DE602004005203T2

DE602004005203T2 - Antibiotikum 107891, dessen Faktoren A1 und A2, pharmazeutisch annehmbare Salzeund Zusammensetzungen und Verwendung davon

Info

Publication number: DE602004005203T2
Application number: DE602004005203T
Authority: DE
Inventors: Ameriga Lazzarini; Luciano Gastaldo; Gianpaolo Candiani; Ismaela Ciciliato; Daniele Losi; Flavia Marinelli; Enrico Selva; Franco Parenti
Original assignee: Vicuron Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Sentinella Pharmaceuticals Inc ("sentinella" Us
Priority date: 2003-07-18
Filing date: 2004-07-12
Publication date: 2007-11-22
Anticipated expiration: 2024-07-13
Also published as: TW200510541A; US20060183673A1; EP1646646B1; CA2529124A1; TWI340167B; CA2529124C; EP1646646A1; DE602004005203D1; AR046809A1; JP2007525479A; ATE356143T1; JP4163737B2; WO2005014628A1; US7307057B2; MXPA06000691A; ES2281808T3; BRPI0412591A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine antibiotische Substanz mikrobieller Herkunft, die willkürlich als Antibiotikum 107891 bezeichnet wurde, die ein Komplex, umfassend die Faktoren A1 und A2, ist, die pharmazeutisch annehmbaren Salze davon, pharmazeutische Zusammensetzungen davon und deren Verwendung als antibakterieller Wirkstoff.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums 107891, das das Kultivieren von Microbispora sp. 107891 (hierin nachfolgend identifiziert als Microbispora sp. ATCC PTA-5024) oder einer Variante oder Mutante davon, die die Fähigkeit zur Produktion dieses Antibiotikums beibehalten hat, Gewinnen des erfindungsgemäßen Antibiotikums aus dem Mycelium und/oder aus der Fermentationsbrühe, Isolieren der Reinsubstanz durch chromatographische Mittel und Abtrennen der Faktoren A1 und A2 umfasst.
Das Antibiotikum 107891 ist ein neuer antimikrobieller Wirkstoff mit einer Peptidstruktur, die Lanthionin und Methyllanthionin als Bestandteile enthält. Dieses sind typische Merkmale von Lantibiotika ("lantibiotics"), und insbesondere der Untergruppe, die hauptsächlich auf die Zellwandbiosynthese wirkt.
Lantibiotika sind Peptide, die die Thioether-Aminosäure Lanthionin sowie mehrere andere modifizierte Aminosäuren enthalten (H.G. Sahl und G. Bierbaum, (1998) "Lantibiotics: Biosynthesis and biological activities of uniquely modified peptides from gram-positive bacteria", Ann. Rev. Microbiol. 52:41-79). Die Mehrheit der bekannten Lantibiotika besitzt antibakterielle Aktivität, obwohl für einige berichtet worden ist, dass sie bezüglich verschiedener pharmakologischer Ziele aktiv sind. Die antibakteriellen Lantibiotika können auf der Grundlage ihrer Strukturen auf breite Weise in zwei Gruppen unterteilt werden: Lantibiotika vom Typ A sind typischerweise langgestreckte, amphiphile Peptide, während Lantibiotika vom Typ B kompakt und globulär sind (O. McAuliffe, R.P. Ross und C. Hill, (2001): "Lantibiotics: structure, biosynthesis and mode of action", FEMS Microb. Rev. 25: 285-308). Nisin ist der typische Vertreter eines Lantibiotikums vom Typ A, wohingegen Actagardin (Gardimycin) und Mersacidin zu der Unterklasse der Typ B-Lantibiotika gehören. Lantibiotika vom Nisin-Typ als auch solche vom Mersacidin-Typ wechselwirken mit den Membran-gebundenen Peptidoglykan-Vorläufern Lipid II, obwohl sich diese zwei Klassen hinsichtlich der Wirkungen, die sie im bakteriellen Proliferationsvorgang erzeugen, unterscheiden. Lantibiotika vom Nisin-Typ töten Bakterien vorwiegend durch Permeabilisierung der Zytoplasmamembran (H. Brotz, M. Josten, I. Wiedemann, U. Schneider, F. Gotz, G. Bierbaum und H.G. Sahl, (1998): "Role of lipidbound peptidoglycan precursors in the formation of pores by nsin, epidermin and other lantibiotics", Mol. Microbiol. 30:317-27), während Lantibiotika vom Mersacidin-Typ die Bakterienzelle hauptsächlich durch Inhibieren der Zellwandbiosynthese töten (H. Brotz, G. Bierbaum, K. Leopold, P.E.Reynolds und H.G. Sahl, (1998): "The lantibiotic mersacidin inhibits peptidoglycan synthesis by targeting lipid II", Antimicrob Agents Chemother. 42:154-60).
Die zwei von dem Microbispora corallina-Stamm NRRLL 30420 produzierten Antibiotika, bezeichnet als Antibiotikum MF-BA-1768α₁ bzw. MF-BA-1768β₁, sind in der US 6 551 591 B1 beschrieben. Die in dem obenstehend bezeichneten Patent angegebenen physikochemischen Daten (z.B. Massenspektroskopiedaten, Molekulargewicht, Gehalt an Aminosäuren) und der Vergleich der Retentionszeiten in experimentellen LC-MS-Untersuchungen zeigen deutlich, dass der Antibiotikum 107891-Komplex sowie seine Komponenten Faktor A1 und Faktor A2 chemische Strukturen sind, die von den Antibiotika MF-BA 1768α₁ und MF-BA-1768β₁ verschieden sind.
Die EP 0592835A2 beschreibt die Antitumor-Antibiotika BU-4803TA₁, A₂, B, C₁, C₂ und D. Die Antibiotika BU-4803TA₁, A₂ und B werden aus der Fermentationsbrühe von Microbispora ATCC 55327 (AA 9966) gewonnen, während die Antibiotika BU4803TC₁, C₂ und D Umwandlungsprodukte der Antibiotika BU 4803TA₁, A₂ bzw. B sind, wenn diese Produkte in Dimethylsulfoxid gelagert werden. Die in der EP 0592 835 A berichteten physiko-chemischen Daten für die obenstehenden Antibiotika (z.B. Aussehen, UV-Absorption, Molekulargewicht, Antitumor-Aktivität) zeigen deutlich, dass sie chemische Substanzen sind, die von dem Antibiotikum 107891-Komplex und seinen Faktoren A1 und A2 verschieden sind.
STAMM UND FERMENTATION
Microbispora sp. 107891 wurde aus der Umwelt isoliert und am 27. Februar 2003 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd, Manassas VA, 20110-2209 USA, gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrages hinterlegt. Für den Stamm wurde die Eingangsnummer PTA-5024 erteilt.
Die Produktion von Antibiotikum 107891 wird erreicht durch Kultivieren eines Microbispora sp.-Stammes, der fähig ist, es zu produzieren, d.h., Microbispora sp. ATCC PTA-5024 oder eine Variante oder Mutante davon, die die Fähigkeit zur Produktion dieses Antibiotikums beibehalten hat; Isolieren des resultierenden Antibiotikums aus der gesamten Kulturbrühe und/oder aus dem abgetrennten Mycelium und/oder aus der filtrierten Fermentationsbrühe und Reinigen des isolierten Antibiotikums durch chromatographische Mittel. Auf jeden Fall ist es bevorzugt, das Antibiotikum 107891 unter anaeroben Bedingungen in einem wässrigen Nährmedium zu produzieren, das leicht assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält. Viele auf dem Gebiet der Fermentation normalerweise eingesetzte Nährmedien können verwendet werden, jedoch sind bestimmte Medien bevorzugt.
Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Saccharose, Fructose, Glucose, Xylose und dergleichen. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Sojabohnenmehl, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trypton, Aminosäuren, hydrolysiertes Casein und dergleichen. Zu den anorganischen Salzen, die in die Kulturmedien eingearbeitet werden können, zählen die gebräuchlichen löslichen Salze, die fähig sind, Natrium-, Kalium-, Eisen-, Zink-, Kobalt-, Magnesium-, Calcium-, Ammoni um-, Chlorid-, Carbonat-, Sulphat-, Phosphat-, Nitrat-Ionen und dergleichen Ionen bereitzustellen.
Der das Antibiotikum 107891 produzierende Stamm wird bevorzugt in einem Fermentationsröhrchen oder einem Schüttelkolben vorkultiviert, dann wird die Kultur verwendet, um Glasbehälterfermenter ("jar fermentors") für die Produktion wesentlicher Mengen von Substanzen anzuimpfen. Das für die Vorkultur verwendete Medium kann das gleiche sein, wie das, das für größere Fermentationen eingesetzt wird, aber auch andere Medien können eingesetzt werden. Der das Antibiotikum 107891 produzierende Stamm kann bei einer Temperatur zwischen 17°C und 37°C gezüchtet bzw. wachsen gelassen werden, wobei optimale Temperaturen um 28-30°C liegen.
