ES2303512T3 - Suplemento de echinacea y metodo de fabricacion. - Google Patents

Suplemento de echinacea y metodo de fabricacion. Download PDF

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Richard E. Barton
Jan V. Slama
Chuck C. Chang
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Abstract

Una composición de Echinacea que comprende de 0,2 mg/ml a 500 mg/ml de ácido cichórico, de 0,02 mg/mL a 50 mg/ml de alquilamidas de Echinacea, y de 5,6 mg/ml a 800 mg/ml de polisacáridos de Echinacea, estando dicha composición en forma líquida.

Description

Suplemento de Echinacea y método de fabricación.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a suplementos nutricionales preparados a partir de plantas del género Echinacea.
Fundamento de la invención
Numerosos estudios atestiguan las propiedades saludables de extractos derivados de plantas del género Echinacea. Véase, p. ej., A. Awang y D. Kindack, Canadian Pharmaceutical Journal, 124: 512-516 (1991). Hay un robusto mercado comercial para composiciones de Echinacea que contienen componentes biológicamente activos que se cree que favorecen la buena salud. Además, es deseable formular composiciones de Echinacea que contengan cantidades estandarizadas de componentes biológicamente activos derivados de plantas Echinacea. Tales composiciones de Echinacea estandarizadas proporcionan al consumidor una dosis efectiva consistente de uno o más componentes de Echinacea biológicamente activos.
En particular, hay un importante mercado comercial de extractos de Echinacea que contienen una elevada concentración de uno o más componentes de Echinacea biológicamente activos que se cree que promueven la buena salud. Tales extractos altamente enriquecidos pueden usarse directamente como suplementos dietéticos o pueden ser mezclados con otros extractos de Echinacea para preparar suplementos dietéticos que contienen cantidades estandarizadas de componentes de Echinacea biológicamente activos.
Hay estudios científicos que indican que los polisacáridos, las alquilamidas y el ácido cichórico (un derivado del ácido cafeico también conocido como ácido cichórico, ácido 2,3-o-di-cafeoil-tartárico) derivados de Echinacea poseen cada uno de ellos propiedades saludables. Por ejemplo, se ha demostrado que las alquilamidas de Echinacea estimulan la fagocitosis en granulocitos de ratones a concentraciones de aproximadamente 0,1 partes por millón (ppm). Bauer, R. et al., Arzneim.-Forsch./Drug Research, 38: 276-281 (1988). Del mismo modo, se ha demostrado que el ácido cichórico aumenta la fagocitosis en granulocitos, y puede estimular el sistema inmunitario a concentraciones tan bajas como 0,01 ppm. Véase, p. ej., A. Awang et al., supra. Se ha demostrado que los polisacáridos de Echinacea inhiben la hialouronidasa, aumentan la fagocitosis, inducen la liberación de interferón-6 y potencian la resistencia contra la infección por C. albicans en ratones. Véase, p. ej., A. Awang et al., supra; Wagner, H. et al. Arzneim.-Forsch./Drug Research, 35: 1069-1075 (1985).
Numerosos factores han de ser considerados y optimizados con el fin de producir extractos de Echinacea que tienen una elevada concentración de polisacáridos, alquilamidas y/o ácido cichórico. Por ejemplo, las cantidades de polisacáridos, alquilamidas y ácido cichórico en las plantas de Echinacea están influidas por la especie de la planta, su edad y sus condiciones de crecimiento. Adicionalmente, los disolventes y los parámetros del proceso tales como la temperatura y la duración del periodo de extracción utilizado para extraer los polisacáridos, las alquilamidas y el ácido cichórico de las plantas de Echinacea, pueden afectar en gran medida al rendimiento de estos componentes.
Así pues, existe la necesidad de métodos para extraer eficientemente polisacáridos, alquilamidas y ácido cichórico de las plantas de Echinacea, y de extractos de Echinacea que contengan una elevada concentración de polisacáridos, alquilamidas y/o ácido cichórico. Además, existe la necesidad de composiciones de Echinacea estandarizadas que contengan una cantidad predeterminada y deseada de extractos de Echinacea, incluyendo extractos de polisacáridos, alquilamida y/o ácido cichórico.
Sumario de la invención
En un primer aspecto, la invención proporciona una composición de Echinacea que comprende de 0,2 mg/ml a 500 mg/ml de ácido cichórico, de 0,02 mg/ml a 50 mg/ml de alquilamidas de Echinacea, y de 5,6 mg/ml a 800 mg/ml de polisacáridos de Echinacea, en donde dicha composición está en forma líquida.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición de Echinacea que comprende de
0,01 mg/g a 5,6 mg/g de ácido cichórico, de 0,005 mg/g a 100 mg/g de alquilamidas de Echinacea, y de 5 mg/g a
900 mg/g de polisacáridos de Echinacea, en donde dicha composición está en forma sólida o de gel.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un método para preparar una composición de Echinacea que comprende combinar una cantidad de ácido cichórico, una cantidad de alquilamidas de Echinacea y una cantidad de polisacáridos de Echinacea para dar una composición de Echinacea que incluye de 0,2 mg/ml a 500 mg/ml de ácido cichórico, de 0,02 mg/ml a 50 mg/ml de alquilamidas de Echinacea y de 10 mg/ml a 800 mg/ml de polisacáridos de Echinacea, o de 0,01 mg/g a 500 mg/g de ácido cichórico, de 0,005 mg/g a 100 mg/g de alquilamidas de Echinacea y de 5 mg/g a 900 mg/g de polisacáridos de Echinacea.
Las composiciones de Echinacea de la presente invención incluyen cantidades estandarizadas de al menos tres componentes de Echinacea. En este contexto, la expresión "cantidad estandarizada", o sus equivalentes gramaticales, significa una cantidad deseada y cuantificada de un componente de Echinacea. Los componentes de Echinacea actualmente preferidos son polisacáridos de Echinacea, alquilamidas de Echinacea y ácido cichórico. Los extractos de Echinacea actualmente preferidos, útiles para preparar las composiciones de Echinacea de la presente invención, son extractos enriquecidos en ácido cichórico (lo más preferentemente ácido cichórico preparado como se describe en el presente texto), alquilamidas de Echinacea (lo más preferentemente alquilamidas de Echinacea preparadas como se describe en el presente texto) o polisacáridos de Echinacea (lo más preferentemente polisacáridos de Echinacea preparados como se describe en el presente texto). Las composiciones de Echinacea de la presente invención pueden estar en forma líquida, en forma de gel o en forma sólida, tal como un polvo, o comprimidos o cápsulas, y preferentemente están adaptadas para la administración (más preferentemente administración oral) a una persona.
Los métodos para preparar extractos de Echinacea enriquecidos incluyen las etapas de elegir una planta de Echinacea en un estado de desarrollo que tiene una cantidad mejorada del componente que se desee (tal como ácido cichórico, alquilamidas o polisacáridos); elegir una porción de la planta que esté enriquecida en el componente deseado, y poner en contacto la porción elegida con una cantidad de un disolvente, elegido entre el grupo consistente en etanol y agua, efectiva para extraer el componente deseado de la porción de la planta. Preferentemente, el extracto de Echinacea después se concentra. Puede utilizarse en la práctica de la presente invención cualquier especie de planta de Echinacea, pero la especie actualmente preferida es E. purpurea. La extracción del material vegetal de Echinacea utiliza una relación (en peso) de material vegetal a disolvente de no más de aproximadamente dos partes de material vegetal por aproximadamente una parte de disolvente. La relación (en peso) de material vegetal a disolventes actualmente preferida es de aproximadamente una parte de material vegetal por aproximadamente cuatro partes de
disolvente.
Los extractos líquidos de Echinacea pueden enriquecerse en uno o más miembros del grupo consistente en polisacáridos de Echinacea, alquilamidas de Echinacea y ácido cichórico. Los extractos líquidos de Echinacea actualmente preferidos enriquecidos en polisacáridos incluyen polisacáridos a una concentración mayor que aproximadamente 1% (p/p), más preferentemente mayor que aproximadamente 5% (p/p) y lo más preferentemente mayor que aproximadamente 10% (p/p). Los extractos líquidos de Echinacea actualmente preferidos enriquecidos en alquilamidas incluyen alquilamidas a una concentración mayor que aproximadamente 0,1% (p/p), más preferentemente mayor que aproximadamente 1,0% (p/p) y lo más preferentemente mayor que aproximadamente 3,0% (p/p). Los extractos líquidos de Echinacea actualmente preferidos enriquecidos en ácido cichórico incluyen ácido cichórico a una concentración mayor que aproximadamente 0,2% (p/p), más preferentemente mayor que aproximadamente 0,5% (p/p) y lo más preferentemente mayor que aproximadamente 3,0% (p/p).
Los extractos sólidos de Echinacea pueden enriquecerse en uno o más miembros del grupo consistente en polisacáridos de Echinacea, alquilamidas de Echinacea y ácido cichórico. Los extractos sólidos de Echinacea actualmente preferidos enriquecidos en polisacáridos incluyen polisacáridos a una concentración mayor que aproximadamente 0,1% (p/p), más preferentemente mayor que aproximadamente 0,05% (p/p) y lo más preferentemente mayor que aproximadamente 20% (p/p). Los extractos sólidos de Echinacea actualmente preferidos enriquecidos en alquilamidas incluyen alquilamidas a una concentración mayor que aproximadamente 0,001% (p/p), más preferentemente mayor que aproximadamente 0,01% (p/p) y lo más preferentemente mayor que aproximadamente 0,5% (p/p). Los extractos sólidos de Echinacea actualmente preferidos enriquecidos en ácido cichórico incluyen ácido cichórico a una concentración mayor que aproximadamente 0,005% (p/p), más preferentemente mayor que aproximadamente 0,05% (p/p) y lo más preferentemente mayor que aproximadamente 1,5% (p/p).
Los extractos de Echinacea descritos en el presente texto son útiles, por ejemplo, como suplementos dietéticos y como fuente de polisacáridos, alquilamidas o ácido cichórico para mezclar para producir las composiciones de Echinacea de la presente invención. Las composiciones de Echinacea de la presente invención son útiles, por ejemplo, como suplementos dietéticos humanos. A título de ejemplo no limitante, cuando se administran a un mamífero las composiciones de Echinacea de la presente invención, estimulan uno o más de los siguientes aspectos del sistema inmunitario: actividad fagocítica de macrófagos; producción de óxido nítrico por los macrófagos; producción de
TNF-\alpha por los macrófagos; producción de TNF-\gamma por los esplenocitos; y producción de TNF-\alpha por los esplenocitos.
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona el uso de una composición de Echinacea en la elaboración de un medicamento para potenciar la actividad del sistema inmunitario en un mamífero, en donde la composición de Echinacea se formula para que proporcione una dosificación diaria de 40 \mug/Kg de peso corporal a 2000 \mug/Kg de peso corporal de ácido cichórico, de 4 \mug/Kg de peso corporal a 200 \mug/Kg de peso corporal de alquilamidas de Echinacea y de 1 mg/Kg de peso corporal a 50 mg/Kg de peso corporal de polisacáridos de Echinacea. El medicamento puede ser para potenciar la actividad fagocítica de los macrófagos, potenciar la producción de óxido nítrico de los macrófagos, potenciar la producción de TNF-\alpha por los macrófagos, potenciar la producción de TNF-\gamma por los esplenocitos, o potenciar la producción de TNF-\alpha por los esplenocitos.
Una composición de Echinacea puede ser administrada a un mamífero para proporcionar una dosificación diaria efectiva de una composición de Echinacea que comprende cantidades estandarizadas de ácido cichórico de Echinacea, alquilamidas de Echinacea y polisacáridos de Echinacea. La expresión "dosificación diaria estandarizada", y sus equivalentes gramaticales, significa una dosificación diaria que es efectiva para potenciar la actividad del sistema inmunitario en un mamífero.
Breve descripción de los dibujos
Los aspectos precedentes y muchas de las ventajas relacionadas de esta invención se hacen más fáciles de apreciar al ser más comprensibles por referencia a la descripción detallada que sigue, cuando se toman junto con los dibujos adjuntos, en los que:
La Figura 1 muestra el efecto de diferentes dosificaciones de una composición de Echinacea de la presente invención sobre varios parámetros del sistema inmunitario en ratas. La composición de Echinacea incluye extractos de ácido cichórico, alquilamida y polisacárido de Echinacea, como se exponen en el Ejemplo 8 en el presente texto. Los niveles de dosificación se exponen en la Tabla 1 en el presente texto. Las abreviaturas son: IL2 SP: producción de interleucina-2 en los esplenocitos; TNF-\alpha SP: producción de factor de necrosis tumoral alfa en los esplenocitos;
INF-\gamma SP: producción de interferón gamma en los esplenocitos; TNF-\alpha MA: factor de necrosis tumoral alfa en los macrófagos alveolares; NO MA: producción de óxido nítrico en los macrófagos alveolares; PI MA: índice fagocítico en macrófagos alveolares; PA MA: actividad fagocítica en los macrófagos alveolares. Los resultados están normalizados respecto a valores testigo.
