DE69317058T2

DE69317058T2 - Die antibiotika ge 37468 a, b und c

Info

Publication number: DE69317058T2
Application number: DE69317058T
Authority: DE
Inventors: Luigi Colombo; Maurizio Denaro; Monnier Francis Le; Nicoletta Montanini; Enrico Selva; Sergio Stella
Original assignee: Biosearch Italia SpA
Current assignee: Biosearch Italia SpA
Priority date: 1992-12-22
Filing date: 1993-12-15
Publication date: 1998-06-10
Anticipated expiration: 2013-12-16
Also published as: ATE163294T1; GR3026590T3; JPH08504782A; WO1994014838A1; AU679202B2; EP0675900A1; CA2151616A1; DK0675900T3; KR960703410A; DE69317058D1; EP0675900B1; ES2112517T3; AU5810894A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue antibiotische Substanzen, die als Antibiotika GE 37468 A, B und C bezeichnet werden, deren Additionssalze mit Basen, die Arzneimittel davon und ihre Verwendung als Medikamente, insbesondere in der Behandlung von Infektionskrankheiten unter Beteiligung von Mikroorganismen, die gegen diese Antibiotika empfindlich sind.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind außerdem als wachstumsfördernde Mittel bei Tieren, wie z.B. Geflügel, Schweinen, Wiederkäuern usw., wirksam.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der Antibiotika GE 37468 A, B und C, umfassend die Züchtung von Streptomyces sp. GE 37468 ATCC 55365 oder einer die Antibiotika GE 37468 produzierenden Variante oder Mutante davon und Isolierung der erfindungsgemäßen Antibiotika aus dem Myzel und/oder den Fermentationsbrühen.
Streptomyces sp. GE 37468 ATCC 55365 wurde aus einer Bodenprobe isoliert und am 6. Oktober 1992 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 Maryland, USA, unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt.
Der Stamm erhielt die Hinterlegungsnummer ATCC 55365. Das Antibiotikum GE 37468 A stammt direkt aus dem Stoffwechselweg des vorstehend erwähnten Mikroorganismus-Stammes, dagegen scheinen die Antibiotika GE 37468 B und C hauptsächlich durch die Spaltung des vorstehend erwähnten Antibiotikums GE 37468 A zu entstehen, die während der Gewinnungsund Isolierungs7erfahren nach der Fermentation abläuft. Ein Beweis dafür is die Tatsache, daß die Mengen dieser beiden Produkte während der Bearbeitung der Fermentationsbrühe zur Isolierung und Gewinnung der Fermentationsprodukte wesentlich ansteigen, jedoch kann nicht ausgeschlossen werden, daß kleine Mengen der beiden Produkte auch als direkte Metaboliten des Mikroorganismus-Stammes produziert werden.
Die Antibiotika GE 37468 A, B und C werden hergestellt, indem ein zur Herstellung dieser Antibiotika befähigter Streptomyces-Stamm, d.h. Streptomyces sp. GE 37468 ATCC 55365 oder eine die Antibiotika GE 37468 produzierende Variante oder Mutante davon, unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält, gezüchtet wird und die antibiotischen Produkte aus dem Fermentationsansatz isoliert werden. Hierfür können viele der Nährmedien verwendet werden, die üblicherweise nach dem Stand der Technik zur Fermentation eingesetzt werden, jedoch sind bestimmte Medien bevorzugt. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Glucose, Mannose, Galactose, Stärke, Maismehl und dergleichen. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Ammoniak, Nitrate, Sojamehl, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trypton, Aminosäuren und dergleichen. Zu den anorganischen Salzen, die im Medium enthalten sein können, zählen herkömmliche lösliche Salze, die Natrium-, Kalium-, Eisen-, Zink-, Kobalt-, Magnesium-, Calcium-, Ammonium-, Chlorid-, Carbonat-, Sulfat-, Phosphat-, Nitrat- und dergleichen Ionen liefern können.
Üblicherweise wird der die Antibiotika produzierende Stamm in einem Schüttelkolben vorkultiviert und sodann diese Kultur für die Beimpfung von Glasfermentern zur Herstellung von großen Mengen der antibiotischen Substanzen verwendet. Für die Vorkultivierung kann das gleiche Medium verwendet werden, das auch für die größeren Fermentationen eingesetzt wird, jedoch können auch andere Medien verwendet werden. Der Stamm, der die "Antibiotika GE 37468" (mit diesem allgemeinen Begriff werden alle drei vorstehend erwähnten Produkte gemeinsam bezeichnet) produziert, kann bei Temperaturen zwischen 20 und 40º0, vorzugsweise zwischen 24 und 35ºC, gezüchtet werden.
Während der Fermentation kann die Produktion der Antibiotika GE 37468 überwacht werden, indem Proben der Brühe oder des Myzelextraktes auf antibiotische Aktivität getestet werden, wobei z.B. Biotests oder DC- oder HPLC-Verfahren verwendet werden.
Organismen, die gegen die Antibiotika GE 37468 empfindlich sind, wie z.B. Bacillus subtilis und S. aureus, können als Testorganismen verwendet werden. Der Biotest wird am besten nach dem Agardiffusionsverfahren auf Agarplatten durchgeführt. Die maximale Produktion der antibiotischen Aktivität findet im allgemeinen zwischen dem zweiten und dem fünften Tag der Fermentation statt.
Die antibiotische Aktivität, die durch Züchtung des Stammes Streptomyces sp. GE 37468 ATCC 55365 oder einer Antibiotika GE 37468 produzierenden Mutante oder Variante davon produziert wird, liegt hauptsächlich im Myzel.

CHARAKTERISIERUNG DES STAMMES Streotomvces sp. GE 37468 ATCC 55365

Charakterisierunh der Zellwand

Die enantiomere Form der Zeliwand-Aminosäure (2,6-Diaminopimelinsäure) wurde unter Einsatz von Dünnschichtchromatographie bestimmt, wobei das Verfahren von Staneck und Roberts (Staneck, J. L., Roberts, G. D., "Simplified approach to identification of aerobic actinomycetes by thin layer chromatography", Applied Microbiology 28 (1974), 226-231) verwendet wurde. Die Fettsäurezusammensetzung wurde durch GC/MS-Analyse der Methylester (FAMEs) bestimmt, die nach dem Verfahren von Jantzen (Jantzen, E., "Analysis of Cellular Components in Bacterial Classification and Diagnosis", Gas Chromatography/Mass Spectrometry - Applications in Microbiology, Hrsg. G. Odham, L. Larsson, P-A Mårdh Plenum Press, New York, 1984) hergestellt wurden.
Die chemische Analyse zeigte, daß der Stamm Streptomyces sp. GE 37468 ATCC 55365 LL-2,6-Diaminopimelinsäure enthält; meso-2,6-Diaminopimelinsäure wurde nicht nachgewiesen. Das Fettsäureprofil zeigte größere Mengen von gesättigten Iso- und Anteiso-Fettsäuren.

Charakterisierung der die Ernährung betreffenden und der biochemischen Merkmale

a) Makromorphologie und biochemische Tests

Streptomyces sp. GE 37468 ATCC 55365 wurde in flüssigem V6-Medium, das die folgende Zusammensetzung aufwies:
Glucose 20 g/l
Fleischextrakt 5 g/l
Hefeextrakt 5 g/l
Bacto-Pepton 5 g/l
Casaminosäuren 3 g/l
NaCl 1,5 g/l
vier Tage gezüchtet. Das Myzel wurde abzentrifugiert und zweimal in steriler, auf 1/4 der Stärke verdünnter Ringer-Lösung (OXOID) gewaschen, die kleine Glasperlen (2 mm) enthielt, um das Myzel aufzubrechen. Anschließend wurde ausreichend Ringer- Lösung zum Myzel zugegeben, daß ein geeignetes Impfmaterial erhalten wurde (A&sub4;&sub1;&sub4; = 1,8). Aliguots der Suspension wurden im Muster einer Kreuzschraffierung auf verschiedene von Shirling und Gottlieb empfohlene Medien (Shirling, E. B., und Gottlieb, D., "Method for characterization of Streptomyces spedes", Int. J. Syst. Bacteriology 16 (1966), 313-340) und mehrere von Waksman empfohlene Medien (Waksman, S. A., "The Actinomycetes", (1961), Bd. 2, 328-334, The Williams und Wilkins Co., Baltimore) ausgestrichen. Die Fähigkeit, verschiedene Kohlenhydrate als Kohlenstoff- und Energiequelle zu verwerten, wurde in ISP8-Medium (Shirling und Gottlieb, a.a.O.) bestimmt, das die jeweilige Kohle nstoffquelle in einer Endkonzentration von 2 % (Gew./Vol.) enthielt. Alle Medien wurden vier Tage bei 28ºC inkubiert. Die Farbe wurde bei natürlichem Tageslicht beurteilt, wobei der Farbatlas von Maerz und Paul (Maerz, A., und Paul, M. R., "A Dictionary of Colours", 2. Auflage, McGraw-Hill Book Co. Inc., New York, 1950) verwendet wurde.
Das Aussehen der Kolonien, die Farbe von Substrat und Luftmyzel und die Pigmentproduktion des Stammes Streptomyces sp. GE 37468 ATCC 55365 sind in Tabelle I wiedergegeben. Die physiologischen Merkmale des Stammes sind in Tabelle II dargestellt. Die Fähigkeit, verschiedene Kohlenhydrate für das Wachstum zu verwerten, wird in Tabelle III gezeigt. TABELLE I Wachstumseigenschaften von Streptomyces sp. GE 37468 ATCC 55365 TABELLE I (Fortsetzung) TABELLE I (Fortsetzung)
++: mäßiges Wachstum; +++: gutes Wachstum
Die ISP-Nummern beziehens sich auf die Medien von Shirling und Gottlieb (Codes des "International Streptomyces Project"). TABELLE II Physiologische Tests TABELLE III Verwertung von Kohlenhydraten
+++: gutes Wachstum; ++: mäßiges Wachstum; +: schwaches Wachstum; -: kein Wachstum; p: Luftmyzel schwach entwickelt; n: keine Bildung von Luftmyzel

