DE69626010T2

DE69626010T2 - Verwendung von tropolon derivate zur hemmung des inositmono phosphatase

Info

Publication number: DE69626010T2
Application number: DE69626010T
Authority: DE
Inventors: Maurizio Denaro; Khalid Islam; Federica Sponga; Stefania Stefanelli
Original assignee: Lepetit SpA
Current assignee: Gruppo Lepetit SpA
Priority date: 1995-05-24
Filing date: 1996-05-20
Publication date: 2003-07-24
Anticipated expiration: 2016-05-21
Also published as: WO1996037197A1; ATE231721T1; DK0828483T3; EP0828483A1; US5990160A; JPH11505817A; CA2221771A1; KR20040004513A; CA2221771C; AU5900096A; DE69626010D1; AU698059B2; JP4054061B2; ES2186782T3; PT828483E; KR100412753B1; SI0828483T1; EP0828483B1; KR19990021882A

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung einiger Tropolon-Derivate als Inhibitoren des Enzyms Inositolmonophosphatase (EC 3.1.3.25), hiernach mit dem Acronym "IMPase" bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung dieser Verbindungen zur Behandlung von Manie- und Depressionssymptomen sowie pharmazeutische Formulierungen, welche die Verbindungen als Wirkstoff enthalten; die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch in Analyseverfahren zum Nachweis von IMPase verwendet werden.
Die Tropolon-Derivate sind insbesondere bekannte Verbindungen der Formel I
worin R für eine Carboxylgruppe und R¹ für Wasserstoff steht oder R und R¹ zusammen mit den benachbarten Kohlenstoffatomen einen heterocyclischen Ring der Formel:
bilden.
Steht R in obiger Formel für eine Carboxylgruppe und R¹ für Wasserstoff, ist die Verbindung Puberulsäure (d. h. 3,4,6-Trihydroxy-5-oxo-1,3,6-cycloheptatrien-1-carbonsäure), während wenn R und R¹ zusammen mit den benachbarten Kohlenstoffatomen einen heterocyclischen Ring, wie oben definiert, bilden, ist die Verbindung Puberulonsäure (d. h. 3,4,6-Trihydroxy-5-oxo-1,3,6-cycloheptatrien-1,7-dicarbonsäureanhydrid).
Wie auf dem Gebiet bekannt ist, sind die tautomeren Formen der Verbindungen der Formel I äquivalent und daher durch die vorliegende Formel umfasst.
Obwohl diese Verbindungen bereits in den frühen 30ern isoliert wurden, wie beschrieben von Birkinshaw et al., Biochem. Jour. 26, 441 (1932), wurde ihre Struktur erst 15 Jahre später bestimmt, wie beschrieben von Corbett et al., Jour. Chem. Soc., 1950, 6. Einige Jahre später wurde auch die chemische Synthese der Tropolon-Derivate von Johns et al., Jour. Chem. Soc. 1954, 198 und von Nozoe et al., Bull. Chem. Soc. Jap., 33, 1071 (1960) beschrieben.
Puberulsäure und Puberulonsäure, wie andere Tropolon-Derivate, sind für ihre antimikrobielle Wirksamkeit bekannt, während für einige andere Tropolon-Derivate eine antineoplastische Wirkung oder eine antiallergische Wirkung beschrieben wurde; siehe beispielsweise Yamato M. et al., Jour. Med. Chem. 30(10), 1897-1900 (1987) bzw. Bagli J. F., Jour. Med. Chem. 22(10), 1186 (1979).
Bei Manie- und Depressions-bekämpfenden Therapien ist die Verwendung von Lithium, vorzugsweise in Form von Lithiumcarbonat, dafür bekannt, dass es die Symptome der Manie lindert und die Gemütslage manischer Patienten normalisiert, anstelle dass man das Übermaß des manischen Zustands durch Beruhigungsmittel oder "Ruhigstellung" kompensiert. Ferner scheint es das einzige Arzneimittel in der Psychiatrie zu sein, für das eine deutliche Prophylaxe gegen das erneute Erkranken und die Verschlechterung des Zustands gezeigt wurde. Lithium zeigt seine deutlichste Wirkung in manisch-depressiven Erkrankungen, welche sowohl Manie und Depression, oder nur Manie umfassen; diese Störungen werden in manisch-depressive I- und II-Störungen unterteilt. Im ersten Fall liegt eine vollausgewachsene manische Episode vor, während im zweiten Fall nur eine milde Hypomanie auftritt.