La Figura 2 muestra el efecto sobre el índice fagocítico de los macrófagos alveolares de la rata, de diferentes dosificaciones de una composición de Echinacea de la presente invención. La composición de Echinacea incluye extractos de ácido cichórico, alquilamida y polisacárido de Echinacea, como se expone en el Ejemplo 8 en el presente texto. Los niveles de dosificación se exponen en la Tabla 1 en el presente texto.
La Figura 3 muestra el efecto de un extracto de ácido cichórico de Echinacea sobre varios parámetros del sistema inmunitario en ratas. El extracto de ácido cichórico de Echinacea se preparó como se describe en el Ejemplo 2 en el presente texto. Las abreviaturas son: IL2 SP: producción de interleucina-2 en los esplenocitos; TNF-\alpha SP: producción de factor de necrosis tumoral alfa en los esplenocitos; INF-\gamma SP: producción de interferón gamma en los esplenocitos; TNF-\alpha MA: factor de necrosis tumoral alfa en los macrófagos alveolares; NO MA: producción de óxido nítrico en los macrófagos alveolares; PI MA: índice fagocítico en los macrófagos alveolares; PA MA: actividad fagocítica en los macrófagos alveolares. Los resultados están normalizados respecto a valores testigo.
La Figura 4 muestra el efecto de un extracto de polisacárido de Echinacea sobre varios parámetros del sistema inmunitario en ratas. El extracto de polisacárido de Echinacea se preparó como se describe en el Ejemplo 3 en el presente texto. Las abreviaturas son: IL2 SP: producción de interleucina-2 en los esplenocitos; TNF-\alpha SP: producción de factor de necrosis tumoral alfa en los esplenocitos; INF-\gamma SP: producción de interferón gamma en los esplenocitos; TNF-\alpha MA: factor de necrosis tumoral alfa en los macrófagos alveolares; NO MA: producción de óxido nítrico en los macrófagos alveolares; PI MA: índice fagocítico en macrófagos alveolares; PA MA: actividad fagocítica en los macrófagos alveolares. Los resultados están normalizados respecto a los valores testigo.
La Figura 5 muestra el efecto de un extracto de alquilamida de Echinacea sobre varios parámetros del sistema inmunitario en ratas. El extracto de alquilamida de Echinacea se preparó como se describe en el Ejemplo 1 en el presente texto. Las abreviaturas son: IL2 SP: producción de interleucina-2 en los esplenocitos; TNF-\alpha SP: producción de factor de necrosis tumoral alfa en los esplenocitos; INF-\gamma SP: producción de inferferón gamma en los esplenocitos; TNF-\alpha MA: factor de necrosis tumoral alfa en los macrófagos alveolares; NO MA: producción de óxido nítrico en los macrófagos alveolares; PI MA: índice fagocítico en los macrófagos alveolares; PA MA: actividad fagocítica en macrófagos alveolares. Los resultados están normalizados respecto a los valores testigo.
La Figura 6 muestra el efecto de una composición de Echinacea de la presente invención, y el efecto de cada uno de sus componentes, extractos de ácido cichórico, alquilamida y polisacárido, sobre el índice fagocítico de los macrófagos alveolares de rata. La composición de Echinacea incluye extractos de ácido cichórico, alquilamida y polisacárido de Echinacea como se expone en el Ejemplo 8 en el presente texto. La dosificación de la composición de Echinacea fue de Nivel 4 como se expone en la Tabla 1 en el presente texto, esto es, la composición de Echinacea proporcionó una dosificación diaria de ácido cichórico de Echinacea a 800 \mug/kg, polisacáridos de Echinacea a
20 mg/kg, y alquilamidas de Echinacea a 80 \mug/kg. Se administró por separado ácido cichórico de Echinacea a una dosificación diaria de 800 \mug/kg, se administró por separado polisacáridos de Echinacea a una dosificación diaria de 20 \mug/kg, y se administró por separado alquilamidas de Echinacea a una dosificación diaria de 80 \mug/kg. Se administró a las ratas testigo una mezcla de agua y etanol.
La Figura 7 muestra el efecto sobre la producción de TNF-\alpha en los macrófagos alveolares de rata, de distintas dosificaciones de una composición de Echinacea de la presente invención. La composición de Echinacea incluye extractos de ácido cichórico, alquilamida y polisacárido de Echinacea como se expone en el Ejemplo 8 en el presente texto. TNF-\alpha MA: factor de necrosis tumoral alfa en los macrófagos alveolares. Las concentraciones relativas se obtuvieron normalizando cada una de las concentraciones de la dosis de la Tabla 1 respecto a las concentraciones al nivel de dosis 2 expuesto en la Tabla 1.
La Figura 8 muestra el efecto de distintas dosificaciones de una composición de Echinacea de la presente invención sobre la producción de Interleucina-2 en los esplenocitos de rata. La composición de Echinacea incluye extractos de ácido cichórico, alquilamida y polisacárido de Echinacea como se expone en el Ejemplo 8 en el presente texto. La composición de Echinacea se administró a los niveles de dosificación expuestos en la Tabla 1 en el presente texto. IL-2 SP: producción de interleucina-2 de los esplenocitos. Los resultados están normalizados respecto a los valores testigo. Las concentraciones relativas se obtuvieron normalizando cada una de las concentraciones de la dosis de la Tabla 1 respecto a las concentraciones al nivel de dosis 2 expuesto en la Tabla 1.
Descripción detallada de la realización preferida
Se usan las siguientes abreviaturas: mg/ml (o mg/mL) es una abreviatura de miligramos por mililitro; mg/g es una abreviatura de miligramos por gramo.
La presente invención proporciona composiciones de Echinacea y métodos para preparar las composiciones de la invención. Cualquier especie de Echinacea puede ser utilizada en la práctica de la presente invención. La ciencia botánica reconoce actualmente nueve especies de Echinacea. E. pallida es una especie tetraploide con pétalos oscuros, hojas pilosas y polen blanco. E. angustifolia crece típicamente en zonas secas silvestres y se caracteriza por las hojas pilosas cortas, y flores marchitas. La E. purpurea prefiere un suelo rico, tiene flores de color violeta oscuro, y hojas anchas. La E. atrorubens tiene pelos prensados en el tallo, con lígulas reflejadas próximas al tallo y hojas no pilosas. La E. sanguinea es una planta diploide de aspecto similar a la E. pallida, pero tiene el polen amarillo. La E. simulata parece ser físicamente idéntica a la E. pallida excepto que la E. simulata tiene el polen amarillo. La E. paradoxa tiene flores amarillas o bien rosas y pelos prensados. La E. teneseensis tiene lígulas curvadas hacia arriba y es la más pilosa de todas las especies de Echinacea. La E. laevigata tiene largas lígulas marchitas igual que la E. pallida, pero sus hojas son anchas como las de la E. purpurea. Aunque puede utilizarse cualquier especie de Echinacea en la práctica de la presente invención, la E. purpurea es la especie de Echinacea preferida actualmente.
La Echinacea puede propagarse a partir de semillas, división en la corona y plantando secciones de la raíz, preferentemente de 10-12 cm de longitud. Las semillas pueden sembrarse al exterior inmediatamente después de madurar en otoño y germinar el brote siguiente, pero la velocidad de emergencia es afectada por el grado de latencia de la semilla, que varía con la especie. La germinación de la semilla es afectada por varios factores. El almacenamiento prolongado de la semilla a temperatura ambiente durante tres años o más reduce la velocidad de germinación. El tamaño de la semilla y la posición de la inflorescencia no afecta a la germinación de la semilla, si bien las semillas recolectadas en la madurez fisiológica, pero antes del envejecimiento, tienen una velocidad de germinación más alta que las semillas recolectadas después de la desecación. De acuerdo con la experiencia de los autores de la presente invención, el origen de las semillas (es decir, el suministrador de las semillas) interviene en la mayor parte de la variación de la velocidad de germinación de la E. purpurea. En particular, la presencia de de semillas híbridas de Echinacea en lotes de semillas suministradas en el comercio es indeseable. Un método actualmente preferido para identificar semillas híbridas de Echinacea es el siguiente. Las semillas a estudiar se germinan en planteros con riego diario. Se dejan crecer las plántulas durante una semana después de la germinación. Después se retiran las plántulas y se lavan intensamente con agua, y se secan. Las plántulas limpias se procesan a continuación con un mezclador de cocina hasta que están finamente mezcladas. El material vegetal se retira filtrando a través de filtros de 5 \mum. El líquido que queda se concentra mediante evaporación bajo vacía a la mitad de su volumen original y después se filtra a través de un filtro de 0,45 \mum para análisis de HPLC. El análisis de HPLC, usando el método de ensayo del ácido cichórico descrito en el Ejemplo 6 en el presente texto, indicará un pico diferenciado de ácido cichórico para semillas no híbridas, mientras que el pico de ácido cichórico está ausente en las semillas híbridas.
El brote de las plántulas de campos sembrados directamente puede no ser tan uniforme como en el interior después de la estratificación. Un método actualmente preferido para la estratificación de las semillas es mezclar las semillas con arena limpia (en una relación de 1:1, v/v) en una bolsa de plástico, y mantener la humedad en aproximadamente diez por ciento durante un periodo de cuatro a seis semanas, a una temperatura entre aproximadamente 1°C y aproximadamente -4°C. Las semillas estratificadas se separan después de la arena y pueden sembrarse en la superficie del suelo o a 0,5 cm de profundidad en semilleros de cajón o tiestos pequeños llenos de una mezcla de turba y perlita (en una relación de 1:1, v/v). Las semillas plantadas en semilleros mantenidos a aproximadamente 18-20°C empiezan a brotar típicamente en el plazo de siete a diez días después de plantadas. Las plántulas crecen preferentemente en un invernadero o en interior con luz suplementaria hasta el trasplante al exterior. Típicamente hay aproximadamente 257.000 semillas/kg para la E. purpurea y hasta aproximadamente 319.000 semillas/kg para la E. angustifolia. Aproximadamente se requieren 500 g de semillas para proporcionar trasplantes para un campo de 0,5 hectáreas (ha).
También es posible la propagación asexual mediante esquejes y cultivos de células. La propagación asexual puede producir una población grande de plantas iguales genéticamente que pueden mejorarse mediante cultivo selectivo o ingeniería genética para obtener rendimientos más elevados de compuestos activos.
En la naturaleza, la Echinacea crece típicamente en terreno pobre y rocoso bajo la luz del sol total. Sin embargo, también florece cultivándola en suelo de marga o marga arenosa moderadamente rico y bien drenado, que es entre neutro y ligeramente ácido (pH 6-7). La Echinacea es un cultivo de raíces y por tanto debe evitarse un terreno rocoso o pesado. Aunque la Echinacea es tolerante a la sequía, el agua es importante para su crecimiento y se recomienda el riego regular.
La fertilización intensiva produce un elevado rendimiento herbáceo pero un bajo rendimiento de raíz. Normalmente es suficiente un fertilizante equilibrado, bajo en nitrógeno y que incluya una cantidad adecuada de fósforo y potasio. La harina de huesos o la roca fosfática (14,5 a 20 kg/ha) y la ceniza de madera (45 a 51,5 kg/ha) aplicadas antes de la siembra, y el estiércol vacuno o caballar aplicado en 3 aplicaciones después de la plantación, son una combinación de fertilizante orgánico para el cultivo de Echinacea preferida en la actualidad. El fertilizante de pescado (incluyendo
N-P_{2}O_{5}-K_{2}O en una relación de 5-2-2, respectivamente) aplicado a una concentración de trabajo de 4 mL/L favorece el crecimiento de E. purpurea. Además del estiércol y los residuos municipales descompuestos, también es beneficioso un cultivo protector tal como la quinoa, la ortiga o el trébol rojo. También puede usarse un fertilizante químico para cultivo no orgánico. El fertilizante de nitrógeno se usa para la salud general de la planta y, más específicamente, para producir una planta hojosa de color verde oscuro. Los fertilizantes de fosfato harán que aumente la floración.
Adicionalmente, la separación entre plantas afecta al rendimiento. Preferentemente, la Echinacea debe ser plantada separada 30 cm en macizos de 120 cm de ancho, dejando cinco filas por macizo y dando aproximadamente 74.000 plantas por hectárea. Esta es una densidad máxima, que puede ser excesiva si se usa una especie de Echinacea vigorosa, o si las plantas se cultivan por más de cuatro años.