Während der Fermentation kann die Produktion von Antibiotikum 107891 durch Bioassay an empfindlichen Mikroorganismen und/oder durch HPLC-Unersuchungen überwacht werden. Maximale Produktion des Antibiotikums 107891 tritt im Allgemeinen nach näherungsweise 90 Stunden und vor den 200 Stunden der Fermentation auf.
Das Antibiotikum 107891 wird durch Kultivieren von Microbispora sp. ATCC PTA-5024 oder einer Variante oder Mutante davon, die fähig ist, das Antibiotikum 107891 zu produzieren, hergestellt, und es wird in den Kulturbrühen und/oder in Mycelium gefunden.
In dieser Beschreibung und diesen Ansprüchen bezeichnet der Begriff "Antibiotikum 107891", sofern nicht anders angegeben, den Antibiotikum 107891-Komplex, umfassend die Faktoren A1 und A2.
MORPHOLOGISCHE CHARAKTERISTIKA VON Microbispora sp. ATCC PTA-5024
Microbispora sp. ATCC PTA-5024 wächst auf verschiedenen festen Standardmedien. Mikroskopische Dimensionen wurden gemessen unter Verwendung der Kultur, die auf Huminsäure-Spurensalze-Agar (Zusammensetzung in g/l: Huminsäure 0,5 FeSO₄·7H₂O 0,001, MnCl₂·4H₂O 0,001, ZnSO₄·7H₂O 0,001, NiSO₄·6H₂O 0,001, MOPS 2, Agar 20), supplementiert mit 1 ml/l Vitaminlösung (25 mg/l Thiaminhydrochlorid, 250 mg/l Calciumpantothenat, 250 mg/l Nicotinsäure, 0,5 mg/l Biotin, 1,25 g/l Riboflavin, 6,25 mg/l Cyanocobalamin, 25 mg/l Paraminobenzoesäure, 500 mg/l Folsäure, 500 mg/l Pyridoxalhydrochlorid) wachsen gelassen wurde.
In Flüssigkultur (V6-Medium, Zusammensetzung in g/l: Dextrose 22, Fleischextrakt 5, Hefeextrakt 5, Casein 3, NaCl 1,5) wurde nach 6 Tagen des Wachstums bei 28°C keine Fragmentierung des Myceliums beobachtet. Mikroskopische Untersuchung auf Huminsäure-Spurensalze-Agar (nach 21 Tagen der Inkubation bei 28°C) offenbart ein verzweigtes, unfragmentiertes Substratmycelium und monopodial verzweigtes Luftmycelium; auch sind viele lange, gerade und spärlich verzweigte Lufthyphen sichtbar. Charakteristische longitudinale Sporenpaare werden von kurzen Sporophoren bzw. Sporenträgern gebildet, die lateral aus Verzweigungen oder direkt aus den Haupt-Lufthyphen hervorgehen. Die Sporen sind globos und nicht-motil bzw. unbeweglich. Sporangium-artige Körper oder andere besondere Strukturen werden nicht beobachtet.
KULTURMERKMALE VON Microbispora sp. ATCC PTA-5024
Microbispora sp. ATCC PTA-5024 wurde sechs Tage lang in AF/MS-Flüssigmedium (siehe Beispiel 1) bei 28°C und 200 U/min wachsen gelassen, dann auf ein neues AF/MS-Flüssigmedium (5% Inokulum) transferiert und weitere 6 Tage lang wachsen gelassen und schließlich in 100 ml V6-Flüssigmedium (siehe Beispiel 1) inokuliert (7% Inokulum). Nach 6 Tagen des Wachstums bei 28°C und 200 U/min wurde das Mycelium durch Zentrifugation geerntet und dreimal mit steriler Kochsalzlösung gewaschen, dann wurde es verdünnt, um ein geeignetes Inokulum bereitzustellen. Aliquote der Suspension wurden auf eine Kreuzschraffurartige Weise auf verschiedenen Medien ausgestrichen, die empfohlen wurden von Shirling und Gottlieb (E.B. Shirling und D. Gottlieb, (1966): "Method for Characterization of Streptomyces species", Int. J. Syst. Bacteriol. 16: 313-340), und Medien, die empfohlen wurden von S.A. Waksman (1961). "The Actinomycetes", The Williams and Wilkins Co., Baltimore. Bd. 2: 328-334).
Die Fähigkeit, eine Vielfalt an Kohlenyhdraten als Kohlenstoff- und Energiequelle zu nutzen, wurde unter Verwendung des Mediums ISP4 ohne Stärke, supplementiert mit 1 ml/l der obenstehend beschriebenen Vitaminlösung, als Basalmedium bestimmt; jede Kohlenstoffquelle wurde in der Endkonzentration von 1 % (G/V) zugegeben.
NaCl-Toleranz, pH-Bereich des Wachstums sowie die Fähigkeit, bei verschiedenen Temperaturen zu wachsen, wurden auf ISP2-Medium bestimmt. Alle Medien wurden drei Wochen lang bei 28°C inkubiert; Beschreibungen beziehen sich auf 21 Tage, sofern nicht anders angegeben. Die Farbe wurde unter natürlichem Tageslicht beurteilt, wobei der Farbatlas von Maerz und Paul (A. Maerz und M.R. Paul, 1950-A Dictionary of Colour, 2. Auflage. Mc-Graw-Hill Book Co. Inc., New York) verwendet wurde. Die Fähigkeit, Nitrate zu Nitriten zu reduzieren, wurde gemäß der von Williams et al. (S.T. Williams, M. Goodfellow, G. Alderson, E.M.H. Wellington, P.H.A. Sneath & M.J. Sackin, 1983 -Numerical classification of Streptomyces and related genera – J. Gen. Microbiol. 129, 1743-1813) beschriebenen Verfahrensweise auf Nitrat-Schrägmedium ("sloppy Nitrate medium") untersucht.
Wachstum, Kolonieerscheinungsbild, Substrat- und Luftmycelfarbe und Pigmentbildung für den Stamm Microbispora sp. ATCC PTA-5024 sind in Tabelle I angegeben. Auf den meisten der verwendeten Medien liegt vegetatives Wachstum vor, im Unterschied zum Luftmycel bzw. Luftmycelium, das nur auf einigen von ihnen vorliegt. Auf keinem der verwendeten Medien wird eine offensichtliche Pigmenterung gezeigt. Physiologische Charakteristika des Stammes sind in Tabelle II dargestellt. Wachstum und Luftmycelium-Bildung liegen bei 17°C, aber nicht bei 43°C vor. Eine Bildung von Luftmycelium auf ISP2 liegt bei pH-Werten von mehr als 6 vor, während sie in Gegenwart von 1% NaCl fehlt.
Die Fähigkeit, verschiedene Kohlenhydrate für das Wachstum zu nutzen, ist in Tabelle III dargestellt. Tabelle I: Wachstumsmerkmale von Microbispora sp. ATCC PTA-5024

(ISP4 und Glucose-Asparagin-Agar, mit 1 ml/l Vitaminlösung supplementiert).

+++ reichlich; ++ gutes Wachstum; + moderates Wachstum; +/– dürftiges Wachstum; – kein Wachstum; Luftmycelium fehlt immer.

CHEMOTAXONOMISCHE MERKMALE VON Microbispora sp. ATCC PTA-5024
Microbispora sp. ATCC PTA-5024 wurde in GYM-Medium (Glucose 4 g/l; Hefeextrakt 4 g/l; Malzextrakt 10 g/l) bei 28°C auf einem Rotationsschüttler wachsen gelassen, und das Mycelium wurde geerntet, zweimal mit sterilem destillierten Wasser gewaschen und nachfolgend gefriergetrocknet. Analysen der Aminosäuren wurden gemäß dem Verfahren von Staneck und Roberts (J.L. Staneck und G.D. Roberts, (1974): "Simplified approach to identification of aerobic actinomycetes by thin-layer chromatography", Appl. Microbiol. 28: 226-231) durchgeführt. Menachinone und polare Lipide wurden nach der Verfahrensweise von Minnikin et al. (D.E. Minnikin, A.G. O'Donnell, M. Goodfellow., G. Alderson, M. Athalye, A. Schaal und J.H. Parlett, (1984): "An integrated procedure of isoprenoid quinones and polar lipids", J. Microbiol. Meth. 2: 233-241) extrahiert. Polare Lipide wurden durch Dünnschichtchromatographie (D.E. Minnikin, V. Patel, L. Alshamaony und M. Goodfellow, (1977): "Polar lipid composition in the classification of Nocardia and related bacteria", Int. J. Syst. Bacteriol. 27:104-117), Menachinone durch HPLC (R.M. Kroppenstedt, (1982): "Separation of bacterial menaquinones by HPLC using reverse phase RP18 and a silver loaded ion exchanger as stationary phase", J. Liquid. Chromat. 5:2359-2367; R.M. Kroppenstedt, (1985): "Fatty acid and menaquinone analysis of actinomycetes and related organisms", in: Chemical Methods in Bacterial Systematics. No20 SAB Technical Series, S. 173-199, M. Goodfellow und D.E. Minnikin, Hrsg., Academic Press, London) bzw. Fettsäuremethylester durch Gas-Flüssigkeitschromatographie (L.T. Miller, (1982): "A single derivatization method for bacterial fatty acid methyl esters including hydroxy acids", J. Clin. Microbiol. 16: 584-586; M. Sasser, (1990): "Identification of bacteria by gas chromatography of cellular fatty acids", USFCC News Letters 20:1-6) untersucht. Das Vorhandensein von Mycolsäuren wurde durch das Verfahren von Minnikin et al. (D.E. Minnikin, L. Ashamaony und M. Goodfellow, (1975): "Differentiation of Mycobacterium, Nordica and related taxa by thin layer chromatographic analysis of whole organism methanolyzates", J. Gen. Microbiol. 88: 200-204) untersucht.