Trotz seiner therapeutischen Eigenschaften wird die therapeutische Verwendung von Lithium durch eine Anzahl Themen beeinträchtigt. Antipsychotika sind die ersten pharmakologischen Mittel zur Behandlung akuter manisch-depressiver Störungen, sofern der Patient stabil genug ist, um die 7 bis 10 Tage zu warten, die das Lithium benötigt, um seine anti-manische Wirkung zu entfalten. Eine teure Aufarbeitung vor der Vergabe von Lithium ist aufgrund der negativen Wirkungen, die eine Lithiumtherapie üblicherweise mit sich bringt, erforderlich. In der Tat kann Lithium eine vorübergehende Leukocytenauflösung verursachen; es kann dazu führen, dass Patienten mit einer grenzwertigen Schilddrüsenreserve eine klinische Schilddrüsenüberfunktion entwickeln, und es kann dazu führen, dass der Herzzustand aufgrund von Verschiebungen in Fluiden und Elektrolyten entgleist.
Es wurde beobachtet, dass das Polyurie-Polydipsie-Symptom bei bis zu 60% der behandelten Patienten auftritt. Strukturelle Läsionen in der Niere, wie die interstitielle Fibrose, die Tubulusatrophie und die Glomerulosklerose, wurden nach der chronischen Lithiumbehandlung beobachtet, insbesondere bei Patienten, die eine Lithiumtoxizität erfahren hatten. Andere schädliche Wirkungen von Lithium umfassen Zittern, Gewichtszunahme, Diarrhoe und Hautausschlag. Diese Nebenwirkungen sind schwerwiegende praktische Hinderungsgründe für die Verwendung von Lithium in der klinischen Praxis.
Nebenwirkungen, insbesondere die schwerwiegenderen, können durch Überwachen der Lithiumkonzentration im Plasma manisch-depressiver Patienten verringert werden. Die Notwendigkeit, die Wirkstoffkonzentration im Plasma zu überwachen und diese innerhalb eines engen therapeutischen Bereichs zu halten, beeinträchtigt seine klinische Nützlichkeit.
Ein ideales Lithium-nachahmendes Mittel hätte eine schnelle Wirkungsentfaltung bei sowohl manisch-depressiver als auch nicht-manisch-depressiver Depression, würde eine Dosierung von einmal täglich benötigen und ein Sicherheitsprofil aufweisen, das keine lange Vorbehandlung zur medizinischen Abschätzung benötigt, würde keine Überwachung des Wirkstoffs im Plasma erfordern noch würde es ein derart schwerwiegendes Spektrum von Nebenwirkungen aufweisen, wie Lithium selbst.
Es wurde gezeigt, dass Inositolmonophosphat ein Schlüsselenzym in dem Phosphoinositid-Zyklus ist und für die Bereitstellung von Inositol durch Dephosphorylierung von Inositol-1-Phosphat, Inositol-3-Phosphat und Inositol-4-Phosphat verantwortlich ist; da Lithium die Aktivität dieses Enzyms hemmt, wurde vorgeschlagen, dass diese Hemmung sehr wahrscheinlich der molekulare Mechanismus ist, durch den Lithium seine anti- manische und anti-depressive Wirkung entfaltet.
In dieser Hinsicht könnte die Entwicklung potenter und spezifischer Inhibitoren der IMPase zu einer völlig neuen Wirkstoffwirksamkeit zur Behandlung von Manie und Depression führen.
Geeignete Verbindung, welche diese hemmende Wirkung gegen IMPase zeigen, sind die Verbindungen der Formel I.
Wie oben erwähnt können die Verbindungen der Formel I entweder durch mikrobielle oder durch chemische Synthese gewonnen werden.
