DE3109335A1 - Die neue, physiologisch wirksame substanz ebelacton und verfahren zur herstellung derselben - Google Patents

Description

Die neue, physiologisch wirksame Substanz Ebelacton und VerirJajren zur Herstellung derselben.

Die vorliegende Erfindung betrifft neue, physiologisch wirksame Verbindungen^ die als Ebelacton A und Ebelacton B bezeichenet werden. Diese Substanzen zeichnen sich sowohl durch immunpotenzierende als auch durch entzündungshemmende Wirkung aus. Die Erfindung betrifft ausserdem ein Verfahren zur Herstellung der genannten Substanzen sowie deren Verwendung als Mittel zur Erhöhung der Abwehrkräfte bzw. der Immunreaktion sowie zur Bekämpfung von Entzündungen bei lebenden Tieren und Menschen.

Viele Stämme der Gattung Streptomyces erzeugen therapeutisch wertvolle Substanzen, beispielsweise Antibiotika. Einige der erzeugten Substanzen sind auch als Mittel zur Erhöhung der Abwehrkräfte bzw. der Immunreaktion sowie als entzündungshemmende Mittel brauchbar. Trotzdem besteht weiterhin ein Bedarf an noch wirksameren Mitteln, welche zur therapeutischen Behandlung verschiedener Krankheiten bei Tieren und Menschen eingesetzt werden können.

Eingesandte Modelle werden nach 2 Monaten, falls nicht zurückgefordert, vernichtet. Mündliche Abreden, insbesondere durch Fernsprecher, bedürfen schriftlicher Bestätigung. — Die in Rechnung gestellten Kosten sind mit Rechnungsdatum ohne Abzug fällig. — Bei verspäteter Zahlung werden Bankzinsen berechnet.

Gerichtsstand und Erfüllungsort Bremen. Bremer Bank, (BLZ 29080010) Nr. 2310028 - Die Spartasse in Bremen (BLZ 29050101) Nr. 1045855 - Postscheckkonto: Hamburg (BLZ 20010020) 339 52-202

] Die vorliegende Erfindung macht es sich zur Aufgabe, neue Verbindungen mit immunpotenzierender und/oder entzündungshemmender Wirkung bereitzustellen und Verfahren zur Herstellung solcher Verbindungen vorzuschlagen.

Im Rahmen umfangreicher Forschungsarbeiten und Untersuchungen konnte jetzt festgestellt werden, dass man bei der Züchtung eines neuen Stammes der Gattung Streptomyces, der aus einer Bodenprobe aus dem Boden der Rissho-

•JO Universität in Kumagaya City, Saitama Prefecture, Japan, isoliert worden ist und der die vorläufige Laboratoriumsbezeichnung Streptomyces MG7-G1 erhalten hat, in einem Kulturmedium unter aeroben Bedingungen neue Substanzen gewinnen kann, die eine inhibierende Wirkung gegenüber Esterase und Formylmethionin-Aminopeptidase aufweisen. Es ist gelungen, die neuen Substanzen aus der Kulturbrühe zu isolieren und zu reinigen. Aus chemischen, physikalischen und biologischen Untersuchungen an den isolierten Substanzen konnte geschlossen werden, dass jede der isolierten Substanzen eine neue Verbindung mit geringer Toxizität ist, die sich von anderen bekannten Verbindungen unterscheidet. Die isolierten neuen Verbindungen wurden als Ebelacton A und Ebelacton B bezeichnet. Ebelacton A und B besitzen neue chemische Strukturen und spezifische physikalisch-chemische Eigenschaften, auf die im folgenden noch näiier eingegangen werden wird.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind die in den Ansprüchen 1 bis 3 beanspruchten und gekennzeichneten neuen Verbindungen.

Venn im folgenden der Ausdruck "Ebelacton" verwendet wird, so wird darunter entweder Ebelacton A oder Ebelacton B oder eine Mischung aus beiden Substanzen verstanden, soweit im Einzelfall nichts anderes angegeben ist.

109335

— ι —

Die Erfindung betrifft Ebelacton A und Ebelacton B, jeweils allein oder in Mischung untereinander, sowohl in Form einer verdünnten Lösung als auch in Form eines rohen Konzentrates, einer rohen festen Substanz oder

5 einer gereinigten festen Substanz.

Untersuchungen über die Brauchbarkeit von Ebelacton als Arzneimittel haben gezeigt, dass Ebelacton nicht nur eine Wirkung zur Verbesserung der zellenvermittelten Immunreaktion bei lebenden Tieren bewirkt, sondern sich auch durch eine starke entzündungshemmende Wirkung auszeichnet. Ebelacton erscheint danach als wertvolles Mittel für verschiedene therapeutische Anwendungszwecke, dessen biologische Eigenschaften beispielsweise bei der immunologischen Behandlung von Tumoren sowie als Hilfsmittel zur Vergrösserung der Wirkung von Antitumorraitteln iv^rie Bleomycinen ausgenutzt werden können.

Es ist auch untersucht worden, ob Ebelacton die enzymatische Wirkung von Esterase beim Abbau von p-Nitrophenylacetat und die enzymatische Wirkung von Formylmethionin-

Aminopeptidase beim Abbau von N-Formylmethionin-/^ ^ naphthylamid inhibiert. Dabei hat sich gezeigt, dass Ebelacton eine kombinierte anti-Esterase-Wirkung und anti-Formylmethionin-Aminopeptidase-Wirkung aufweist,

wie die nachfolgend erläuterten Versuche zeigen.

Ebelacton A und Ebelacton B weisen folgende chemische Strukturen auf:
30

Ebelacton A

3H- CH, CH, CH, CH,

2 3

CH^-CH-CH-CH-CH₉-C=CH-CH-C-CH-CH-CH-CH₀-Ch, ⁵ I j 4 ₅ ² 6 ₇ 8 „ 10 I 12 ₁₃ ²

O=C-O 0 OH

Ebelacton B

CH- CH, CH, CH, CH,

2· 1' 2 3 I ³ I ⁵ I ⁵9 I ⁵H I ^

CH -CH₀-CH-CH-CH-CH₉-C=CH-CH-C-CH-CH-CH-CH₂-Ch 3 2 ι , ₄ 2 _{6 8} μ ₁₀ , ₁₂

O=C-O ^{5 7} 0 OH ^

Ebelacton A und B werden beide in Form von farblosen

Kristallen gewonnen, indem man einen ebelactonerzeugenden Stamm in einem Kulturmedium züchtet, das Brühenfiltrat mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert, den organischen Extrakt

'5 chromatografisch über Silikagel in beliebiger bekannter Weise fraktioniert und schliesslich die aktiven Fraktionen, die das Ebelacton enthalten, konzentriert. Anschliessend werden die Ebelactone A und B chromatogra-

fisch getrennt.
20

Physiko-chemische Eigenschaften von Ebelacton:

rv
Ebelacton A ist eine neutrale Verbindung, die in Form

farbloser Kristalle vorliegt. Sie besitzt einen ^ Schmelzpunkt von 86°C und eine, spezifische optische Drehung von (^)₀ -221° (c=l; Methanol). Das Molekulargewicht beträgt 338, wenn die Bestimmung durch Massenspektrometrie erfolgt. Die Elementaranalyse ergab folgende Werte: C: 70,97%; H: 10,20 %; 0: 19,07%,

was mit den theoretischen Werten für die Summenformel

Cp₀H^₄O. übereinstimmt. Das Ultraviolet-Spektrum von

Ebelacton A zeigt eine Schulter bei λ ^Me0H 291 nm (e 311).

max

Das Infrarot-Absorptionsspektrum von Ebelacton A (in

Kaliumbromid-Tablette) zeigt charakteristische Schultern -35

bei 3500, 2950, 1825, 1695, 1460, 1385, 1125, 980 und _Λ

870 cm . Das protonenkernmagnetische Resonanzspektrum

( ο ppm) von Ebelacton in Deutero-chloroform weist folgen de Schultern auf: 1,38 (2-CH-); 3,29 (CH von C-2); 3,88 (CH von C-3); 0,87 (4-CH₃) ~-l,99 (CH von C-4); ^ 1,7 und 2,35 (CH₂ von C-5); 1,73 (6-CH₃); 5,04 (CH von C-7); 1,12 (8-CH₃); 3,59 (CH von C-8); 1,10 (10-CH₃); 2,86 (CH von C-IO); 3,50 (CH von C-Il); 3_r03 (ll-OH); 0,79 (12-CH₃); -1,41 (CH von C-12); ~Ί,71 (CH₂ von C-13) und 0,87 (CH₃ von C-14).

