DE3744570A1

DE3744570A1 - Pharmazeutische zubereitungen mit immunstimulierender wirkung und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE3744570A1
Application number: DE19873744570
Authority: DE
Inventors: Rudolf Dr Bauer; Hildebert Prof Dr Wagner
Original assignee: LOHMANN RUDOLF LOMAPHARM
Current assignee: LOHMANN RUDOLF LOMAPHARM
Priority date: 1987-12-30
Filing date: 1987-12-30
Publication date: 1989-07-13

Description

Die Erfindung betrifft pharmazeutische Zubereitungen mit immunstimulie render Wirkung und Verfahren zu ihrer Herstellung.

Die Immunstimulation als therapeutisches Konzept ist in der Medizin seit langem bekannt. Im allgemeinen versteht man darunter die Verabreichung von Substanzen, die selbst nur eine geringe bzw. überhaupt keine antigene Wirkung aufweisen, die jedoch in der Lage sind, auf unspezifische oder auch spezifische Art und Weise die körpereigenen Abwehrmechanismen zu induzieren. Nach heutigen Erkenntnissen ist eine Vielzahl von Stoffen in der Lage, die Immunabwehr zu stimulieren, wobei insbesondere verschiedene Mineralien, zum Beispiel Al (OH)₃, MgSO₄, Beryllium, pflanzliche Öle mit oder ohne Zusatz von Mykobakterien sowie eine Reihe von pflanzlichen Wirkstoffgruppen wie Alkaloide, Sesqui- und Diterpenverbindungen, Chinone und Polysacharide zu nennen sind. Der gesamte Komplex der Immunstimulie rung wird ausführlich beschrieben von z. B. Chedid, L., et al. Immun stimulation, Springer-Verlag, Heidelberg/New York 1980; Heidelberger, M., Structure and Immunological Specificity of Polysaccharides; Fortschritte d. Chem. org. Naturst. 42, 288 (1982); Drews, H., Möglichkeiten der Immunstimulation, Swiss Pharma 2, 9, (49) (1980).

Die genaue Wirkungsweise immunstimulierender Substanzen konnte in den meisten Fällen bis heute nicht endgültig geklärt werden. Generell zeigen diese Substanzen unter anderem einem Einfluß auf die Proliferation der immunkompetenten Zellen, wobei sie jedoch keine Gedächtnisreaktion hin terlassen. Dies bedeutet, daß als Wirkungsziele für die immunstimulierenden Substanzen die Makrophagen und Granulozyten sowie T- und B-Lymphozyten im Vordergrund stehen. Die Wirkung kann auf direktem oder indirektem Wege, z. B. über das Komplementsystem oder über Lymphozyten, über die Produktion von Interferon oder lysosomaler Enzyme (z. B. Lymphokine, colony stimulating factor und andere), sowie über eine Steigerung von Makro- und Mikrophagozytose erfolgen. Wegen der Verflechtung von unspezi fischen und spezifischen Abwehrmechanismen ist dabei immer mit Kaskaden effekten und der gleichzeitigen Beeinflussung mehrerer Abwehrsysteme zu rechnen.

In der Medizin ergeben sich als bevorzugte Anwendungsgebiete für die Immunstimulation vor allem die Therapie von Mischinfektionen, chroni schen, persistierenden, chemotherapie-resistenten, bakteriellen und vi ralen Infektionen, die Prophylaxe von opportunistischen Infektionen bei Risikopatienten, die Therapie der malignen Erkrankungen und in gewissem Umfang auch die Behandlung von Autoimmunerkrankungen. Immunstimulatien können auch bei der Zytostatika-Therapie zur teilweisen Kompensation der damit verbundenen Immunsuppression eingesetzt werden.