b) Mikromorohologie

In Flüssigkultur (V6-Medium) wurde nach vier Tagen Wachstum bei 28ºC keine Fragmentierung des Myzels beobachtet.
Die mikroskopische Untersuchung des Stammes auf Bodenextrakt-Agar zeigte nach vier Tagen Züchtung bei 28ºC stark verzweigte vegetative Hyphen (Durchmesser 1,1 µm). Keine Fragmentierung wurde beobachtet. Das Luftmyzel enthielt Sporenketten, sowohl in Retinaculiaperti- (Spiralen mit ein bis zwei Schleifen) als auch in rektiflexibler (gerader bis gebogener) Anordnung.

c) Identifizierung

Aufgrund der Zellwandzusammensetzung, der makro- und der mikromorphologischen Merkmale wurde der Stamm GE 37468 der Gattung Streptomyces zugeordnet.
Wie bei anderen Mikroorganismen kommen auch bei dem Stamm, der die Antibiotika GE 37468 produziert, Variationen vor. Z.B. können künstliche Mutanten des Stammes durch Behandlung mit verschiedenen bekannten Mutagenen erhalten werden, z.B. Uv-Strahlen, Röntgenstrahlen, Hochfrequenzwellen, radioaktive Strahlen und Chemikalien wie salpetrige Säure, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin und viele andere. Alle natürlichen und künstlichen Mutanten, die zu einer Art der Gattung Streptomyces gehören und die Antibiotika GE 37468 erzeugen, werden als äquivalent zu dem Stamm angesehen, der erfindungsgemäß mit dem Code ATCC 55365 bezeichnet wurde, und sollen im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten sein.
Die Gewinnung und Isolierung der Antibiotika GE 37468 aus dem Myzel des produzierenden Mikroorganismus wird nach bekannten Techniken durchgeführt, z.B. mittels Extraktion mit Lösungsmitteln, Fällung durch Zusatz von Nicht-Lösungsmitteln oder durch Änderung des pH-Wertes der Lösung, Verteilungschromatographie, Umkehrphasen-Verteilungschromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie, Molekülausschluß-Chromatographie und dergleichen.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Gewinnung und Isolierung der antibiotischen Substanzen der vorliegenden Erfindung aus dem Myzel umfaßt die Extraktion des abfiltrierten oder abzentrifugierten Myzels mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, das Einengen des Extraktes und die Gewinnung der rohen antibiotischen Substanz durch Fällung, gegebenenfalls unter Zusatz eines Fällungsmittels, durch Extraktion des eingeengten wäßrigen Restes mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel oder durch Adsorptions- Chromatographie und anschließende Elution der gewünschten Produkte aus der Adsorptionsmatrix.
Die in dieser Anmeldung verwendete Bezeichnung "mit Wasser mischbares Lösungsmittel" soll die Bedeutung haben, die sie üblicherweise nach dem Stand der Technik hat, und betrifft Lösungsmittel, die unter den eingesetzten Bedingungen mit Wasser in einem ziemliche großen Konzentrationsbereich mischbar sind.
Beispiele der mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, die zur Extraktion der antibiotischen Substanzen der vorliegenden Erfindung aus der Myzelmasse verwendet werden können, sind Niederalkanole, z.B. (C&sub1;-C&sub3;)-Alkanole, wie z.B. Methanol, Ethanol und Propanol; Phenyl(C&sub1;-C&sub3;)alkanole, wie z.B. Benzylalkohol; Niederketone, z.B. (C&sub3;-C&sub4;) -Ketone, wie z.B. Aceton und Methylethylketon; zyklische Ether, wie z.B. Dioxan und Tetrahydrofuran; Glykole und ihre Produkte einer partiellen Veresterung, wie z.B. Ethylenglykol, Propylenglykol und Ethylenglykolmonomethylether; Niederamide, wie z.B. Dimethylformamid und Diethylformamid.
Die in dieser Anmeldung verwendete Bezeichnung "mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel" soll die Bedeutung haben, die sie üblicherweise nach dem Stand der Technik hat, und betrifft Lösungsmittel, die unter den eingesetzten Bedingungen mit Wasser in einem ziemliche großen, für die geplante Verwendung geeigneten Konzentrationsbereich schwach mischbar oder praktisch nicht mischbar sind.
Beispiele von mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln, die zur Extraktion der antibiotischen Substanzen der vorliegenden Erfindung aus einer wäßrigen Phase verwendet werden können, sind die herkömmlichen Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel, die linear, verzweigt oder zyklisch sein können, wie z.B. Hexan oder Cylohexan; halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie z.B. Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Dichlorethan, Fluorbromethan, Dibromethan, Trichlorpropan, Chlortrifluoroctan und dergleichen; aromatische Kohlenwasserstoffe, wie z.B. Benzol, Toluol, Xylol und dergleichen; Ester mit mindestens vier Kohlenstoffatomen, wie z.B. Essigsäureethylester, Essigsäurepropylester, Buttersäureethylester und dergleichen; Alkanole mit mindestens vier Kohlenstoffatomen, die linear, verzweigt oder zyklisch sein können, wie z.B. Butanol, 1-Pentanol, 2-Pentanol, 3-Pentanol, 1-Hexanol, 2-Hexanol, 3-Hexanol, 3,3-Dimethyl-1-butanol, 4-Methyl-l-pentanol; 3-Methyl-1- pentanol, 2,2-Dimethyl-3-pentanol, 2,4-Dimethyl-3-pentanol, 4,4-Dimethyl-2-pentanol, 5-Methyl-2-hexanol, 1-Heptanol, 2- Heptanol, 5-Methyl-1-hexanol, 2-Ethyl-1-hexanol, 2-Methyl-3- hexanol, 1-Octanol, 2-Octanol, Cyclopentanol, 2-Cyclopentylethanol, 3-Cyclopentyl-1-propanol, Cyclohexanol, Cycloheptanol, Cyclooctanol, 2, 3-Dimethylcyclohexanol, 4-Ethylcyclohexanol, Cyclooctylmethanol, 6-Methyl-5-hepten-2-ol, 1-Nonanol, 2- Nonanol, 1-Decanol, 2-Decanol und 3-Decanol; unverzweigte oder verzweigte Alkylester und Gemische davon, wie z.B. Petrolether, Ethylether, Propylether, Butylether usw.; und Gemische oder funktionelle Derivate davon.
Wie dem Fachmann bekannt ist, kann die Phasentrennung durch Salzen verbessert werden.
Wenn bei Durchführung einer Extraktion eine wäßrige Phase gewonnen wird, die eine wesentliche Menge eines organischen Lösungsmittels enthält, kann es günstig sein, das Wasser daraus azeotrop abzudestillieren. Im allgemeinen erfordert dies die Zugabe eines Lösungsmittels, das mit Wasser minimale azeotrope Gemische erzeugen kann. Nach der azeotropen Destillation von Wasser kann zu der eingeengten organischen Lösung gegebenenfalls ein Fällungsmittel zugefügt werden, um das gewünschte Produkt auszufällen. Repräsentative Beispiele der organischen Lösungsmittel, die mit Wasser minimale azeotrope Gemische erzeugen können, sind n-Butanol, Benzol, Toluol, Butylether, Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform, Cyclohexan, 2, 5-Dimethylfuran, Hexan und n-Xylol; wobei n-Butanol das bevorzugte Lösungsmittel ist.