IQ Ebelacton B ist ebenfalls eine neutrale Verbindung, die in Form farbloser Kristalle vorliegt. Der Schmelzpunkt liegt bei 77°C und die spezifische optische Drehung beträgt (öC)p⁶ -203° (c=l, Methanol). Das Molekulargewicht (bestimmt durch Massenspektrometrie) beträgt

352. Die Werte der Gewichtsanalyse, nämlich C: 71,72%; H: 10,31%; 0: 18,37%, stimmen mit den theoretischen Werten für die Summenformel C_n.H-,,0. überein. Das

ΔΎ ob 4

Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Ebelacton B weist eine Absorptionsschulter bei λ ^^ 291 nm ( ε 479) auf.

πι ax Das Infrarot-Absorptionsspektrum von Ebelacton B in

Kaliumbromidtablette weist charakteristische Absorptionsschultern bei 3500, 2960, 1825, 1700, 1465, 1390, 1125, 1000, 970 und 870 cm auf. Das protonenkernmagnetische Resonanzspektrum (0 ppm) von Ebelacton B in Deutero-

25 chloroform zeigt folgende charakteristische Schultern: 1,06 (CH₃ von C-2¹); ~1,86 (CH₂ von C-I¹); 3,20 (CH von C-2); 3,92 (CH von C-3); 0,86 (4-CH₃); ~ 2 (CH von C-4), r·* 1,86 und 2,38 (CH₂ von C-5); 1,73 (6-CH₃); 5,04 (CH von C-7); 1,12 (8-CH₃); 3,58 (CH von C-8);

1,10 (10-CH₃); 2,86 (CH von C-IO); 3,51 (CH von C-Il); 3,04 (ll-OH); 0,78 (12-CH₃); ^ 1,43 (CH von C-12); ~ 1,73 (CH₂ von C-13) und 0,87 (CH₃ von C-14).

Zum Gegenstand der Erfindung gehört auch das in den Ansprüchen 4 bis 9 beanspruchte und gekennzeichnete Verfahren zur Herstellung von Ebelacton.

Als Ebelacton erzeugender Stamm der Gattung Streptomyces wird der Stamm Streptomyces MG7-G1 verwendet, der aus dem Boden der Rissho-Universität in Kumagaya City, Saitama Prefecture, Japan isoliert worden ist und der in Japan bei F.R.I, die Hinterlegungsnummer FERM-P 5363 sowie in USA bei ATCC die Hinterlegungsnummer ATCC 31 8^0 erhalten hat.

geändert

Dieser Stamm MG7-G1 besitzt folgende mikrobiologische Eigenschaften.

1. Mikroskopische Morphologie

Die mikroskopische Beobachtung zeigte, dass der Stamm MG7-G1 ein verzweigtes Substratmycel erzeugt. Aus dem Substratmycel entwickeln sich verhältnismässig lange und rectiflexible Lufthyphen. Spiralen und Quirlverzweigungen wurden nicht beobachtet. Die reifen Lufthyphen tragen Ketten mit 10 oder mehr Sporen. Eine Spore besitzt Abmessungen von 0,6 bis 0,8 Mikron in der Breite und 0,8 bis 1,2 Mikron in der Länge. Unter dem Elektronenmikroskop zeigt sich, dass die Oberfläche der Sporen glatt ist.

2. Züchtungseigenschaften in verschiedenen Kulturmedien

Die im folgenden in Klammern angegebenen Farbbezeichnungen beziehen sich auf die Standardfarbbezeichnungen gemäss Festsetzung in /'Color Harmony Manual", veröffentlicht von Container Corporation of America.

(1) Auf Saccharose-Nitrat-Agar-Medium (bebrütet bei 27 C): farblos bis schwach gelb (2 ec, biscuit) bis schwach gelblich-braun (2 gc, bambus), Wachstum mit Lufthyphen, welches bräunlich-weiss (3 ec, hellbeige) bis bräunlich-grau (3 ig, beige-braun) ist. Diffundie-

- 11 •j rendes Pigment wurde nicht beobachtet.

(2) Auf Glucose-Asparagin-Agar-Medium (bebrütet bei 27⁰C): farbloses bis schwach gelbes bis schwach gelblich-

c braunes (2 nl, bedecktes braun) Wachstum mit Lufthyphen, bräunlich-weiss bis hellbraun-grau (3 ml, bibergrau) bis hellgrau (2 fe, gedecktes grau). Nach etwa 14 Tagen der Bebrütung wird ein diffundierendes Pigment gebildet, welches schwach braunstichig ist.

(3) Auf Glycerin-Asparagin-Agar-Medium (ISP-Medium 5,

bebrütet bei 27°C): schwach gelbes bis schwach gelblichbraunes (2 ie, hellsenfbraun) bis graustichig gelbbraunes (2 Ii, gedecktes braun) bis dunkelbraunes (3 nl,

15 dunkelbraun) Wachstum, auf welchem sich Lufthyphen

bilden, die graustichig weiss (2 dc, naturell) bis hellgrau (2 fe, gedecktes grau) bis bräunlich-grau (3 ig, beigebraun) sind. Nach etwa 10 Tagen der Bebrütung wird ein diffundierendes Pigment gebildet, welches schwach

20 braunstichig ist.

(4) Auf Stärke-anorganisches Salz-Agar-Medium (ISP-Medium 4λ bebrütet bei 27 C): schwach gelbes bis gelblich-braunes (2 ie, hellsenfbraun) bis gelbbraunes (3 Ii, biber) Wachstum, auf welchem sich Lufthyphen bilden, die bräunlich-weiss bis hellgrau (2 fe, gedecktes grau) bis bräunlich-grau (3 ih, beige-grau) gefärbt sind. Nach etwa 10 Tagen der Bebrütung wird ein diffundierendes Pigment gebildet, welches schwach braun-

30 stichig ist.

(5) Auf Tyrosin-Agar, Medium (ISA-Medium 7, bebrütet bei 27 C): schwach gelblich-braunes bis gelblich-braunes (2 ni, senfbraun) Wachstum, auf welchem sich Lufthyphen bilden, die gelblich-grau bis hellgrau (2 fe, gedecktes grau) gefärbt sind. Nnch etwa 5 Tagen der Bebrütung wird ein diffundierendes Pigment gebildet, welches braunstichig ist.

(6) Auf Nähragar-Medium (bebrütet bei 27 C): schwach gelblich-braunes bis hellbraunes (3 Ig, hellbraun) Wachstum ohne oder mit nur geringer Bildung braunstichiger Lufthyphen. Ein braungefärbtes diffundierendes Pig-,

5 ment wird gebildet.

(7) Auf Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar-Medium (ISP-Medium 2, bebrütet bei 27°C): schwach gelblich-braunes bis graustichig-gelblich-braunes (2 nl, gedecktes braun) Wachstum, auf welchem sich Lufthyphen bilden, die graustichig weiss bis hellgrau (2 fe, gedecktes grau) bis bränlich-grau (2 ih, dunkles gedecktes grau) gefärbt ist. Es wird ein braungefärbtes diffundierendes Pigment gebildet.

(8) Auf Hafermehl-Agar-Medium (ISP-Medium 3, bebrütet bei 27°C): schwach gelblich-braunes (2 ie, hellselfbraun) Wachstum mit Lufthyphen, die gelbstichig grau bis hellgrau (2 fe, gedecktes grau) bis bräunlich-grau (2 ih, dunkles gedecktes grau) gefärbt sind. Nach etwa 21 Tagen der Bebrütung wird ein diffundierendes Pigment gebildet, welches schwach braunstichig ist.

'i

(9) Auf Glycerin-Nitrat-Agar-Medium (bebrütet bei 27°C):

schwach gelbes bis schwach gelblich-braunes bis gelblichbraunes (3 Ii, biber) Wachstum mit Lufthyphen, die graustichig-weiss bis hellgrau (2 Ii, gedecktes braun) bis grau (3 ih, beigegrau) gefärbt sind. Nach etwa 6 Tagen der Bebrütung wird ein diffundierendesPigment

30 gebildet, welches schwach braunstichig ist

(10) Auf Stärke-Agar-Medium (bebrütet bei 27°C): farbloses bis schwach gelbes bis gelblich-braunes (2 Ig, senfbraun) Wachstum,auf welchem Lufthyphen gebildet werden, die graustichig weiss bis hellgrau (3 fe, silbergrau) bis bräunlichgrau (3 ih, beigegrau) gefärbt sind.