Wird die mikrobielle Synthese eingesetzt, kann Puberulonsäure allgemein in größeren Mengen als Puberulsäure gewonnen werden und daher wird letztere vorzugsweise durch eine Decarboxylierungsreaktion aus Puberulonsäure hergestellt.
Das mikrobielle Verfahren zur Gewinnung von Puberulonsäure umfasst:
a) Kultivieren, unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Nährmedium, welches assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen enthält, eines Pilzes der Gattung Penicillinum, der fahig ist, die erfindungsgemäße IMPase-hemmenden Verbindungen herzustellen;
b) Gewinnen der IMPase-hemmenden Verbindungen aus dem Nährmedium und/oder dem Myzel;
c) Reinigen und Isolieren der Puberulonsäure gemäß Verfahren, die an sich bekannt sind.
Geeignete Mikroorganismen der Penicillinum-Gattung für obiges Verfahren sind P. puberulum, P. aurantiovirens, P. johannioll und P. cyclopium viridicatum, die gemäß bekannten Verfahren fermentiert werden können, beispielsweise wie in der oben zitierten Referenz (d. h. Birkinshaw et al.) oder von Oxford et al., Chem. Ind. 1942, 61, 485 beschrieben.
Das zur Kultivierung des produzierenden Stamms verwendete Medium kann jedes Fluid oder Feststoffmedium sein, das die Nährstoffe, die von den jeweiligen Mikroorganismen verwendet werden können, enthält, obwohl ein Fluidmedium für den Betrieb im gewerblichen Maßstab bevorzugt ist.
Wie auf dem Gebiet bekannt ist kann die Zusammensetzung des Nährmediums über einen breiten Bereich verändert werden, vorausgesetzt die Kohlenstoff und Stickstoffquellen sind in dem Fermentationsmedium vorhanden. Übliche Kohlenstoffquellen umfassen: Glucose, Lactose, Maltose, Galactose, Sucrose, Dextrin, Fette und ÖIe (z. B. Sojabohnenöl, Lardöl, Hühneröl), Stärken, Glycerol, Mannitol, Sorbitol und dergleichen. Übliche Stickstoffquellen umfassen: Ammoniak, Ammoniumsulfat, Aminosäuren, wie Glycin, Arginin, Threonin, Methionin, Trypton, Pepton, komplexe Quellen, wie Hefeautolysate, Malze, Sojabohnen, Baumwollsamen, Tomatenpaste, gewöhnlicher, in Wasser eingeweichter Mais, Hefeextrakt, Fleischextrakt und Fermentationsnebenprodukte, wie Vollhefe und Brennereirückstände. Andere wesentliche Nährstoffe werden über die Mineralsalze, wie die Chloride, Nitrate, Sulfate, Carbonate und Phosphate von Natrium, Kalium, Ammonium, Magnesium und Calcium bereitgestellt. Das Nährmedium kann auch Quellen für anorganische Spurenelemente, wie Magnesium, Eisen, Kupfer, Mangan, Zink, Colbalt, Cadmium, Molybdän und dergleichen enthalten. Es ist natürlich möglich anorganische oder organische Säuren, Laugen, Puffer usw. zum Anpassen des pH-Wertes des Mittels zuzugeben, oder geeignete Mengen von Ölen, oberflächenaktiven Mitteln usw. zur Entschäumung zuzugeben.
Üblicherweise wird der produzierende Stamm in einer Schüttelflasche vorkultiviert und dann wird die Kultur verwendet, um Flaschenfermentoren zur Herstellung größerer Mengen IMPase-hemmender Substanzen herzustellen. Das für die Vorkultur verwendete Medium kann das gleiche sein, wie für größere Fermentationen verwendet, jedoch können auch andere Medien verwendet werden.
Den produzierenden Stamm lässt man allgemein bei Temperaturen von 20ºC bis 40ºC, vorzugsweise 24ºC bis 35ºC wachsen, besonders bevorzugt ist eine Temperatur von etwas 25ºC.
Die Fermentation kann durch jedes Verfahren durchgeführt werden, wie durch eine stationäre, Schüttel- oder aerob gerührte Kultur; vorzugsweise werden Schüttel- oder Oberflächen-Kulturen verwendet, besonders bevorzugt ist die Fermentation auf einer Umlaufschüttelmaschine.