Beispiele von Fällungsmitteln sind Petrolether, Niederalkylether, wie z.B. Ethylether, Propylether und Butylether, und Niederalkylketone, wie z.B. Aceton.
Beispiele von Chromatographiesystemen, die zweckmäßigerweise zur Gewinnung der erfindungsgemäßen antibiotischen Substanzen verwendet werden können, sind Polystyrol oder gemischte Polystyrol-Divinylbenzol-Harze, wie z.B. Amberlite XAD2 oder XAD4 (Rohm und Haas), S112 (The Dow Chemical Co.) und Diaion HP 20 (Mitsubishi); Acrylharze, wie z.B. XAD7 oder XAD8 (Rohm und Haas); Polyamide, wie z.B. Polycaprolactame, Nylon und vernetzte Polyvinylpyrrolidone, die im allgemeinen ein Porenvolumen (ml/g) im Bereich zwischen 1 und 5, eine Oberfläche (m²/g) im Bereich zwischen 1 und 100, eine offensichtliche Dichte (g/ml) im Bereich zwischen 0,15 und 0,50, einen durchschnittlichen Porendurchmesser (Ängström-Einheiten) im Bereich zwischen 100 und 3000 und eine Partikelgrößenverteilung aufweisen, bei der mindestens 40 % der Partikel kleiner als 300 µm sind, wie z.B. Polyamid-CC 6, Polyamid-SC 6, Polyamid-CC 6,6, Polyamid-CC 6AC und Polyamid-SC 6AC (Macherey-Nagel & Co., BRD), das Polyvinylpyrrolidon-Harz PVP-CL (Aldrich Chemie Gmbh & Co. KG, BRD), das Polyamid-Harz PA 400 (M. Woelm Ag., BRD); und Kohlenstoff.
Da die Antibiotika GE 37468 einen sauren Charakter aufweisen, können für ihre Gewinnung und Reinigung auch Anionenaustauscherharze verwendet werden. Sowohl stark basische als auch schwach basische Anionenaustauscherharze können nützlich sein. Repräsentative Beispiele solcher Harze sind die folgenden: Dowex 1x2, Dowex 1x8 (The Dow Chemical Co.) und Amberlite IRA 67 (Rohm & Haas).
Ein bevorzugtes Laufmittel ist im Fall von Polystyroloder Acrylharz ein polares Lösungsmittelgemisch aus mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, wie vorstehend erwähnt; das Laufmittel im Fall eines Polyamidharzes ist vorzugsweise ein wäßriges Gemisch eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie vorstehend erwähnt, wobei ein bevorzugtes Laufmittel für Kohlenstoff ein Niederketon, wie z.B. Aceton, oder ein Niederalkohol, wie z.B. Methanol, ist.
Die weitere Reinigung eines Rohpräparats der Antibiotika GE 37468 kann nach einem beliebigen bekannten Verfahren durchgeführt werden, vorzugsweise werden hierfür jedoch chromatographische Methoden eingesetzt.
Beispiele dieser chromatographischen Verfahren sind die Verfahren, die vorstehend im Zusammenhang mit der Gewinnungsstufe aufgezähl: wurden, und umfassen auch eine Chromatographie an stationären Phasen, wie z.B. Kieselgel, Aluminiumoxiden, Florisil und dergleichen, mit einer organischen Eluierungsphase, die aus Gemischen von Lösungsmitteln besteht, umfassend halogenierte Kohlenwasserstoffe, Ether, höhere Ketone des bereits vorstehend erwähnten Typs, oder eine Umkehrphasen- Chromatographie auf silanisiertem Kieselgel mit verschiedenen funktionellen Derivatisierungen, wobei mit einem wäßrigen Gemisch von mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, wievorstehend erwähnt, eluiert wird.
Zweckmäßigerweise kann auch die Technik der sogenannten sterischen Ausschlußchromatographie mit guten Reinigungsergebnissen verwendet werden. Bei dieser Technik werden insbesondere vernetzte Dextrane mit bestimmter Porengröße eingesetzt, bei denen die meisten Hydroxylgruppen alkyliert sind, z.B. Sephadex LH-20 (Pharmacia LKB Biotechnology, AB).
Die Isolierung und Trennung der Komponenten eines Gemisches der Antibiotika GE 37468 kann durchgeführt werden, indem ein Mitteldruck-Flüssigchromatographie (MPLC) -System verwendet wird, worauf eine weitere Reinigung durch präparative oder semipräparative HPLC folgt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Antibiotikum GE 37468 A von den Antibiotika GE 37468 B und GE 37468 C abgetrennt, indem ein MPLC-System mit einem linearen Gradienten von Methanol in Methylenchlorid verwendet wird, der von 0 % bis 50 % Methanol reicht. Hier sind in den am Anfang eluierten Fraktionen die beiden letzteren Produkte angereichert, wie durch DC- oder HPLC-Analysen gezeigt wird, und die letzte Fraktion enthält im wesentlichen Antibiotikum GE 37468 A. Die mit GE 37468 B und GE 37468 C angereicherten Fraktionen werden zur Isolierung der reinen Bestandteile einer präparativen oder semipräparativen HPLC unterworfen.
Das aus dem MPLC-System erhaltene Antibiotikum GE 37468 A wird üblicherweise einer weiteren Reinigung durch präparative HPLC unterworfen, wodurch eine hochreine Probe dieses Produkts erhalten wird.
Eine bevorzugte HPLC-Technik für die weitere Reinigung von Antibiotikum GE 37468 A ist eine Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Säule mit porösen und kugelförmigen Partikeln aus silanisiertem Kieselgel, z.B. Kieselgel, das mit C-18-Alkylgruppen funktionalisiert ist und einen gleichmäßigen Durchmesser aufweist (z.B. 5 µm Ultrashere ODS Altex; Beckman Co.), einer Vorsäule, die ein mit C-18-Alkylgruppen funktionalisiertes Kieselgel ist (z.B. RP 18 Brownlee Labs) und eines Laufmittels, das ein Gemisch mit linearem Gradient eines polaren mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, wie vorstehend beschrieben, in einer wäßrigen gepufferten Lösung darstellt. Vorzugsweise ist diese Lösung auf einen pH-Wert von 6 bis 7 eingestellt. Ein am stärksten bevorzugtes Laufmittel ist ein linearer Gradient der Laufmittel A und B, wobei das Laufmittel A im Bereich von 30 bis 70 %, vorzugsweise von 40 bis 60 % liegt und ein Gemisch aus Acetonitril/wäßrigem Puffer, pH 6 bis 7, 80:20, darstellt, und Laufmittel B ein Gemisch aus Acetonitril/wäßrigem Puffer, pH 6 bis 7, 5:95, ist.
Bei der Trennung der beiden Antibiotika GE 37468 B und C werden im HPLC-System vorzugsweise die gleichen Laufmittel verwendet, die vorstehend beschrieben werden, wobei ein linearer Gradient im Bereich von 40 bis 95 %, vorzugsweise von 50 bis 90 %, eingesetzt wird.
Wie es nach dem Stand der Technik üblich ist, können die Herstellung und außerdem die Gewinnungs- und Reinigungsschritte durch verschiedenste Analyseverfahren überwacht werden, umfassend Biotests, wie z.B. Papierscheiben- oder Agar-Diffusionstests auf empfindlichen Mikroorganismen oder DC- oder HPLC-Verfahren, die gegebenenfalls einen Nachweis mittels UV oder Mikroorganismen umfassen.