El pajuzo o mantillo sirve para mantener la humedad y la temperatura del suelo, y, lo que es más importante, para controlar las malezas. Las plántulas medran bajo mantillo plástico negro o mantillo de corteza. Si la plántula está al aire libre, se considera esencial un mantillo de paja limpia (2 a 3 cm) sobre la semilla. La Echinacea no es tolerante a las malezas, por lo que es un factor importante el control de las mismas. En la experiencia de los autores de la presente invención, con respecto al cultivo orgánico de Echinacea, el mantillo plástico negro o de corteza es la mejor medida de control de malezas, especialmente para plantas recién establecidas. El mantillo plástico puede hacer disminuir los costes de trabajo del control de las malezas entre un setenta y un ochenta por ciento. La aplicación del mantillo debe hacerse inmediatamente después de plantar y debe ser grueso (es decir, utilizando trozos de mantillo de corteza que tengan unas dimensiones mayores que aproximadamente 2 cm por 2 cm) para permitir que la superficie se seque y cree condiciones desfavorables para la germinación de malezas. La preparación del terreno, al menos un año antes de plantar, es otra forma de deshacerse de malezas perennes y de reducir la población anual de malezas. Un método preferido de preparación del terreno es revolver la tierra en primavera, cuando las malezas han crecido, pero antes de plantar las plantas de Echinacea. De esta forma, las malezas se destruyen por exposición de sus raíces.
El cultivo meticuloso del suelo es esencial para optimizar el crecimiento y el rendimiento de la Echinacea. Normalmente, las raíces no alcanzan el tamaño deseado hasta 3-4 años después de la siembra. Con unas condiciones de cultivo reguladas cuidadosamente, el rendimiento de E. angustifolia puede alcanzar hasta 2,5 ton/ha. Los rendimientos para E. purpurea son típicamente más elevados que los de E. angustifolia.
Las composiciones de Echinacea de la presente invención incluyen cantidades estandarizadas de al menos tres componentes de Echinacea. En este contexto, la expresión "cantidad estandarizada", o los equivalentes gramaticales de la misma, significa una cantidad deseada y cuantificada de un componente de Echinacea. Es deseable formular composiciones de Echinacea que contengan cantidades estandarizadas de componente de Echinacea porque tales composiciones estandarizadas de Echinacea proporcionan al consumidor una dosis efectiva constante (es decir, que no varía de unos lotes a otros) del componente o de los componentes biológicamente activos.
Los extractos de Echinacea actualmente preferidos, útiles para preparar las composiciones de Echinacea de la presente invención, están enriquecidos en al menos un componente de Echinacea que es capaz de inducir una respuesta biológica, tal como la estimulación de la función inmunitaria, cuando se introduce en un organismo vivo. A título de ejemplo no limitante, los componentes de Echinacea útiles para preparar las composiciones de Echinacea de la presente invención incluyen: aceites esenciales, alcamidas (incluyendo alquilamidas), ácido cichórico, polisacáridos, polialquinos y polialquenos. Los ejemplos representativos de aceites esenciales de Echinacea incluyen borneol, acetato de bornilo, pentadeca-8-en-2-ona, germacreno D, cariofileno, cariofileno epóxido y ácido palmítico. Los aceites esenciales de Echinacea se describen, por ejemplo, en A. Awang y D. Kindack, Canadian Pharmaceutical Journal 124: 512-516 (1991), y en Bauer, R., "Echinacea Species as Potencial Immunostimulatory Drugs", Economic and Medicinal Plant Research, vol. 5, p. 261-267 (1991). Los componentes de Echinacea útiles para preparar las composiciones de Echinacea de la presente invención son ácido cichórico (lo más preferentemente ácido cichórico preparado como se describe en el presente texto), alquilamidas de Echinacea (lo más preferentemente alquilamidas de Echinacea preparadas como se describe en el presente texto) y polisacáridos de Echinacea (lo más preferentemente polisacáridos de Echinacea preparados como se describe en el presente texto).
Las composiciones de Echinacea pueden incluir una cantidad estandarizada de un primer componente de Echinacea y una cantidad estandarizada de un segundo componente de Echinacea, en donde el primero y el segundo componentes de Echinacea se eligen cada uno de ellos independientemente entre el grupo consistente en ácido cichórico (lo más preferentemente ácido cichórico preparado como se describe en el presente texto), alquilamidas de Echinacea (lo más preferentemente alquilamidas de Echinacea preparadas como se describe en el presente texto) y polisacáridos de Echinacea (lo más preferentemente polisacáridos de Echinacea preparados como se describe en el presente texto), y en donde la cantidad estandarizada de ácido cichórico es de aproximadamente 0,2 mg/ml a aproximadamente 500 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 0,3 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, lo más preferentemente de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml; la cantidad estandarizada de alquilamidas de Echinacea es de aproximadamente 0,02 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, lo más preferentemente de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml; y la cantidad estandarizada de polisacáridos de Echinacea es de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente
800 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 800 mg/mi, lo más preferentemente de aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 800 mg/ml.
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La presente invención proporciona composiciones de Echinacea que incluyen una cantidad estandarizada de ácido cichórico (lo más preferentemente ácido cichórico preparado como se describe en el presente texto), alquilamidas de Echinacea (lo más preferentemente alquilamidas de Echinacea preparadas como se describe en el presente texto), y polisacáridos de Echinacea (lo más preferentemente polisacáridos de Echinacea preparados como se describe en el presente texto), y en donde la cantidad estandarizada de ácido cichórico es de aproximadamente 0,2 mg/ml a aproximadamente 500 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 0,3 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, lo más preferentemente de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml; la cantidad estandarizada de alquilamidas de Echinacea es de aproximadamente 0,02 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, lo más preferentemente de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml; y la cantidad estandarizada de polisacáridos de Echinacea es de aproximadamente
10 mg/ml a aproximadamente 800 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 800 mg/ml, lo más preferentemente de aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 800 mg/ml.
Las composiciones de Echinacea pueden incluir una cantidad estandarizada de un primer componente de Echinacea y una cantidad estandarizada de un segundo componente de Echinacea, en donde el primero y el segundo componentes de Echinacea se eligen cada uno de ellos independientemente entre el grupo consistente en ácido cichórico (lo más preferentemente ácido cichórico preparado como se describe en el presente texto), alquilamidas de Echinacea (lo más preferentemente alquilamidas de Echinacea preparadas como se describe en el presente texto) y polisacáridos de Echinacea (lo más preferentemente polisacáridos de Echinacea preparados como se describe en el presente texto), y en donde la cantidad estandarizada de ácido cichórico es de aproximadamente 0,01 mg/g a aproximadamente
500 mg/g, más preferentemente de aproximadamente 0,05 mg/g a aproximadamente 500 mg/g, lo más preferentemente de aproximadamente 15 mg/g a aproximadamente 500 mg/g; la cantidad estandarizada de alquilamidas de Echinacea es de aproximadamente 0,005 mg/g a aproximadamente 100 mg/g, más preferentemente de aproximadamente
0,1 mg/g a aproximadamente 100 mg/g, lo más preferentemente de aproximadamente 5 mg/g a aproximadamente
100 mg/g; y la cantidad estandarizada de polisacáridos de Echinacea es de aproximadamente 5 mg/g a aproximadamente 900 mg/g, más preferentemente de aproximadamente 10 mg/g a aproximadamente 900 mg/g, lo más preferentemente de aproximadamente 200 mg/g a aproximadamente 900 mg/g.
La presente invención proporciona composiciones de Echinacea que incluyen una cantidad estandarizada de ácido cichórico (lo más preferentemente ácido cichórico preparado como se describe en el presente texto), alquilamidas de Echinacea (lo más preferentemente alquilamidas de Echinacea preparadas como se describe en el presente texto), y polisacáridos de Echinacea (lo más preferentemente polisacáridos de Echinacea preparados como se describe en el presente texto), y en donde la cantidad estandarizada de ácido cichórico es de aproximadamente 0,01 mg/g a aproximadamente 500 mg/g, más preferentemente de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 500 mg/g, lo más preferentemente de aproximadamente 15 mg/g a aproximadamente 500 mg/g; la cantidad estandarizada de alquilamidas de Echinacea es de aproximadamente 0,005 mg/g a aproximadamente 100 mg/g, más preferentemente de aproximadamente 0,1 mg/g a aproximadamente 100 mg/g, lo más preferentemente de aproximadamente 5 mg/g a aproximadamente 100 mg/g; y la cantidad estandarizada de polisacáridos de Echinacea es de aproximadamente 5 mg/g a aproximadamente 900 mg/g, más preferentemente de aproximadamente 10 mg/g a aproximadamente 900 mg/g, lo más preferentemente de aproximadamente 200 mg/g a aproximadamente 900 mg/g.
En el tercer aspecto, la presente invención proporciona métodos para preparar composiciones de Echinacea, incluyendo los métodos la etapa de combinar cantidades de tres componentes de Echinacea suficientes para dar una composición de Echinacea que incluye cantidades estandarizadas de cada uno de los componentes de Echinacea combinados. En este contexto, la expresión "cantidad estandarizada", o los equivalentes gramaticales de la misma, significa una cantidad deseada y cuantificada de un componente de Echinacea. Los componentes de Echinacea actualmente preferidos, útiles para preparar las composiciones de Echinacea de acuerdo con la presente invención, son capaces de inducir una respuesta biológica, tal como la estimulación de la función inmunitaria, cuando se introducen en un organismo vivo. Los componentes de Echinacea útiles para preparar las composiciones de Echinacea incluyen: aceites esenciales, alcamidas (incluyendo alquilamidas), ácido cichórico, polisacáridos, polialquinos y polialquenos. Los componentes de Echinacea útiles para preparar composiciones de Echinacea, de acuerdo con los métodos de la presente invención, son ácido cichórico (lo más preferentemente ácido cichórico preparado como se describe en el presente texto), alquilamidas de Echinacea (lo más preferentemente alquilamidas de Echinacea preparadas como se describe en el presente texto) y polisacáridos de Echinacea (lo más preferentemente polisacáridos de Echinacea preparados como se describe en el presente texto). Las composiciones de Echinacea preparadas de acuerdo con la presente invención pueden estar en forma líquida, en forma de gel o en forma sólida, tal como polvo o cápsulas, y preferentemente se adaptan para su administración (más preferentemente administración oral) a una persona.
Los métodos para preparar composiciones de Echinacea pueden incluir la etapa de combinar una cantidad de un primer componente de Echinacea y una cantidad de un segundo componente de Echinacea, siendo elegidos cada uno de dichos primero y segundo componentes de Echinacea independientemente entre el grupo consistente en ácido cichórico (lo más preferentemente ácido cichórico preparado como se describe en el presente texto), alquilamidas de Echinacea (lo más preferentemente alquilamidas de Echinacea preparadas como se describe en el presente texto) y polisacáridos de Echinacea (lo más preferentemente polisacáridos de Echinacea preparados como se describe en el presente texto), siendo dicha cantidad de ácido cichórico una cantidad suficiente para dar una composición de Echinacea que incluye una cantidad estandarizada de ácido cichórico de aproximadamente 0,2 mg/ml a aproximadamente
500 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 0,3 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, lo más preferentemente de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml; siendo dicha cantidad de alquilamidas de Echinacea una cantidad suficiente para dar una composición de Echinacea que incluye una cantidad estandarizada de alquilamidas de aproximadamente 0,02 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, lo más preferentemente de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml; y siendo dicha cantidad de polisacáridos de Echinacea una cantidad suficiente para dar una composición de Echinacea que incluye una cantidad estandarizada de polisacáridos de Echinacea de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 800 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 800 mg/ml, lo más preferentemente de aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 800 mg/ml.
La presente invención proporciona métodos para preparar composiciones de Echinacea que incluyen la etapa de combinar una cantidad de ácido cichórico (lo más preferentemente ácido cichórico preparado como se describe en el presente texto), una cantidad de alquilamidas de Echinacea (lo más preferentemente alquilamidas de Echinacea preparadas como se describe en el presente texto) y una cantidad de polisacáridos de Echinacea (lo más preferentemente polisacáridos de Echinacea preparados como se describe en el presente texto), siendo dicha cantidad de ácido cichórico una cantidad suficiente para dar una composición de Echinacea que incluye una cantidad estandarizada de ácido cichórico de aproximadamente 0,2 mg/ml a aproximadamente 500 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente
0,3 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, lo más preferentemente de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml; siendo dicha cantidad de alquilamidas de Echinacea una cantidad suficiente para dar una composición de Echinacea que incluye una cantidad estandarizada de alquilamidas de aproximadamente 0,02 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, lo más preferentemente de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml; y siendo dicha cantidad de polisacáridos de Echinacea una cantidad suficiente para dar una composición de Echinacea que incluye una cantidad estandarizada de polisacáridos de Echinacea de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 800 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 800 mg/ml, lo más preferentemente de aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 800 mg/ml.