Die Bewegung und Belüftung der Kulturgemische kann auf verschiedene Weise erfolgen. Die Bewegung kann durch einen Rührer oder eine ähnliche mechanische Rührvorrichtung bereitgestellt werden, indem der Fermentor gedreht oder geschüttelt wird, durch zahlreiche Pumpvorrichtung oder durch das Durchleiten von steriler Luft durch das Medium. Die Belüftung kann durch Durchleiten steriler Luft durch das Fermentationsgemisch erreicht werden.
Während der Fermentation kann die Herstellung der IMPase-hemmenden Verbindungen überwacht werden, indem man Probenextrakte aus der Nährlösung oder dem Myzel auf die IMPase-hemmende Wirkung untersucht, beispielsweise durch Bioassays oder mittels TLC- oder HPLC-Verfahren.
Im allgemeinen ist die Fermentation in etwa 3 bis 5 Tagen abgeschlossen.
Die Gewinnung der IMPase-hemmenden Verbindungen aus dem Myzel oder der Fermentationsnährlösung der produzierenden Mikroorganismen erfolgt mittels an sich bekannter Verfahren, wie der Extraktion mit Lösungsmitteln, der Präzipitation durch Zugabe von Nicht-Lösungsmitteln oder durch Verändern des pH-Wertes der Lösung, durch Trennungschromatographie, Umkehrphasen-Trennungschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Molekülausschlusschromatographie und dergleichen.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Gewinnung der rohen erfindungsgemäßen IMPase- hemmenden Substanzen umfasst das Extrahieren des filtrierten oder zentrifugierten Myzels mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, das Aufkonzentrieren der Extrakte und das Gewinnen der rohen IMPase-hemmenden Substanzen durch Präzipitation, gegebenenfalls unter Zugabe eines Präzipitationsmittels, durch Extrahieren des wässrigen Rückstands mit einem Wasser-unmischbaren organischen Lösungsmittel oder durch Adsorptionschromatographie und anschließendes Eluieren des gewünschten Produkts aus der Adsorptionsmatrix; vorzugsweise werden die rohen IMPase-hemmenden Substanzen mittels Adsorptionschromatographie gewonnen.
Beispiele der Trennfüllungen, die nützlicherweise in obigem chromatographischem Adsorptionsschritt verwendet werden, sind Aluminiumdioxid, Diatomeenerde, Kohlenstoff, Polystyrolharze (z. B. Amberlit-XAD2 oder -XAD4, Rohm und Haas; Dowex-M112 oder -S112, Dow Chemical Co.; Diaion-HP20, Mitsubishi), Acrylharze (z. B. XAD7 oder XAD8, Rohm und Haas), Polyamidharze wie Polycaprolactame, Nylon und vernetzte Polyvinylpyrrolidone (z. B. Polyamid-CC-6, Polyamid-SC-6, Polyamid-CC-6.6, Polyamid-CC-6AC und Polyamid-SC-6AC, Macherey-Nagel & Co., Bundesrepublik Deutschland; PA-400, M. Woelm AG, Bundesrepublik Deutschland und die Polyvinylpyrrolidonharze PVP-CL, Aldrich Chemie GmbH & Co.KG, Bundesrepublik Deutschland) und vernetzte Dextrane mit kontrollierten Poren (z. B. Sephadex-LH-20, Pharmacia Fine Chemicals, Ab). Vorzugsweise werden Polystyrolharze verwendet, insbesondere bevorzugt ist der S112-Harz.
Das bevorzugte Lösungsmittel zum Eluieren der IMPase-hemmenden Verbindungen aus der Adsorptionsmatrix hängt von der spezifischen Trennfüllung ab.
Wird beispielsweise Kieselgel oder Aluminiumdioxid verwendet, sind die bevorzugten Lösungsmittel halogenierte Kohlenwasserstoffe, niedere Alkanole, Ether, höhere Ketone und Gemische davon; ein niederes Keton, wie Aceton, oder ein niederer Alkohol, wie Methanol, können mit Kohlenstoff als Trennfüllung verwendet werden; Wassermischbare Lösungsmittel oder Gemische davon, wie Ethanol, sind bevorzugte Elutionsmittel für Polystyrol- oder Acrylharze, während wässrige Gemische aus Wasser-mischbaren Lösungsmitteln bei Polyamidharzen bevorzugt sind.