Nach etwa 10 Tagen der Bebrütung wird ein diffundierendes Pigment gebildet, welches schwach braunstichig ist.

(11) Auf Calcium-Malat-Agar-Medium (bebrütet bei 27°C): schwach gelbes Wachstum mit Lufthyphen, die graustichig weiss bis bräunlich-grau (3 ig, beigebraun) gefärbt sind. Ein diffundierendes Pigment wurde nicht beobachtet,,

(12) Auf Cellulose-Medium (bebrütet bei 27°C): farbloses Wachstum. Weder Lufthyphen noch diffundierendes Pigment

wurden beobachtet.

(13) Auf Gelatinepfropf-Medium: auf einfachem Gelatine-Medium (bebrütet bei 20°C), schwach gelbes bis schwach gelblich-braunes Wachstum, auf welchem in geringer Menge Lufthyphen gebildet werden, die einen bräunlich-weissen Stich haben; ein bräunliches diffundierendes Pigment wird gebildet. Auf Glucose-Pepton-Gelatine-Medium (bebrütet bei 27°C) ist das Wachstum dagegen schwach gelblich-braun ohne Lufthyphen. Es wird ein diffundierendes Pigment gebildet, welches schwach braunstichig ist.

(14) Auf Magermilch-Medium (bebrütet bei 27°C): schwach gelbes bis seiwach braunes bis -gelblich-braunes Wachstum

ohne Lufthyphen. Es wird ein diffundierendes Pigment gebildet, welches schwach braunstichig ist.

30 3. Physiologische Eigenschaften

(1) Wachstumstemperaturen: Wachstum erfolgt bei 20⁰C, 24°C,o27°C, 30⁰C und 37⁰C, jedoch nicht bei 50⁰C, wenn die Versuche auf Glucose-Asparagin-Agar-Medium durchgeführt werden. Es erscheint, dass die optimale Temperatur für ein gutes Wachstum im Bereich zwischen 24 und 30⁰C liegt.

(2) Verflüssigung von Gelatine.

Wird ein 15%-iges einfaches Gelatine-Medium bei 20°C bzw. ein Glucose-Pepton-Gelatine-Medium bei 27°C bebrütet, so beginnt die Verflüssigung etwa 6 Tage nach

g Bebrütungsbeginn in beiden Fällen in mittlerem Ausmaß»

(3) Hydrolyse von Stärke.

Bei Bebrütung auf einem Stärke-anorganisches Salz-Agar-Medium oder auf einem Stärke-Agar-Medium jeweils bei
10 27°C beginnt die Hydrolyse der Stärke in bemerkenswertem Ausmaß etwa 6 Tage nach Beginn der Bebrütung mittelmässig bis stark.

(4) Koagulation und Peptonisierung von Magermilch

(bebrütet bei 37°C): die Koagulation beginnt etwa nach fünftägiger Bebrütung und ist am Ende des 7. Tages der

Bebrütung beendet; die Peptonisierung schliesst sich
unmittelbar an. Die Peptonisierung ist etwa nach 14-tägiger Bebrütung beendet. Das Ausmaß der Peptonisierung ist

mittel bis stark.

(5) Bildung von Melanoidpigment (bebrütet bei 27°C auf Trypton-Hefeextrakt-Brühe, ISP-Medium 1; bebrütet bei 27°C auf Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar, ISP-Medium 6; bebrütet bei 27°C auf Tyrosin-Agar, ISP-Medium 7):

Die Bildung eines Melanoidpigmentes konnte auf Trypton-Hefeextrakt-Brühe und auf Tyrosin-Agar-Medium beobachtet werden. Der Stamm MG7-G1 wächst nicht auf Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar-Medium, dagegen wächst der Stamm und erzeugt ein Melanoidpigment auf einem derartigen Medium, wenn man die Eisenammoniumcitrat-Komponente aus dem Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar-Medium entfernt.

(6) Ausnutzung von Kohlenstoffquellen für das Wachstum (die Feststellung erfolgte auf Pridham-Gottlieb-Medium, ISP-Medium 9, und zwar bei einer Bebrütung bei 27°C).

Glucose wird zum Wachstum benutzt. L-Arabinose, D-Xylose, D-Fructose, Saccharose, Inosit, L-Rhamnose, Raffinose und D-Manniton werden nicht ausgenutzt.

c (7) Auflösung von Calciummalat (bebrütet bei 27°C auf Calciummalat-Agar-Medium).

Etwa 6 Tage nach Bebrütungsbeginn beginnt die Auflösung des Calciummalats um das Wachstum herum; das Ausmaß der Auflösung ist mittel bis stark.

(8) Reduktion von Nitrat (festgestellt in wässriger Peptonlösung, die 1.0% Kaliumnitrat enthielt, ISP-Medium 8, bei einer Bebrütung bei 27 C): negativ.

Eine zusammenfassende Betrachtung der vorstehend aufgeführten Charakteristika des Stammes MG7-G1 zeigt, dass derselbe zur Gattung Streptomyces gehört und durch das Fehlen von Quirlen oder Spiralen an den Lufthyphen sowie durch die glatte Oberfläche der Sporen gekennzeichnet ist.

Es ist weiter zu beachten, dass der Stamm MG7-G1 auf verschiedenen Kulturmedien ein schwach gelbes bis schwach gelblich-braunes bis gelblich-braunes Wachstum mit Lufthyphen bildet, wobei die letzteren graustichig weiss bis hellgrau bis bräunlich-grau gefärbt sind. Es wird ein diffundierendes Pigment, welches schwach braunstichig ist, gebildet. Der Stamm zeigt eine positive Chromogenizität,

30 ein mittleres Ausmaß der Proteolyse und ein mittleres bis starkes Ausmaß der Hydrolyse von Stärke.

Auf der Basis der vorstehend genannten Eigenschaften wurde der Stamm MG7-G1 mit bekannten Stämmen der Gattung Streptomyces verglichen, wobei die Beschreibung in folgenden vier Literaturstellen herangezogen wurde: H. Nishimura et al. "Journal of Antibiotics" Ser. A, Bd. 10, Seite 205

, (1957); "Bergy's Manual of Determinative Bacteriology", 8. Ausgabe, Seite 761; "International Journal of Systematic Bacteriology" Bd. 18, No. 4, Seite 284 (1968); "Actinomycetes" Bd. 2, Seite 166. Aufgrund der erwähnten Charakteristika ist die Verwandtschaft des Stammes MG7-G1 zu Streptomyces aburaviensis am grössten.

Eine Kulturprobe von Streptomyces Aburaviensis wurde direkt mit dem Stamm MG7-G1 verglichen. Die Ergebnisse des Vergleiches sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt.

Eigenschaften

Form der Lufthyphen Sporenoberfläche Farbe der Lufthyphen

Farbe des Wachstums

diffundierendes Pigment

Chromogenizitat: auf ISP-Medium auf ISP-Medium auf ISP-Medium Hydrolyse von Stärke Koagulation von Milch

Peptonisierung von Milch

Verflüssigung von Gelatine:

auf einfacher Gelatine

auf Glucose-Pep t on-Ge1at ine

Reduktion von Nitrat

Ausnutzung von Kohlenstoffquellen:

Glucose L-Arabinose D-XyIose D-Fructose Saccharose Inosit L-Rhamnose D-Mannitol

- 17 -

Tabelle 1
MG7-G1

rektiflexibel
glatt

graustichigweiss bis hellgrau bis bräunlich-grau

hellgelb bis
hellgelblichbraun bis
gelblich-braun

netativ oder
braunstichig

kein Wachstum

Streptomyces avuraviensis ISP 5033

rektiflexibel glatt

graustichigweiss bis grau bis bräunlichgrau

schwachgelb bis schwachgelblichbraun bis dunkelbraun

negativ oder braunstichig

Bemerkung: (+) bedeutet wahrscheinlich +; ί bedeutet schwach +; + bedeutet wahrscheinlich -.

* bedeutet + bei der Beschreibung in "International Journal of Systematic Bacteriology".