Ganzzellhydrolysate des Stamms Microbispora sp. ATCC PTA-5024 enthalten meso-Diaminopimelinsäure als die Diaminosäure des Peptidoglykans. Die vorherrschenden Menachinone sind MK-9 (III, VIII-H₄), MK-9(H₂) und MK-9(H₀). Das Muster polarer Lipide ist gekennzeichnet durch das Vorhandensein von Phosphatidylethanolamin, Methylphosphatidylethanolamin, Phosphatidylgylcerin, Diphosphatidylglycerin, Phosphatdiylinositol, Phosphatidylinositolmannosiden und N-Acetylglucosamin-enthaltendem Phospholipid, d.h., Phospholipid des Typs IV nach Lechevalier et al. (H.A. Lechevalier, C. De Brieve und M.P. Lechevallier, (1977): "Chemotaxonomy of aerobic actinomycetes: phospholipid composition", Biochem. Syst. Ecol. 5: 246-260). Die Hauptkomponenten des Fettsäuremusters sind anteiso 15:0, iso 16:0, n-16:0, anteiso 17:0 und 10-Methylheptadecansäure (10-Me-17:0), d.h., 3c sensu Kroppenstedt (R.M. Kroppenstedt, (1985): "Fatty acid and menaquinone analysis of actinomycetes and related organisms", in: Chemical Methods in Bacterial Systematics. No20 SAB Technical Series, S. 173-199. M. Goodfellow und D.E. Minnikin Hrsg., Academic Press, London). Es wurden keine Mycolsäuren detektiert.
SEQUENZIERUNG DER 16S rDNA von MICROBISPORA sp. ATCC PTA-5024
Die Teilsequenz des 16 rRNA-Gens (16S rDNA), d.h., 1443 Nucleotide, entsprechend 95% der gesamten rRNA, des Stamms Microbispora sp. ATCC PTA-5024 wurde gemäß publizierter Verfahrensweisen (P. Mazza, P. Monciardini, L. Cavaletti, M Sosio und S. Donadio, (2003): "Diversity of Actinoplanes and related genera isolated from an Italian soil", Microbial Ecol. 5:362-372) erhalten. Sie ist in SEQ ID NO 1 angegeben.
Diese Sequenz wurde mit der des Stammes Microbispora corallina NRRL 30420 (MF-BA-1768), wie sie in der US 6 551 591 B1 angegeben ist, verglichen. Die zwei Sequenzen wurden angeglichen, und Unterschiede wurden an 31 von 1456 angeglichenen Positionen festgestellt, was eine insgesamte Sequenzabweichung bzw. Sequenzdivergenz von 2,13% darstellt. Zwei beliebige Stämme, die weniger als 97,5% Sequenzidentität aufweisen, gehören üblicherweise zu unterschiedlichen Arten (Stackebrandt, E. und Embley, M.T. (2000), "Diversity of Uncultered Microorganisms in the Environment". In: Nonculturable Microorganisms in the Environment, R.R. Colwell und D.J. Grimes (Hrsg.). ASM, Press, Washington DC, S. 57-75). Deshalb ist ein Level von 2% Sequenzdivergenz relativ hoch (Rossellò-Mora, R. und Amann, R. (2001). "The Species Concept for Prokaryotes". FEMS Microbiol. Rev. 25: 39-67) und weist darauf hin, dass Microbispora sp. ATCC PTA-5024 und Microbispora corallina NRRL 30420 (MF-BA-1768) verschiedene Stämme sind.
IDENTITÄT DES STAMMES MICROBISPORA sp. ATCC PTA-5024
Der das Antibiotikum 107891 produzierende Stamm wird der Gattung Microbispora, Familie Streptosporangiaceae, aufgrund der folgenden chemotaxonomischen und morphologischen Merkmale zugeordnet:

– Vorhandensein von meso-Diaminopimelinsäure in der Zellwand;
– Große Menge an MK-9 (III, VIII-H₄) und Phospholipid vom Typ IV nach Lechevalier et al. (H.A. Lechevalier, C. De Brieve und M.P. Lechevalier, (1977): "Chemotaxonomy of aerobic actinomycetes: phospholipid composition", Biochem. Syst. Ecol. 5: 246-260);
– Fettsäureprofil von 3c sensu Kroppenstedt (R.M. Kroppenstedt, (1992): "The genus Nocardiopsis", in: The Prokarotes, Bd. II, S. 1139-1156, A. Balows, H. Truper, M. Dworkin, W. Harder und K.H. Schleifer, Hrsg.; New York, Springer-Verlag);
– Fehlen von Mycolsäuren;
– Bildung charakteristischer longitudinaler Sporenpaare an den Spitzen von kurzen Sporophoren, die lateral aus Lufthyphen abzweigen. Unbewegliche Sporen.
– Eine Teilsequenz des 16 rRNA-Gens (16S rDNA), d.h., 1443 Nucleotide, entsprechend 95% der gesamten rRNA, angegeben in SEQ ID NO 1, zeigt >97% Identität mit 16S rDNA-Sequenzen von beschriebenen Microbispora-Arten.

Wie bei anderen Mikroorganismen, unterliegen die Merkmale des das Antibiotikum 107891 produzierenden Stammes Änderungen. Z.B. können künstliche Varianten und Mutanten des Stammes erhalten werden, und zwar durch Behandlung mit zahlreichen bekannten Mutagenen, wie z.B. UV-Strahlen und Chemikalien, wie z.B. salpetrige Säure, N-Methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin und viele andere. Alle natürlichen und künstlichen Varianten und Mutanten des Stammes Microbispora sp. ATCC PTA-5024, die zur Produktion des Antibiotikums 107891 fähig sind, werden für die Zwecke dieser Erfindung als gleichwertig dazu erachtet und sind deshalb in den Umfang der Erfindung eingeschlossen.
EXTRAKTION UND REINIGUNG DES ANTIBIOTIKUMS 107891
Wie oben stehend erwähnt, wird das Antibiotikum 107891 in beinahe gleicher Verteilung sowohl im Mycelium als auch in der filtrierten Fraktion der Fermentationsbrühe gefunden.
Die geerntete Brühe kann verarbeitet werden, um das Mycelium von dem Überstand der Fermentationsbrühe abzutrennen, und das Mycelium kann mit einem Wasser-mischbaren Lösungsmittel extrahiert werden, um, nach Entfernung des verbrauchten Myceliums, eine Lösung zu erhalten, die das Antbiotikum 107891 enthält. Dieser Myceliumsextrakt kann dann separat oder im Pool mit dem Überstand gemäß den hiernach für die Überstandsfraktion angegebenen Verfahrensweisen verarbeitet werden. Wenn das Wasser-mischbare Lösungsmittel Störungen der Handlungen bzw. Verfahrensschritte zum Gewinnen des Antibiotikums aus dem Myceliumsextrakt verursachen kann, kann das Wasser-mischbare Lösungsmittel durch Destillation entfernt werden oder kann mit Wasser auf eine nicht-störende Konzentration verdünnt werden.
Der Begriff "Wasser-mischbares Lösungsmittel", wie er in dieser Anmeldung verwendet wird, soll die Bedeutung besitzen, die ihm gegenwärtig auf dem Fachgebiet dieses Begriffs gegeben wird und bezieht sich auf Lösungsmittel, die unter den Bedingungen der Verwendung mit Wasser in einem einigermaßen breiten Konzentrationsbereich mischbar sind. Beispiele Wasser-mischbarer organischer Lösungsmittel, die bei der Extraktion der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können, sind: niedere Alkanole, z.B. (C₁-C₃)-Alkanole, wie z.B. Methanol, Ethanol und Propanol; Phenyl-(C₁-C₃)-alkanole, wie z.B. Benzylalkohol; niedere Ketone, z.B. (C₃-C₄)-Ketone, wie z.B. Aceton und Ethylmethylketon; cyclische Ether, wie z.B. Dioxan und Tetrahydrofuran; Glykole und ihre Produkte aus der partiellen Veresterung, wie z.B. Ethylenglykol, Propylenglykol und Ethylenglykolmonomethylether, niedere Amide, wie z.B. Dimethylformamid und Diethylformamid; Essigsäure, Dimethylsulfoxid und Acetonitril.