Physikalisch-chemische Eigenschaften des Antibiotikums GE 37468 A

A) Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum ist in Figur 1 der beigefügten Abbildungen dargestellt und zeigt die folgenden Absorptionsmaxima:
B) Das Infrarot-Absorptionsspektrum in Nujol-Mull ist in Figur 2 der beigefügten Abbildungen dargestellt und zeigt die folgenden Absorptionsmaxima (cm&supmin;¹): 3600; 3100; 2924 (Nujol); 2853 (Nujol); 1705; 1653; 1514; 1466 (Nujol); 1377 (Nujol); 1310; 1269; 1200; 1173; 1153; 1101; 1024; 1007; 878; 808; 758; 721 (Nujol); 702.
Die wichtigsten funktionellen Banden dieses IR-Absorptionsspektrums können unterschieden werden als:
C) Das ¹H-NMR-Spektrum ist in Figur 3 dargestellt und zeigt die folgenden Signalgruppen (in ppm) bei 500 MHz, aufgenommen in DMSO-d&sub6; (Hexadeuterodimethylsulfoxid) unter Verwendung von TMS als interner Standard (0,00 ppm); [8, ppm Multiplizität, (s = Singulett, d = Dublett; dd = Dublett von Dubletts; m = Multiplett; br s = breites Signal)]:
10.08, s; 9.59, s; 9.03, br s; 8.67, s; 8.64, d; 8.57, d; 8.54, d; 8.38, d; 8.19, s; 7.91, s; 7.751 5; 7.30-7.28, m; 7.20, m; 7.18, br s; 7.06, d; 6.78, br s; 6.58, d; 6.49, br s; 6.45, s; 6.06, s; 5.82, 5; 5.79, br s; 5.29, m;5.07, m; 4.93, m; 4.87, in; 4.64, d; 3.63, dd; 3.4-3.3, m; 3.19, dd; 2.94, m; 2.73, s; 2.67, m; 2.62, m; 2.11, m;1.98, m; 1.91, in; 1.14, in.
D) Das ¹³C-NMR-Spektrum (¹H-entkoppelt) ist in Figur 4 der beigefügten Abbildungen dargestellt und zeigt in DMSO-d&sub6; die folgenden Signalgruppen (δ, ppm) bei 125 MHz mit TMS als interne Referenz (0,00 ppm), wobei Q guaternäre Kohlenstoffatome oder C=O-Gruppen bedeutet;
174.4 (Q); 174.0 (Q); 173W0 (Q); 171.6 (Q); 171.4 (Q); 169.3 (Q); 167.6 (Q); 165.0 (Q); 162.3 (Q); 161.3 (Q); 161.2 (Q); 160.8 (Q); 159.0 (Q); 156.0 (Q); 155.7 (Q); 153.9 (Q); 153.3 (Q); 152.1 (Q); 150.5 (Q, 2C); 149.3 (Q); 147.4 (Q); 140.1 (CH); 137.3 (Q); 134.7 (Q); 134.6 (Q); 130.7 (2 CH); 129.8 (Q); 129.5 (2 CH); 129.0 (CH); 128.4 (2 CH); 127.4 (Q); 126.8 (CH); 123.9 (CH); 123.1 (Q); 122.3 (CH); 118.7 (CH); 116.7 (CH); 115.1 (2 CH); 111.2 (CH&sub2;); 105.4 (CH&sub2;); 81.9 (CH); 77.5 (CH); 66.7 (CH); 54.3 (CH); 52.3 (CH); 48.5 (CH); 42.8 (CH&sub2;); 39.0 (CH); 38.5 (CR&sub2;); 38.1 (CR&sub2;); 37.0 (CR&sub2;); 36.3 (CR&sub2;); 16.0 (CR&sub3;); 11.7 (CR3)
E) Die Retentionszeit (Rt) beträgt 14,4 Minuten, wenn die Analyse durch Umkehrphasen-HPLC unter den folgenden Bedingungen durchgeführt wird:
Säule: Ultrasphere ODS (silanisiertes Kieselgel mit Umkehrphase; 5 µm) Altex (Beckman) 4,6 mm (i.D.) x 250 mm Vorsäule: Brownlee Labs RP 18 (Octadecylsilan-Kieselgel; 5 µm)
Laufmittel A: Acetonitril : 16 mM Ammoniumphosphat 80:20 (Vol./Vol.), eingestellt auf pH 6,0,
Laufmittel B: Acetonitril : 16 mM Ammoniumphosphat 5:95 (Vol./Vol.), eingestellt auf pH 6,0,
Elutionsmodus: linearer Gradient von Laufmittel A in
Laufmittel B von 10 bis 90 % in 20 Minuten,
Durchflußgeschwindigkeit: 1,5 ml pro Minute, UV-Detektor: 230 nm,
interner Standard: Antibiotikum GE 2270 Faktor A, EP-A- Nr. 359062 (Rt = 16,7 Min.).
F) Die Elementaranalyse nach vorheriger Trocknung der Probe bei etwa 100ºC unter inerter Atmosphäre zeigt die folgende Zusammensetzung: Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Schwefel.
G) Der Rf-Wert beträgt 0,15 im folgenden chromatographischen System:
Dichlormethan : Methanol, 85:15 (Vol./Vol.), unter Verwendung von Kieselgelpiatten (Silicagel 60F&sub2;&sub5;&sub4;, Merck Co.);
Sichtbarmachung: UV-Licht bei 254 nm, gelber Fleck mit Ioddämpfen oder Bioautographie unter Verwendung von B. subtilis ATCC 6633 auf Davis-Minimalmedium; interner Standard: Antibiotikum GE 2270 Faktor A, EP-A Nr. 359062 (Rf 0,77).
H) Die FAB-MS-Analyse zeigt das Isotop mit der niedrigsten Masse des protonierten molekularen Ions bei einem m/z- Wert, der einem Molekulargewicht von 1308,3 ± 0,1 Dalton entspricht, wobei die Analyse mit einem doppelfokussierenden Massenspektrometer, Kratos MS-50TC, unter den folgenden experimentellen Bedingungen durchgeführt wurde: Beschuß mit schnellen Xe-Atomen bei 8 kV; m-Nitrobenzylalkohol-Matrix; positiver Iönisierungsmodus.
I) Eine Aminosäureanalyse des HCl-Hydrolysats zeigt das Vorliegen der folgenden natürlichen Aminosäuren: Cystein, Phenylalanin, Tyrosin und Cystin, wobei die folgenden experimentellen Bedingungen verwendet wurden:
Die Probe wurde 24 Stunden bei 105 ºC in Gegenwart von 6 N HCl, enthaltend 1 % Phenol, hydrolysiert und anschließend in zwei Schritten wie folgt derivatisiert:
a) Erzeugung der n-Propylester der Carbonsäurefunktionen mit 2 M HCl in wasserfreiem Propanol (90ºC, 1 Stunde) und anschließende Trocknung unter Stickstoff;
b) Umwandlung der freiem Aminogruppen in Amide mit Trifluoressigsäureanhydrid/wasserfreiem Dichlormethan, 1/1 (Vol./Vol.) 10 Min. bei 80ºC und anschließende Trocknung unter Stickstoff; der auf diese Weise erhaltene derivatisierte Rückstand wurde in Dichlormethan gelöst und durch GC-MS unter Verwendung eines TSQ 700 Finnigan Mat-Systems unter den folgenden Bedingungen analysiert: Säule: HP-5 Fused Silica-Kapillarsäule (25 m x 0,32 mm i.D. x 0,17 µm; Hewlett & Packard); Temperaturprogramm 2 Minuten bei 60ºC, dann 8ºC pro Minute.
Die Antibiotika GB 37468 B und GE 37468 C scheinen aus Antibiotikum GB 37468 A durch hydrolytische Spaltung zu entstehen. Dies wird durch die Tatsache bekräftigt, daß aus einer Probe von Antibiotikum GE 37468 A, die 6 bis 18 Stunden in einer wäßrigen Pufferlösung mit einem pH-Wert zwischen 3 und 4 gehalten wird, wesentliche Mengen der beiden Antibiotika GE 37468 B und GE 37468 C erhalten werden. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften dieser beiden Produkte sehen folgendermaßen aus:

Physikalisch-chemische Eigenschaften des Antibiotikums GE 37468 B

A) Die Retentionszeit (Rt) beträgt 11,5 Minuten, wenn die Analyse durch Umkehrphasen-HPLC unter den folgenden Bedingungen durchgeführt wird:
Säule: Ultrasphere ODS (silanisiertes Kieselgel mit Umkehrphase; 5 µm) Altex (Beckman) 4,6 mm (i.D.) x 250 mm
Laufmittel A: Acetonitril : 16 mM Ammoniumphosphat 80:20 (Vol./Vol.), eingestellt auf pH 6,0,
Laufmittel B: Acetonitril : 16 mM Ammoniumphosphat 5:95 (Vol./Vol.), eingestellt auf pH 6,0,
Elutionsmodus: linearer Gradient von Laufmittel A in Laufmittel B von 40 bis 90 % in 20 Minuten, Durchflußgeschwindigkeit: 1,5 ml pro Minute,
UV-Detektor: 230 nm, interner Standard: Chloramphenicol (Rt = 4,0 Min.).
B) Die FAB-MS-Analyse zeigt das Isotop mit der niedrigsten Masse des protonierten molekularen Ions bei m/z 1169,3 ± 0,1 Dalton. Alle anderen Peaks über 800 m/z Masseneinheiten (wobei Isotopenpeaks nicht mitgezählt werden) im Spektrum machten weniger als 20% des molekularen Ions aus, wobei die Analyse mit einem doppelfokussierenden Massenspektrometer, Kratos MS-50TC, unter den folgenden experimentellen Bedingungen durchgeführt wurde: Beschuß mit schnellen Xe-Atomen bei 8 kV; m-Nitrobenzylalkohol- Matrix; positiver Ionisierungsmodus.

Physikalisch-chemische Eigenschaften des Antibiotikums GE 37468 C

A) Die Retentionszeit (Rt) beträgt 13,0 Minuten, wenn die Analyse durch Umkehrphasen-HPLC unter den folgenden Bedingungen durchgeführt wird:
Säule: Ultrasphere ODS (silanisiertes Kieselgel mit Umkehrphase; 5 µm) Altex (Beckman) 4,6 mm (i.D.) x 250 mm Laufmittel A: Acetonitril 16 mM Ammoniumphosphat 80:20 (Vol./Vol.), eingestellt auf pH 6,0,
Laufmittel B: Acetonitril : 16 mM Ammoniumphosphat 5:95 (Vol./Vol.), eingestellt auf pH 6,0,
Elutionsmodus: linearer Gradient von Laufmittel A in Laufmittel B von 40 bis 90 % in 20 Minuten,
Durchflußgeschwindigkeit: 1,5 ml pro Minute, UV-Detektor: 230 nm,
interner Standard: Chloramphenicol (Rt = 4,0 Min.).
B) Die FAB-MS-Analyse zeigt das Isotop mit der niedrigsten Masse des protonierten molekularen Ions bei m/z 1238,3 ± 0,1 Dalton. Alle anderen Peaks über 800 m/z Masseneinheiten (wobei Isotopenpeaks nicht mitgezählt werden) im Spektrum machten weniger als 20% des molekularen Ions aus, wobei die Analyse mit einem doppelfokussierenden Massenspektrometer, Kratos MS-50TC, unter den folgenden experimentellen Bedingungen durchgeführt wurde: Beschuß mit schnellen Xe-Atomen bei 8 kV; m-Nitrobenzylalkohol- Matrix; positiver Ionisierungsmodus.
Aufgrund der vorstehend dargestellten physikalisch-chemischen Daten kann der antibiotischen Verbindung GE 37468 A vorläufig die folgende Formel I zugewiesen werden:
Wie vorstehend erwähnt, scheinen die Antibiotika GE 37468 B und GE 37468 C aus Antibiotikum GE 37468 A durch hydrolytische Spaltung hervorzugehen.
Aufgrund des durch die FAB-MS-Analyse bestimmten Verlustes an Molekulargewicht der Verbindung GE 37468 B im Vergleich zur Verbindung GE 37468 A und aufgrund der vorstehenden vermutlichen Formel, die der Verbindung GE 37468 A zugewiesen wurde, kann der Verbindung GE 37468 C vorläufig die folgende Formel II zugewiesen werden:
Analog kann der Verbindung GE 37468 B vorläufig die folgende Formel III zugewiesen werden:

Biologische Eigenschaften und Verwendung von Antibiotikum GE 37468

Die antimikrobielle Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde durch eine Reihe von in-vitro-Standardtests gezeigt.
Die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC) wurden durch Mikroverdünnung der Brühe bestimmt. Das Impfmaterial betrug 10&sup4; CFU/ml, mit Ausnahme von C. perfringes, P. acnes und B. fragilis (10&sup5;). Die Inkubationszeiten betrugen 20 bis 24 Stunden, außer für N. gonorrhoeae, H. influenzae, P. acnes, C. perfringens und B. fragilis (48 Stunden). Die Inkubation wurde bei 37ºC durchgeführt. N. gonorrhoeae und H. influenzae wurden in 5% CO&sub2; in Luft, P. acnes, C. perfringes und B. fragilis in N&sub2;:CO&sub2;:H&sub2; (80:10:10) inkubiert. Die folgenden Medien wurden verwendet: Iso-Sensitest-Brühe (Oxoid) (Staphylococci, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeru.ginosa, Proteus vulgaris); GC Base-Brühe (Difco) + 1 % Isovitalex (BBL) (N. gonorrhoeae); Brain Heart Infusion-Brühe (Difco) + 1 % (Vol./Vol.) Supplement C (Difco) (H. influenzae); Wilkins- Chalgren-Brühe (Difco) (P. acnes, C. perfringens, B. fragilis), phosphatgepufferte Yeast Nitrogen Base-Brühe (Difco), enthaltend Glucose (1 % Gew./Vol.) und L-Asparagin (0,15 %, Gew./Vol.) (C. albicans).
Die nachstehende Tabelle IV zeigt die Ergebnisse der vorstehend erwähnten Tests für die Antibiotika GE 37468 A, B und C. TABELLE IV
Die antimikrobielle Aktivität des Antibiotikums GE 37468 A wurde auch bei der experimentellen Septikämie von Mäusen bestätigt.
Gruppen von fünf CD1-Mäusen beiderlei Geschlechts (Charles River, durchschnittliches Gewicht 18 bis 22 g) wurden mit 10&sup6; CFU/Maus von Staphylococcus aureus Smith, suspendiert in 0,5 ml 5 -% bakteriologischem Mucin (Difco), intraperitoneal infiziert. Die Testverbindung wurde einmal unmittelbar nach der Infektion in einer sterilen Lösung, die 10 % Dimethylsulfoxid, 10 % Chremophor EL , 20 % 0,07 M Phosphatpuffer (pH 8Y und 60 % Glucoselösung (5 %) enthielt, intravenös verabreicht.
Der ED&sub5;&sub0;-Wert wurde für jede Dosis aus dem Prozentsatz der am Tag sieben nach der Infektion noch lebenden Tiere nach dem Verfahren von Spearman und Kaerber berechnet und betrug 3,2 mg/kg.
Aufgrund ihrer Eigenschaften können die erfindungsgemäßen Verbindungen als Wirkstoffe für die Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Menschen und Tieren verwendet werden.
Insbesondere sind die Antibiotika GE 37468 A, GE 37468 B und GE 37468 C antimikrobielle Mittel, die hauptsächlich gegen grampositive Bakterien und sowohl grampositive als auch gramnegative Anaerobier wirksam sind.
Die wichtigste therapeutische Indikation der erfindungsgemäßen antibiotischen Substanzen besteht somit in der Behandlung von Infektionen unter Beteiligung von Mikroorganismen, die gegen diese Antibiotika empfindlich sind.
Der Begriff "Behandlung" soll auch die Prophylaxe, Therapie und Heilung umfassen.
Der Patient, der diese Behandlung erhält, ist ein beliebiges tierisches Lebewesen, das eine solche Behandlung nötig hat, einschließlich Primaten, insbesondere Menschen, und andere Säuger, wie z.B. Pferde, Rinder, Schweine und Schafe, außerdem Geflügel und Haustiere im allgemeinen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als solche oder als Gemisch mit pharmazeutisch verträglichen Trägern verabreicht werden, außerdem können sie zusammen mit anderen antimikrobiellen Mitteln verabreicht werden, wie z.B. Penicillinen, Cephalosporinen, Aminoglykosiden und Glykopeptiden. Die Kombinationstherapie umfaßt somit die aufeinanderfolgende, gleichzeitige und separate Verabreichung der Wirkstoffe in einer Weise, daß die therapeutischen Effekte des ersten verabreichten Wirkstoffs nicht vollständig verschwunden sind, wenn der folgende Wirkstoff verabreicht wird.
Eine bevorzugte pharmazeutische Formulierung ist eine Formulierung, die für eine örtliche Verabreichung auf intakte oder geschädigte Haut oder Schleimhaut geeignet ist. Beispiele solcher Formulierungen sind Pulver, Salben, Cremes und Lotionen. Die Excipienten in diesen Formulierungen sind die herkömmlichen pharmazeutisch verträglichen Träger, wie z.B. fetthaltige Salbengrundlagen (Z.B. Cetylester-Wachs, Ölsäure, Olivenöl, Paraffin, Spermaceti, Stärkeglycerit); absorbierende Salbengrundlagen (z.B. wasserfreies Lanolin, hydrophiles Petrolatum), Emulsions-Salbengundlagen (z.B. Cetylalkohol, Glycerylmonostearat, Lanolin, Stearinsäure), wasserlösliche Salbengrundlagen (z.B. Glykolether und ihre Derivate, umfassend Polyethylenglykole, Poly(oxy-1,2-ethandiyl)-alpha-hydro-omegahydroxyoctadecanoat, Polysorbate und Polyethylenglykolmonostearate).
Diese Formulierungen können andere bekannte Excipienten enthalten, wie z.B. Konservierungsmittel, und werden nach Verfahren hergestellt, die auf dem Fachgebiet bekannt sind und in Standard-Nachschlagewerken, wie z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Auflage, 1985, Mack Publishing Co., beschrieben werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch gemäß Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind und in Nachschlagewerken, z.B. dem vorstehend erwähnten, beschrieben werden, als Formulierungen zubereitet werden, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind.
Z.B. wird eine erfindungsgemäße Verbindung mit einem Lösungsvermittler, wie z.B. Polypropylenglykol oder Dimethylacetamid, und einem oberflächenaktiven Mittel, wie z.B. Polyoxyethylensorbitanmonooleat oder polyethoxyliertem Rizinusöl in sterilem Wasser für die Injektion formuliert.
Ein Beispiel einer typischen Formulierung für die parenterale Verabreichung umfaßt 10 mg des Antibiotikums GE 37468 A, B oder C pro ml des Endpräparates, 10 bis 20 % eines oberflächenaktiven Mittels, das ein Polyoxyethylensorbitan-Fettsäureester, ein Polyoxyethylen-Derivat von Rizinusöl oder ein Polyoxyethylen-Derivat von hydriertem Rizinusöl sein kann, und 0 bis 20 %, vorzugsweise 10 bis 20 % eines Lösungsvermittlers, wie z.B. Propylenglykol, Dimethylacetamid, Dimethylformamid, ter.-Butyl-N-hydroxycarbamat, 1,2-, 1,3- oder 1,4-Butandiol, Ethyloleat, Tetrahydrofurfurylpolyethylenglykol 200, Dimethylisosorbid, Benzylalkohol und dergleichen. Ein bevorzugter Lösungsvermittler ist Propylenglykol.
Polyoxyethylensorbitan-Fettsäureester sind im Handel erhältlich und einige von ihnen werden unter dem Handelsnamen "Tween" vermarktet. Sie sind auch unter dem nicht-geschützten Namen "Polysorbate" bekannt. Beispiele sind Polysorbat 20, 21, 40, 60, 61, 65, 80, 81 und 85. Für die Verwendung in den erfindungsgemäßen Formulierungen ist Polysorbat 80 (Sorbitanmono-9-octadecanoat, Poly(oxy-1,2-ethandiyl)-Derivate) bevorzugt.
Polyoxyethylen-Derivate von Rizinusöl und Polyoxyethylen- Derivate von hydriertem Rizinusöl sind auch im Handel erhältlich. Einige dieser Produkte werden unter dem Handelsnamen "Cremophor" vermarktet. Solcher Verbindungen sind z.B. als Cremophor EL (polyethoxyliertes Rizinusöl), Cremophor RH 40 (polyethoxyliertes hydriertes Rizinusöl), Cremophor RH 60 (PEG 60 hydriertes Rizinusöl) oder Emulphor EL-719 (polyoxyethyliertes pflanzliches Öl) bekannt.
Eine Formulierung zur Injektion sollte vorzugsweise einen pH-Wert im Bereich von 7 ± 0,5 aufweisen. Gegebenenfalls könnte es ratsam sein, den pH-Wert des Präparates mit einem geeigneten Puffer einzustellen. Am besten können TRIS (d.h. Trihydroxymethylaminomethan) oder Phosphat als Puffer verwendet werden.
Eine bevorzugte Formulierung für die parenterale Verabreichung umfaßt die folgenden Excipienten: Cremophor EL (Polyoxyl-35-Rizinusöl USP/NF) 20 %, Propylenglykol 5 bis 20 %, vorzugsweise 10 bis 20 %.
Im allgemeinen können diese Formulierungen hergestellt werden, indem der Wirkstoff im organischen Lösungsmittel gelöst wird, anschließend der oberflächenaktive Bestandteil unter Rühren zugegeben wird und schließlich mit sterilem Wasser für die Injektion auf das gewünschte Volumen verdünnt wird.
Andere Excipienten, wie z.B. Konservierungsmittel oder Stabilisatoren, können zugegeben werden, wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist.
Ein Beispiel einer parenteralen Formulierung sieht folgendermaßen aus:
Antibiotikum GE 37468 A, B oder C 10 mg
PEG 40 Rizinusöl (Cremophor EL) 0,2 ml
Propylenglykol 0,2 ml
para-Hydroxybenzoesäuremethylester 0, 5 mg
para-Hydroxybenzoesäurepropylester 0, 05 mg
Wasser zur Injektion auf 1 ml
In einer anderen Ausführungsform kann der Wirkstoff als gefriergetrocknetes Pulver hergestellt werden, das vor Verwendung rekonstituiert werden kann.
Sofern das Ausgangsmaterial bei der Herstellung des gefriergetrockneten Produktes ein Gemisch ist, das den Wirkstoff und das grenzflächenaktive Mittel, wie z.B. Polyethylenglykol 60-Derivat von hydriertem Rizinusöl, enthält, kann es einfach mit dem wäßrigen Medium alleine ohne Zusatz eines organischen Lösungsmittels rekonstituiert werden.
Gegebenenfalls kann ein herkömmliches Gefriertrocknungs- Hilfsmittel zugegeben werden, sofern dies erforderlich ist, um ein gefriergetrocknetes Material in Pulverform zu erhalten.
Vorzugsweise werden alle diese Formulierungen zur i.v.- Verabreichung bei der Behandlung einer beliebigen Infektion verwendet, bei der ein Mikroorganismus beteiligt ist, der gegen das erfindungsgemäße Antibiotikum empfindlich ist.
Bei Behandlung von pseudomembranöser Colitis oder anderen Krankheiten, die auf das Vorliegen von Anaerobiern im Gastrointestinaltrakt zurückzuführen sind, kann eine wirksame Dosis der erfindungsgemäßen Verbindung in geeigneter pharmazeutischer Form oral verabreicht werden, wie z.B. als Kapsel, Tablette oder als wäßrige Suspension.
Die Dosierung des Wirkstoffs hängt von vielen Faktoren ab, umfassend Art, Alter und Leiden des Patienten, den spezifischen Wirkstoff und die für die Verabreichung ausgewählte Formulierung, das Verabreichungsschema usw..
Im allgemeinen werden wirksame antimikrobielle Dosierungen mittels einer einzelner Einheitsdosierungsform verabreicht
Wiederholte Anwendungen/Verabreichungen, z.B. zwei- bis sechsmal täglich, sind im allgemeinen bevorzugt. Eine wirksame Dosis kann im allgemeinen im Bereich von 0,5 bis 500 mg pro kg Körpergewicht pro Tag liegen.
Ein bevorzugtes örtlich applizierbares Präparat ist eine Salbe, die 1 bis 10% einer Verbindung der vorliegenden Erfindung enthält.
In jedem Fall wird der verschreibende Arzt die optimale Dosierung für einen bestimmten Patienten in der jeweiligen Situation festlegen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können neben ihrer Verwendung als Medikamente für die Therapie von Menschen und Tieren auch als wachstumsfördernde Mittel bei Tieren eingesetzt werden.
Für diesen Zweck wird eine erfindungsgemäße Verbindung in geeignetem Futter oral verabreicht. Die genaue erforderliche Konzentration muß so eingestellt werden, daß der Wirkstoff beim Verzehr normaler Futtermengen in einer wirksamen wachstumsfördernden Menge bereitgestellt wird.
Der Zusatz des erfindungsgemäßen Wirkstoffs zum Tierfutter wird vorzugsweise durchgeführt, indem zuerst eine geeignetes Futter-Vorgemisch hergestellt wird, das den Wirkstoff in einer wirksamen Menge enthält, und sodann das Vorgemisch mit der gesamten Ration vermischt wird.
In einer anderen Ausführungsform kann ein intermediäres Konzentrat oder ein Futterzusatz, das/der den Wirkstoff enthält, unter das Futter gemischt werden. Die Art und Weise, wie solche Futter-Vorgemische und komplette Rationen hergestellt und verabreicht werden können, werden in Nachschlagewerken beschrieben (wie z.B. "Applied Animal Nutrition", W. H. Freed man und Co., S. Francisco, USA, 1969, oder "Livestock Feeds and Feeding", 0 and B books, Corvallis, Oregon, USA, 1977).
Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Erläuterung der Erfindung ud sollen in keiner Weise den Umfang der Patentansprüche einschränken.