■ι Man erkennt aus der vorstehenden Tabelle, dass der Stamm MG7-G1 sich von Streptomyces aburaviensis ISP 5033 dadurch unterscheidet, dass 1. der erstgenannte auf den ' ISP-Medien 1 und 7 eine positive Chromogenizität aufweist, r während der letztere eine negative Chromogenizität auf diesen Medien zeigt, und dass 2. der erstere auf ISP-Medium 6 nicht wächst, aber unter Bildung eines Melanoid-Pigmentes zum Wachstum gebracht werden kann, wenn die Eisenammoniumcitrat-Komponente aus dem ISP-Medium 6 Ι« entfernt wird; der letztgenannte Stamm wächst dagegen auf ISP-Medium 6 ohne Bildung eines Melanoid-P'ignientes.

Obwohl der Stamm MG7-G1 Eigenschaften aufweist, die von denen von Streptomyces aburaviensis in den erwähnten

κ Punkten abweichen, stimmen die Eigenschaften in anderen Punkten weitgehend überein, was anzeigt, dass die Stämme eng verwandt sind. Der Stamm Streptomyces MG7-G1 ist bei der japanischen Hinterlegungsstelle "Fermentation Research Institute", Agency of Industrial Science and Technology, Tukuba-gun, Ibaragi Prefecture, Japan

unter der Hinterlegungsnummer FERM-P 5363 und ausserdem am 24. Februar 1981 auch bei der "American Type Culture λ, Collection", Washington, D.C, U.S.A., unter der

ATCC-Nummer 31 8§0 hinterlegt worden.

geändert ^U

nachträglich

Eine Mutation von Actinomyceten tritt häufig sowohl spontan als auch durch entsprechende Beeinflussung auf. Die vorliegende Erfindung erfasst infolgedessen die Verwendung des Stammes MG7-G1 einschliesslich aller möglichen Varianten und Mutanten, solange diese die Fähigkeit besitzen, Ebelacton zu produzieren.

Ebelacton lässt sich durch aerobe Züchtung oder Mycelien eines Ebelacton erzeugenden Stammes der Gattung Streptomyces, beispielsweise Streptomyces MG7-G1 (FERM-P 5363 oder ATCC No. 31 820) gewonnen werden.

3103335

Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird eine entsprechende Menge Sporen oder Mycel eines Ebelacton erzeugenden Stammes in ein geeignetes Kulturmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und c Stickstoffquellen enthält, eingeimpft; das Medium wird unter aeroben Bedingungen, vorzugsweise unter submersen aeroben Bedingungen bebrütet, so dass Ebelacton erzeugt wird und sich in der Gärbrühe ansammeln kann. Als Nährstoffe können in dem Gärmedium alle Substanzen vorhanden

IQ sein, die üblicherweise auch bei der Züchtung von Actinomyceten verwendet werden. Beispielsweise sind geeignet: Glycerin, Glucose, Lactose, Saccharose, Stärke, Maltose, Melasse und andere Kohlehydrate, Fette und Öle sowie Salze von niederen aliphatischen Säuren wie

•J5 Malonsäure, Maleinsäure u.a.; die genannten Substanzen dienen als Kohlenstoffquellen. Handelsübliches Pepton, Fleischextrakt, Baumwollsamenmehl (zum Beispiel Pharma-Media), Erdmussmehl, Sojabohnenmehl, Hefeextrakt, N-Z-Amin, Casein, L-Asparagin, Fischmehl, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat u.a. können als Stickstoffquellen verwendet werden. Zusätzlich können Natriumchlorid, Phosphate, Calciumcarbonat, Magnesiumsulfat und andere anorganische Salze, als Salzzusätze in der Gärbrühe verwendet werden. Andere Metallsalze sowie verschiedene Schwermetallsalze in Spurenmengen können gegebenenfalls auch in der Gärbrühe vorhanden sein bzw. dieser zugesetzt werden, solange die Produktion von Ebelacton durch den eingesetzten Ebelacton erzeugenden Stamm nicht nachträglich beeinflusst wird.

Besonders vorteilhaft lassen sich Glycerin als Kohlenstoff quelle und Fischmehl u.a. als Stickstoffquelle verwenden. Ein Kulturmedium, welches 3,0% Glycerin, 2,0% Fischmehl und 0,2% Calciumcarbonat enthält, hat

35 sich als besonders gut geeignet erwiesen.

] Für die Herstellung von Ebelacton in grösserem Maßstab hat sich die Züchtung in Flüssigkeit als geeignet erwiesen. Grundsätzlich kann bei jeder Temperatur gearbeitet werden, bei der der Ebelacton erzeugende Stamm wächst und Ebelacton produziert; als gut geeignet hat sich ein Temperaturbereich von 20 bis 37 C erwiesen, besonders gut ist das Arbeiten bei 27⁰C. Die Züchtung bzw. Bebrütung wird solange fortgesetzt, bis sich eine ausreichende Menge Ebelacton in dem Kulturmedium, d.h.

der Gärbrühe angesammelt hat. Die Produktion und Ansammlung von Ebelacton erreicht nach ein- bis dreitätiger Bebrütung ein Maximum, wenn das Kulturmedium 3,0% Glycerin, 2,0% Fischmehl und 0,2% Calciumcarbonat enthält. Dieses Medium war zuvor sterilisiert und dann mit

15 Sporen und Mycel geimpft worden, welche von einer Schrägbodenkultur des Stammes MG7-G1 geerntet worden waren. Die Züchtung bzw. Bebrütung erfolgte unter Schütteln und unter aeroben Bedingungen bei 27°C.

Die Produktion des Ebelactons im Verlauf der Züchtung sowie dessen Verbleib während der Abtrennung und der Reinigung kann verfolgt werden, indem man die anti-Esterase-Wirkung und die anti-Formylmethionin-Aminop.eptidase-Wirkung des Ebelactons nach den im folgenden be-

25 schriebenen Methoden bestimmt.

Zunächst wird die anti-Esterase-Wirkung des Ebelactons dadurch bestimmt, dass man die Potenz der Esterase-Inhibierung nach der modifizierten Methode von

C. Huggins und J. Lapides, "J. Biol. Chem." 170, 467 (1947) feststellt. Hierzu wird ein handelsübliches Esterasepräparat, welches aus Schweineleber hergestellt wird (ein Produkt der Firma Sigma Co., U.S.A.) in Wasser auf das 1000-fache Volumen verdünnt. Die entstan-

35 dene Esteraselösung (0,025 ml) wird mit 1 ml 0,1 m Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0), welche 0,06% "Triton X-IOO"^ (d.i. ein Emulgator, welcher aus

1 Polyäthylenglycolalkylphenyläther besteht) enthält,

sowie 0,95 ml Wasser, welches die zu prüfende Ebelactonprobe enthält, vermischt. Die so gewonnene Lösung (1,975 ml) wird mit 0,025 ml einer Lösung aus 40 mM p-Nitrophenylacetat (als Substrat) in Methanol vermischt, um
die Reaktion des p-Nitrophenylacetats mit der Esterase
einzuleiten. Nachdem die enzymatisch^ Reaktion bei
Raumtemperatur 20 Minuten abgelaufen ist, wird das
Absorptionsvermögen (a) der entstandenen Reaktionslösung bei 400 nm gemessen. Ausserdem wird das Absorptionsvermögen (b) einer Kontroll-Lösung, welche kein
Ebelacton enthält, ebenfalls bei 400 nm in derselben
Weise gemessen. Die prozentuale Inhibierung der Esterase wird nach folgender Gleichung berechnet.

Inhibierung (%) = χ 100.

Bei der Bestimmung nach dieser Methode wies das farblose kristalline Ebelacton A (das Produkt des Beispiels 8 dieser Anmeldung) eine Potenz von IDc₀ auf, und zwar betrug die Dosis, die eine 50%-ige Esterase-Inhibierung ergab,
0,056 mcg/ml; das farblose kristalline Ebelacton B
(das Produkt von Beispiel 9 gemäss dieser Anmeldung)
wies eine solche Potenz auf, dass sein ID,_₀-Wert

25 0,00035 mcg/ml ausmachte.