Los métodos para preparar composiciones de Echinacea pueden incluir la etapa de combinar una cantidad de un primer componente de Echinacea y una cantidad de un segundo componente de Echinacea, siendo elegidos cada uno de dichos primero y segundo componentes de Echinacea independientemente entre el grupo consistente en ácido cichórico (lo más preferentemente ácido cichórico preparado como se describe en el presente texto), alquilamidas de Echinacea (lo más preferentemente alquilamidas de Echinacea preparadas como se describe en el presente texto) y polisacáridos de Echinacea (lo más preferentemente polisacáridos de Echinacea preparados como se describe en el presente texto), siendo dicha cantidad de ácido cichórico una cantidad suficiente para dar una composición de Echinacea que incluye una cantidad estandarizada de ácido cichórico de aproximadamente 0,01 mg/g a aproximadamente 500 mg/g, más preferentemente de aproximadamente 0,05 mg/g a aproximadamente 500 mg/g, lo más preferentemente de aproximadamente 15 mg/g a aproximadamente 500 mg/g; siendo dicha cantidad de alquilamidas de Echinacea una cantidad suficiente para dar una composición de Echinacea que incluye una cantidad estandarizada de alquilamidas de aproximadamente 0,005 mg/g a aproximadamente 100 mg/g, más preferentemente de aproximadamente
0,1 mg/g a aproximadamente 100 mg/g, lo más preferentemente de aproximadamente 5 mg/g a aproximadamente
100 mg/g; y siendo dicha cantidad de polisacáridos de Echinacea una cantidad suficiente para dar una composición de Echinacea que incluye una cantidad estandarizada de polisacáridos de Echinacea de aproximadamente 5 mg/g a aproximadamente 900 mg/g, más preferentemente de aproximadamente 10 mg/g a aproximadamente 900 mg/g, lo más preferentemente de aproximadamente 200 mg/g a aproximadamente 900 mg/g.
La presente invención proporciona métodos para preparar composiciones de Echinacea, que incluyen la etapa de combinar una cantidad de ácido cichórico (lo más preferentemente ácido cichórico preparado como se describe en el presente texto), una cantidad de alquilamidas de Echinacea (lo más preferentemente alquilamidas de Echinacea preparadas como se describe en el presente texto) y una cantidad de polisacáridos de Echinacea (lo más preferentemente polisacáridos de Echinacea preparados como se describe en el presente texto), siendo dicha cantidad de ácido cichórico una cantidad suficiente para dar una composición de Echinacea que incluye una cantidad estandarizada de ácido cichórico de aproximadamente 0,01 mg/g a aproximadamente 500 mg/g, más preferentemente de aproximadamente
0,05 mg/g a aproximadamente 500 mg/g, lo más preferentemente de aproximadamente 15 mg/g a aproximadamente 500 mg/ml; siendo dicha cantidad de alquilamidas de Echinacea una cantidad suficiente para dar una composición de Echinacea que incluye una cantidad estandarizada de alquilamidas de aproximadamente 0,005 mg/g a aproximadamente 100 mg/g, más preferentemente de aproximadamente 0,1 mg/g a aproximadamente 100 mg/g, lo más preferentemente de aproximadamente 5 mg/g a aproximadamente 100 mg/g; y siendo dicha cantidad de polisacáridos de Echinacea una cantidad suficiente para dar una composición de Echinacea que incluye una cantidad estandarizada de polisacáridos de Echinacea de aproximadamente 5 mg/g a aproximadamente 900 mg/g, más preferentemente de aproximadamente 10 mg/g a aproximadamente 900 mg/g, lo más preferentemente de aproximadamente 200 mg/g a aproximadamente 900 mg/g.
Las composiciones de Echinacea preparadas de acuerdo con la presente invención pueden estar en forma líquida, en forma de gel o en forma sólida, tal como un polvo, o comprimidos o cápsulas, y preferentemente están adaptadas para la administración (más preferentemente administración oral) a una persona. Típicamente, antes de mezclar para formar composiciones de Echinacea de la presente invención, se analiza la potencia de partes alícuotas de Echinacea. Los extractos se ajustan a la concentración o a las concentraciones deseadas, mediante concentración o dilución con cargas o disolventes apropiados (incluyendo agua, alcohol, aceite de soja u otros aceites, lecitina, glicerina, etc.). Los recipientes para hacer la mezcla pueden purgarse con gas nitrógeno y la mezcla puede llevarse a cabo bajo nitrógeno para prevenir la oxidación. Las composiciones de Echinacea, o los extractos de Echinacea individuales, pueden formularse en una base de alcohol o de glicerina. Los extractos o composiciones de Echinacea en polvo pueden ser elaborados mediante secado por pulverización o secado por liofilización. Los extractos o composiciones líquidas de Echinacea pueden también ser microencapsulados en forma de polvo suelto o fluible. Las composiciones o extractos de Echinacea líquidas pueden usarse directamente como ingredientes en cápsulas de gelatina blanda y cápsulas de gelatina dura, y pueden hacerse comprimidos a partir del material en polvo.
En general, los extractos de Echinacea preparados como se describe en el presente texto, y las composiciones preparadas de acuerdo con la presente invención, pueden incluir uno o más excipientes. Los excipientes adecuados aceptables farmacéuticamente incluyen agentes de procesado y modificadores y potenciadores de suministro de fármacos tales como, por ejemplo, polvo de aceite vegetal, croscaramelosa sódica, goma acacia y goma guar. Otros excipientes adecuados aceptables farmacéuticamente se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Pub. Co, New Jersey (1991).
Los métodos para preparar extractos enriquecidos de Echinacea se describen en el presente texto. Los extractos de Echinacea preferidos están enriquecidos en alquilamidas de Echinacea, polisacáridos de Echinacea o ácido cichórico. Los métodos incluyen las etapas de elegir una planta de Echinacea en un estado de desarrollo que tenga una cantidad potenciada del componente que se desee (tal como alquilamidas de Echinacea, polisacáridos de Echinacea o ácido cichórico); seleccionar una porción de la planta que esté enriquecida en el componente deseado, y poner en contacto la porción seleccionada con una cantidad de un disolvente, elegido entre el grupo consistente en etanol y agua, efectiva para extraer el componente deseado de la porción de la planta. Preferentemente, se concentra entonces el extracto de Echinacea. Puede utilizarse cualquier especie de planta de Echinacea, pero la especie actualmente preferida es E. purpurea. Los componentes actualmente preferidos extraídos de plantas de Echinacea son polisacáridos, alquilamidas y ácido cichórico. Cuando se usan los métodos para extraer polisacáridos, las plantas de Echinacea extraídas tienen preferentemente una edad de aproximadamente uno a aproximadamente cuatro años. Preferentemente los polisacáridos se extraen de las flores, las hojas, los tallos y/o las raíces de las plantas de Echinacea. Cuando se usan los métodos para extraer alquilamidas, las plantas de Echinacea extraídas tienen preferentemente una edad de aproximadamente dos a aproximadamente cuatro años. Preferentemente, las alquilamidas se extraen de las flores maduras y raíces de las plantas de Echinacea. Cuando los métodos se usan para extraer ácido cichórico, las plantas de Echinacea extraídas tienen preferentemente una edad de aproximadamente uno a aproximadamente tres años. Preferentemente, el ácido cichórico se extrae de plantas de Echinacea jóvenes, de las hojas de las plantas de Echinacea y de las flores inmaduras. La extracción del material vegetal de la Echinacea utiliza una relación (en peso) de material vegetal a disolvente de no más de aproximadamente dos partes de material vegetal a aproximadamente una parte de disolvente. La relación (en peso) actualmente preferida de material vegetal a disolvente es aproximadamente una parte de material vegetal a aproximadamente cuatro partes de disolvente.
Los polisacáridos pueden ser extraídos de material vegetal de Echinacea seleccionado poniendo en contacto el material vegetal con una mezcla de etanol y agua que contiene de aproximadamente 0,1% de etanol a aproximadamente 50% de etanol (p/p), preferentemente de aproximadamente 5% de etanol a aproximadamente 20% de etanol. Los polisacáridos se extraen preferentemente de las flores, hojas, tallos y/o raíces de las plantas de Echinacea. Las partes aéreas de la planta contienen típicamente concentraciones de polisacáridos más elevadas que las raíces, y las flores maduras contienen típicamente concentraciones de polisacáridos más elevadas que las flores inmaduras. La temperatura de extracción preferida para extraer los polisacáridos es de aproximadamente 20°C a aproximadamente 80°C, más preferentemente de aproximadamente 30°C aproximadamente 70°C, y lo más preferentemente de aproximadamente 30°C a aproximadamente 50°C. La duración de la extracción de los polisacáridos es preferentemente de aproximadamente 48 horas a aproximadamente 14 días, más preferentemente de aproximadamente de aproximadamente 3 días a aproximadamente 12 días, y lo más preferentemente de aproximadamente 4 días a aproximadamente 8 días. Los tiempos de extracción prolongados a temperaturas elevadas aseguran que los polisacáridos son extraídos de la forma más completa posible, aunque tiene lugar cierta hidrólisis de los polisacáridos a temperaturas más altas, pero las temperaturas bajas retardan el proceso de extracción de forma significativa. Los extractos de polisacárido que contienen bajas concentraciones de etanol han de ser vigilados estrechamente para evitar el crecimiento de bacterias, levaduras u hongos, y el consiguiente deterioro.
Los extractos de polisacáridos preparados como se describe en el presente texto contienen típicamente polisacáridos en unas concentraciones de aproximadamente 0,5 mg/mL a aproximadamente 20,0 mg/mL. Los extractos de polisacáridos se concentran preferentemente a una concentración final de polisacáridos de aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 900 mg/mL, más preferentemente a una concentración de polisacáridos de aproximadamente
60 mg/mL a aproximadamente 900 mg/mL, lo más preferentemente a una concentración de polisacáridos de aproximadamente 100 mg/mL a aproximadamente 900 mg/mL. El método actualmente preferido para concentrar extractos de polisacáridos es la evaporación. La evaporación se realiza preferentemente a una temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 85°C, durante un periodo de tiempo de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 6 días. El vacío aplicado es típicamente de aproximadamente 5 milibares (mbar) a aproximadamente 320 mbar absolutos de vacío.
Las alquilamidas pueden extraerse del material vegetal de Echinacea seleccionado poniendo en contacto el material vegetal con una mezcla de etanol y agua que contiene de aproximadamente 50% de etanol a aproximadamente 95% de etanol (p/p), preferentemente de aproximadamente 65% de etanol a aproximadamente 85% de etanol, más preferentemente de aproximadamente 70% de etanol a aproximadamente 80% de etanol. Las alquilamidas se encuentran en todas las especies de Echinacea y la concentración total de alquilamida (y la complejidad de la fracción de alquilamida) es mayor en la raíz que en las hojas. Las isobutilamidas son el componente mayoritario de la fracción de alquilamida en las raíces de E. angustifolia y E. purpurea, aunque son un componente minoritario de la fracción de alquilamida en las raíces de E. pallida. Las isobutilamidas están presentes en las partes aéreas de E. angustifolia, E. purpurea y E. pallida. Las flores maduras y las raíces de las plantas de Echinacea se usan preferentemente como materiales de partida para preparar extractos de alquilamida, ya que estos materiales vegetales tienen la cantidad de alquilamidas más elevada. Las alquilamidas se extraen preferentemente de plantas de Echinacea que tienen una edad superior a aproximadamente dos años.
La temperatura de extracción preferidas para extraer alquilamidas de Echinacea es de aproximadamente 4°C a aproximadamente 85°C, más preferentemente de aproximadamente 30°C a aproximadamente 70°C, lo más preferentemente de aproximadamente 40°C a 60°C. La duración de la extracción de alquilamida es preferentemente de aproximadamente 24 horas a aproximadamente 7 días, más preferentemente de aproximadamente un día a aproximadamente cuatro días, lo más preferentemente de aproximadamente dos días a aproximadamente tres días. La temperatura de extracción de alquilamida elegida depende en parte del contenido de otros compuestos en el material vegetal de partida. En el caso de un material vegetal que contiene una gran proporción de alquilamidas y poco ácido cichórico, las extracciones pueden llevarse a cabo a 85°C; sin embargo, cuando también está presente una cantidad significativa de ácido cichórico en el material vegetal de partida, y es deseable preservar el ácido cichórico en el extracto final, la temperatura de extracción debe reducirse a menos de 40°C para evitar la degradación del ácido cichórico.
Los extractos de alquilamida preparados como se describe en el presente texto contienen típicamente alquilamidas en una concentración de aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 3,0 mg/mL. Los extractos de alquilamida se concentran preferentemente a una concentración final de alquilamida de aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 300 mg/mL, más preferentemente a una concentración de alquilamida de aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 300 mg/mL, lo más preferentemente a una concentración de alquilamida de aproximadamente
20 mg/mL a aproximadamente 300 mg/mL. El método actualmente preferido para concentrar extractos de alquilamida es la evaporación. La evaporación se realiza típicamente a una temperatura de aproximadamente 10°C a aproximadamente 90°C, durante un periodo de tiempo de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 3 días. El vacío aplicado es típicamente de aproximadamente 5 milibares (mbar) a aproximadamente 320 milibares absolutos de vacío.
El ácido cichórico puede extraerse del material vegetal de Echinacea seleccionado poniendo en contacto el material vegetal con una mezcla de etanol y agua que contiene de aproximadamente 40% de etanol (p/p) a aproximadamente 95% de etanol (p/p), preferentemente de aproximadamente 40% de etanol (p/p) a aproximadamente 85% (p/p) de etanol, más preferentemente de aproximadamente 50% de etanol (p/p) a aproximadamente 70% de etanol (p/p). Las partes de la planta de Echinacea que contienen las concentraciones más altas de ácido cichórico se extraen preferentemente con el fin de dar extractos que tienen una elevada concentración de ácido cichórico. En la E. purpurea las concentraciones más altas de ácido cichórico se encuentran en las raíces, las flores y las hojas, mientras que en la E. angustifolia el ácido cichórico se encuentra solamente en las raíces. En general, el ácido cichórico se extrae preferentemente de plantas jóvenes, hojas y flores inmaduras. Se eligen las plantas de Echinacea que tengan preferentemente menos de un año de edad.