Die Gewinnung der Verbindung aus dem Überstand der Fermentationsbrühe des produzierenden Mikroorganismus wird gemäß per se bekannter Techniken durchgeführt, die Extraktion mit Lösungsmitteln, Präzipitation durch Zugabe von Nicht-Lösungsmitteln oder durch Ändern des pH-Wertes der Lösung, durch Verteilungschromatographie, Umkehrphasen-Verteilungschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Molekül-Ausschlusschromatographie und dergleichen, oder eine Kombination von zwei oder mehr dieser Techniken umfassen. Eine Ver fahrensweise zum Gewinnen der erfindungsgemäßen Verbindungen aus der filtrierten Fermentationsbrühe umfasst Extraktion des Antibiotikums 107891 mit Wasser-mischbaren organischen Lösungsmitteln, gefolgt von Präzipitation aus den konzentrierten Extrakten, möglicherweise durch Zugeben eines Präzipitationsmittels.
Auch in diesem Fall soll der Begriff "nicht-Wasser-mischbares Lösungsmittel", wie er in dieser Anmeldung verwendet wird, die Bedeutung besitzen, die diesem Begriff gegenwärtig auf dem Fachgebiet gegeben wird, und bezieht sich auf Lösungsmittel, die unter den Bedingungen der Verwendung mit Wasser in einem einigermaßen breiten Konzentrationsbereich, der für die beabsichtigte Verwendung geeignet ist, geringfügig mischbar oder praktisch unmischbar sind.
Beispiele für nicht-Wasser-mischbare organische Lösungsmittel, die bei der Extraktion der erfindungsgemäßen Verbindungen aus der Fermentationsbrühe verwendet werden können, sind: Alkanole mit wenigstens vier Kohlenstoffatomen, die linear, verzweigt oder cyclisch sein können, wie z.B. n-Butanol, 1-Pentanol, 2-Pentanol, 3-Pentanol, 1-Hexanol, 2-Hexanol, 3-Hexanol, 3,3-Dimethyl-1-butanol, 4-Methyl-1-pentanol, 3-Methyl-1-pentanol, 2,2-Dimethyl-3-pentanol, 2,4-Dimethyl-3-pentanol, 4,4-Dimethyl-2-pentanol, 5-Methyl-2-hexanol, 1-Heptanol, 2-Heptanol, 5-Methyl-1-hexanol, 2-Ethyl-1-hexanol, 2-Methyl-3-hexanol, 1-Octanol, 2-Octanol, Cyclopentanol, 2-Cyclopentylethanol, 3-Cyclopenthyl-1-propanol, Cyclohexanol, Cycloheptanol, Cyclooctanol, 2,3-Dimethylcyclohexanol, 4-Ethylcyclohexanol, Cyclooctylmethanol, 6-Methyl-5-hepten-2-ol, 1-Nonanol, 2-Nonanol, 1-Decanol und 3-Decanol; Ketone mit wenigstens fünf Kohlenstoffatomen, wie z.B. Methylisopropylketon, Methylisobutylketon, Methyl-n-amylketon, Methylisoamylketon, und Gemische davon.
Wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist, kann die Produktextraktion aus der filtrierten Fermentationsbrühe verbessert werden, indem der pH auf einen geeigneten Wert eingestellt wird und/oder durch Zugeben eines geeigneten organischen Salzes, das mit dem Antibiotikum ein Ionenpaar bildet, das in dem Extraktionslösungsmittel löslich ist.
Wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist, kann die Phasentrennung durch Salzung der restlichen Phase verbessert werden.
Wenn, anschließend an eine Extraktion, eine organische Phase gewonnen wird, die eine wesentliche Menge an Wasser enthält, kann es zweckmäßig sein, Wasser aus ihr azeotrop abzudestillieren. Im Allgemeinen erfordert dies die Zugabe eines Lösungsmittels, das zur Bildung minimal azeotroper Gemische mit Wasser fähig ist, gefolgt von der Zugabe eines Präzipitationsmittels zum Präzipitieren des gewünschten Produkts, sofern notwendig. Repräsentative Beispiele für organische Lösungsmittel, die zum Bilden minimal azeotroper Gemische mit Wasser fähig sind, sind: n-Butanol, Benzol, Toluol, Butylether, Kohlenstofftetrachlorid, Chloroform, Cyclohexan, 2,5-Dimethylfuran, Hexan und m-Xylol; das bevorzugte Lösungsmittel ist n-Butanol.
Beispiele für Präzipitationsmittel sind Petrolether, Niederalkylether, wie z.B. Ethylether, Propylether und Butylether, und Niederalkylketone, wie z.B. Aceton.
Gemäß einer bevorzugten Verfahrensweise zur Gewinnung des Antibiotikums 107891 kann die filtrierte Fermentationsbrühe mit einer Absorptionsmatrix in Kontakt gebracht werden, gefolgt von der Elution mit einem polaren, Wasser-mischbaren Lösungsmittel oder einem Gemisch davon, Konzentration bis zu einem öligen Rückstand unter reduziertem Druck und Präzipitation mit einem Präzipitationsmittel des bereits obenstehend erwähnten Typs.
Beispiele für Adsorptionsmatrizes, die zweckdienlicherweise bei der Gewinnung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können, sind Polystyrol- oder gemischte Polystyrol-Divenylbenzolharze (z.B. M112 oder 5112, Dow Chemical Co.; Amerlite^® XAD2 oder XAD4, Rohm & Haas, Diaion HP 20, Mitsubishi), Acrylharze (z.B. XAD7 oder XAD8, Rohm & Haas), Polyamide, wie z.B. Polycaprolactame, Nylons und vernetzte Polyvinylpyrrolidone (z.B. Polyamid-CC 6, Polyamid-SC 6, Polyamid-CC 6.6, Polyamid-CC 6AC und Polyamid-SC 6AC, Macherey-Nagel & Co., Deutschland; PA 400, M. Woelm AG, Deutschland); und das Polyvinylpyrrolidonharz PVP-CL (Aldrich Chemie & Co., KG, Deutschland) und Poren-kontrollierte, vernetzte Dextrane (z.B. Sephadex^® LH-20, Pharmacia, Fine Chemicals, AB). Bevorzugt werden Polystyrolharze eingesetzt, insbesondere ist das Diaion HP 20-Harz bevorzugt.
Im Falle von Polystyrolharzen, Polystyrol-Divenylbenzolharzen, Polyamidharzen oder Acrylharzen ist ein bevorzugter Eluent ein Wasser-mischbares Lösungsmittel oder seine wässrigen Gemische. Die wässrigen Gemische können Puffer bei einem geeigneten pH-Wert enthalten.
Auch in diesem Fall soll der Begriff "Wasser-mischbares Lösungsmittel", wie er in dieser Beschreibung und den Ansprüchen verwendet wird, die Bedeutung haben, die diesem Begriff auf dem Fachgebiet gegenwärtig beigemessen wird, wie es obenstehend beschrieben ist.
Die schrittweisen bzw. aufeinanderfolgenden Verfahrensweisen zur Isolation und Reinigung des Antibiotikums können an den vereinigten bzw. gepoolten Extrakten aus dem Brühenüberstand und aus dem Mycelium durchgeführt werden. Wenn z.B. der in der filtrierten Fermentationsbrühe oder dem Überstand enthaltene Anteil des antibiotischen Produkts durch Absorption an einem Absorptionsharz gewonnen wird und der im Mycelium enthaltende Anteil des antibiotischen Produkts daraus mit einem Wasser-mischbaren Lösungsmittel extrahiert wird, gefolgt von der Absorption an ein Absorptionsharz, können die aus jedem der zwei Sätze von Absorptionsharzen eluierten Fraktionen kombiniert bzw. vereinigt werden, gegebenenfalls nach Konzentration, und können dann als eine einheitliche Ernte weiter bearbeitet werden. Wenn alternativ die zwei Sätze von Absorptionsharzen, die für die getrennten Extraktionsstufen verwendet wurden, vom gleichen Typ sind und die gleichen funktionellen Merkmale besitzen, können sie vereinigt werden, und das Gemisch kann einer einheitlichen Elutionsstufe bzw. ei nem einheitlichen Elutionsschritt, z.B. mit einem Wasser-mischbaren Lösungsmittel oder einem Gemisch davon mit Wasser, unterworfen werden.