Die anti-Formylmethionin-Aminopeptidase-Wirkung von
Ebelacton kann wie folgt bestimmt werden: Als Substratlösung verwendet man eine Lösung von N-Formylmethionin-β-naphthylamid (als Substrat) in Methanol, welches 5%

R)

(Gewicht/Volumen) "Tween 20"^^ (d.i. ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel, welches von der Firma
Atlas Powder Co., U.S.A. vertrieben wird) enthält.
Weiterhin wird Formylmethionin-Aminopeptidase verwendet, die aus Rattenleber hergestellt worden ist. Die Substratlösung (0,005 ml), 0,5 ml einer 0,1 m Tris-Chlorwasserstoffsäure gepufferten Lösung (pH 7,8) und 0,495 ml Wasser,

3T09335

1 welches die zu prüfende Ebelactonprobe enthielt, wurden vermischt, so dass sich ein Gesamtvolumen von 0,95.ml ergab. Die so gewonnene Reaktionslösung wurde weiterhin mit 0,05 ml Enzymlösung vermischt und dann bei 37 C 5 25 Minuten gehalten, damit die enzymatische Reaktion ablaufen konnte. Danach wurde die Reaktionslösung mit 1 ml einer Lösung vermischt, die "Fast Garnet GBC" v^ in einer Konzentration von 1 mg/ml in 1 m acetatgepufferter Lösung (pH 4,2), welche auch 10% "Tween 20"^S/

10 enthielt, vermischt. Nachdem das Gemisch 15 Minuten bei Umgebungstemperatur gestanden hatte, wurde das Absorptionsvermögen (a) der Reaktionslösung bei 525 nm gemessen. Ausserdem wurde das Absorptionsvermögen (b) einer Kontroll-Lösung bei 525 nm gemessen; diese Kontroll-

Lösung war eine Blindprobe.

Die prozentuale Inhibierung der Formylmethionin-Aminopeptidase wurde in derselben Weise berechnet, wie die weiter vorn für die Bestimmung der Inhibierungswirkung 20 gegenüber Esterase angegeben ist. Bei Anwendung der

beschriebenen Methode konnte festgestellt werden, dass farbloses kristallines Ebelacton A eine solche Potenz aufweist, dass sein ID^-Wert, d.h. die Dosis, die eine

ou

50%-ige Inhibierung der Formylmethionin-Aminopeptidase ergibt, 0,08 mcg/ml beträgt. Farbloses kristallines Ebelacton B weist eine Potenz auf, derart, dass sein ID_5Q-Wert gegenüber der genannten Peptidase 0,02 mcg/ml beträgt.

Ebelacton kann sowohl durch Züchtung im Tank als auch durch Züchtung nach der Schüttelmethode gewonnen werden. Beispielsweise wurden zur Herstellung 1000 1 eines flüssigen Kulturmediums, welches 3,0% Glycerin, 2,0% Fischmehl und 0,2% Calciumcarbonat enthielt, in einen Gärtank mit einem Fassungsvermögen von 2000 1 gegeben und dann sterilisiert. Das sterilisierte Medium wurde mit einer Schrägbodenkultur des Stammes MG7-G1 geimpft,

■j wobei die Impfmenge 2% betrug. Sterile Luft wurde mit einer Geschwindigkeit von 800 l/Minute durch das Kulturmedium geleitet, wobei mit einem Rührer mit einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 240 Umdrehungen pro Minute c gerührt wurde. Die Bebrütungstemperatur betrug 27°C. Bei diesem Versuch erreichte die Bildung von Ebelacton nach 37 Stunden Bebrütung ein Maximum. Das gebildete Ebelacton ist in der Gärbrühe und auch in dem Mycel des Stammes MG7-G1 vorhanden. Zur Abtrennung des Ebelactons

IQ aus der Kultur des Ebelacton erzeugenden Organismus wurde die Gärbrühe nach Beendigung der Bebrütung mit der gleichen Menge eines mit Wasser nicht mischbaren organi-, sehen Lösungsmittels wie Butylacetat, Butanol u.a. extrahiert. Hierzu wurde die Gärbrühe mit dem organischen Lösungsmittel vermischt, die Mischung mehrere Stunden geschüttelt, damit das Ebelacton aus der flüssigen Phase der Kultur und aus dem Mycel in das organische Lösungsmittel übertreten konnte. Das in dem Gärbrühenfiltrat vorhandene Ebelacton kann ebenfalls mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel wie Butanol, Butylacetat u.a. extrahiert werden. Das Ebelacton, welches in dem Mycel vorhanden ist, kann auch mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel wie Methanol, Äthanol u.a. extrahiert werden. Es ist auch möglich, das Ebelacton in guter Ausbeute aus der Lösung zu gewinnen, indem man Lösung an einem geeigneten Absorptionsmittel absorbiert und anschliessend desorbiert. Zu diesem Zweck kann man verschiedene anorganische Adsorbentien verwenden, beispielsweise Aktivkohle, Aluminiumoxid, Silikagel und Magnesiumsilikat (Frorigil). Ebenfalls geeignet sind organische Adsorbentien wie beispielsweise "Amberlite XAD"^ (das ist ein nicht-ionisches, hoch mikroporöses Harz; ein Produkt der Firma Rohm & Haas Co., U.S.A.). Beispielsweise wurde Ebelacton an Silikagel absorbiert und anschliessend eluiert, wobei ein Lösungsmittelgemisch

aus η-Hexan und Chloroform als Eluierungsmittel verwendet wurde.

Zur Abtrennung des Ebelacton A von Ebelacton B ist es ι- besonders günstig, wenn man die Mischung aus Ebelacton A und B der Säulenchromatographie an Silikagel mit umgekehrter Phase unterwirft. Hierzu wird an der Oberfläche des Silikagel ein Silan gebunden, worauf die Eluierung mit einem Lösungsmittelgemisch aus Methanol und Wasser

Ι« als Eluierungsmittel durchgeführt wird. Beispielsweise kann die Gewinnung und Trennung von Ebelacton A und Ebelacton B wie folgt durchgeführt werden: das Gärbrühenfiltrat wird mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel wie Butylacetat extrahiert;

■ic der Butylacetat-Extrakt wird unter vermindertem Druck zu einem Öl eingeengt; dieses Öl wird durch Säulenchromatographie an Silikagel gereinigt und dann einer weiteren Säulenchromotographie an Silikagel unterworfen, wobei zum Entwickeln ein geeignetes organisches Lösungsmittelsystem wie n-Hexan-Chloroform verwendet wird, um die aktiven Fraktionen mit dem Ebelacton A allein getrennt von den aktiven Fraktionen mit dem Ebelacton B allein zu erhalten; schliesslich werden die Ebelactone A und B aus den ent- , sprechenden aktiven Fraktionen isoliert.

Die abschliessende Reinigung des Ebelactons kann durch Umkristallisieren erreicht werden. Sowohl Ebelacton A als auch Ebelacton B kristallisieren gut und setzen sich in Form von Nadeln aus einem Lösungsmittelgemisch wie Methanol-Wasser ab.

Die Prüfung der pharmakologischen Eigenschaften von Ebelacton hat ergeben, dass das Ebelacton eine Wirkung besitzt, die die Immunreaktion bei lebenden Tieren stimuliert, indem sie die zellenverraittelte Immunität vergrössert; aussserdem besitzt Ebelacton eine entzün-

■j dungshemmende Wirkung bei lebenden Tieren. Nachfolgend werden die pharmakologischen Eigenschaften des Ebelactons beschrieben.

c (1) Wirkung des Ebelactons mit Bezug auf die Vergrösserung der zellenvermittelten Immunität

Der Einfluss des Ebelactons auf die zellenvermittelte Immunität wurde nach der bekannten D.T.H.-Methode ,Λ ("Delayed Type Hypersensitivity¹¹, vergl. P.H.Lagrange, G.B.Mackaness und T.E. Mille: J. Exp. Med.", 159, 1529-1539 (1974)) geprüft, wobei Mäuse, die mit roten Schafsblutzellen (SRBC) als Antigen immunisiert worden waren, verwendet wurden.

10 SRBC, suspendiert in 0,05 ml physiologischer Salzlösung,wurden durch subkutane Injektion einseitig in die hinteren Fußballen von CDF₁-MaUSeU (5 Mäuse pro Gruppe, weiblich, 8 Wochen alt) eingeimpft, um die Immunisierung zu bewirken. Gleichzeitig mit dieser Immunisierung wurden jeder Testmaus 50 gm/kg, 12,5 mg/kg, 3,125 mg/kg oder 0,781 mg/kg Ebelacton intraperitoneal injiziert. 4 Tage später wurden jeweils 10 SRBC in die andere Seite der Hinterfußballen der Testmäuse eingeimpft, um die D.T.H.-Reaktion auszulösen. 24 Stunden nach dieser auslösenden Injektion wurde die Dicke (in mm) des hinteren Fußballens gemessen, um das Ausmaß der Schwellung des Fußballens festzustellen, welcher die auslösende SRBC-Injektion erhalten hatte. Der Grad der Schwellung des

30 Fußballens dient als Maß zur Feststellung der zellenvermittelten Immunität. Die Versuchsergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 zusammengestellt.