La temperatura de extracción preferida para extraer el ácido cichórico es de aproximadamente 4°C a aproximadamente 45°C, más preferentemente de aproximadamente 4°C a aproximadamente 30°C. La duración de la extracción del ácido cichórico es preferentemente de aproximadamente 24 horas a aproximadamente 3 días, más preferentemente de aproximadamente 24 horas a aproximadamente 40 horas, lo más preferentemente de aproximadamente 24 horas a aproximadamente 36 horas. La degradación del ácido cichórico se hace significativa a temperaturas de extracción superiores a aproximadamente 40°C. Puede perderse una cantidad tan elevada como el 95% del ácido cichórico inicialmente presente en el material vegetal, si la extracción se lleva a cabo a más de 40°C durante más de 48 horas. Las extracciones más prolongadas pueden dar extractos completamente carentes de ácido cichórico. Los extractos de ácido cichórico preparados como se describe en el presente texto contienen típicamente ácido cichórico en una concentración de aproximadamente 0,2 mg/mL a aproximadamente 2,0 mg/mL. Los extractos de ácido cichórico se concentran preferentemente a una concentración final de ácido cichórico de aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 700 mg/mL, más preferentemente a una concentración de ácido cichórico de aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 700 mg/mL, lo más preferentemente a una concentración de ácido cichórico de aproximadamente 30 mg/mL a aproximadamente 700 mg/mL. El método actualmente preferido para concentrar extractos de ácido cichórico es la evaporación. La evaporación se realiza preferentemente a una temperatura de aproximadamente 10°C a aproximadamente 45°C, durante un periodo de tiempo de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 2,5 días. El vacío aplicado es típicamente de aproximadamente 5 milibares (mbar) a aproximadamente 320 milibares absolutos de vacío.
En los métodos de preparación de extractos de Echinacea, las condiciones de extracción de la Echinacea minimizan preferentemente la degradación de los polisacáridos, alquilamidas y ácido cichórico. Muchos compuestos de la Echinacea biológicamente activos son sensibles a la degradación y cada compuesto o grupo de compuestos es sensible a diferentes condiciones que pueden causar degradación. Por ejemplo, el ácido cichórico no es estable en solución. La degradación del ácido cichórico puede ocurrir rápidamente por oxidación mediada por fenol oxidasa, por hidrólisis y por degradación química. El calor también puede provocar la degradación del ácido cichórico. Del mismo modo, las enzimas vegetales endógenas (tales como glicosido hidrolasas y amilasas) pueden degradar los polisacáridos por hidrólisis. Además, los extractos de polisacárido se estropean fácilmente por el crecimiento de mohos, levaduras y hongos. Las alquilamidas se degradan rápidamente una vez secadas y purificadas.
Un método de reducir la degradación de compuestos biológicamente activos durante la extracción es utilizar una atmósfera rica en nitrógeno o argón, excluyendo así el oxígeno. El nitrógeno puede aplicarse purgando intensamente todo el equipo y los recipientes antes de que se transfiera cualquier líquido. Además, el gas nitrógeno puede ser burbujeado continuamente a través de los extractos líquidos de Echinacea durante el almacenamiento y la extracción. Un control estricto de los parámetros de proceso, tales como la temperatura y la concentración, puede contribuir también a reducir la oxidación y la hidrólisis. Por ejemplo, la hidrólisis enzimática de polisacáridos para dar restos de monosacáridos ocurre mucho más fácilmente a 74°C que a 40°C. La hidrólisis química ocurre a una temperatura entre 75°C y 120°C. Manteniendo temperaturas más bajas durante el tratamiento, puede reducirse al mínimo la hidrólisis. La oxidación también se reduce mediante temperaturas de tratamiento más bajas. Otra ayuda en la disminución de la actividad enzimática endógena es concentrar los extractos líquidos para minimizar el contenido de agua.
Dado que muchos consumidores demandan que los productos derivados de hierbas sean producidos solamente con disolventes no tóxicos, muchos disolventes usados rutinariamente en el laboratorio, tales como hexano, cloroformo, éteres y cetonas, preferentemente no se usan en la práctica de la presente invención. Los métodos para preparar extractos de Echinacea utilizan agua y etanol como disolventes de extracción, y se utilizan diferentes mezclas de etanol y agua para extraer diferentes ingredientes activos de plantas de Echinacea. Preferentemente, el material vegetal se extrae en un disolvente líquido en una relación (en peso) de una parte de material vegetal por cuatro partes de disolvente líquido. Sin embargo, también pueden hacerse extractos utilizando una relación de material vegetal a disolvente líquido tan alta como 2 partes de material vegetal por una parte de disolvente líquido. También se han preparado extractos de Echinacea utilizando una relación de material vegetal a disolvente líquido de una parte de material vegetal por veinte partes de disolvente líquido. Las extracciones con una relación de material vegetal a disolvente líquido tienen por resultado la extracción de una mayor cantidad de compuestos activos de la planta en una forma más diluida. Los extractos diluidos se concentran preferentemente para alcanzar las concentraciones deseadas de polisacáridos, alquilamidas y/o ácido cichórico.
Alternativamente, puede usarse dióxido de carbono supercrítico como disolvente no tóxico para extraer componentes biológicamente activos de plantas de Echinacea. El fluido supercrítico se hace circular a través del material vegetal hasta que la extracción ha tenido lugar todo lo completamente que se desee. Los extractos de Echinacea preparados usando fluido supercrítico de dióxido de carbono contienen en su mayor parte compuestos no polares (tales como aceites). Otros diversos disolventes de extracción (tales como propano y acetona) pueden ser añadidos al fluido supercrítico de dióxido de carbono con el fin de extraer una elevada proporción de componentes polares pero, para el consumidor consciente de su salud, solamente es aceptable la adición de agua y etanol.
En general, los recipientes de extracción utilizados para preparar extractos de Echinacea son grandes depósitos con una o más aberturas a través de las cuales los materiales vegetales y los disolventes de extracción pueden ser fácilmente cargados y retirados. Puede instalarse un mecanismo de agitación en el recipiente de extracción para que la extracción tenga lugar con agitación constante con el fin de reducir el tiempo de extracción. Se han utilizado con éxito recipientes de extracción tan pequeños como de 500 mL y tan grandes como de 3000 L. Los recipientes deben estar construidos de materiales resistentes a la degradación por etanol, preferentemente polipropileno y acero inoxidable.
En la práctica de los métodos para preparar extractos de Echinacea, preferentemente los extractos de Echinacea se concentran para reducir el espacio de almacenamiento, para aumentar la estabilidad al almacenamiento (es decir, reduciendo la cantidad de agua) y para conseguir las concentraciones deseadas de polisacáridos, alquilamidas y ácido cichórico. La etapa de concentración se optimiza preferentemente para reducir al mínimo la pérdida de actividad biológica de los polisacáridos, alquilamidas y ácido cichórico. Dado que las temperaturas elevadas causan la rápida degradación de muchos compuestos, la concentración se realiza normalmente a bajas temperaturas y bajo presión reducida. Normalmente se utiliza un evaporador rotatorio. Los recipientes de evaporación y reacción están típicamente en un tamaño entre 20 L y 100 L. Puede recuperarse entre el 5% y el 90% del disolvente usado para los extractos.
Los extractos líquidos de Echinacea pueden ser enriquecidos en uno o más miembros del grupo consistente en polisacáridos de Echinacea, alquilamidas de Echinacea y ácido cichórico. Los extractos de Echinacea enriquecidos en polisacáridos actualmente preferidos incluyen polisacáridos a una concentración mayor que aproximadamente 1% (p/v), más preferentemente mayor que aproximadamente 5% (p/v), y lo más preferentemente mayor que aproximadamente 10% (p/v). Los extractos de Echinacea enriquecidos en alquilamidas actualmente preferidos incluyen alquilamidas a una concentración mayor que aproximadamente 0, (p/v), más preferentemente mayor que aproximadamente 1,0% (p/v), y lo más preferentemente mayor que aproximadamente 3,0% (p/v). Los extractos de Echinacea enriquecidos en ácido cichórico actualmente preferidos incluyen ácido cichórico a una concentración mayor que aproximadamente 0,2% (p/v), más preferentemente mayor que aproximadamente 0,5% (p/v), y lo más preferentemente mayor que aproximadamente 3,0% (p/v).
Los extractos sólidos de Echinacea pueden ser enriquecidos en uno o más miembros del grupo consistente en polisacáridos de Echinacea, alquilamidas de Echinacea y ácido cichórico. Los extractos de Echinacea enriquecidos en polisacáridos actualmente preferidos incluyen polisacáridos a una concentración mayor que aproximadamente 0, más preferentemente mayor que aproximadamente 0,05% (p/p), y lo más preferentemente mayor que aproximadamente 20% (p/p). Los extractos de Echinacea enriquecidos en alquilamidas actualmente preferidos incluyen alquilamidas a una concentración mayor que aproximadamente 0,001% (p/p), más preferentemente mayor que aproximadamente 0,01% (p/p), y lo más preferentemente mayor que aproximadamente 0,5% (p/p). Los extractos de Echinacea enriquecidos en ácido cichórico actualmente preferidos incluyen ácido cichórico a una concentración mayor que aproximadamente 0,005% (p/p), más preferentemente mayor que aproximadamente 0,05% (p/p), y lo más preferentemente mayor que aproximadamente 1,5% (p/p).
Un extracto de polisacárido de Echinacea actualmente preferido incluye al menos 60% (en peso) de arabinosa y galactosa, y las moléculas de polisacárido tienen un peso molecular mayor que aproximadamente 10.000.
Un extracto de alquilamida de Echinacea actualmente preferido incluye más de aproximadamente un 70% (p/p) de isobutilamidas. Un extracto de alquilamida de Echinacea actualmente más preferido tiene una concentración de isobutilamida mayor que aproximadamente 70% (p/p) e incluye más de aproximadamente el 30% (p/p) de 2E, 4E, 8E, 10E/Z tetraeno-dodeca-isobutilamida.
Pueden formularse composiciones nutricionales para que proporcionen una dosis estandarizada de al menos dos, preferentemente tres, componentes de Echinacea. Los componentes de Echinacea actualmente preferidos son ácido cichórico, polisacáridos de Echinacea y alquilamidas de Echinacea. La dosis estandarizada de alquilamidas de Echinacea actualmente preferida es de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 100 mg, más preferentemente de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 40 mg, lo más preferentemente de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 1 mg; la dosis estandarizada de ácido cichórico actualmente preferida es de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 120 mg, más preferentemente de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 15 mg, lo más preferentemente de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 3 mg; la dosis estandarizada de polisacáridos de Echinacea actualmente preferida es de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 500 mg, más preferentemente de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 100 mg, lo más preferentemente de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 50 mg.
En el cuarto aspecto, la presente invención proporciona el uso de una composición de Echinacea en la elaboración de un medicamento para potenciar la actividad del sistema inmunitario en un mamífero. La composición se formula para proporcionar una dosis diaria efectiva de cantidades estandarizadas de ácido cichórico de Echinacea, alquilamidas de Echinacea y polisacáridos de Echinacea. Las cantidades estandarizadas de ácido cichórico de Echinacea son de
40 \mug/Kg de peso corporal a 2000 \mug/Kg de peso corporal, tales como de 120 \mug/Kg de peso corporal a 1000 \mug/Kg de peso corporal (p. ej 800 \mug/Kg de peso corporal). Las cantidades estandarizadas de alquilamidas de Echinacea son de 4 \mug/Kg de peso corporal a 200 \mug/Kg de peso corporal, tal como 12 \mug/Kg de peso corporal a 100 \mug/Kg de peso corporal (p. ej. 80 \mug/Kg de peso corporal). Las cantidades estandarizadas de polisacáridos de Echinacea son de 1 \mug/Kg de peso corporal a 50 mg/Kg de peso corporal, tales como de 3 mg/Kg de peso corporal a 30 mg/Kg de peso corporal (p. ej. 20 mg/Kg de peso corporal). A título de ejemplo no limitante, las composiciones de Echinacea como se describen en el presente texto son útiles para potenciar la actividad fagocítica de los macrófagos, potenciar la producción de óxido nítrico por los macrófagos, potenciar la producción de TNF-\alpha por los macrófagos, potenciar la producción de TNF-\gamma por los esplenocitos, y potenciar la producción de TNF-\alpha por los esplenocitos.