Beispiel 1

Herstellung der Antibiotika GE 37468

Eine Kultur von Streptomyces sp. GE 37468 ATCC 55365 wird auf einem Hafermehl-Schrägagar vier Tage bei 28 bis 30 ºC gezüchtet und anschließend zum Beimpfen von 500-ml-Kolben verwendet, die 100 ml eines Vorkulturmediums der folgenden Zusammensetzung enthalten:
Dextrose 20 g/l
Hefeextrakt 2 g/l
Sojamehl 8 g/l
Calciumcarbonat 4 g/l
Natriumchlorid 1 g/l
Destilliertes Wasser auf 100 ml (vor der Sterilisation auf pH 7,0 eingestellt)
Der Kolben wird auf einem Kreisschüttler (200 UpM) 26 Stunden bei 28 bis 30ºC inkubiert. Die erhaltene Kultur wird sodann zum Beimpfen eines Glasfermenters verwendet, der 4 Liter des gleichen Mediums enthält, und die Kultur 24 Stunden bei 28 bis 30ºC unter Rühren (etwa 900 UpM) und Beflüftung (etwa 0,5 Standard-Liter Luft pro Volumen pro Minute) inkubiert.
Die erhaltene Brühe wird in einen Fermenter überführt, der 200 1 des folgenden Produktionsmediums enthält:
Sorbit 20 g/l
Hefeextrakt 2 g/l
Sojamehl 8 g/l
Calciumcarbonat 4 g/l
Natriumchlorid 1 g/l
Destilliertes Wasser auf 100 ml (vor Sterilisation auf pH 7,0 eingestellt) und etwa 72 Stunden bei 28 bis 30ºC inkubiert, wobei der pH-Wert durch Zusatz von Schwefelsäure zwischen 7,0 und 7,5 gehalten wird.
Die Produktion von Antibiotika wird durch HPLC oder Agardiffusionstest unter Verwendung von B. subtilis ATCC 6633, gezüchtet auf Davis-Minimalmedium, überwacht. Die Hemmzonen werden nach der Inkubation über Nacht bei 35ºC gemessen.

Beispiel 2

Gewinnung der Antibiotika GE 37468

Die geernteten Brühen, die aus wiederholten Fermenationsgängen, wie in Beispiel 1 beschrieben, stammen, werden vereinigt (300 l) und in Gegenwart eines Filtrierhilfsmittels (Clarcell) filtriert.
Der größte Teil des Fermentationsproduktes wird aus dem Myzel gewonnen.
Das Myzel wird mit 100 l Aceton extrahiert und der Extrakt unter vermindertem Druck eingeengt, wodurch ein wäßriger Rückstand erhalten wird, der mit n-Butanol (7 l) extrahiert wird. Ein die Antibiotika GE 37468 enthaltender Feststoff (13,5 g) wird aus der konzentrierten organischen Phase durch Zusatz von Petrolether ausgefällt.
Dieser Feststoff (13,3 g) wird in 3 1 Ammoniumformiat- Puffer (16 mM, pH 6,0) suspendiert und dreimal mit einem gleichen Volumen Essigsäureethylester extrahiert. Die wäßrige Lösung wird sodann mit 1 N HCl auf pH 4,5 eingestellt und mit Essigsäureethylester (3 l) extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt.
Die rohen Antibiotika GE 37468 (3,4 g) werden durch Fällung mit Petrolether gewonnen.