Tabelle 2
Einfluss des Ebelactons auf die Ausbildung der DTH-Reaktion gegen SRBC in Mäusen

-■?

Test- Verbindung	Injektion von Antigen zur Immunizierung (0 Τάκε)	Ebelacton- Dosis (mg/kg)	Auszulösende Injektion 4. Tag nach der Immunxzicrunp;	Fußballen dicke (x 0,1 mm)
Ebelacton B	108 SRBC Il Il Il M	Intraperitoneal 0 (Kontrolle) 50 ' 12,5 3,125 ' 0,781	108 SRBC Ii Il Il Il	7,4 12,2 13,3 13,6 14,2
Ebelacton B	108 SRBC Il	Oral 0 (Kontrolle) 0,5	108 SRBC Il	8,1 14,1
Ebelacton A	108 SRBC	0,5	108 SRBC	12,2

CD CO CO CaJ

Aus der Tabelle kann man ablesen, dass die Verabreichung von Ebelacton in einer Dosis von 0,781 bis 50 mg/kg durch intraperitoneale Injektion oder in einer Dosis von 0,5 mg/kg oral an Mäuse die Entwicklung einer DTH-Reaktion

c bemerkenswert vergrössert und das Ebelacton einen

potenzierenden Effekt auf die zellenvermittelte Immunität besitzen.

(2) Einfluss des Ebelactons auf die Entzündungshemmung

Es wurden Versuche durchgeführt, um die suppressive

Wirkung von Ebelacton und Esterastin(US-PSen 4189438 und 4242453) auf die Schwellung von Rattenfußballen, die durch Injektion von Karragheenin hervorgerufen worden war, abzuschätzen, wenn die Testverbindungen sowohl oral als auch intraperitoneal Wister-Ratten (männlich, Körpergewicht 140 bis 150 g) verabreicht wurden. Die Testverbindung wurde jeweils in et\v^ra 0,5 ml Äthanol gelöst, wobei ein Tropfen "Tween 80" als nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel zugesetzt wurde. Die Lösung der Testverbindung in Äthanol wurde mit einer wässrigen Lösung von Gummiarabicum verdünnt, um so eine wässrige Suspension herzustellen, die die Testd-psis an Ebelacton oder Esterastin enthielt. Die so hergestellte Testprobe der Suspension wurde den Ratten oral oder intraperitoneal verabreicht. Eine Stunde später wurde ein Prozent wässriges Karragheenin subcutan in die Fußballen injiziert, um die Entzündung hervorzurufen. Nach der Injektion des Karragheenins wurde der Umfang des Fußballens zweimal

30 gemessen, und zwar 3 Stunden und 5 Stunden nach der

Karragheenin-Injektion. In einem weiteren Kontrollversuch wurden Ebelacton bzw. Esterastin weggelassen. Das Ausmaß (Prozent) der Unterdrückung des Anschwellens wurde aus dem gemessenen Umfang des entzündeten Fußballens berechnet.

Die Ergebnisse der Versuche sind in den Tabellen 3 und 4 zusammengestellt.

Tabelle 3

Unterdrückung einer Entzündung bei oraler Verabreichung von Ebelacton und Esterastin

Prozentuale Verringerung der Schwellung

Test-Verbindung 3 Stunden 5 Stunden

Gummiarabicum - -

(Kontrollversuch)

Esterastin (50 mg/kg) 10,3% -3,0% (Vergleich)

Ebelacton	B (10 mg/kg)	11	,2%	8	,2%
Il	(50 mg/kg)	11	,6%	7	,8%
Il	(100 mg/kg)	7	,0%	9	,6%

Tabelle 4

Verringerung der Entzündung bei intraperitonealer Verabreichung von Ebelacton und Esterastin

25

Prozentuale Verringerung der Entzündung

Test-Verbindung	3 Stunden	5 Stunden
Gummiarabicum
(Kontrollversuch)
Esterastin	31,1%	28,1%
(Vergleich)
Ebelacton B (5 mg/kg)	17,1%	8,8%
(10 mg/kg)	9,1%	10,0%
35 " (30 mg/kg)	50,6%	20,9%
Ebelacton A (30 mg/kg)	45,9%	18,5%

•j Aus den vorstehenden Tabellen erkennt man, dass bei oraler Verabreichung von Ebelacton B eine bemerkenswerte Verringerung des Ausmaßes der Schwellung erreicht werden kann, wenn man das Ergebnis mit dem der Kontrollversuche verc gleicht. Dies gilt sowohl bei einer Dosis von 10 mg/kg Ebelacton B 3 Stunden bzw. 5 Stunden nach der Karragheenin-Injektion als auch bei einer Dosis von 50 mg/kg Ebelacton B 3 Stunden nach der Karragheenin-Injektion und bei einer Dosis von 100 mg/kg Ebelacton B 5 Stunden nach der

IQ Karragheenin-Injektion. Darüber hinaus ist festzustellen, dass sich bei intraperitonealer Verabreichung des Ebelactons eine erhebliche Verminderung der Schwellung verglichen mit den Kontrolltieren - ergibt; dies gilt für alle Dosierungen des Ebelacton A und B und zu allen

I^ Zeiten der Bewertung, mit Ausnahme der Dosis von 5 mg/kg nach 5 Stunden und der Dosis von 10 mg/kg Ebelacton B nach 3 Stunden. Entsprechende Ergebnisse konnten auch bei der Prüfung der entzündungshemmenden Wirkung von Ebelacton A erhalten werden.

Aus weiteren Versuchen ging hervor, dass Ebelacton in

einer Konzentration von 100 mcg/ml keine Zellentoxizität gegenüber Gewebekulturzellen aufweist und dass eine Dosis von 250 mg/kg Ebelacton (intraperitoneal) keine Toxizitäts-Symptome bei der Abschätzung der akuten Toxizität bei Mäusen ergab.

Aufgrund dieser Ergebnisse kann geschlossen werden, dass Ebelacton eine geringe Toxizität besitzt und ein wertvolles pharmazeutisches Mittel darstellt, welches mit hohem Sicherheitsgrad verwendet werden kann. Ebelacton ist zumindest als ein Mittel der Potenzierung der zellenvermittelten Immunität einsetzbar.

35 Zum Gegenstand der Erfindung gehören infolgedessen auch die pharmazeutischen Zubereitungen, nämlich die Mittel

zur Erhöhung der Abwehrkräfte bzw. der Irmnunreaktion

lebender Tiere und der entzündungshemmenden Mittel sowie die Methoden zur Verwendung dieser Mittel, die in den
Ansprüchen 10 bis 14 beansprucht und gekennzeichnet sind.

Die Mittel zur Erhöhung der Abwehrkräfte bzw. der Immunreaktion lebender Tiere bzw. der entzündungshemmenden Mittel gemäss vorliegender Erfindung können in üblicher bekannter Weise für die orale Verabreichung in die Form

IQ von Tabletten, Kapseln, Pulven oder Lösungen oder

Suspensionen gebracht werden. Zu diesem Zweck vermischt man eine ausreichende Menge Ebelacton mit einem üblichen, pharmazeutisch akzepteblen festen Trägermaterial wie
Stärke, Saccharose, Talkum oder Caleiumcarbonat oder

löst oder suspendiert das Ebelacton in einer pharmazeutisch akzeptablen Flüssigkeit wie Äthanol oder Wasser. Das Mengenverhältnis von Ebelacton zu festem oder flüssigem Trägermaterial kann so ausgewählt werden, dass je nach der Verabreichungsform das aktive Material in

20 einem Gewichtsverhältnis von 1:1 bis 1:100 vorhanden ist.

Die Mittel gemäss vorliegender Erfindung können auch in die Form von injif'ierbaren Lösungen oder Suspensionen gebracht werden. Zu diesem Zweck vrird Ebelacton in einer ausreichenden Menge von 0,1 bis 10 Gewichtsprozent in einer physiologischen Salzlösung oder in einem anderen üblichen pharmazeutisch akzeptablen Trägermaterial wie beispielsweise Ringer's Lösung mit oder ohne Zuhilfenahme eines geeigneten Dispersionshilfsmittels gelöst

30 oder suspendiert. Die injizierbare Lösung oder Suspension, die auf diese Weise gewonnen worden ist, kann beispielsweise durch intravenöse, intramuskuläre oder intraperitoneale Injektion verabreicht werden.