Los métodos para potenciar la actividad del sistema inmunitario en un mamífero pueden comprender administrar al mamífero una dosis diaria efectiva de un extracto de Echinacea elegido entre el grupo consistente en alquilamidas de Echinacea y polisacáridos de Echinacea. Las dosis diarias efectivas representativas de alquilamidas de Echinacea son de 0,5 \mug/Kg de peso corporal a 200 \mug/Kg de peso corporal, tales como de 12 \mug/Kg de peso corporal a 100 \mug/Kg de peso corporal (p. ej. 80 \mug/Kg de peso corporal). Una dosis diaria efectiva de polisacáridos de Echinacea es útil para potenciar la actividad fagocítica de los macrófagos, potenciar la producción de óxido nítrico por los macrófagos y/o potenciar la producción de TNF-\alpha por los macrófagos.
Las dosis diarias efectivas representativas de polisacáridos de Echinacea son de 125 \mug/Kg de peso corporal a
50 mg/Kg de peso corporal, tales como de 3 mg/Kg de peso corporal a 30 mg/Kg de peso corporal (p. ej. 20 mg/Kg de peso corporal). Una dosis diaria efectiva de polisacáridos de Echinacea es útil para potenciar la producción de TNF-\alpha por los macrófagos.
Los ejemplos que siguen simplemente ilustran el mejor modo que se contempla ahora para llevar a la práctica la presente invención, pero no han de considerarse como limitantes de dicha invención.
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Ejemplo 1 Extracción de alquilamidas de plantas de Echinacea
Las plantas de Echinacea se cultivan separadas aproximadamente 61 cm y se riegan una vez por semana hasta una semana antes de recolectar las flores. Preferentemente se recolectan las flores de plantas de Echinacea purpurea de dos y/o tres años de edad. Los conos de la flor de Echinacea purpurea totalmente madura se recolectan preferentemente a finales de agosto y típicamente se recogen aproximadamente 700 kg de flores de un campo de 40,5 áreas (1 acre).
Se maceran 500 kg de flores recién recogidas con un molino de martillo hasta tamaños de partículas de aproximadamente 1,5 cm^{3}, o más pequeñas, y después se extraen con aproximadamente 2000 kg de etanol al 75% durante 72 horas a 35°C. Las concentraciones de etanol y temperaturas más bajas reducen el rendimiento, mientras que concentraciones de etanol y temperaturas más altas incrementan los costes. El líquido y el material vegetal se agitan a 3 revoluciones por minuto con palas mecánicas rotatorias separadas aproximadamente 20 cm y que salen radialmente de un eje central en el recipiente de extracción. Al final del periodo de extracción, se sacan 2300 kg de extracto líquido de las flores extraídas.
El extracto líquido contiene ahora aproximadamente 0,6 mg/mL de alquilamidas. La concentración del extracto líquido a 25 mbar y 40°C durante 30 horas da aproximadamente 100 kg de concentrado líquido rico en alquilamida que tiene una concentración de alquilamida de aproximadamente 10 mg/mL. El concentrado se caracteriza por un color verde oscuro, debido a la presencia de clorofila de la planta, y típicamente contiene menos de aproximadamente 1 mg/mL de ácido cichórico y menos de aproximadamente 10 mg/mL de polisacáridos.
Ejemplo 2 Extracción de ácido cichórico de plantas de Echinacea
Las plántulas se germinan a partir de semillas seleccionadas no híbridas a finales de febrero y primeros de marzo, y se trasplantan a campos a mediados o finales de marzo. Las plantas están separadas aproximadamente 61 cm y se riegan dos veces por semana hasta la recolección. Se usa mantillo plástico negro para reducir el crecimiento de malezas y acelerar el crecimiento de la planta. Las semillas se eligen cuidadosamente ya que la contaminación con semillas de Echinacea angustifolia (o semillas de híbridos de E. angustifolia/E. purpurea) reducirá el rendimiento de ácido cichórico más de 20 veces a causa del aumento de la degradación enzimática. Las plantas se recolectan como plantas completas a finales de septiembre y los tallos, hojas y flores de las plantas se retiran para la extracción. Típicamente, 460 áreas de plantas de Echinacea purpurea dan aproximadamente 1000 kg de material vegetal. Preferentemente se recolectan plantas de Echinacea purpurea de un año de edad.
Se maceran 500 kg de las plantas recién recolectadas con un molino de martillos para producir tamaños de partícula de aproximadamente 1,5 cm^{2} a aproximadamente 4 cm^{2}. El material macerado se extrae con 2000 kg de etanol al 50% durante 30 horas a 25°C. Una concentración de etanol más baja y una temperatura de extracción más alta permiten que aumente la degradación, mientras que una concentración de etanol más alta y una temperatura más baja reducen el rendimiento. Continuamente se purga con gas nitrógeno través del líquido de extracción para reducir la cantidad de degradación de ácido cichórico. El líquido de extracción se hace circular a través de la malla vegetal mediante una bomba rotatoria con una capacidad de hasta 500 L por hora. Al final del periodo de extracción, pueden obtenerse
2100 kg de extracto líquido que tiene una concentración de ácido cichórico de aproximadamente 2,0 mg/ml.
La concentración del extracto líquido a 10 mbar y 35°C durante 20 horas da 100 kg de concentrado rico en ácido cichórico que tiene una concentración de ácido cichórico de 30 mg/mL. El concentrado se caracteriza por un color verde oscuro, que resulta de la presencia de clorofila de la planta, y contiene menos de 2 mg/mL de alquilamidas y menos de 20 mg/mL de polisacáridos.
Ejemplo 3 Extracción de polisacáridos de plantas de Echinacea
Las plantas se cultivan separadas aproximadamente 61 cm y se riegan una vez por semana hasta una semana antes de la recolección. Se recogen los conos de la flor de Echinacea purpurea totalmente madura a finales de agosto. Típicamente se recogen aproximadamente 700 kg de flores de un campo de 40,5 áreas de Echinacea purpurea. Preferentemente se recogen plantas de Echinacea purpurea de dos o tres años.
Se maceran 500 kg de flores recién recogidas con un molino de martillo hasta tamaños de partículas de aproximadamente 1,5 cm^{3}, o más pequeñas, y después se extraen con 2000 kg de etanol al 20% durante 72 horas a 55°C. Las concentraciones de etanol más altas y temperaturas más bajas reducen el rendimiento, mientras que concentraciones de etanol más bajas hacen aumentar la carga microbiana del extracto acabado y temperaturas más altas incrementan los costes. El líquido y el material vegetal se agitan a 3 revoluciones por minuto con palas mecánicas rotatorias separadas aproximadamente 20 cm, que salen radialmente de un eje central en el recipiente de extracción. Al final del periodo de extracción, se sacan 1900 kg del extracto líquido de las flores extraídas.
El extracto líquido típicamente contiene ahora aproximadamente 15 mg/mL de polisacáridos, que pueden concentrarse a 50 mbar y 60°C durante 15 horas para dar aproximadamente 200 kg de concentrado que tiene una concentración de polisacárido de aproximadamente 120 mg/mL. El concentrado se caracteriza por un color marrón oscuro, y típicamente contiene menos de aproximadamente 2 mg/mL de alquilamidas y menos de aproximadamente 2 mg/mL de ácido cichórico.
Ejemplo 4 Ensayo de polisacáridos extraídos de plantas de Echinacea
El método de ensayo de polisacáridos es una versión modificada del método expuesto en AOAC Oficial Methods of Analysis (1995), AOAC Oficial Method 988.12, "Dextran in Raw Cane Sugar", 44.1.30, "Part E–Phenol-H_{2}SO_{4} Test". El ensayo de polisacáridos puede llevarse a cabo en tubos de cultivo desechables de 13 x 100 mm. El volumen final de reacción del ensayo es 1,5 ml. Se añade a la muestra de polisacárido agua destilada un volumen de muestra de agua más polisacárido de 400 \mul. Entonces se añaden 100 \mul de una solución al 5% (p/v) de fenol de calidad reactivo a la muestra de polisacárido diluida, y se mezcla. Se añade entonces un mililitro de ácido sulfúrico concentrado (calidad reactivo, 95-98% de concentración) y se mezcla rápidamente en agitador de vórtice. Los tubos que contienen las muestras se ponen después en un baño de agua hirviendo durante dos minutos. Después se deja que los tubos se enfríen a temperatura ambiente durante 30 minutos y se mide la absorbancia de las muestras a 485 nanómetros (nm) frente a un blanco de agua destilada usando un espectrofotómetro. El espectrofotómetro debe ser capaz de leer con precisión valores de la absorbancia A_{485} en el margen de 0 a 1,5.
Se prepara un patrón de concentración de polisacáridos de Echinacea a partir de una extracción en agua de flores de Echinacea con precipitaciones en etanol de la manera siguiente. Se obtiene material de polisacárido de Echinacea concentrado como se describe en el Ejemplo 3 en el presente texto. El extracto se concentra más a aproximadamente 400 mg/mL de polisacáridos. Este concentrado se precipita después con 4 volúmenes de etanol al 95% a 4°C, durante la noche. El precipitado se separa mediante centrifugación y se redisuelve en un baño de agua a 35-40°C. El material que no se disuelve en esta etapa se desecha y el sobrenadante se precipita con un volumen de 30% (p/v) de ácido tricloroacético. El precipitado se retira de nuevo mediante centrifugación y el sobrenadante se precipita con cuatro volúmenes más de etanol. Los polisacáridos precipitados se disuelven en soluciones al 2% de acetato sódico y se precipitan por tercera vez con etanol. El sobrenadante se desecha y el precipitado se disuelve en agua para diálisis con tubos de diálisis Spectra/Por® de 10000 de peso molecular como valor de corte. Se lleva a cabo la diálisis durante tres días y el material restante se liofiliza para dar un material sólido con aspecto de pelusa.
Se disuelve un peso conocido del polisacárido liofilizado en un volumen conocido de agua, para dar un patrón de polisacáridos de Echinacea de concentración conocida. Se hacen diluciones de la solución patrón de polisacáridos de Echinacea y se mide la A_{485} de cada dilución con el fin de construir una curva estándar de absorbancia a 485 nanómetros frente a la concentración de polisacárido.
Ejemplo 5 Ensayo de alquilamidas extraídas de plantas de Echinacea
El método de ensayo de alquilamidas actualmente preferido es una modificación del método publicado por Bauer en Planta Medica, 55, 367-371 (1989). La fase móvil del método se cambió de acetonitrilo a metanol debido a problemas de precipitación de la muestra. El método utiliza un HPLC (cromatografía de líquidos de alto rendimiento) consistente en una bomba de gradiente, un muestreador automático y un detector de UV-visible. Preferentemente se utiliza un sistema HPLC Hewlett Packard Serie 1100 y un sistema HPLC Hewlett Packard Serie 1050. Se usa una columna C-18, preferentemente una columna ODS Hypersil de 125 x 4,0 mm, con una columna guarda de 4,0 mm x 4,0 mm coincidente. La fase móvil consiste en 60% de metanol y 40% de agua (v/v) al inicio del análisis, y cambia de forma lineal a 95% de metanol y 5% de agua en 12,5 minutos en el análisis. El tiempo total de funcionamiento es 19,0 minutos con 4 minutos de equilibrado post-funcionamiento. La fase móvil se bombea a 1,0 mL/minuto. Se inyectan muestras de 10 pL y se mide la absorbancia de la muestra a 254 nm. Las alquilamidas eluyen de la columna a un tiempo entre 2,0 minutos y 9,0 minutos. Más específicamente, la isobutilamida del ácido dodeca-2E, 4E, 8E, 10E/Z-tetranoico eluye a tiempos entre 5,0 y 8,0 minutos.
Un patrón de concentración de alquilamida se prepara preferentemente extrayendo 500 ml de concentrado líquido rico en alquilamida, preparado como se describe en el Ejemplo 3 en el presente texto, con 500 ml de éter de petróleo, a temperatura ambiente. La fracción de éter de petróleo se retira al cabo de un día y se evapora a sequedad bajo vacío, y resulta un residuo oleoso negro oscuro. El residuo se disuelve en el mínimo de metanol (aproximadamente 20 mL) y se centrifuga para separar los precipitados. Sílice funcionalizada con octadecilo se instala en una columna de vidrio. Se usa para la elución una fase móvil consistente en 70% de metanol y 30% de agua en volumen. El material preparado a partir del concentrado líquido se aplica a la columna y se recogen fracciones de 10 mL. En las fracciones se analiza el contenido de alquilamida usando el método de análisis descrito y se reúnen las fracciones que contienen una pureza de la alquilamida de interés del 90% y superior. Las fracciones reunidas se evaporan en evaporador rotatorio a 45°C para reducir el volumen total. Las fracciones de alquilamida purificadas de la elución de la columna se evaporan bajo vacío para dar un líquido transparente (de color amarillo). Se añade éter de petróleo al residuo y se calienta en un baño de agua caliente. El residuo y el líquido se tratan con ultrasonidos para saturar la solución con la alquilamida purificada. La solución saturada se recoge y se deja enfriar a temperatura ambiente. Después la solución se traslada a un congelador a -20°C. Se forman cristales durante la noche. 500 mL de solución saturada dan aproximadamente 0,1 a 5 g de cristales purificados, dependiendo de la solubilidad de la alquilamida específica.