Jedenfalls wird, ungeachtet der zur Gewinnung des rohen Antibiotikums 107981 gewählten Verfahrensweise, die nachfolgende Reinigungsstufe normalerweise am Gemisch der Rohmaterialien durchgeführt, das aus der Kombination der aus den getrennten Extraktionsstufen hervorgehenden Produkte resultiert.
Die Reinigung des rohen Antibiotikums 107891 kann mittels jeder der per se bekannten Techniken bewerkstelligt werden, wird aber bevorzugt mittels chromatographischer Verfahrensweisen durchgeführt. Beispiele dieser chromatographischen Verfahrensweisen sind jene, die in Bezug auf die Gewinnungsstufe angegeben sind und umfassen auch Chromatographie an stationären Phasen, wie z.B. Kieselgel, Alumina, aktiviertes Magnesiumsulfat und dergleichen, oder Umkehrphasenchromatographie an silanisiertem Kieselgel mit verschiedenen funktionellen Derivatisierungen, und Elution mit Wasser-mischbaren Lösungsmitteln oder einem wässrigem Gemisch Wasser-mischbarer Lösungsmittel der obenstehend erwähnten Art.
Beispielsweise kann präparative HPLC-Chromatographie eingesetzt werden, wobei RP-8 oder RP-18 als stationäre Phase und ein Gemisch aus HCOONH₄-Puffer:CH₃CN als Elutionssystem verwendet werden.
Die aus der Reinigungsstufe erhaltenen aktiven Fraktionen werden vereinigt, unter Vakuum konzentriert, durch Zugabe eines Präzipitationsmittels der obenstehend erwähnten Art präzipitiert und getrocknet oder lyophilisiert in einem oder schrittweisen Durchgängen. In dem Fall, dass das Produkt Restmengen an Ammoniumformiat oder anderen puffernden Salzen enthält, können diese durch Absorption des Antibiotikums 107891 an einer Festphasen-Extraktionssäule, z.B. einer Umkehrphasen-Harzsäule, wie z.B. SPE Superclean LCP18 Supelco (Bellefonte PA, USA), gefolgt von Waschen mit destilliertem Wasser unter Elution mit einem geeigneten wässrigen Lösungsmittelgemisch, z.B. Methanol:Wasser, entfernt werden. Das Antibiotikum wird dann durch Entfernen der Elutionslösungsmittel gewonnen.
Demgemäß wird eine gereinigte getrocknete Antibiotika 107891-Komplex-Zubereitung als ein weißes Pulver erhalten.
Wie es auf diesem Fachgebiet üblich ist, können sowohl die Produktion als auch die Gewinnungs- und Reinigungsstufen durch eine Vielzahl an analytischen Verfahrensweisen, einschließlich Hemmtest gegen empfindliche Mikroorganismen und analytische Kontrolle unter Verwendung der HPLC oder Massenspektrometrie-gekuppelten HPLC überwacht werden.
Eine bevorzugte analytische HPLC-Technik wird auf einem Waters-Instrument (Waters Chromathography, Milford, MA), ausgestattet mit einer Säule vom Typ Waters Simmetryshield RP8, 5 μ (250 × 4,6 mm) durchgeführt, wobei bei einer Flussrate von 1 ml/min und bei einer Temperatur von 50°C eluiert wird.
Die Elution wurde mit einem mehrstufigen Programm (multistep programm) durchgeführt: Zeit=0 (30% Phase B); Zeit=28 min (30% Phase B); Zeit=28 min (40% der Phase B). Phase A war Acetonitril: 100 mM Ammoniumformiat-Puffer (pH 5,0) 5:95 (V/V), und Phase B war Acetonitril. Der UV-Detektor war auf 282 nm eingestellt.
Der Effluent aus der Säule wurde im Verhältnis 5:95 aufgeteilt, und die Hauptmenge (ca. 950 μl/min) wurde zum Photodioden-Array-Detektor geführt. Die restlichen 50 μl/min wurden zur ESI-Schnittstelle eines Ionenfalle-Massenspektometers vom Typ Finnigan LCQ (Thermoquest, Finnigan MAT, San Jose, CA) geführt.
Die massenspektrometrische Untersuchung wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
Probeneintrittsbedingungen:
Hüllgas (N₂) 60 psi;
Hilfsgas (N₂) 5 psi;
Kapillarenerhitzer bzw. Säulenofen 250°C;
Spannungseinstellungen für den Probeneintritt:
Polarität sowohl positiv als auch negativ;
Ionensprühspannung +/– 5 kV
Kapillarenspannung +/– 19 V;
Abtastungsbedingungen: Maximale Ionenzeit bzw. Ionisierungszeit ("ion time") 200 ms;
Ionenzeit 5 ms;
Vollständige Mikroabtastung ("full micro scan") 3;
Segment: Dauer 30 min, Abtastungsereignisse positiv (150-2000 m/z) und negativ (150-2000 m/z).
Unter diesen analytischen HPLC-Bedingungen zeigten die Antibiotikum 107891-Faktoren A1 bzw. A2 Retentionszeiten von 13,2 min bzw. 13,9 min. Im gleichen HPLC-System eluierte Ramoplanin-A2-Faktor (L. Gastaldo, R. Ciabatti, F. Assi, E. Restelli, J.K. Kettenring, L.F. Zerilli, G. Romanò, M. Denaro und B. Cavalleri, (1992): "Isolation, structure determination and biological activity of A-16686 Factors A'1, A'2 and A'3 glycolipodepsipeptide antibiotics", J. Ind. Microbiol. 11: 13-18) mit einer Retentionszeit von 7,5 min.
Die Antibiotikum 107891-Faktoren A1 und A2 können aus einer gereinigten Probe des Antibiotikum 107891-Komplexes mittels präparativer HPLC abgetrennt werden.
Faktor A1 wurde aus dem in DMSO:Ameisensäure 95:5 (V/V) gelösten, gereinigten Antibiotikums 107891-Komplex an einer Säule vom Typ Symmetry Prep. C18 getrennt und aufgereinigt, wobei eine 25-minütige lineare Gradientenelution von 30% bis 45% Phase B bei einer Flussrate von 3,5 ml verwendet wurde.
Phase B war Acetonitril. Phase A war 25 mM Ammoniumformiat-Puffer H 4,5:Acetonitril 95:5 (V/V). Die reinen Antibiotikum 107891-Faktor A1-enthaltenden, eluierten Fraktionen wurden vereinigt und unter Vakuum konzentriert. Die zurückbleibende Lösung wurde lyophilisiert, was reinen Faktor A1 als ein weißes Pulver ergab.
Faktor A2 wurde durch isokratische Elution an einer Säule vom Typ Symmetry Prep. C18 aus einer Probe gereinigten Antibiotikum 107891-Komplex, gelöst in einem Gemisch aus Essigsäure:Acetonitri1:100 mM Ammoniumformiat-Puffer (pH 4) im Verhältnis 50:120:80 (V/V) abgetrennt und gereinigt. Die isokratische Elution wurde bei einer Flussrate von 7 ml mit einem Gemisch aus 100 mM Anunoniumformiat-Puffer pH 4:Acetonitril im Verhältnis 82,5:17,5 (V/V) durchgeführt. Die reinen Antibiotikum 107891-Faktor A2-enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und unter Vakuum konzentriert. Die zurückbleibende Lösung wurde lyophilisiert, was reinen Faktor A2 als ein weißes Pulver ergab.
Da das Antibiotikum 107891 und seine Faktoren A1 und A2 eine basische Funktion enthalten, wie durch Säure/Base-Titration in 2-Methoxyethanol (MCS):H₂O 12:3 (V/V) gezeigt wurde, sind sie zur Bildung von Salzen mit geeigneten Säuren gemäß herkömmlicher Verfahrensweisen fähig und können auch in der freien Basenform vorliegen.
Wenn sie in der freien Basenform erhalten werden, können das Antibiotikum 107891 und seine Faktoren A1 und A2 mit Säuren in die entsprechenden Salze umgewandelt werden, die nicht-toxische, pharmazeutisch annehmbare Salze umfassen. Geeignete Salze umfassen jene Salze, die gebildet werden durch Standardumsetzung mit sowohl organischen als auch anorganischen Säuren, wie z.B. Salz-, Bromwasserstoff-, Schwefel-, Phosphor-, Essig-, Trifluoressig-, Trichloressig-, Bernstein-, Zitronen-, Ascorbin-, Milch-, Malein-, Fumar-, Palmitin-, Chol-, Pamin-, Schleim-, Glutamin-, Camphor-, Glutar-, Glykol-, Phthal-, Wein-, Laurin-, Stearin-, Salicyl-, Methansulfon-, Benzolsulfon-, Sorbin-, Picrin-, Benzoe-, Zimtsäure und dergleichen Säuren. Die Additionssalze von Antibiotikum 107891 und seiner Faktoren A1 und A2 mit Säuren können gemäß den allgemein verwendeten üblichen Verfahrensweisen hergestellt werden. Beispielsweise wird Antibiotikum 107891 oder sein Faktor A1 oder sein Faktor A2, in der freien Basenform, in der minimalen Menge eines geeigneten Lösungsmittels, typischerweise ein Niederalkanol oder ein Niederalkanol/Wasser-Gemisch, gelöst, die stöchiometrische Menge einer geeigneten ausgewählten Säure wird stufenweise zu der erhaltenen Lösung zugegeben, und das erhaltene Salz wird durch die Zugabe eines Nicht-Lösungsmittels präzipitiert. Das Additionssalz, das sich bildet, wird dann durch Filtration oder Verdampfung der Lösungsmittel gewonnen.