Beispiel 3

Reinigung der Antibiotika GE 37468 auf Sephadex LH-20

Die gemäß Beispiel 2 erhaltenen rohen Antibiotika GE 37468 (3,3 g) werden in 10 % Tetrahydrofuran enthaltendem Methanol suspendiert. Die Suspension wird auf eine Chromatographiesäule aufgetragen, die ein in Methanol (1,5 l) gequollenes vernetztes Dextran mit kontrollierter Porengröße (Sephadex LH- 20, Pharmacia LKB Biotechnology AB) enthält. Die Säule wird mit Methanol eluiert.
Fraktionen werden gesammelt, durch DC, HPLC oder durch Agardiffusionstest gegen B. subtilis ATCC 6633 analysiert und gemäß ihrem Antibiotikagehalt vereinigt. Die die Antibiotika GE 37468 enthaltenden vereinigten Fraktionen werden unter vermindertem Druck eingeengt.
Teilweise gereinigte Antibiotika GE 37468 (1,3 g) werden aus dem öligen Rückstand durch Zusatz von Diethylether gewonnen

Beispiel 4

Isolierung und Reinigung des Antibiotikums GE 37468 A durch MPLC

Der gemäß Beispiel 3 erhaltene Feststoff (1,24 g) wird in Tetrahydrofuran gelöst und unter vermindertem Druck in Gegenwart von Kieselgel (230 bis 400 Mesh) eingeengt. Der erhaltene feste Rückstand wird gesammelt und auf eine Chromatographiesäule (45 cm x 7 cm) aufgetragen, die in Methylenchlorid (CH&sub2;Cl&sub2;) gequollenes Kieselgel (230 bis 400 Mesh) enthält. Die Säule wird unter Verwendung eines Mitteldruck-Flüssigchromatographie (MPLC)-Systems (Modell B-681 und B-687, Büchi Laboratory-Techniques Ltd.) mit einem Gemisch aus Methanol und Methylenchlorid (linearer Gradient von 0 bis 10 % (Vol./Vol.) Methanol in 10 Minuten, anschließend von 10 bis 50 % (Vol./Vol.) Methanol in 110 Minuten) bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 100 ml/Min. entwickelt.
Die gesammelten Fraktionen werden durch DC, HPLC oder durch Agardiffusionstest gegen B. subtilis ATCC 6633 analysiert.
Die Fraktionen 60 bis 83 werden gemäß ihrem Antibiotikagehalt vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt, wodurch ein öliger Rückstand erhalten wird, der mit Tetrahydrofuran solubilisiert wird. Aus dieser Lösung wird das Antibiotikum GE 37468 A (500 mg) durch Zusatz von Petrolether ausgefällt.

Beispiel 5

Weitere Reinigung des Antibiotikums GE 37468 A durch präparative HPLC

Eine hochreine Probe des Antibiotikums GE 37468 A kann durch HPLC-Reinigung erhalten werden, wobei das folgende Verfahren angewendet wird:
Ein Teil (9 mg) des wie in Beispiel 4 beschrieben erhaltenen Niederschlags wird in 1 ml Acetonitril und 1 ml Ammoniumformiat-Puffer (pH 7,0) gelöst und durch präparative HPLC auf einer silanisierten Kielselgelsäule (Lichrosorb RP 18, 7, µm, 250 mm x 25 mm, Merck, Darmstadt) weiter gereinigt.
Die Elution wird mit einem linearen Gradienten von Phase A und Phase B (45 bis 55 % (Vol./Vol.) Phase A in 20 Min.) bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 12 ml/Min. durchgeführt. Die Phase A ist ein Gemisch aus Acetonitril und 16 mM Ammoniumformiat-Puffer, 80/20 (Vol./Vol.), eingestellt auf pH 7, während die Phase B ein Gemisch aus Acetonitril und 16 mM Ammoniumformiat, 5/95 (Vol./Vol.), eingestellt auf pH 7, darstellt.
Der UV-Nachweis wird bei 230 nm durchgeführt. Die Fraktionen von acht aufeinanderfolgenden chromatographischen Läufen mit gleichem Gehalt werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt, um das Acetonitril zu entfernen. Die Lösung, die reines Antibiotikum GE 37468 A enthält, wird dreimal mit einem gleichen Volumen Essigsäureethylester extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird in DMSO gelöst und gefriergetrocknet, wodurch 34 mg des reinen Antibiotikums GE 37468 A erhalten werden.

Beispiel 6

Trennung und Reinigung der Antibiotika GE 37468 B und GE 37468 C

Während des Aufarbeitens des Fermentationsproduktes wird eine partielle Spaltung von GE 37468 A beobachtet, wobei wesentliche Mengen von zwei Hydrolyseprodukten erzeugt werden.
Die ersten zehn Fraktionen, die durch das in Beispiel 4 beschriebene chromatographische Verfahren erhalten wurden, enthalten angereichert diese Hydrolyseprodukte, wie durch DC- und HPLC-Analyse gezeigt wird. Diese Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt, wodurch ein öliger Rückstand erhalten wird, aus dem ein Gemisch aus den zwei Hydrolyseprodukten durch Zusatz von Petrolether ausgefällt wird.
Die zwei Produkte werden isoliert und durch präparative HPLC gereinigt. Ein Teil (6 mg) des Gemisches wird in 0,5 ml Acetonitril und 0,5 ml 16 mM Ammoniiumformiat-Puffer (pH 6,2) gelöst und in fünf Läufen auf eine silanisierte Kieselgelsäule (Ultrasphere ODS, 5 µm, 250 x 4,6 mm, Altex, Beckman) injiziert.
Die Elution wird mit einem linearen Gradienten von Phase A und Phase B (50 bis 90 % Phase A in 20 Min.) bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,5 ml/Min. durchgeführt. Die Phase A ist ein Gemisch aus Acetonitril und 16 mM Ammoniumformiat-Puffer, 80/20 (Vol./Vol.), eingestellt auf pH 6,2, während die Phase B ein Gemisch aus Acetonitril und 16 mM Ammoniumformiat, 5/95 (Vol./Vol.), eingestellt auf pH 6,2, darstellt.
Der UV-Nachweis wird bei 230 nm durchgeführt. Die einer Retentionszeit (Rt) von 11 bis 12,5 Min. entsprechenden Fraktionen aus jedem Chromatographielauf werden gesammelt und vereinigt. Nach Entfernung von Acetonitril durch Destillation unter vermindertem Druck fällt aus der resultierenden wäßrigen Lösung ein weißer Niederschlag aus. Der Niederschlag wird gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch 1,5 mg reines GE 37468 B erhalten werden.
Auch die einer Retentionszeit (Rt) von 13 bis 13,5 Min. entsprechenden Fraktionen aus jedem Chromatographielauf werden gesammelt und vereinigt. Nach Durchführung eines dem vorstehend beschriebenen Verfahren analogen Verfahrens wird 1,0 mg reines GE 37468 C erhalten.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Figur 1 zeigt das UV-Spektrum des Antibiotikums GE 37468 A. Die Symbole beziehen sich auf die folgenden verwendeten Lösungsmittel:
bezieht sich auf den Test in CH&sub3;OH
bezieht sich auf den Test in 0,1 M HCl
bezieht sich auf den Test in Phosphatpuffer, pH 7,4
bezieht sich auf den Test in 0,1 M KOH.
Figur 2 stellt das IR-Absorptionsspektrum von GE 37468 A in Nujol-Mull dar.
Figur 3 stellt das ¹H-NMR-Spektrum des Antibiotikums GE 37468 A, gemessen bei 500 MHz in DMSO-d&sub6;&sub1; dar.
Figur 4 stellt das ¹³C-NMR-Spektrum des Antibiotikums GE 37468 A bei 125 MHz in DMSO-d&sub6; dar.

Claims

1. Antibiotikum, ausgewählt aus Antibiotikum GE 37468 A, Antibiotikum GE 37468 B, Antibiotikum GE 37468 C und ihren Salzen mit Basen, die in der Nicht-Salz-Form jeweils die folgenden Eigenschaften aufweisen:

Antibiotikum GE 37468 A

A) Ultraviolett-Absorptionsspektrum, das die folgenden Absorptionsmaxima zeigt:

B) Infrarot-Absorptionsspektrum in Nujol-Mull, das die folgenden Absorptionsmaxima (cm&supmin;¹) zeigt: 3600; 3100; 2924 (Nujol); 2853 (Nujol); 1705; 1653; 1514; 1466 (Nujol); 1377 (Nujol); 1310; 1269; 1200; 1173; 1153; 1101; 1024; 1007; 878; 808; 758; 721 (Nujol); 702;

C) ¹H-NMR-Spektrum, das die folgenden Signalgruppen (in ppm) bei 500 MHz zeigt, aufgenommen in DMSO-d&sub6; (Hexadeuterodimethylsulfoxid) unter Verwendung von TMS als interner Standard (0,00 ppm);

[δ, ppn Multiplizität, (s = Singulett, d = Dublett; dd = Dublett von Dubletts; m = Multiplett; br s = breites Signal)]: 10.08, s; 9.59, s; 9.03, br s; 8.67, s; 8.64, d; 8.57, d; 8.54, d; 8.38, d; 8.19, s; 7.91, s; 7.75, s; 7.30-7.28, m; 7.20, a; 7.18, br s; 7.06, d; 6.78, br s; 6.58, d; 6.49, br s; 6.45, s; 6.06, 8; 5.82, s; 5.79, br s; 5.29, in;5.07, m; 4.93, m; 4.87, a; 4.64, d; 3.63, dd; 3.4-3.3, m; 3.19, dd; 2.94, m; 2.73, s; 2.67, in; 2.62, in; 2.11, m;1.98, m; 1.91, m; 1.14, m.