El patrón de alquilamida purificada se disuelve a varias concentraciones y se hace pasar por una columna de HPLC como se describe en el presente texto. Se construye una curva de calibración a partir de las áreas de los picos resultantes frente a las concentraciones de las soluciones patrón de alquilamida. Las áreas de los picos de las muestras de alquilamida de concentración desconocida se comparan frente a la curva de calibración para determinar la concentración de cada muestra.
Ejemplo 6 Análisis del ácido cichórico extraído de plantas de Echinacea
El método de análisis de ácido cichórico es una modificación del método publicado por Bauer en Planta Medica, 57, 447-449 (1991). La fase móvil del método se cambió de acetonitrilo a metanol debido a problemas de precipitación de la muestra. El método utiliza una HPLC (cromatografía de líquidos de alto rendimiento) consistente en una bomba de gradiente, un muestreador automático y un detector de UV-visible. En este caso, se utiliza un sistema HPLC Hewlett Packard Serie 1100 y un sistema HPLC Hewlett Packard Serie 1050. Se usa una columna C-18, en este caso una columna ODS Hypersil de 125 x 4,0 mm, con una columna guarda en coincidencia de 4,0 mm x 4,0 mm. La fase móvil consiste en 7,0% de metanol y 93,0% de agua con 0,1% de ácido fosfórico (v/v) al inicio del análisis, y cambia de forma lineal a 32% de metanol y 68% de agua con 0,1% de ácido fosfórico (v/v) a los 11,6 minutos en el análisis, que después cambia a 40,7% de metanol y 59,3% de agua con 0,1% de ácido fosfórico a los 19,1 minutos. El tiempo total de funcionamiento es 22,0 minutos con 3,5 minutos de equilibrado post-funcionamiento. La fase móvil se bombea a 1,0 mL/minuto. Se inyectan muestras de 10 pL y se recogen los datos a 330 nm. El área de pico de la muestra se compara frente a un patrón químico purificado para cuantificación. Los derivados del ácido cafeico eluyen de la columna a tiempos entre 7,0 minutos y 18,0 minutos. Más específicamente, el ácido cichórico eluye entre 14,5 y 17,0 minutos.
Se prepara un patrón de concentración de ácido cichórico de la siguiente manera. El concentrado líquido de ácido cichórico, preparado como se describe en el Ejemplo 2 en el presente texto, se reduce en volumen aún más mediante destilación a vacío a 50°C. Los polisacáridos se separan por precipitación con isopropanol usando 2 partes de isopropanol y 1 parte de concentrado de destilado. Se separa el sobrenadante y se evapora el isopropanol mediante destilación bajo vacío a 37°C. Se añade agua destilada a dos veces el volumen del concentrado y se ajusta el pH del concentrado en pH 0-1 con ácido clorhídrico concentrado. El ácido cichórico se purifica más mediante elución a través de una columna lipófila de Sephadex LH-20 con metanol al 100% como fase móvil. Las fracciones con una pureza en ácido cichórico de más del 90%, según análisis por el método descrito anteriormente, se reúnen. Las fracciones reunidas se reducen a sequedad bajo vacío y después se redisuelven en una cantidad mínima de agua hirviendo. El ácido cichórico se separa por cristalización en forma de agujas blancas cortas al enfriarse.
El patrón de ácido cichórico purificado se disuelve a varias concentraciones y se pasa a través de una columna de HPLC como se describe en el presente texto. Se construye una curva de calibración a partir de las áreas de los picos resultantes frente a las concentraciones de las soluciones patrón de ácido cichórico. Las áreas de los picos de muestras de ácido cichórico de concentración desconocida se comparan frente a la curva de calibración para determinar la concentración de cada muestra.
Ejemplo 7 Ejemplos de composiciones de Echinacea de la presente invención
A título de ejemplo representativo, se preparan composiciones comerciales mezcladas de Echinacea de la presente invención de la manera siguiente. Un concentrado rico en alquilamida (preparado de acuerdo con el Ejemplo 1, en el presente texto), un concentrado rico en ácido cichórico (preparado de acuerdo con el Ejemplo 2, en el presente texto), y un concentrado rico en polisacárido (preparado de acuerdo con el Ejemplo 3, en el presente texto), se combinan en las relaciones en volumen 0,4:0,2:0,4, respectivamente. Los concentrados se mezclan con un mezclador motorizado para obtener un producto homogéneo. En una realización actualmente preferida, este concentrado líquido combinado contiene 5,2 mg/mL de alquilamidas, 7,2 mm/ml de ácido cichórico y 56 mg/ml de polisacáridos. Esta composición mezclada se usa para preparar composiciones comerciales de Echinacea de la forma siguiente:
(a)
Se prepara una composición líquida comercial de Echinacea libre de alcohol evaporando más la composición mezclada de Echinacea para eliminar el etanol, y diluyendo después la composición evaporada diez veces añadiendo nueve veces el volumen de glicerina al 70% (p/p). El material resultante se mezcla intensamente para dar un producto que contiene 0,52 mg/mL de alquilamidas, 0,72 mg/mL de ácido cichórico, y 5,6 mg/mL de polisacáridos.
(b)
Se prepara una composición líquida comercial de Echinacea diluyendo 10 veces la composición mezclada de Echinacea mediante la adición de 9 veces el volumen de etanol al 40% (p/p). El material resultante se mezcla intensamente para dar un producto que contiene 0,52 mg/mL de alquilamidas, 0,72 mg/mL de ácido cichórico, y 5,6 mg/mL de polisacáridos.
(c)
Se preparan cápsulas de gelatina blanda líquida comercial de Echinacea diluyendo 10 veces la composición mezclada de Echinacea mediante la adición de 9 veces el volumen de una mezcla de 30% de lecitina y 70% de aceite de soja. El material resultante se mezcla intensamente y después se encapsula en cápsulas de gelatina blanda a razón de 1,0 mL por cápsula para dar un producto que contiene 0,52 mg de alquilamidas por cápsula, 0,72 mg de ácido cichórico por cápsula, y 5,6 mg de polisacáridos por cápsula.
(d)
Se preparan polvos liofilizados de Echinacea mezclando la composición de Echinacea mezclada con 9 veces su volumen de agua, y después liofilizando con fosfato tricálcico al 10% (p/p) como vehículo. Se obtiene una torta seca después de 30 horas de liofilización. Se obtiene un polvo suelto, una vez que las tortas liofilizadas se muelen a través de un molino de cono de 100 pm, que incluye 2,6 mg/g de alquilamidas, 3,6 mg/g de ácido cichórico y 2,8 mg/g de polisacáridos.
(e)
Se preparan polvos de Echinacea microencapsulados mezclando la composición de Echinacea mezclada con 1% (v/v) de vitamina E para la estabilidad y después microencapsulando la mezcla con un recubrimiento de celulosa y cera a 50% de llenado (p/p) con cápsulas que tienen un promedio de tamaño de 100 pm. Las microcápsulas aparecen como un polvo suelto (fluible) con una composición de 2,6 mg/g de alquilamidas, 3,6 mg/g de ácido cichórico y 2,8 mg/g de polisacáridos.
(f)
Se preparan cápsulas de gelatina dura de Echinacea mezclando el polvo liofilizado (descrito en la sección (d) de este ejemplo) o el polvo microencapsulado (descrito en la sección (e) de este ejemplo) con cinco partes en peso de celulosa microcristalina y 2% (p/p) de estearato de magnesio. El polvo resultante se encapsula en cápsulas de 1000 mg para proporcionar 0,52 mg de alquilamidas por cápsula, 0,72 mg de ácido cichórico por cápsula y 5,6 mg de polisacáridos por cápsula.
(g)
Se preparan comprimidos de Echinacea mezclando el polvo liofilizado (descrito en la sección (d) de este ejemplo) o el polvo microencapsulado (descrito en la sección (e) de este ejemplo) con tres partes (en peso) de fosfato dicálcico, dos partes (en peso) de celulosa microcristalina y 3% (p/p) de estearato de magnesio. El polvo resultante se prensa en comprimidos de 1000 mg para proporcionar 0,52 mg de alquilamidas por comprimido, 0,72 mg de ácido cichórico por comprimido y 5,6 mg de polisacáridos por comprimido.
Ejemplo 8 Efectos de las composiciones de Echinacea de la presente invención y extractos sobre la función inmunitaria
Los datos expuestos en estos ejemplos indican que los extractos y composiciones de Echinacea de la presente invención estimulan varios aspectos del sistema inmunitario de la rata.
Mantenimiento de los animales y muestreo de los tejidos. Ratas Sprague-Dawley jóvenes, adultas y machos (de aproximadamente 240 g cada una) fueron aclimatadas en el laboratorio durante una semana antes de administrar el material de ensayo. Cien microlitros del material de ensayo de varias concentraciones, como se especifica en el presente texto, fueron administrados a cada animal a través de una sonda de cebado, dos veces al día durante 4 días. Se sacaron muestras de sangre y tejidos de los animales el quinto día, para su análisis. Cada grupo de ensayo incluía ocho animales cuyos resultados de ensayo fueron promediados.
Material de ensayo: La muestra testigo administrada a los animales era una mezcla de etanol y agua. Uno de los siguientes materiales de ensayo fue administrado a cada animal (los niveles de dosis, expresados como microgramos (jig) de material de ensayo por kilogramo (kg) de peso corporal del animal de ensayo, se exponen en la Tabla 1): uno de cuatro niveles de dosis de extracto de alquilamida de Echinacea, uno de cuatro niveles de dosis de extracto de ácido cichórico de Echinacea, uno de cuatro niveles de dosis de extracto de polisacárido de Echinacea, o uno de cuatro niveles de dosis de una composición de Echinacea que incluye extractos de alquilamida, ácido cichórico y polisacáridos de Echinacea.
La composición de Echinacea contenía los tres extractos listados en la Tabla 1 en las cantidades especificadas para la dosis diaria. Por ejemplo, la dosificación diaria de nivel 1 de la composición de Echinacea, que no está incluida en el alcance de la presente invención, proporcionó 0,5 \mug/kg de alquilamida, 5,0 \mug/kg de ácido cichórico y
125 \mug/kg de polisacáridos. La composición de Echinacea se preparó mezclando los tres extractos de Echinacea purpurea (alquilamidas, ácido cichórico y polisacáridos) que fueron preparados como se describe en los Ejemplos 1-3 en el presente texto.
TABLA 1
100
Tratamiento de la sangre: Se obtuvo la sangre de los animales de ensayo mediante punción cardíaca y se guardó en un tubo vacutainer con EDTA, que se centrifugó a 3000 rpm durante 10 minutos para separar el plasma. El plasma se almacenó en un tubo de plástico con tapón a -30°C hasta su uso.
Preparación de los esplenocitos: Los bazos de los animales se prensaron a través de una malla de nilón en solución fría de Krebs-Ringer-HEPES (KRH) suplementada con 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA), y se recogieron en tubos de 50 mL. Las células recogidas fueron entonces centrifugadas a 4°C durante 10 minutos a 2000 rpm, y se decantó el sobrenadante. Se añadió a las células un mililitro de tampón para lisis ACK (que contiene cloruro de aluminio y potasio). Las células se lavaron después dos veces con 50 mL de KRH + BSA. Después se resuspendieron las células en 1 mL de CCM (Complete Culture Médium: medio de cultivo completo que contiene RPMI-1640 y 4% de suero de ternera fetal. El RPMI-1640 es un sistema tampón basado en bicarbonato desarrollado por Moore y Woods como se describe en Tissue Culture Association Manual, 3: 503-508 (1976)) con penicilina, estreptomicina, anfotericina, glutamina, 2-mercaptoetanol y HEPES, cada uno de los cuales componentes estaban presentes en una concentración de 1% (v/v). Las células se diluyeron a 3,0-5,0 x 10^{6}/mL y se activaron con 20 pL de Concanavalina A (ConA) (10 \mug/mL) y se incubaron durante 48 horas. Al cabo de 48 horas, las células se centrifugaron y el sobrenadante se recogió y se congeló a -30°C para ensayos de citosina y óxido nítrico.
Preparación de macrófagos alveolares: Se obtuvieron los macrófagos alveolares por lavado broncoalveolar con 40 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células se centrifugaron a 4°C durante 20 minutos a 2000 rpm y se desechó el sobrenadante. Entonces se añadió 1 mL de ACK y después se lavó tres veces con PBS fría. Las células se suspendieron después en 1 mL de RPMI suplementado con 10% de suero de ternera fetal. Las células se diluyeron a 5-10 x 10^{6} células/mL, y 100 \muL de las células diluidas se incubaron durante 2 horas a 37°C en placas de microtítulo de fondo en V. El sobrenadante se desechó y las placas de microtitulo se lavaron 3 veces con PBS. Se añadieron 200 \muL de LPS para activar las células y después se incubaron las células durante 24 horas. El sobrenadante se recogió después de la incubación y se congeló a -30°C para ensayos de citocina y óxido nítrico.