Die Reinigung der rohen Puberulonsäure wird durch an sich bekannte Verfahren erreicht, beispielsweise durch Suspendieren des Rohprodukts in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie Methanol, und dem anschließenden Entfernen des Präzipitats. Puberulonsäure wird dann mittels bekannter Chromatographieverfahren abgetrennt; es kann beispielsweise ein Trennsystem verwendet werden, welches vernetzte Dextrane mit kontrollierten Poren als Trennfüllung (z. B. Sephadex-LH-20, Pharmacia Fine Chemicals, Ab) und Methanol als mobile Phase enthält. Das Pulver, das durch Auffangen und Aufkonzentrieren der aktiven Fraktionen unter Vakuum gewonnen wurde, kann weiter durch Ionenaustauschchromatographie gereinigt werden. Es kann beispielsweise in einer gepufferten Lösung (z. B. 0,02 M Natriumacetat, pH 5,5) wieder gelöst werden und die erhaltene Lösung kann oben auf eine Chromatographiesäule aufgetragen werden, die ein vernetztes Agaroseharz (z. B. Q-Sepharose, Pharmacia) enthält, welches mit einer wässrigen Lösung aus 1 N Salzsäure eluiert wird, vorzugsweise mit einem Gradienten von 10% bis 20%.
Puberulsäure wird dann durch Decarboxylierung von Puberulonsäure, wie von Corbett et al., Jour. Chem. Soc.; 1950, 6 beschrieben, gewonnen.
Puberulsäure kann auch durch direkte chemische Synthese, wie von Johns et al., Jour. Chem. Soc. 1954, 198 beschrieben, gewonnen werden. Gemäß diesem Verfahren wird eine Lösung aus 3,4,6-Trimethoxycycloheptatrien-carbonsäure (ein Zwischenprodukt, das durch Umsetzen von Diazoessigsäureethylester und 1,2,4-Trimethoxybenzol gewonnen wird) in Chloroform mit einer Lösung aus Brom in Tetrachlorkohlenstoff umgesetzt; das gewonnene Präzipitat wird dann in Ethylacetat erwärmt, in Eis abgekühlt und dann mit Hydrobromsäure hydrolisiert, so dass Stipitatsäure entsteht. Diese Stipitatsäure wird dann mit Brom umgesetzt, um Monobromstipitatsäure zu erhalten, welche dann wiederum mit Kaliumhydroxid umgesetzt wird, um die gewünschte Puberulsäure zu erhalten.
Die chemische Synthese von Puberulonsäure, wie beschrieben von Nozoe et al., Bull. Chem. Soc. Jap., 33, 1071 (1960), umfasst das Umsetzen von Tropolon-3,4-dicarbonsäureanhydrid (gewonnen durch alkalische Wasserstoffperoxid-Oxidation von Purpurogallin) mit Brom in Essigsäure, wobei das 7-Bromtropolon-3,4-dicarbonsäureänhydrid gewonnen wird, welches wiederum mit einem Gemisch aus Natrium-β-naphtalensulfonat, Natriumhydroxid und Kupferpulver umgesetzt wird, so dass 3-Hydroxy-tropolon-4,5- dicarbonsäureanhydrid entsteht. Durch Wiederholen der obigen zwei Schritte wird eine weitere Hydroxylgruppe in das Molekül eingebracht, wobei die gewünschte Puberulonsäure entsteht.
Zur Bestimmung der Wirksamkeit der Verbindungen der Formel I wird IMPase mit einer Reinheit über 90%, wie durch SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektronphorese) bestimmt, gereinigt, wie beschrieben in P. D. Pelton und A. J. Ganzhorn, Journal Biolog. Chem., 267, 1992, Seiten 5916-5920. Das Enzym kann aus dem Hirn von Tieren gereinigt werden oder aus rekombinanten E. coli-Stämmen, welche tierische IMPase exprimieren, stammen. Obwohl auch rohe Enzympräparate verwendet werden können, wird vorzugsweise das gereinigte Enzym eingesetzt. Das gereinigte Enzym hat üblicherweise eine spezifische Aktivität von 25 umol Pi/min/mg Protein, wie in einem üblichen Assay bestimmt (P. V. Attwood et al., Biochem. Jour.; 1988, 253, Seiten 387- 394) mit 4 mM 2-Glycerolphophat als Substrat.