In diesem Zusammenhang haben auch Echinacea-Präparate eine immer größere Bedeutung erlangt. In der pharmazeutischen Stoffliste (7. Auflage, Werbe- und Vertriebsgesellschaft Deutscher Apotheker mbH, Frankfurt/Main 1986) und der Präparateliste der Naturheilkunde (6. Jahrgang, Sommer-Verlag GmbH, Teningen 1986) sind ca. 230 Präparate aufgeführt, die Zubereitungen aus Echinacea purpurea, Echinacea angustifolia bzw. Echinacea pallida enthalten. Bei Echinacea angustifolia bzw. Echinacea pallida werden vor allem ethanolisch/wäßrige Extrakte aus den Wurzeln verwendet. Dagegen werden bei Echinacea purpurea sowohl das Kraut als auch die Wurzeln ein gesetzt.

Als Hauptanwendungsgebiete für Echinacea-haltige Präparate werden grip pale Infekte, Entzündungen, chronische Polyarthritis, Blasenerkrankungen, schlecht heilende Wunden und die adjuvante Tumortherapie angegeben. Er folge bei der prophylaktischen und therapeutischen Anwendung werden der Stimulierung der körpereigenen Abwehrkräfte zugeschrieben, vergleiche G. Har nischfeger und H. Stolze in Notabene Medici, 10. Jahrgang, November 1980, 11 : 484.

Als immunologisch wirksame Inhaltsstoffgruppe von Echinacea sind die Polysaccharide bekannt, vgl. Wagner et al., Arzneimittelforschung/Drug Research 35, 1069 (1985). Diese Autoren isolierten und charakterisierten zwei Polysaccharide aus E. purpureae herba, bei denen es sich um ein 4-O-Methyl-glucurono-arabinoxylan mit einem Molekulargewicht von ca. 35 000 D, und ein Arabinorhamnogalaktan mit einem mittleren Molekular gewicht von 450 000 D handelt. Sie stimulieren in vitro und in vivo die Phagozytose von Granulozyten und aktivieren Makrophagen zu einer erhöh ten Zytotoxität gegenüber Tumorzellen. In den im Handel befindlichen wäßrig-ethanolischen Extrakten sind diese Polysaccharide auf Grund ihrer Fällbarkeit mit Alkohol nicht enthalten. Mit ihrer Anwesenheit ist des halb nur in Preßsäften oder in Extrakten zu rechnen, die mit einem sehr hohen Wasseranteil hergestellt werden.

Die Nachteile der bisher im Handel befindlichen Echinacea-Präparate lie gen vor allem darin, daß sie die Inhaltsstoffe nur in geringen oder schwankenden Anteilen enthalten, weshalb diese chemisch nicht exakt stan dardisierbaren Präparate einen gezielten therapeutischen Einsatz mit re produzierbaren Resultaten nicht zulassen.

Es wurde nunmehr eine Wirkstoffgruppe gefunden, die überraschend eine Steigerung der Immunabwehr, im besonderen eine Steigerung der Phagozytose- Rate des monozytären Systems, bewirkt. Bei dieser Wirkstoffgruppe handelt es sich um in 2- und/oder 3-Stellung mit Phenolcarbonsäureresten acylierte Derivate der Weinsäure bzw. Estern der Weinsäure mit niedrigen Alkoholen (C₁ bis C₄), wobei es sich bei den Phenolcarbonsäuren um einfach oder mehrfach hydroxylierte und/oder methoxylierte Derivate der Zimtsäure und der Benzoesäure handelt, sowie deren Isomeren der allge meinen Formel:

in der

R = H oder einen C₁-C₄-Alkylrest,
R₁ = H oder einen Acylrest von einfach oder mehrfach hydroxilierten und/oder methoxylierten Derivaten der Zimt- oder Benzoesäure, und
R₂ = H oder einen Acylrest von einfach oder mehrfach hydroxylierten und/oder methoxylierten Derivaten der Zimt- oder Benzoesäure be deuten.

Als Ausgangsmaterial zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Wirkstoffgruppe können Wurzeln und/oder oberirdische Teile von botanisch exakt bestimmten Echinacea purpurea, Echinacea angustifolia und Echinacea pallida Pflanzen verwendet werden. (Echinacea purpurea und Echinacea pallida können über die Landesanstalt für Bodenkultur und Pflanzenbau in Frei sing/Weihenstephan und Echinacea angustifolia von der Trout Lake Farm, Washington, USA, bezogen werden).