Ensayo de fagocitosis: Los macrófagos se incubaron durante 3 horas a 37°C para adhesión. Después se lavaron 3 veces con RPMI al 10% y se añadieron esferas de látex a una concentración de 2,5 x 10^{6} esferas/200 \muL. Las células se incubaron durante una hora más y se lavaron 5 veces con RPMI. Se tiñeron las células y se determinó la fagocitosis mediante examen microscópico.
Ensayo del óxido nítrico: Se preparó una solución madre de nitrito sódico 4 mM y se diluyó a 1 mM con tampón de CCM al 4% inmediatamente antes de usarla. La solución madre de nitrito sódico se usó a varias concentraciones para construir una curva de calibración lineal. Se preparó reactivo de Griess disolviendo 0,5 g de sulfanilamida y
6 mL de ácido fosfórico al 85% en 100 mL de agua, y disolviendo 0,05 g de N-(1-naftil)etil-endiamina en 100 mL de agua. Los sobrenadantes de los macrófagos o los esplenocitos se añadieron al reactivo de Griess y se dejaron reposar durante 10 minutos. Se midió la absorbancia a 540 nm y la concentración de óxido nítrico se calculó a partir de la curva estándar de nitrito sódico.
Ensayos de TNF-\alpha, INF-\gamma e Interleucina-2. Los anticuerpos se obtuvieron de uno cualquiera de los suministradores siguientes: Sigma Chemicals, Box 14508 St. Louis, Missouri 63178, EE.UU.; R&D Systems, o PharMagen, 6300 Kitimat Road, Unit 1, Mississauga, Ontario L5N 5M1, Canadá. Los ensayos se llevaron a cabo usando un protocolo estándar de ELISA.
Efectos de las composiciones de Echinacea de la invención y extractos sobre la actividad fagocítica y el índice fagocitico en macrófagos alveolares: Como se muestra en la Figura 1, todos los niveles de dosificación (niveles 2 a 5 como se exponen en la Tabla 1) de la composición de Echinacea descrita en este ejemplo produjeron un aumento en la actividad fagocítica y el índice fagocítico de macrófagos alveolares. Como se muestra más claramente en la Figura 2, a medida que aumenta la dosificación también lo hace la magnitud del efecto sobre la actividad fagocítica y el índice fagocítico.
Como se muestra en la Figura 3, un extracto de ácido cichórico de Echinacea, preparado como se describe en el Ejemplo 2 en el presente texto y administrado a ratas a los niveles de dosificación 1-4 como se exponen en la Tabla 1, no tuvo efecto significativo sobre la actividad fagocítica ni sobre el índice fagocítico de macrófagos alveolares de la rata. Del mismo modo, como se muestra en la Figura 4, un extracto de polisacárido de Echinacea, preparado como se describe en el Ejemplo 3 en el presente texto y administrado a ratas a los niveles de dosificación 1-4 como se exponen en la Tabla 1, no tuvo efecto significativo sobre la actividad fagocítica ni sobre el índice fagocítico de macrófagos alveolares de la rata.
En cambio, como se muestra en la Figura 5, un extracto de alquilamidas de Echinacea, preparado como se describe en el Ejemplo 1 en el presente texto y administrado a ratas a los niveles de dosificación 1-4 como se exponen en la Tabla 1, potenció tanto la actividad fagocítica como el índice fagocítico de macrófagos alveolares de la rata, comparando con ratas testigo tratadas con una mezcla de etanol y agua. En particular, al nivel de dosis 3 el extracto de alquilamida incrementó de forma significativa tanto la actividad como el índice fagocítico de los macrófagos, con un aumento de hasta el 60% de la actividad y un aumento del índice del 50%, en comparación con los testigos. La Figura 6 muestra una comparación del efecto sobre el índice fagocítico de la composición de Echinacea descrita en este Ejemplo, y los extractos individuales de ácido cichórico, alquilamida y polisacárido de Echinacea. De la Figura 6 está claro que la composición de Echinacea mostró una actividad sinérgica estadísticamente significativa en comparación con los compuestos individuales.
Efectos de las composiciones de Echinacea de la presente invención y extractos sobre la producción de óxido nítrico por los macrófagos alveolares: Como se muestra en la Figura 1, los niveles de dosificación 3-5, como se exponen en la Tabla 1, de la composición de Echinacea descrita en este Ejemplo, produjeron un aumento en la producción de óxido nítrico por los macrófagos alveolares. A medida que aumentó la dosificación, hizo lo mismo la magnitud del nivel de óxido nítrico.
Como se muestra en la Figuras 3 y 4, los extractos de ácido cichórico y polisacárido de Echinacea preparados como se describe en los Ejemplos 2 y 3 en el presente texto, no hicieron aumentar significativamente el nivel de producción de óxido nítrico por los macrófagos alveolares. En cambio, como se muestra en la Figura 5, los niveles de dosificación 1-4 (especialmente los niveles de dosificación 3 y 4) de un extracto de alquilamidas de Echinacea, preparado como se describe en el Ejemplo 1 en el presente texto, produjeron un aumento significativo en el nivel de óxido nítrico producido por los macrófagos alveolares.
Efectos de composiciones de Echinacea de la invención y extractos sobre la producción de TNF-\alpha en macrófagos: Como se muestra en la Figura 1, la composición de Echinacea descrita en este Ejemplo produjo un aumento en la producción de TNF-\alpha por los macrófagos alveolares en dosificaciones por encima del nivel 4. Inicialmente la producción de TNF-\alpha aumenta al aumentar la dosificación de la composición de Echinacea, y después la respuesta disminuye. Como se muestra en la Figura 7, la dosificación óptima de composición de Echinacea está entre el Nivel 3 y el Nivel 4.
Como se muestra en la Figura 3, el extracto de ácido cichórico de Echinacea, preparado como se describe en el Ejemplo 2 en el presente texto, no aumentó significativamente el nivel de producción de TNF-\alpha por los macrófagos alveolares. En cambio, como se muestra en las Figuras 4 y 5, el extracto de polisacárido de Echinacea y el extracto de alquilamida de Echinacea, preparados como se describe en los Ejemplos 3 y 1 en el presente texto, causaron ambos un aumento significativo en el nivel de TNF-\alpha producido por los macrófagos alveolares. El efecto estimulador del extracto de alquilamida fue especialmente intenso en el nivel de dosificación 3. Sin embargo, en el nivel 4 de dosificación de alquilamida, la producción de TNF-\alpha volvió a ser la de los testigos. Esto podría ser una consecuencia del aumento pronunciado de la producción de óxido nítrico a esta dosis.
Efectos de las composiciones de Echinacea de la presente invención y extractos sobre la producción de IFN-\gamma en los esplenocitos: Como se muestra en la Figura 1, todos los niveles de dosificación (niveles 2 a 5 como se exponen en la Tabla 1) de la composición de Echinacea descrita en este Ejemplo causaron un aumento en la producción de IFN-\gamma por los esplenocitos. Los efectos más pronunciados fueron en los niveles de dosificación 4 y 5.
Como se muestra en las Figuras 3 a 5, los extractos de ácido cichórico, alquilamida y polisacárido de Echinacea no causaron un aumento significativo en la producción de IFN-\gamma por los esplenocitos.
Efectos de las composiciones de Echinacea de la presente invención y extractos sobre la producción de TNF-\alpha en los esplenocitos: Como se muestra en la Figura 1, el nivel de dosificación 5 de la composición de Echinacea descrita en este Ejemplo causó un aumento significativo en la producción de TNF-\alpha por los esplenocitos.
Efectos de las composiciones de Echinacea de la presente invención y extractos sobre la producción de IL-2 en los esplenocitos: Como se muestra en la Figura 1, los niveles de dosificación 2 y 3 de la composición de Echinacea descrita en este Ejemplo suprimió la producción de IL-2 en los esplenocitos, mientras que los niveles de dosificación 4 y 5 dieron un valor próximo al de los testigos para la producción de IL-2. El efecto supresor se observa con mayor claridad en la Figura 8, que muestra una representación de la producción de IL-2 por los esplenocitos de rata frente a la concentración relativa de la composición de Echinacea. La supresión de la IL-2 tiene por resultado la supresión de la respuesta inflamatoria que puede reducir la gravedad de los síntomas de las enfermedades inflamatorias (y puede mejorar los síntomas de la diabetes de aparición tardía).
Como se muestra en las Figuras 3 a 5, los extractos de ácido cichórico, alquilamida y polisacárido de Echinacea no afectaron a la producción de IL-2 en los esplenocitos.

Claims (16)

1. Una composición de Echinacea que comprende de 0,2 mg/ml a 500 mg/ml de ácido cichórico, de 0,02 mg/mL a 50 mg/ml de alquilamidas de Echinacea, y de 5,6 mg/ml a 800 mg/ml de polisacáridos de Echinacea, estando dicha composición en forma líquida.
2. La composición de Echinacea según la reivindicación 1ª, que comprende de 0,3 mg/ml a 30 mg/ml de ácido cichórico, de 0,05 mg/mL a 50 mg/ml de alquilamidas de Echinacea, y de 20 mg/ml a 800 mg/ml de polisacáridos de Echinacea.
3. La composición de Echinacea según la reivindicación 2ª, que comprende de 5 mg/ml a 30 mg/ml de ácido cichórico, de 0,8 mg/mL a 50 mg/ml de alquilamidas de Echinacea, y de 50 mg/ml a 800 mg/ml de polisacáridos de Echinacea.
4. Una composición de Echinacea que comprende de 0,01 mg/g a 500 mg/g de ácido cichórico, de 0,005 mg/g a 100 mg/g de alquilamidas de Echinacea, y de 5 mg/g a 900 mg/g de polisacáridos de Echinacea, estando dicha composición en forma sólida o de gel.
5. La composición de Echinacea según la reivindicación 4ª, que comprende de 0,05 mg/g a 500 mg/g de ácido cichórico, de 0,01 mg/g a 100 mg/g de alquilamidas de Echinacea, y de 10 mg/g a 900 mg/g de polisacáridos de Echinacea.
6. La composición de Echinacea según la reivindicación 5ª, que comprende de 15 mg/g a 500 mg/g de ácido cichórico, de 5 mg/g a 100 mg/g de alquilamidas de Echinacea, y de 200 mg/g a 900 mg/g de polisacáridos de Echinacea.
7. Un método para preparar una composición de Echinacea que comprende combinar una cantidad de ácido cichórico, una cantidad de alquilamidas de Echinacea y una cantidad de polisacáridos de Echinacea para dar una composición de Echinacea que incluye de 0,2 mg/ml a 500 mg/ml de ácido cichórico, de 0,02 mg/mL a 50 mg/ml de alquilamidas de Echinacea, y de 10 mg/ml a 800 mg/ml de polisacáridos de Echinacea, o de 0,01 mg/g a 500 mg/g de ácido cichórico, de 0,005 mg/g a 100 mg/g de alquilamidas de Echinacea, y de 5 mg/g a 900 mg/g de polisacáridos de Echinacea.
8. Una composición de Echinacea según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 6ª para ser usada en la potenciación de la actividad del sistema inmunitario en un mamífero.
9. El uso de una composición de Echinacea en la elaboración de un medicamento para potenciar la actividad del sistema inmunitario en un mamífero, en donde la composición de Echinacea se formula para que proporcione una dosificación diaria de 40 \mug/Kg de peso corporal a 2000 \mug/Kg de peso corporal de ácido cichórico, de 4 \mug/Kg de peso corporal a 200 \mug/Kg de peso corporal de alquilamidas de Echinacea y de 1 mg/Kg de peso corporal a 50 mg/Kg de peso corporal de polisacáridos de Echinacea.
10. El uso según la reivindicación 9ª, en el que dicha dosificación diaria de ácido cichórico de Echinacea es de
120 \mug/Kg de peso corporal a 1000 \mug/Kg de peso corporal, dicha dosificación diaria de alquilamidas de Echinacea es de 12 \mug/Kg de peso corporal a 100 \mug/Kg de peso corporal y dicha dosificación diaria de polisacáridos de Echinacea es de 3 mg/Kg de peso corporal a 30 mg/Kg de peso corporal.
11. El uso según la reivindicación 10ª, en el que dicha dosificación diaria de ácido cichórico de Echinacea es
800 \mug/Kg de peso corporal, dicha dosificación diaria de alquilamidas de Echinacea es de 80 \mug/Kg de peso corporal y dicha dosificación diaria de polisacáridos de Echinacea es de 20 mg/Kg de peso corporal.
12. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 8ª a 11ª, en el que dicho medicamento es para potenciar la actividad fagocítica de los macrófagos.
13. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 8ª a 11ª, en el que dicho medicamento es para potenciar la producción de óxido nítrico de los macrófagos.
14. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 8ª a 11ª, en el que dicho medicamento es para potenciar la producción de TNF-\alpha por los macrófagos.
15. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 8ª a 11ª, en el que dicho medicamento es para potenciar la producción de IFN-\gamma por los esplenocitos.
16. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 8ª a 11ª, en el que dicho medicamento es para potenciar la producción de TNF-\alpha por los esplenocitos.
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