composición de Echinacea según la
reivindicación 2ª, que comprende de 5 mg/ml a 30 mg/ml de ácido
cichórico, de 0,8 mg/mL a 50 mg/ml de alquilamidas de
Echinacea, y de 50 mg/ml a 800 mg/ml de polisacáridos de
Echinacea.
4. Una composición de Echinacea que
comprende de 0,01 mg/g a 500 mg/g de ácido cichórico, de 0,005 mg/g
a 100 mg/g de alquilamidas de Echinacea, y de 5 mg/g a 900
mg/g de polisacáridos de Echinacea, estando dicha composición
en forma sólida o de gel.
5. La composición de Echinacea según la
reivindicación 4ª, que comprende de 0,05 mg/g a 500 mg/g de ácido
cichórico, de 0,01 mg/g a 100 mg/g de alquilamidas de
Echinacea, y de 10 mg/g a 900 mg/g de polisacáridos de
Echinacea.
6. La composición de Echinacea según la
reivindicación 5ª, que comprende de 15 mg/g a 500 mg/g de ácido
cichórico, de 5 mg/g a 100 mg/g de alquilamidas de Echinacea,
y de 200 mg/g a 900 mg/g de polisacáridos de Echinacea.
7. Un método para preparar una composición de
Echinacea que comprende combinar una cantidad de ácido
cichórico, una cantidad de alquilamidas de Echinacea y una
cantidad de polisacáridos de Echinacea para dar una
composición de Echinacea que incluye de 0,2 mg/ml a 500
mg/ml de ácido cichórico, de 0,02 mg/mL a 50 mg/ml de alquilamidas
de Echinacea, y de 10 mg/ml a 800 mg/ml de polisacáridos de
Echinacea, o de 0,01 mg/g a 500 mg/g de ácido cichórico, de
0,005 mg/g a 100 mg/g de alquilamidas de Echinacea, y de 5
mg/g a 900 mg/g de polisacáridos de Echinacea.
8. Una composición de Echinacea según una
cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 6ª para ser usada en la
potenciación de la actividad del sistema inmunitario en un
mamífero.
9. El uso de una composición de Echinacea
en la elaboración de un medicamento para potenciar la actividad del
sistema inmunitario en un mamífero, en donde la composición de
Echinacea se formula para que proporcione una dosificación
diaria de 40 \mug/Kg de peso corporal a 2000 \mug/Kg de peso
corporal de ácido cichórico, de 4 \mug/Kg de peso corporal a 200
\mug/Kg de peso corporal de alquilamidas de Echinacea y de
1 mg/Kg de peso corporal a 50 mg/Kg de peso corporal de
polisacáridos de Echinacea.
10. El uso según la reivindicación 9ª, en el que
dicha dosificación diaria de ácido cichórico de Echinacea es
de
120 \mug/Kg de peso corporal a 1000 \mug/Kg de peso corporal, dicha dosificación diaria de alquilamidas de Echinacea es de 12 \mug/Kg de peso corporal a 100 \mug/Kg de peso corporal y dicha dosificación diaria de polisacáridos de Echinacea es de 3 mg/Kg de peso corporal a 30 mg/Kg de peso corporal.
120 \mug/Kg de peso corporal a 1000 \mug/Kg de peso corporal, dicha dosificación diaria de alquilamidas de Echinacea es de 12 \mug/Kg de peso corporal a 100 \mug/Kg de peso corporal y dicha dosificación diaria de polisacáridos de Echinacea es de 3 mg/Kg de peso corporal a 30 mg/Kg de peso corporal.
11. El uso según la reivindicación 10ª, en el
que dicha dosificación diaria de ácido cichórico de Echinacea
es
800 \mug/Kg de peso corporal, dicha dosificación diaria de alquilamidas de Echinacea es de 80 \mug/Kg de peso corporal y dicha dosificación diaria de polisacáridos de Echinacea es de 20 mg/Kg de peso corporal.
800 \mug/Kg de peso corporal, dicha dosificación diaria de alquilamidas de Echinacea es de 80 \mug/Kg de peso corporal y dicha dosificación diaria de polisacáridos de Echinacea es de 20 mg/Kg de peso corporal.
12. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 8ª a 11ª, en el que dicho medicamento es para
potenciar la actividad fagocítica de los macrófagos.
13. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 8ª a 11ª, en el que dicho medicamento es para
potenciar la producción de óxido nítrico de los macrófagos.
14. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 8ª a 11ª, en el que dicho medicamento es para
potenciar la producción de TNF-\alpha por los
macrófagos.
15. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 8ª a 11ª, en el que dicho medicamento es para
potenciar la producción de IFN-\gamma por los
esplenocitos.
16. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 8ª a 11ª, en el que dicho medicamento es para
potenciar la producción de TNF-\alpha por los
esplenocitos.
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