An Stelle der aus Kulturen stammenden Pflanzen können auch Handelsdrogen verwendet werden, soweit diese botanisch exakt bestimmt wurden.

Neben der botanischen Bestimmung können auch die HPLC-Fingerprints für die Differenzierung herangezogen werden, wobei insbesondere auf die Ver fälschung mit Parthenium integrifolium geprüft werden muß.

Herstellung

Die an der Luft getrockneten ganzen Pflanzenteile von Echinacea purpurea, Echinacea pallida oder Echinacea angustifolia werden zerkleinert und an schließend in einer Mühle pulverisiert. Das Pulver (Siebweite 500 µm) wird in einer Soxhlet-Apparatur mit einem Alkohol (bis 4 C-Atome) extrahiert und anschließend eingeengt. Nach Bestimmung der Extraktausbeute wird der Rückstand vorzugsweise in 90% Ethanol gelöst. Zur Gewinnung der wäßrigen Fraktion wird diese Lösung 1 : 1 bis 1 : 3 mit Wasser verdünnt und dann mindestens einmal mit Chloroform oder anderen lipophilen Lösungsmitteln (z. B. Hexan, Pentan, Dichlormethan, Diethylether) ausgeschüttelt. Die ver bleibende wäßrige Phase wird für die weiteren Untersuchungen verwendet.

Die pulverisierten Pflanzenteile können auch direkt mit einem polaren Lö sungsmittel (Wasser oder Alkohol/Wasser-Gemisch) extrahiert werden, das weitere Verfahren folgt dem oben beschriebenen Verfahren.

Aus den oberirdischen Teilen der Pflanze gewinnt man den wäßrigen Extrakt dadurch, daß man den alkoholisch-wäßrigen Extrakt mit Chloroform ausschüttelt und wie oben beschrieben weiterverarbeitet.

Im folgenden wird die Herstellung einer wäßrigen Fraktion aus dem Methanol extrakt von Echinacea-purpurea-Wurzeln beschrieben:

Die an der Luft getrockneten ganzen Wurzeln wurden zerkleinert und anschlie ßend in einer Mühle pulverisiert. 1,007 g Wurzelpulver (500 µm Sieb) wurden in einer Soxhlet-Apparatur 1 Stunde mit 50 ml Methanol p. a. extrahiert. Nach Bestimmung der Extraktausbeute (0,130 g) wurde dieser in 10,0 ml 90% Etha nol gelöst. Zur Gewinnung der wäßrigen Fraktion wurde die Lösung 1 : 1 mit Wasser verdünnt und dann dreimal mit 10 ml Chloroform ausgeschüttelt. Die Chloroformphasen wurden abgetrennt und die wäßrige Phase für die pharma kologische Testung verwendet. Die Zusammensetzung dieser wäßrigen Phase wird durch das beiliegende Chromatogramm erläutert, das mit den kürzlich be schriebenen hochleistungs-flüssig-chromatographischen Verfahren erstellt wurde (vgl. Bauer et al., Dtsch. Apoth. Ztg. 127, 1325 (1987) und Bauer et al., Sci. Pharm. 55, 159 (1987).

Pharmakologie

Für die Untersuchung des Einflusses der Wasserfraktion auf das unspezifische Immunsystem wurden Testsysteme verwendet, mit denen die Stimulierungsfähig keit des mononuklearen phagozytären Systems gemessen werden kann.

Für die Untersuchungen der immunstimulierenden Wirkung des wäßrigen extraktes wurde der Granulozyten-Ausstrich-Test in einer Modifikation nach Brandt durchgeführt, vgl. Brandt, L., Scand. J. Haematol., Supp., 2 (1967). Die Ge winnung der Human-Granulozyten erfolgt nach der von Wagner et al. beschrie benen Methode, vgl. Wagner et al., Arzneimittelforschung/Drug Res. 35, 1069, (1985). Bei diesem Test wird die Phagozytosefähigkeit von menschlichen Gra nulozyten in Gegenwart von Hefepartikeln bestimmt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle I dargestellt. Zum Vergleich zeigt Tabelle II die Ergebnisse der Stimulierung mit dem ethanolischen Extrakt.