D) ¹³C-NMR-Spektrum (¹H-entkoppelt), das in DMSO-d&sub6; die folgenden Signalgruppen (δ, ppm) bei 125 MHz mit TMS als interne Referenz (0,00 ppm) zeigt; Q bedeutet guartenäre Kohlenstoffatome oder C=O-Gruppen;

174.4 (Q); 174.0 (Q); 173.0 (Q); 171.6 (Q); 171.4 (Q); 169.3 (Q); 167.6 (Q); 165.0 (Q); 162.3 (Q); 161.3 (Q); 161.2 (Q); 160.8 (Q); 159.0 (Q); 156.0 (Q); 155.7 (Q); 153.9 (Q); 153.3 (Q); 152.1 (0); 150.5 (Q, 2C); 149.3 (Q); 147.4 (Q); 140.1 (CH); 137.3 (Q; 134.7 (Q);. 134.6 (Q); 130.7 (2 CH); 129.8 (Q); 129.5 (2 CH); 129.0 (CH); 128.4 (2 CH); 127.4 (Q); 126.8 (CH); 123.9 (CH); 123.1 (Q); 122.3 (CH); 118.7 (CH); 116.7 (CH); 115.1 (2 CH); 111.2 (CH&sub2;); 105.4 (CH&sub2;); 81.9 (CH); 77.5 (CH); 66.7 (CH); 54.3 (CH); 52.3 (CH); 48.5 (CH); 42.8 (CR&sub2;); 39.0 (CH); 38.5 (CH&sub2;); 38.1 (CH&sub2;); 37.0 (CR&sub2;); 36.3 (CH&sub2;); 16. (CR&sub3;); 11.7 (CR&sub3;)

E) Retentionszeit (Rt) von 14,4 Minuten, wenn die Analyse durch Umkehrphasen-HPLC unter den folgenden Bedingungen durchgeführt wurde:

Säule: Ultrasphere ODS (silanisiertes Kieselgel mit Umkehrphasen; 5 µm) Altex (Beckman) 4,6 mm (i.D.) x 250 mm

Vorsäule: Brownlee Labs RP 18 (Octadecylsilan-Kieselgel; 5 µm)

Laufmittel A: Acetonitril : 16 mim Ammoniumphosphat 80:20 (Vol./Vol.), eingestellt auf pH 6,0,

Laufmittel B: Acetonitril : 16 mM Ammoniumphosphat 5:95 (Vol./Vol.), eingestellt auf pH 6,0,

Elutionsmodus: linearer Gradient von Laufmittel A in Laufmittel B von 10 bis 90 % in 20 Minuten,

Durchflußgeschwindigkeit: 1,5 ml pro Minute, UV-Detektor: 230 nm,

interner Standard: Antibiotikum GE 2270 Faktor A, (Rt = 16,7 Min.);

F) Elementaranalyse einer bei etwa 100ºC in inerter Atmosphäre getrockneten Probe, die die folgende Zusammensetzung zeigt: Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Schwefel;

G) Rf-Wert von 0,15 im folgenden chromatographischen System: Dichlormethan : Methanol, 85:15 (Vol./Vol.), unter Verwendung von Kieselgeiplatten (Silicagel 60F&sub2;&sub5;&sub4;, Merck Co.);

Sichtbarmachung: UV-Licht bei 254 nm, gelber Fleck mit Ioddämpfen oder Bioautographie unter Verwendung von B. subtilis ATCC 6633 auf Davis-Minimalmedium; interner Standard: Antibiotikum GE 2270 Faktor A, (Rf 0,77);

H) FAB-MS-Analyse, die das Isotop mit der niedrigsten Masse des protonierten molekularen Ions bei einem m/z-Wert zeigt, aer einem Molekulargewicht von 1308,3 ± 0,1 Dalton entspricht, wobei die Analyse mit einem doppelfokussierenden Massenspektrometer, Kratos MS-50TC, unter den folgenden experimentellen Bedingungen durchgeführt wurde: Beschuß mit schnellen Xe-Atomen bei 8 kV; m-Nitrobenzylalkohol-Matrix; positiver Ionisierungsmodus;

I) Aminosäureanalyse des HCL-Hydrolysats, die das Vorliegen der folgenden natürlichen Aminosäuren zeigt: Cystein, Phenylalanin, Tyrosin und Cystin.

Antibiotikum GB 37468 B

A) Retentionszeit (Rt) von 11,5 Minuten, wenn die Analyse duch Umkehrphasen-HPLC unter den folgenden Bedingungen durchgeführt wurde:

Säule: Ultrasphere ODS (silanisiertes Kieselgel mit Umkehrphase; 5 µm) Altex (Beckman) 4,6 mm (i.D.) x 250 mm

Laufmittel A: Acetonitril : 16 mM Ammoniumphosphat 80:20 (Vol./Vol.), eingestellt auf pH 6,0,

Elutionsmodus: linearer Gradient von Laufmittel A in Laufmittel B von 40 bis 90 % in 20 Minuten,

Durchflußgeschwindigkeit: 1,5 ml pro Minute, UV-Detektor: 230 nm,

interner Standard: Chloramphenicol (Rt = 4,0 Min.);

B) FAB-MS-Analyse, die das Isotop mit der niedrigsten Masse des protonierten molekularen lons bei einem m/z-Wert zeigt, der einem Molekulargewicht von 1169,3 ± 0,1 Dalton entspricht, wobei die Analyse mit einem doppelfokussierenden Massenspektrometer, Kratos MS-50TC, unter den folgenden experimentellen Bedingungen durchgeführt wurde: Beschuß mit schnellen Xe-Atomen bei 8 kV; m-Nitrobenzylalkohol-Matrix; positiver Ionisierungsmodus;

C) erhältlich durch Züchtung eines Streptomyces-Stamms, der es produzieren kann, wobei der Stamm Streptomyces sp. GE 37468 ATCC 55365 oder eine die Antibiotika GE 37468 produzierende Mutante davon ist.

Antibiotikum GE 37468 C

A) Retentionszeit (Rt) von 13,0 Minuten, wenn die Analyse durch Umkehrphasen-HPLC unter den folgenden Bedingungen durchgeführt wurde:

Laufmittel B: Acetonitril : 16 µM Ammoniumphosphat 5:95 (Vol./Vol.), eingestellt auf pH 6,0,

Durchflußgeschwindigkeit: 1,5 ml pro Minute, UV-Detekor: 230 nm,

interner Standard: Chloramphenicol (Rt = 4,0 Min.);

B) FAB-MS-Analyse, die das Isotop mit der niedrigsten Masse des protonierten molekularen lons bei einem m/z-Wert zeigt, der einem Molekulargewicht von 1238,3 ± 0,1 Dalton entspricht, wobei die Analyse mit einem doppelfokussierenden Massenspektrometer, Kratos MS-50TC, unter den folgenden experimentellen Bedingungen durchgeführt wurde: Beschuß mit schnellen Xe-Atomen bei 8 kV; m-Nitrobenzylalkohol-Matrix; positiver Ionisierungsmodus;

2. Antibiotikum GE 37468 A und die pharmazeutisch verträglichen Salze davon, das in der Nicht-Salz-Form die folgende Formel I aufweist:

3. Antibiotikum GE 37468 C und die pharmazeutisch verträglichen Salze davon, das in der Nicht-Salz-Form die folgende Formel II aufweist:

4. Antibiotiku:a GE 37468 S und die pharmazeutisch verträglichen Salze davon, das in der Nicht-Salz-Form die folgende Formel III aufweist:

5. Verfahren zur Herstellung der antibiotischen Verbindungen nach den Ansprüchen 1 bis 4, umfassend die Züchtung von Streptomyces sp. GE 37468 ATCC 55365 oder einer die Antibiotika GE 37468 prodzierenden Variante oder Mutante davon unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganische Salzen enthält, Gewinnung und Isolierung des Fermentationsprodukts aus dem Myzel des produzierenden Mikroorganismus und Auftrennung der einzelnen Produkte, des Antibiotikums GE 37468 A, des Antibiotikums GE 37468 B und des Antibiotikums GE 37468 C, mit Hilfe von chromatographischen Techniken.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Antibiotikum GE 37468 aus dem Myzel gewonnen wird, indem das filtrierte oder zentrifugierte Myzel mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert, die Extrakte eingeengt und die rohe antibiotische Substanz durch Fällung, Extraktion des konzentrierten wäßrigen Rückstands mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels oder durch Adsorptionschromatographie und anschließende Elution der gewünschten Produkte aus der Adsorptionsmatrix gewonnen wird.

7. Verfahren nach Anspuch 5, wobei die einzelnen antibiotischen Produkte mit Hilfe von Chromatographie auf stationären Phasen, Umkehrphasen-Chromatographie oder sterischer Ausschluß-Chromatographie aufgetrennt werden.

8. Antibiotische Verbindung nach den Ansprüchen 1 bis 4 für die Verwendung als Medikament.

9. Verwendung einer Verbindung nach den Ansprüchen 1 bis 4 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Infektionen, die mit dem Vorliegen von Mikroorganismen zusammenhängen, die hiergegen empfindlich sind.

10. Arzneimittel, das als Wirkstoff eine Verbindung nach den Ansprüchen 1 bis 4, gemischt mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, enthält.

11. Arzneimittel nach Anspruch 10 für die Behandlung von Infektionen, die mit dem Vorliegen von Mikroorganismen zusammenhängen, welche gegen eine Verbindung nach den Anspruchen 1 bis 4 empfindlich sind.

12. Verwendung eines Antibiotikums nach Anspruch 1 als wachstumsförderndes Mittel bei Tieren.

13. Biologisch reine Kultur von Streptomyces sp. GE 37468 ATCC 55365 oder einer die Antibiotika GE 37468 produzierenden Mutante davon.