Die Enzymaktivität kann gemäß A. J. Ganzhorn und M. C. Chanal, Biochem., 1990, 29 bestimmt werden; das Reaktionsgemisch enthält 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM Magnesiumchlorid und 0,1 mM EGTA. Dann werden 5 ug/ml des Enzym; IMPase und 4 mM 2-Glyerolphophat-Substrat zu dem Reaktionsgemisch zugegeben; alternativ ist es auch möglich das Substrat direkt in das Reaktionsgemisch zuzugeben, bevor das Enzym zugegeben wird.
Die Reaktion gilt 30 Minuten nach der Zugabe des Substrats oder des Enzyms (je nachdem welches später zugegeben wird) als beendet; das freigesetzte Phosphat wird durch Molybdatfärbung bestimmt (P. V. Attwood et al., Biochem. Jour., 1988, 253, Seiten 387-394) bei 350 nm mit einem Shimadzu-Spektrophotometer-UV-2100.
Die Enzymreaktion wird entweder in Abwesenheit oder in Gegenwart verschiedener Konzentrationen der Verbindungen der Formel I durchgeführt, um die molare Menge des Inhibitors zu bestimmen, der zur Hemmung der Enzymaktivität um 50% benötigt wird (IC&sub5;&sub0;).
Dieser IC&sub5;&sub0;-Wert ist etwas 4 uM für Puberulonsäure und etwa 40 uM für Puberulsäure, viel geringer als der von Lithium, der etwa 1250 uM beträgt.
Auf Grundlage der obigen Ergebnisse finden die Verbindungen der Formel I Verwendung im therapeutischen Gebiet als Manie- und Depression-bekämpfendes Mittel.
Für die Behandlung von manischen oder depressiven Symptomen können die erfindungsgemäßen Verbindungen als solche verabreicht werden oder mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern formuliert werden; die Verabreichung kann oral, parenteral oder rektal erfolgen.
Für die orale Verabreichung können die erfindungsgemäßen Verbindungen zu festen oder flüssigen Präparaten wie Kapseln, Pillen, Tabletten, Pastillen, Pulvern, Sirups, Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen formuliert werden.
Zur Herstellung fester Zusammensetzungen, wie Tabletten, wird der Hauptwirkstoff mit einem pharmazeutischen Träger, d. h. herkömmlichen Tablettenbestandteilen wie Lactose, Sucrose und Kornstärke, in Verbindung mit Bindemitteln, wie Gummiarabicum, Kornstärke oder Gelatine, Tablettenspaltmitteln, wie Kartoffelstärke oder Alginsäure, Schmiermitteln, wie Stearinsäure oder Magnesiumstearat oder anderen pharmazeutischen Verdünnungsmitteln, z. B. Wasser, gemischt werden, so dass eine feste Vorformulierungszusammensetzung entsteht, die ein homogenes Gemisch enthält. Spricht man bei dieser Vorformulierungszusammensetzung von homogen, ist damit gemeint, dass der Wirkstoff gleichmäßig durch die Zusammensetzung verteilt vorliegt und die Zusammensetzung leicht in gleichsam wirksame Einheitsdosierungsformen, wie Tabletten, Pillen, Kapseln und dergleichen unterteilt werden kann. Diese feste Vorformulierungszusammensetzung wird dann in Einheitsdosierungsformen des oben beschriebenen Typs unterteilt, welche 50 bis etwa 350 mg des erfindungsgemäßen Wirkstoffs enthalten. Die Tabletten oder Pillen der neuen Zusammensetzungen können beschichtet werden oder auf andere Weise compoundiert werden, so dass ein Dosierungsform bereitgestellt wird, die den Vorteil einer Langzeitwirkung bereitstellt. Die Tablette oder Pille kann beispielsweise eine innere Dosierungs- und eine äußere Dosierungskomponente umfassen, wobei die letztere in Form einer Umhüllung um die erstere ist. Die zwei Komponenten können durch eine im Darm lösbare Schicht getrennt sein, welche resistent gegen einen Abbau im Magen ist und ermöglicht, dass die innere Komponente intakt in den Zwölffingerdarm gelangt oder dass seine Freisetzung verzögert erfolgt.