Tabelle I

Ergebnisse des Granulozyten-Ausstrich-Tests mit der wäßrigen Fraktion des ethanolischen Echinacea-Wurzelextrakts (PI=Phagozytose-Index, s=Standard abweichung (n=3-6); StimPI=Stimulierung der Phagozytose im Vergleich zur Kontrolle)

Tabelle II

Ergebnisse des Granulozyten-Ausstrich-Tests mit den ethanolischen Echinacea- Wurzelextrakten (PI=Phagozytose-Index, s=Standardabweichung (n=3-6); StimPI=Stimulierung der Phagozytose im Vergleich zur Kontrolle)

Das Ergebnis der pharmakologischen Testung der Wasserfraktion, die haupt sächlich die vorhin genannten Verbindungsklassen enthält, war, verglichen mit dem gemäß dem Stand der Technik bekannten Ethanolextrakt, wie die Tabelle I und II zeigen, folgendes:

Im in-vitro-Granulozyten-Ausstrich-Test zeigten die wäßrigen Fraktionen aus Echinacea purpurea im Konzentrationsbereich von 10^-4 mg/ml Testansatz eine gegenüber dem ethanolischen Extrakt um etwa 30% gesteigerte Wirkung.

Cichoriensäure zeigte als Reinsubstanz auch im in vivo Carbon Clearance-Test nach peroraler Applikation eine deutliche Stimulierung der Phagozytose. Die Elimination von Kohlepartikeln erfolgte etwa doppelt so schnell wie bei einer Kontrollgruppe.

Die erfindungsgemäßen Zubereitungen sind für die orale oder parenterale Ver abreichung geeignet und können mit üblichen Hilfs- und Trägerstoffen formu liert werden.

Claims

1. Pharmazeutische Zubereitung zur Stimulierung des Immunsystems, enthaltend Verbindungen der allgemeinen Formel in der:
R = H oder einen C₁-C₄-Alkylrest,
R₁ = H oder einen Acylrest von einfach oder mehrfach hydroxylierten und/oder methoxylierten Derivaten der Zimt- oder Benzoesäure, und
R₂ = Wasserstoff oder einen Acylrest von einfach oder mehrfach hydro xylierten und/oder methoxylierten Derivaten der Zimt- oder Benzoe säure bedeuten, gegebenenfalls zusammen mit üblichen Hilfs- und Trägerstoffen.

2. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Hauptwirkstoff Cichoriensäure enthält.

3. Verfahren zur Herstellung der Zubereitung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

i) getrocknete Pflanzenteile von Echinacea purpurea, Echinacea pallida 4008oder Echinacea angustifolia zerkleinert und anschließend pulveri siert;
ii) das Pulver mit einem C₁-C₄-Alkohol extrahiert und anschließend den Extrakt einengt,
iii) den Rückstand in Alkohol löst, mit Wasser verdünnt, mit einem lipo philen Lösungsmittel ausschüttelt, und
iv) die lipophilen Phasen abtrennt und die wäßrige Phase zurückgewinnt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Wurzeln von Echinacea purpurea, Echinacea pallida oder Echinacea angustifolia als Ausgangsmaterial verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkohol Methanol oder Ethanol verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den Rückstand in Stufe (iii) vorzugsweise 1 : 1 mit Wasser verdünnt und mehr mals mit einem lipophilen Lösungsmittel ausschüttelt.

7. Verfahren nach Anspruch 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als lipophiles Lösungsmittel Chloroform, Hexan, Pentan, Dichlormethan, Diethylether oder ihre Mischungen verwendet.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Pflanzenmaterial direkt mit einem wäßrigen Lösungsmittel extrahiert wird.