Alternativ können diese Salze in einer im Wesentlichen wasserfreien Form durch Lyophilisation hergestellt werden; in diesem Fall wird ein Salz von Antibiotikum 107891 oder sein Faktor A1 oder sein Faktor A2 mit einer flüchtigen Säure in einer geeigneten Menge einer nicht-flüchtigen Säure gelöst. Die Lösung wird dann durch Filtration von unlöslichen Bestandteilen befreit und in einem einzelnen oder sich wiederholenden Durchgängen lyophilisiert.
Ein spezielles Additionssalz kann auch aus einer Lösung einer anderen Salzform des Antibiotikums 107891 oder seines Faktors A1 oder seines Faktors A2 erhalten werden, wenn das gewünschte Salz bei Zugabe des geeigneten Anions präzipitiert.
Die Umwandlung der erfindungsgemäßen Nicht-Salz-Verbindung in die entsprechenden Additionssalze und umgekehrt, d.h., Umwandlung eines Additionssalzes einer erfindungsgemäßen Verbindung in die Nicht-Salz-Form liegen innerhalb der technischen Fähigkeiten des Durchschnittsfachmanns und sind von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die Bildung von Salzen aus dem Antibiotikum 107891 und seinen Faktoren A1 und A2 kann mehreren Zwecken dienen, einschließlich der Trennung, Reinigung des Antibiotikums 107891 und seiner Faktoren A1 und A2 und ihrer Verwendung als therapeutische Wirkstoffe oder Tierwachstums-Promotoren. Für therapeutische Zwecke werden normalerweise die pharmazeutisch annehmbaren Salze eingesetzt.
Der Begriff "pharmazeutisch annehmbare Salze" bezeichnet jene nicht-toxischen Salze, die in der Therapie von warmblütigen Tieren verwendet werden können.
Der Antibiotikum 107891-Komplex, seine Faktoren A1 und A2 und ein Gemisch dieser Faktoren in jedem beliebigen Verhältnis kann/können als solches/solcher oder in Gemischen mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern verabreicht werden und können auch in Verbindung bzw. in Kombination mit anderen antimikrobiellen Wirkstoffen, wie z.B. Penicillinen, Cephalosporinen, Aminoglykosiden und Glykopeptiden, verabreicht werden.
Verbindende bzw. konjunktive Therapie ("conjunctive therapy") umfasst somit sequenzielle, gleichzeitige und getrennte Verabreichung der aktiven bzw. wirksamen Verbindung in einer Weise, dass die therapeutischen Wirkungen der ersten verabreichten Verbindung nicht vollständig verschwunden sind, wenn die nachfolgende verabreicht wird.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen oder ihre pharmazeutisch verträglichen Additionssalze können in Formen formuliert werden, die für parenterale, orale oder topische Verabreichung geeignet sind. Für eine i.v.-Verabreichung in der Behandlung einer beliebigen Infektion, an der ein Mikroorganismus beteiligt ist, der gegenüber dem Antibiotikum empfindlich ist, ist eine parenterale Formulierung, beispielsweise in Wasser, mit einem geeigneten Solubilisierungsmittel, wie z.B. Propylenglykol oder Dimethylacetamid, und einem oberflächenaktiven Agens, z.B. Polyoxyethylensorbitanmonooleat oder polyoxyethyliertes Rizinusöl) oder Cyclodextrinen oder Phospholipid-basierte Formulierungen in sterilem Wasser für Injektionszwecke. Eine injizierbare Formulierung kann auch mit einem geeigneten Cyclodextrin erhalten werden.
Der Antibiotikum 107891-Komplex, seine Faktoren A1 und A2 und ein Gemisch der genannten Faktoren in einem beliebigen Verhältnis kann/können auch in einer geeigneten pharmazeutischen Form, wie z.B. einer Kapsel, einer Tablette oder einer wässrigen Lösung, für die orale Verabreichung oder in herkömmlichen Cremes oder Gelees für topische Anwendungen verwendet werden. Neben ihrer Verwendung als Medikamente in der Humantherapie und tiermedizinischen Therapie können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch als Tierwachstums-Promotoren verwendet werden. Zu diesem Zweck wird eine erfindungsgemäße Verbindung oral in einem geeigneten Futter verabreicht. Die eingesetzte genaue Konzentration ist die, die erforderlich ist, um den Wirkstoff in einer wachstumsfördernd wirksamen Menge bereitzustellen, wenn normale Mengen des Futters aufgenommen werden.
Die Zugabe der erfindungsgemäßen aktiven Verbindung zu Tierfutter wird bevorzugt durch Herstellen einer geeigneten Futtervormischung ("feed premix"), die die aktive Verbindung in einer wirksamen Menge enthält, und Einarbeiten der Vormischung in die komplette Ration bewerkstelligt. Alternativ kann ein intermediäres Konzentrat oder ein intermediärer Futterzusatzstoff das/der den aktiven Inhaltsstoff enthält, in das Futter eingemischt werden. Die Weise, auf die derartige Futtervormischungen und komplette Rationen hergestellt und verabreicht werden können, sind in Referenzbüchern (wie z.B. "Applied Animal Nutrition", W.H.
Freedman and CO., S. Francisco, USA, 1969, oder "Livestock Feeds and Feeding"-O- and B-Büchern, Corvallis, Ore., USA, 1977) beschrieben.
PHYSIKO-CHEMISCHE MERKMALE DES ANTIBIOTIKUMS 107891

A) Massenspektrometrie: In MS-Experimenten an einem Thermofinnigan LCQ-deca-Gerät, ausgestattet mit einer Elektrospray-Quelle, unter Verwendung einer Thermofinnigan-Kalibrierungsmischung, ergibt das Antibiotikum 107891 zwei doppelt protonierte Ionen mit m/z 1124 und mit m/z 1116, was der niedrigsten Isotopenzusammensetzung der Komplex-Faktoren A1 bzw. A2 entspricht. Die Elektrospraybedingungen waren: Sprühspannung: 4,7 kV; Kapillarentemperatur: 220°C; Kapillarenspannung: 3 V; Infusionsmodus 10 μl/min. Die Spektren wurden mit einer 0,2 mg/ml-Lösung in Methanol/Wasser 80/20 (V/V) mit 0,1 % Trifluoressigsäure aufgezeichnet und sind in 1A (Spektrum mit vollständiger Abtastung und geringer Auflösung) und 1B (Spektrum mit Zoom-Abtastung und hoher Auflösung) dargestellt.
B) Das Infrarotspektrum von Antibiotikum 107891, aufgenommen in KBr mit einem Bruker FT-IR-Spektralphotometer, Modell IFS 48, weist Absorptionsmaxima bei (cm^–1): 3263, 2929, 1661, 1533, 1402, 1114, 1026 auf. Das Infrarotspektrum ist in 2 angegeben. Absorptionsbanden bei 1631, 1596 und 1346 werden Restmengen an Ammoniumformiat zugeschrieben.
C) Das UV-Spektrum von Antibiotikum 107891, aufgenommen in Methanol/H₂O (im Verhältnis 80:20) mit einem Perkin-Elmer-Spektralphotometer Lambda 16, weist zwei Schultern bei 226 und 267 nm auf. Das UV-Spektrum ist in 3 angegeben.