Die Dosis, in der Ebelacton im Einzelfall verabreicht werden soll, hängt von der Art der zu behandelnden

Krankheit sowie von der Art der Verabreichung ab. Viele Faktoren, so beispielsweise das Alter, das Körpergewicht, das Geschlecht, eine mögliche Diät, die Zeit der Verabreichung, die Art der Verabreichung, das Ausmaß der c Ausscheidung, mögliche Drogenkombinationen, Reaktionsempfindlichkeiten und Schwere der Krankheit können die Höhe der Dosis beeinflussen, die infolgedessen der Fachmann nach seiner Erfahrung festlegen muss. Im allgemeinen kann gesagt werden, dass etwa 0,5 mg/kg bis etwa IQ 100 mg/kg Ebelacton einer erwachsenen Person als tägliche Dosis gegebenen werden können. Die optimale Dosis muss aufgrund der vorstehend genannten Faktoren vom Fachmann festgestellt werden.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Eine Schlinge voll einer Schrägbodenkultur des Stammes Streptomyces MG7-G1 (FERM-P 5363 oder ATCC 31 8^0) als Ebelacton erzeugendem Stamm wurde in 15 1 eines Kulturmediums eingeimpft. Das Kulturmedium enthielt 3,0% Glycerin, 2,0% Fischmehl und 0,2% Calciumcarhonat. Jeweils Mengen von 110 ml wurden in rotierende Kolben mit einem Fassungsvermögen von 500 ml gegeben, die dann zum Sterilisieren 20 Minuten auf 120°C erhitzt wurden. Die.. Bebrütung erfolgte an 10 aufeinanderfolgenden Tagen bei 27 C, wobei die Kolben mit einer Geschwindigkeit von 180 Umdrehungen pro Minute bewegt.wurden. Von Zeit zu Zeit wurden Proben aus dem Medium entnommen, um festzustellen, wie die Ebelacton-Produktion während der Bebrütung fortschreitet. Am zweiten Tag der Bebrütung erreichte die Ebelacton-Produktion ein Maximum; vom dritten Tag der Bebrütung an nahm die Menge der Esterase inhibierenden Substanz in dem Kulturmedium langsam ab. Der pH-Wert des bebrüteten Mediums änderte sich von 7,0 am ersten Tag

] auf 6,6 am zweiten Tag, 7,3 am dritten Tag, 7,8 am vierten Tag und 8,2 am fünften Tag der Bebrütung.

Beispiel 2

Der Stamm Streptomyces MG7-G1 (FERM-P 5363 oder ATCC 318^0) wurde zwei Tage bebrütet, wobei dasselbe Kulturmedium und dieselben Bebrütungsbedingungen angewandt wurden,wie im Beispiel 1 angegeben. Die auf diese Weise entstandene Gärbrühe (2,5 1, anti-Esterasewirkung, ID₅₀: 1 jig/ml) wurde mit 2,5 1 Butylacetat vermischt. Die entstandene Mischung wurde bei Umgebungstemperatur zwei Stunden gerührt und dann unter Zuhilfenahme eines Filtrationshilfsmittels (Diatomeenerde) filtriert. Das gewonnene Filtrat wurde in eine Butylacetat-Phase und eine wässrige Phase getrennt, die Butylacetat-Phase wurde unter vermindertem Druck eingeengt, so dass 4,36g eines öligen Produktes zurückblieben, welches aus Ebelacton bestand.

Beispiel 3

D^as ölige Produkt (4,36g) von Beispiel 2, welches das Ebelacton enthielt, wurde über eine Kolonne (2,5 χ 35 cm) mit Silikagel chromatographiert, wobei ein Lösungsmittelgemisch aus n-Hexan-Chloroform-Äthylacetat (Volumenverhältnis 5:5:1) als Eluierungsmittel verwendet wurde.

Das Eluat wurde in 10 g-Fraktionen aufgefangen; die Fraktionen 41 bis 137 enthielten aktive Substanz, d.h. das Ebelacton. Diese aktiven Fraktionen wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise ein hellgelb gefärbtes öliges Produkt. Ausbeute 434 mg.

Beispeil 4

Das ölige Produkt (434 mg) von Beispiel 3 wurde über eine Kolonne (1,2 χ 47 cm) mit phasenverkehrtem Silikagel (einem silanisierten Silikagel, beispielsweise dem Handelsprodukt " Silicagel 60") chromatographiert, wobei ein

] Lösungsmittelgemisch aus Methanol und Wasser (Y^rolumenverhältnis 1:1) als Eluierungsmittel verwendet wurde. Das Eluat wurde in 10 ml-Fraktionen aufgefangen; die aktiven Fraktionen, die das Ebelacton A enthielten, waren c die Fraktionen 38-53 und die aktiven Fraktionen, die das Ebelacton B enthielten, waren die Fraktionen 65-81. Die jeweils aktiven Fraktionen wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 20 mg Ebelacton A in Form eines farblosen Pulvers und

IQ 10 mg Ebelacton B ebenfalls in Form eines farblosen

Pulvers. Die beiden Ebelacton-Produkte ergaben bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel Einzelflecken bei Rf 0,72 bzw. 0,80, wenn zum Entwickeln ein Lösungsmittelgemisch aus n-Hexan-Chloroform-Äthylacetat

15 (Volurnenverhältnis 5:5:1) verwendet wurde.

Beispiel 5

1000 1 eines Kulturmediums, welches 3,0 % Glycerin, 2,0% Fischmehl, 0,2% Calciumcarbonat und 0,01% eines

20 schaumverhindernden Mittels (beispielsweise das unter der Handelsbezeichnung "Adecanol" erhältliche, aus Polyoxyalkylen bestehende Produkt) enthielt, wurden in

einen Behälter aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 2000 1 gegeben und zum Sterilisieren 30 Minuten auf 120 C erhitzt. Das sterilisierte Kulturmedium wurde mit 50 1 einer Samenkultur geimpft; die Samenkultur war erhalten worden, indem man den Stamm Streptomyces MG7-G1 (FERM-P 5363) zwei Tage bei 28⁰C unter Belüftung und unter Rühren bebrütete. Das geimpfte Kulturmedium wurde 43 Stunden bei 28°C bebrütet, wobei die Belüftung mit 80 1 Luft pro Minute erfolgte und der Rührer mit 240 Umdrehungen pro Minute lief. Die auf diese Weise entstandene Gärbrühe wurde mit 350 1 Butylacetat vermischt und 4 Stunden gerührt. Danach wurde abdekantiert und unter Verwendung eines Filtrationshilfsmittels sowie eines Korbzentrifugators filtriert, um das

] Mycel zu entfernen. Die Butylacetat-Phase, die auf diese Weise entfernt worden war, wurde unter vermindertem Druck eingeengt und ergab 1,9 1 einer konzentrierten, Ebelactonhaltigen Lösung.

Beispiel 6

Die konzentrierte Lösung (1,9 1) von Beispiel 5, die das Ebelacton enthielt, wurde auf eine Kolonne (10 χ 60 cm) mit Silikagel gegeben. Die Kolonne wurde mit 7 1 n-Hexan

IQ gewaschen. Anschliessend wurde die Kolonne mit 4,5 1 n-Hexan-Chloroform (Volumenverhältnis 1:1) entwickelt und schliesslich mit 10 1 n-Hexan-Chloroform-Äthylacetat (Vblumenverhältnis 5:5:1) eluiert. Das Eluat wurde in 50 ml-Fraktionen aufgefangen; als aktive Fraktionen wurden die Fraktionen 81 - 200 erhalten. Diese aktiven Fraktionen ■ wurden vereinigt und eingeengt; man erhielt auf diese Weise 150,9 g eines öligen Produktes.

Beispiel 7

Das ölige Konzentrat (71,6 g), welches gemäss Beispiel 6 erhalten worden war und welches das Ebelacton enthielt, wurde über eine Kolonne (5,1 χ 17,5 cm) mit phasenverkehrtem Silikagel (vergl. Beispiel 4) chromatographiert, wobei ein Gemisch aus Methanol und Wasser (Volumenver-

25 hältnis 1:1) als Eluierungsmittel verwendet wurde. Das Eluat wurde in 20 ml-Fraktionen aufgefangen.