Die flüssigen Formen, in die die neue erfindungsgemäße Zusammensetzung zur oralen Verabreichung eingebracht werden kann, umfassen wässrige Lösungen, geeignet aromatisierte Sirupe, wässrige oder ölige Suspensionen, aromatisierte Emulsionen mit essbaren Ölen, wie Baumwollsamenöl, Sesamöl, Kokosnussöl, Erdnussöl und dergleichen, sowie Elixiere und ähnliche pharmazeutische Vehikel. Geeignete Dispersions- oder Suspensionsmittel für wässrige Suspensionen umfassen synthetische und natürliche Gummi, wie Tragacanth, Gummiarabicum, Alginat, Dextran, Natriumcarboxymethylcellulose, Methylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Gelatine und dergleichen.
Zur parenteralen Verabreichung können die erfindungsgemäßen Verbindungen zu geeigneten injizierbaren Präparaten, die ein flüssiges Vehikel enthalten, formuliert werden. Solche Vehikel haben gewöhnlich keine therapeutische Wirkung und sollten nicht-toxisch sein. Beispiele geeigneter Vehikel zur Herstellung injizierbarer Dosierungsformen der erfindungsgemäßen Verbindungen sind Wasser, wässrige Vehikel (z. B. Natriumchloridinjektionen, Dextroseinjektionen usw.), mit Wasser mischbare Lösungsmittel (z. B. Ethylalkohol, Polyethylenglycol, Propylenglycol usw.) sowie nicht-wässrige Vehikel (z. B. "nicht-flüssige Öle", wie Maisöl, Baumwollsamenöl, Erdnussöl und Sesamöl). Optional können die injizierbaren Präparate ferner Puffer zur Stabilisierung der Lösung (z. B. Citrate, Acetate und Phosphate) und/oder Antioxidationsmittel (z. B. Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit) enthalten. Der gewünschte parenterale Verabreichungsweg bestimmt die Erfordernisse der jeweiligen Formulierung. Suspensionen sollten beispielsweise nicht direkt in den Blutstrom verabreicht werden, da die Gefahr besteht, dass unlösliche Teilchen die Kapillaren blockieren, während man bei Lösungen, die subkutan verabreicht werden sollen, streng auf die Anpassung an den Spannungszustand achten muss, da ansonsten die Nervenenden in dem anatomischen Bereich einen starken Schmerz verursachen würden.
Nützliche Hinweise zur Herstellung geeigneter oraler, parenteraler oder rektaler Dosierungsformen sind zu finden in: Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Ausgabe, 1985, 1985 (Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania).
Die Dosierung des Wirkstoffs hängt von vielen Faktoren ab, einschließlich dem Typ, dem Alter und dem Zustand des Patienten, dem spezifischen Wirkstoff und der für die Verabreichung ausgewählten Formulierung, dem Verabreichungsplan usw.
Allgemein wird ein Dosierungsspiegel von etwa 1 bis 20 mg/kg/Tag bei einer Dosierung von 1-4mal täglich bevorzugt.
Es versteht sich, dass die genaue Behandlungsmenge von der Krankheitsgeschichte des zu behandelnden Patienten abhängt und letztlich wird es dem Ermessen des behandelnden Arztes überlassen, die genaue Behandlungsmenge, innerhalb der obigen Richtlinien, zu ermitteln.
Nachstehend werden anschauliche Beispiele zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen beschrieben.