D) Das ¹H-NMR-Spektrum wurde in dem Gemisch Methanol-d₄:H₂O (pH 4,3 HCl) 40:10 (V/V) bei 40°C an einem Bruker AMX 600-Spektrometer, das eine Wassersuppressionssequenz anwendet, aufgenommen. Als innerer Standard das Restsignal von Methanol-d₄ bei 3,31 ppm berücksichtigt. Das ¹H-NMR-Spektrum von Antibiotikum 107891 ist in 4 angegeben. Das ¹H-NMR-Spektrum von Antibiotikum 107891, gelöst in Methanol-d₄:H₂O (0,01N HCl) 40:10 (V/V), weist die folgenden Signalgruppen (in ppm) bei 600 MHz unter Verwendung von Me-OH-d₄ als innerem Standard (3,31 ppm) auf, [δ=ppm, Multiplizität; (Zuordnung)]: 0,93 d (CH₃), 0.98 d (CH₃), 1.07 t (überlappende CH₃s), 1.18 t (überlappende CH₃s), 1.26 d (CH₃), 1.30 t (überlappende CH₃s), 1.62-1.74 m (CH₂), 1.78 d (CH₃), 1.80 d (CH₃), 2.03 m (CH₂), 2.24 m (CH), 2.36 m (CH₂), 2.72-3.8 m (peptidische α-CHs), 3.8-5.2 m (peptidische α-CHs), 5.53-6.08 s (CH₂), 5.62 d (CH, Doppelbindung), 6.42 m (CH), 6.92 d (CH, Doppelbindung), 7.0-7.55 m (aromatische CHs), 7.62-10.4 d und m (aromatische und peptidische NHs);
E) Das ¹³C-NMR-Spektrum wurde in dem Gemisch Methanol-d₄:H₂O (pH 4,3 HCl) 40:10 (V/V) bei 40°C an einem Bruker AMX 600-Spektrometer aufgenommen, wobei das Restsignal von Methanol-d₄ bei 49,15 ppm als innerer Standard verwendet wurde. Das bb-entkoppelte ¹³C-NMR-Spektrum von Antibiotikum 107891 ist in 5 dargestellt. Das ¹³C-NMR-Spektrum von Antibiotikum 107891, gelöst in Methanol-d₄:H₂O (0,01N HCl) 40:10 (V/V) weist die folgenden Signalgruppen (in ppm) bei 600 MHz auf, wobei MeOH-d₄ als innerer Standard (49,5 ppm) verwendet wird, [δ=ppm; (Zuordnung)]: 13.6-23.2 (aliphatische CH₃s), 26.16-73 (aliphatische CH₂s und peptidische α-CHs), 105-136 (aromatische und Doppelbindungs-CHs und quarternäre Kohlenstoffatome), 164.3-176.3 (peptidische Carbonyle);
F) Antibiotikum 107891-Komplex wurde in 2-Methoxyethanol (MCS):H₂O 12:3 (V/V), enthaltend einen molaren Überschuss an 0,01 M Salzsäure, gelöst. Die Lösung wurde mit einer Lösung von 0,01 N Kaliumhydroxid rücktitriert. Die resultierende Titrationskurve zeigte eine basische ionisierbare Funktion.

AMINOSÄUREZUSAMMENSETZUNG VON ANTIBIOTIKUM 107891 UND SEINEN FAKTOREN A1 UND A2
A) Bestimmung von "Säure-beständigen" Aminosäuren im Antibiotikum 107891-Komplex
Das Antibiotikum 107891 wurde einer vollständigen sauren Hydrolyse (HCl 6N, 105°C, 24 h) unterworfen, und die Aminosäure-Komponenten des Antibiotikums, die gegenüber der Säurebehandlung beständig waren, wurden identifiziert. Säure-labile Aminosäuren waren mit diesem Ansatz nicht detektierbar. Das Hydrolysat wurde nach geeigneter Derivatisierung mittels HPLC-MS- und GC-MS-Untersuchung im Vergleich zu einem Gemisch aus Standard-Aminosäuren, die gleichermaßen derivatisiert waren, untersucht. Für die HPLC-Analyse wurde die hydrolysierte Probe mit 6-Aminochinolinyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat (AccQ-Tag^TM-Fluor-Reagens-Kit) behandelt, für die GC-Analyse mit einem Gemisch aus 3N HCl in wasserfreiem Methanol und Trifluoressigsäure.
Die qualitative HPLC-Analyse wurde an einem Flüssigkeitschromatographiesystem mit gleichzeitiger DAD- und MS-Detektion durchgeführt. Das HPLC-Verfahren hatte die folgenden Bedingungen:
Säule: ACCQ-Tag^TM (Waters C18 NovoPak 4 μm 3,9 × 150 mm)
Säulentemperatur: 37°C
Fluss: 1 ml/min
Phase A: 140 mM Ammoniumacetat pH 5 (Essigsäure)
Phase B: Wasser:Acetonitril 60:40 (V/V)
Elutionsprogramm

UV-Detektion: 254 nm

Die MS-Bedingungen waren wie folgt:
Spektrometer: Finnigan LCQ-deca, ausgestattet mit einer Standard-Elektrospray-Quelle.
Kapillarentemperatur: 250°C
Quellenspannung: 4,70 kV
Quellenstrom: 80 μA
Kapillarenspannung: –15V
Die qualitative GC-Analyse wurde an einem Gaschromatographen, der mit MS-EI-Detektion ausgestattet war, durchgeführt.
Das GC-Verfahren hatte die folgenden Bedingungen:
Säule: J & W Scientific DB-5, 30 m × 0,254 mm ID × 0,25 μm FT
Trägergas: Helium
Injektionsmodus: Splitless bzw. ohne Aufteilung
Injektortemperatur: 200°C
Temperatur der Transferleitung: 300°C
Temperaturprogramm: von 50°C bis 100°C mit 2,5°C/min (10 min), von 100°C bis 250°C mit 10°C/min (15 min), 15 min mit 250°C
Injektionsvolumen: 1 μl
Die MS-Bedingungen waren wie folgt:
Spektrometer: Finnigan TSQ 700
Ionisationsmodus: Elektronenimpakt
Spannungseinstellung:
Filamentstrom: 400 mA
Elektronenvervielfacher: 1400 V
Elektronenenergie: 70 eV
Positiver Ionenmodus
Abtastungsbedingung:
Abtastungsbereich: 40-650 amu
Abtastungszeit: 1 s
In den LC/MS- und GC/MS-Chromatogrammen, die anhand des Hydrolysats von Antibiotikum 107891 erhalten wurden, wurden die folgenden Aminosäuren zusammen mit anderen nicht-identifizierten Peaks identifiziert: Lanthionin, Methyllanthionin, Glycin, Prolin, Valin, Asparaginsäure (NMR-Studien deuten darauf hin, dass dies ein Umwandlungsprodukt von Asparagin ist, welches durch Hydrolyse Asparaginsäure erzeugt), Phenylalanin und Leucin.
Die Antibiotikum 107891-Faktoren A1 und A2 wurden unter den gleichen Bedingungen (Derivatisierung und HPLC-MS), die für den Komplex angegeben wurden, einer vollständigen sauren Hydrolyse unterworfen. Die GC-MS-Analyse wurde an einem Thermo Finnigan Trace-GC-MS-Gerät, ausgestattet mit einem PTV-Injektor, durchgeführt.
Das GC-Verfahren hatte die folgenden Bedingungen:
Säule: Restek RTX-SMS, 15 m × 0,25 mm ID × 0,25 μm FT
Trägergas: Helium
Schnittstellentemperatur: 250°C
Temperaturprogramm: 1,5 min bei 50°C, von 50°C bis 100°C mit 20°C/min, 1 min bei 100°C, von 100°C bis 135°C mit 20°C/min, 1 min bei 135°C, von 135°C bis 250° mit 20°C/min, 1 min bei 250°C.
Injektionsvolumen: 1 μl
Injektor: Aufteilungsfreier Modus bzw. Splitless-Modus, Grundtemperatur 50°C, Transfertemperatur 280°C, Transferrate 14,5°C/min
Die MS-Bedingungen waren die folgenden:
Ionisationsmodus: Elektronenimpakt
Spannungseinstellungen:
Filamentstrom: 149 μA
Elektronenvervielfacher: 200 V
Elektronenenergie: 70 eV
Positiver Ionenmodus:
Abtastungsbedingung:
Abtastungsbereich: 33-500 amu
Abtastungszeit: 0,6 s
Beim Hydrolysat von Faktor A1 von Antibiotikum 107891 zeigten HPLC-MS- und GC-MS-Chromatogramme das Vorliegen der folgenden Amionsäuren zusammen mit anderen nicht-identifizierten Peaks: Lanthionin, Methyllanthionin, Glycin, Prolin, Valin, Asparaginsäure (NMR-Studien deuten darauf hin, dass dies ein Umwandlungsprodukt von Asparagin ist, welches durch Hydrolyse Asparaginsäure erzeugt), Phenylalanin und Leucin.
Die an Faktor A2 durchgeführte, obenstehende Verfahrensweise ergab das Vorliegen der folgenden Aminosäuren, zusammen mit anderen nicht-identifizierten Peaks: Lanthionin, Methyllanthionin, Glycin, Prolin, Valin, Asparaginsäure (NMR-Studien deuten darauf hin, dass dies ein Umwandlungsprodukt von Asparagin ist, welches durch Hydrolyse Asparaginsäure erzeugt), Phenylalanin und Leucin.
B) Bestimmung von 5-Chlortryptophan in Antibiotikum 107891-Komplex und in seinem Faktor A1 und seinem Faktor A2.