Bei der Prüfung mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie zeigt es sich, dass sich das Ebelacton A hauptsächlich

in den Fraktionen 105 - 147 befand, in welches Ebelacton B nicht festgestellt werden konnte. Die Ebelactone A und B befanden sich zusammen in den Fraktionen 148 - 270. Das Ebelacton B allein befand sich hauptsächlich in den Fraktionen 271 - 443, in welchen kein Ebelacton A fest-

35 gestellt werden konnte. Die vereinigten Fraktionen 105 147, die vereinigten Fraktionen 148 bis 270 und die

vereinigten Fraktionen 271 - 44 3 wurden jeweils unter vermindertem Druck eingeengt und ergaben jeweils 392 mg bzw. 974 mg bzw. 518 mg gelbgefärbter Pulver.

2 Beispiel 8

Das erste der gelben Pulver (392 mg) von Beispiel 7, welches im wesentlichen Ebelacton A enthielt, wurde über eine Kolonne mit Silikagel (1,3 χ 48 cm) chromatographiert, wobei zum Eluieren ein Lösungsmittelgemisch aus n-Hexan

^q und Chloroform (Volumenverhältnis 3:1) verwendet wurde.

Das Eluat wurde in 5 g-Fraktionen aufgefangen. Die aktiven Fraktionen 101 - 130 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 175 mg eines farblosen Pulvers, welches aus Ebelacton A bestand. Dieses Pulver ergab bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel einen Einzelfleck bei Rf 0,72, wenn als Laufmittel ein Gemisch aus n-Hexan-Chloroform-Äthylacetat (Volumenverhältnis 5:5:1) verwendet wurde. Dieses farblose Pulver wurde in einer kleinen Menge Methanol gelöst. Die entstandene Methanollösung wnirde in kleinen Mengen mit Wasser versetzt, wobei sich 128 mg Ebelacton A in Form von Nadeln abschieden. F.: 86°C. Dieses kristalline Produkt von Ebelacton <A wies eine Potenz von 0,056 mcg/ml für seinen ID„ gegen

25 Esterase auf.

Beispiel 9

Das in Beispiel 7 letztgenannte gelbe Pulver (518 mg), welches im wesentlichen aus Ebelacton B bestand, wurde ebenfalls über eine Kolonne mit Silikagel (1,3 χ 50 cm) chromatographiert. Zum Eluieren wurde ein Gemisch aus η-Hexan und Chloroform (Volumenverhältnis 3:1) verwendet. Das Eluat wurde inlO g-Fraktionen aufgefangen und die aktiven Fraktionen Nr. 49 - 58 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 219 mg eines farblosen Pulvers, welches aus Ebelacton B

O I U iJ O

- 36 -

bestand. Dieses Pulver ergab bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel einen Einzelfleck bei Rf 0,80, wenn als Laufmittel ein Lösungsmittelgemisch aus n-Hexan-Chloroform-Äthylacetat (Volumenverhältnis 5:5:1) verwendet wurde. Dieses farblose Pulver wurde in einer kleinen Menge Mehtanol aufgenommen. Die entstandene Methanol-Lösung wurde in kleinen Mengen mit Wasser versetzt, wobei sich 129 mg Ebelacton B in Form von Nadeln abschieden. F.: 77°C. Dieses kristalline Ebelacton B wies eine Potenz von 0,00035 mcg/ml für seinen ID_„ gegenüber Esterase auf.

Claims (1)

1. MEISSNER & BOLTE

   BREMEN

   u y ö J Ό

   Anmelder:

   ZAIDAN HOJIN BISEIBUTSU KAGAKÜ KENKYU KAI

   14-23, Kami Osaki 3-chome Shinagawa-ku
   Tokyo, Japan

   PATENTANWÄLTE DIPL.-ING. HANS MEISSNER DIPL.-ING. ERICH BOLTE

   Telefon 0421-342019
   Telegramme: PATMEIS BREMEN Telex: 24 6157 (meibo d)

   Datum ii. März 1981

   Unser Zeichen 5215

   Ihr Zeichen (VNR): 100943

   Die neue, physiologisch wirksame Substanz Ebelacton und Verfahren zur Herstellung derselben

   Patentansprüche

   ^l. Neue Verbindungen mit therapeutischer Wirkung, nämlich Ebelacton A und Ebelacton B der allgemeinen Formel

   CH

   ,3 ,3,3,3

   CH, ,3

   CH

   CH

   R-CH-CH-CH-CH₀-C=CH-CH-C-CH-CH-CH-Ch₀-CH,

   Il ² Il I ^{2 3}

   O=C - 0 0 OH

   in welcher R eine Methylgruppe-CH_ (Ebelacton A) oder eine Äthylgruppe-CH_OCH_ (Ebelacton B) bedeutet.

   Eingesandte Modelle werden nach 2 Monaten, falls nichl zurückgefordert, vernichtet. Mündliche Abreden, insbesondere durch Fernsprecher, bedürfen schriftlicher Bestätigung. — Die in Rechnung gestellten Kosten sind mit Rechnungsdatum ohne Abzug fällig. — Bei verspäteter Zahlung werden Bankzinsen berechnet.

   Gerichtsstand und Erfüllungsort Bremen. Bremer Bank. (BLZ 29080010) Nr. 2310028 - Die Sparkasse in Bremen (BLZ 290501 01) Nr. 1045855 - Postscheckkonto: Hamburg (BLZ 20010020) 33952-202

   - 2 2. Ebelacton A der Formel

   CH, CH, CH, CH, CH, CH -CH-CH-CH-CH₂-C=CH-CH-C-CH-CH-Ch-CH₂-CH₅

   O=C-O

   0 OH

   3. Ebelacton B der Formel

   CH, CH- CH, CH, CH, ,3 ,3,3,3 ,3

   CH_x-CH₉-CH-CH-CH-CH₀-C=CH-CH-C-CH-CH-CH-CH₀-CH, ³²II ² Il I ^{2 3}

   O=C-O 0 OH

   4. Verfahren zur Herstellung von Ebelacton, dadurch gekennzeichnet, dass man einen ebelectonerzeugenden Stamm der Gattung Streptomyces unter aeroben Bedingungen solange in einem Kulturmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, zuchtCt, dass sich eine ausreichende Menge Ebelacton in dem Kulturmedium ansammeln kann.

   5. Verfahren nach Anspruch 4, weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass Ebelacton aus dem Kulturmedium abgetrennt und gewonnen wird.

   6. Verfahren nach den Ansprüchen 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass als ebelactonerzeugender Stamm Streptomyces MG7-G1 mit den Hinterlegungsnummern FERM-P 5363 sowie ATCC 318^0 verwendet wird.

   nsrjhirägHch • gsilnderi

   O 1 η Q '1 ~> K ο ι U J J j j

   7. Verfahren zur Herstellung von Ebelacton A, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Ebelacton A erzeugenden Stamm der Gattung Streptomyces solange unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, züchtet, dass sich das Ebelacton A in dem Kulturmedium ansammeln kann.

   8. Verfahren zur Herstellung von Ebelacton B, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Ebelacton B erzeugenden Stamm der Gattung Streptomyces unter aeroben Bedingungen solange in einem Kulturmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, züchtet, dass sich das Ebelacton B in dem Kulturmedium ansammeln kann.

   9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces MG7-G1 bei einer Temperatur von 20 bis 37⁰C ein bis drei Tage lang züchtet.

   10. Pharmazeutische Zubereitung, bestehend aus einer

   ausreichenden Menge wenigstens einer der Substanzen Ebelacton A oder Ebelacton B in Mischung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägermaterial.

   11. Mittel zur Erhöhung der Abwehrkräfte beziehungsweise der Immunreaktion lebender Individuen, bestehend aus wenigstens einer der Substanzen Ebelacton A oder Ebelacton B gemäss Anspruch 1 als aktivem Bestandteil

   in Mischung mit einem pharmazeutisch akzeptablem Trägermaterial.

   12. Verfahren zur Erhöhung der Immunreaktion bei lebenden Tieren, dadurch gekennzeichnet, dass man den Tieren eine zur Immunpotenzierung ausreichende Menge wenigstens eines der Ebelactone A oder B gemäss Anspruch 1 verabreicht.

   0 I U J j j j

   -A-

   13. Entzündungshemmendes Mittel zur Behandlung von Entzündungen bei lebenden Tieren, bestehend aus wenigstens einem der Ebelactone A oder B gemäss Anspruch als aktivem Bestandteil sowie einem pharmazeutisch akzeptablem Trägermaterial für den aktiven Bestandteil.

   14. Verfahren zur Behandlung von Entzündungen bei lebenden Tieren, dadurch gekennzeichnet, dass man den Tieren eine zur Bekämpfung der Entzündung ausreichende Menge wenigstens eines der Ebelactone A oder B gemäss Anspruch 1 verabreicht.