Beispiel 1: Fermentation von Penicillinum puberulum

Penicillinum puberulum ATCC 8732 wurde in Czapek-Dox-Medium, wie von Birkinshaw et al., Biochem. Jour. 26, 441 (1932) beschrieben, fermentiert.

Beispiel 2: Gewinnung von Puberulonsäure

Die gemäß Beispiel 1 gewonnene Fermentationsnährlösung wurde gewonnen und das Myzel durch Filtration mit einer Hyflo®-Filtermatrix entfernt. Puberulonsäure wurde aus der Filtratnährlösung (bei pH 3,5, 3 Stunden unter Rühren, chargenweise) auf 450 ml S112®-Polystyrolharz (The Dow Chemical Company) adsorbiert. Das Harz wurde dann entfernt, mit Wasser gewaschen und mit 1,51 eines Gemischs aus Aceton : BuOH : Wasser, 8 : 1 : 1 eluiert. Die Eluate wurden unter reduziertem Druck aufkonzentriert und der wässrige Rückstand lyophillisiert, wobei 12,2 g rohe Puberulonsäure entstanden. Die rohe Puberulonsäure kann auch durch Präzipitation mit einem nicht-polaren Lösungsmittel, wie Diethylether, gewonnen und das Präzipitat anschließend filtriert und getrocknet werden.

Beispiel 3: Reinigung von Puberulonsäure

5 g des rohen Präparats (gemäß Beispiel 2 gewonnen) wurden in Methanol suspendiert, das Präzipitat wurde durch Zentrifugation abgetrennt und verworfen. Der Überstand wurde unter reduziertem Druck aufkonzentriert und die gewonnene Probe oben auf eine Sephadex®-LH-20-Säule (Harzkorndurchmesser 25-100 um, Pharmacia; Säule: 6 · 50 cm), welche zuvor in Methanol equillibriert worden war, aufgetragen.
Es erfolgte eine schrittweise Fraktionierung des rohen Antibiotikums, ohne Druck, indem mit Methanol eluiert wurde. Die aktiven Fraktionen (im Enzymassay getestet) wurden aufgefangen und unter Vakuum aufkonzentriert. Der Feststoff wurde dann wieder in Wasser gelöst und lyophillisiert, wobei 60 mg Pulver entstanden.
40 mg des obigen Pulvers wurden in 30 ml Natriumacetat (0,02 M, pH 5,5) gelöst und dann oben auf eine Q-Sepharose®-Säule (Harzkorndurchmesser 24-44 um, Pharmacia; Säule: 1,5 · 12 cm), welche zuvor mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war, aufgetragen. Nach der vollständigen Adsorption des Materials wurde die Säule mit 200 ml deionisiertem Wasser gewaschen. Die Elution erfolgte durch Eluieren mit Wasser/1 N HCl, mit einem Stufengradienten von 10% bis 20% HCl. Die aktiven Fraktionen wurden aufgefangen, mit Ethylacetat bei saurem pH extrahiert, unter reduziertem Druck aufkonzentriert und von Wasser lyophillisiert, wobei 10 mg eines gelben Pulvers gewonnen wurden.

Beispiel 4: Decarboxylierung von Puberulonsäure

5 mg Puberulonsäure wurden in 300 ul Wasser gelöst und bei 105ºC 15 Stunden unter Stickstoff mit einem Pico-tag-Apparat (Waters-Millipore) behandelt. Die Reaktionslösung wurde gefriergetrocknet und es entstanden etwa 3 mg Puberulsäure.

Claims

1. Verwendung von Puberul- oder Puberulonsäure zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung des Enzyms Inositolmonophosphatase; EC 3.1.3.25.

2. Verwendung von Puberul- oder Puberulonsäure zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung manischer oder depressiver Symptome.

3. Verwendung von Puberul- oder Puberulonsäure als hemmendes Mittel für das Enzym Inositolmonophosphatase EC 3.1.3.25 in in vitro-Tests.