Vollständige Hydrolyse von gereinigtem 107891-Komplex und seinen einzelnen Faktoren A1 und A2 wurde gemäß dem Verfahren, das von Simpson RJ, Neuberger MR, Liu TY, "Complete Aminoacid Analysis of Proteins from al Single Hydrolysate", Journal Biol. Chem. (Vereinigte Staaten), 10. April 1976, 251 (7), 1936-40), beschrieben wurde, durchgeführt.
Diese Hydrolyseverfahrensweise beugt dem Abbau bzw. der Degradation von Aminosäuren, die normalerweise während Mineralsäuredigestion bzw. -aufschluss instabil sind, vor und ermöglicht folglich die Bestimmung dieser Aminosäuren, einschließlich Tryptophan, aus einem Hydrolysat eines Peptids. Eine Standardprobe 5-Chlor-DL-tryptophan wurde von Biosynt AG, Staad, Schweiz, erworben, und seine Struktur wurde durch NMR-Untersuchung bestätigt. DL-Tryptophan wurde von Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland, erworben.
Faktor A1 (1,5 mg) wurde in 0,6 ml 4N Methansulfonsäure, enthaltend 0,2% (G/V) 3-(2-Aminoethyl)indol als Katalysator für die Hydrolyse, suspendiert. Die Hydrolyse wurde bei 115°C 16 Stunden lang durchgeführt. Das Hydrolysat wurde dann mit 5N NaOH neutralisiert und mit einer gleichen Menge an destilliertem Wasser verdünnt. 100 μl dieser Lösung wurden durch LC-MS analysiert. Die Trennung wurde an einer Säule vom Typ Symmetry C₁₈ (5 μm) 4,6 × 250 mm (Waters Co. Milford MA, USA), ausgestattet mit einer Vorsäule vom Typ Symmetry C₁₈ (5 μm), 3,9 × 20 mm, durchgeführt. Die Elution wurde bei einer Flussrate von 1 ml/min mit einem 25-minütigen linearen Gradienten von 0% nach 50% Phase B durchgeführt. Phase A war 25 mM HCOONH₄-Puffer, pH 4,5:CH₃CN 95:5 (V/V), und Phase B war CH₃CN. Die UV-Detektion erfolgte bei 280 nm. Die HPLC-Ausrüstung war mit einem Finnigan LCQ-Ionenfalle-Massenspektrometer (Thermoquest, Finnigan MAT, San Jose, CA, USA) gekoppelt. 50 μl/min der Effluenten aus der Säule wurden zu der Elektrospray-Ionisations- (ESI)-Schnittstelle des LCQ-Massenspektrometers geführt. Die MS-Untersuchung wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Probeneintritt: Hüllgas (N₂) 60 psi; Kapillarenerhitzer 210°C; Spannungspolarität am Probeneintritt: sowohl positiv als auch negativ; Ionensprayspannung +/– 4,5 KV; Kapillarenspannung +/– 21 V; Abtastungsbedingungen: maximale Ionisierungszeit ("maximum ion time") 50 ms; full micro: Scan bzw. Abtastung 3.
Standards von Tryptophan und 5-Chlortryptophan eluierten mit Retentionszeiten von 8,1 Minuten und 11,5 Minuten, entsprechend einem M+H⁺ bei m/z 205 bzw. 239. Im Hydrolysat von Antibiotikum 107891-Faktor A1 zeigte das Vorliegen eines Peaks bei 11,5 Minuten mit m/z von 238,97 das Vorliegen von 5-Chlortryptophan an.
Standard-Tryptophan war mit dem verwendeten chromatographischen System bei einer Detektionsgrenze von 0,3 μg/ml detektierbar. Dieser Wert ist niedriger als der Wert, der das Vorliegen der besagten Aminosäure in der untersuchten Antibiotikumprobe anzeigen würde. Innerhalb der oben genannten Grenze wurde im Chromatogramm des Hydrolysats von Antibiotikum 107891-Faktor A1 kein Tryptophan detektiert. Identische Resultate wurden aus der LC-MS-Untersuchung eines Hydrolysats von Faktor A2 und eines Hydrolysats einer gereinigten Probe von Antibiotikum 107891-Komplex erhalten.
MASSENSPEKTROMETRIE VON ANTIBIOTIKUM 107891-FAKTOR A1 UND -FAKTOR A2
Antibiotikum 107891-Faktor A1 ergibt ein doppelt protoviertes Ion mit m/z=1124 und Faktor A2 mit m/z 1116, was der niedrigsten Isotopenzusammensetzung entspricht, in MS-Experimenten an einem Thermofinnigan LCQ-deca-Gerät, ausgestattet mit einer Elektrospray-Quelle unter Verwendung einer Thermofinnigan-Kalibrierungsmischung. Die Elektrospraybedingungen waren: Sprühspannung: 4,7 kV; Kapillarentemperatur: 250°C; Kapillarenspannung: 8 V; Infusionsmodus 10 μl/min. Die Spektren wurden mit einer 0,1 mg/ml-Lösung in Acetonitril:Wasser 50:50 (V/V) mit 0,5% Essigsäure aufgezeichnet und sind in 6A (Spektrum mit vollständiger Abtastung und geringer Auflösung) und 6B (Spektrum mit Zoom-Abtastung und hoher Auflösung) und in 7A (Spektrum mit vollständiger Abtastung und geringer Auflösung) und B (Spektrum mit Zoom-Abtastung und hoher Auflösung) dargestellt.
Die exakte Masse von Antibiotikum-Faktor A1 und -Faktor A2 ist unter Verwendung eines Bruker Daltonics APEX II, 4.7 Tesla-Spektrometers, das mit einer Elektrosprax-Quelle ausgestattet ist, bestimmt worden. Auf der Grundlage dieser Daten wird Faktor A1 ein Molekulargewicht von 2246,71 ± 0,06, wobei die berechnete monoisotopische Masse von [M+2H]²⁺ bei m/z 1124,36124 ist (Genauigkeit 30 ppm), bestimmt durch hochauflösende ESI-FTMS, zugewiesen. Faktor A2 wird ein Molekulargewicht von 2230,71 ± 0,06, wobei die berechnete monoisotopische Masse von [M+2H]²⁺ bei m/z 1116,36260 ist (Genauigkeit 30 ppm), bestimmt durch hochauflösende ESI-FTMS, zugewiesen.
VERGLEICH VON ANTIBIOTIKUM 107891-FAKTOR A1 UND -FAKTOR A2 MIT DEN ANTIBIOTIKA MF-BA-1768α₁ und MF-BA-1768β₁

A) Microbispora corallina NNRL 30420 (MF-BA-1768), beschrieben in der US 6 551 591 B1 , wurde von der NNRL-Sammlung erworben. In einem Erkundungsexperiment ist der Stamm M. corallina NNRL 30420 (MF-BA-1768) in Erlenmeyerkolben unter den in der US 6 551 591 B1 beschriebenen Bedingungen fermentiert worden. Die geerntete Brühe wurde durch Verdünnung mit Ethanol extrahiert. Nach Zentrifugation des Myceliums wurde der Überstand auf ein Polystyrol-Absorptionsharz vom Typ HP20 geladen, mit einem Methanol:Wasser-Gemisch im Verhältnis 70:30 eluiert, das auf ein kleines Volumen eingeengt wurde und dann lyophilisiert wurde. Im Chromatogramm zeigten zwei Peaks [M+2H]²⁺-Signale von 1091 und 1108, die dem [M+2H]²⁺, das in der US 6 551 581 B1 für MF-BA-1768β₁ bzw. MF-BA-1768α₁ angegeben wurde, entsprechen. Der obige Extrakt wurde dann mit Antibiotika 107891-Faktoren A1 und A2 versetzt bzw. gespickt ("spiked"), und das Gemisch wurde mittels LC-MS untersucht. Es wurde festgestellt, dass die Peaks der Antibiotika MF-BA-1768β₁ und MF-BA-1768α₁ und der Antibiotika 107891-Faktoren A1 und A2 verschiedene Retentionszeit und verschiedene [M+2H]²⁺-MS-Fragmente besitzen.
B) In einem weiteren Experiment wurde eine 30 l-Tank-Fermentation von Microbispora sp.-Stamm NRRL 30420 (MF-BA-1768) durchgeführt, und die geerntete Brühe wurde unter Befolgung der Beschreibung der US 6 551 591 B1 bearbeitet. Nach Reinigungsstufen, sequenziell an Polystyrol vom Typ HP20 und Polyamidharz vom Typ CC6, 0,1-0,3 mm, (Macherey-Nagel), wurden zwei einzelne Substanzen in reiner Form durch präparative HPLC an einer C18-Luna-Säule (250 × 12,2 mm) von Phenomenex (Torrance CA, USA), Partikelgröße μ 10, erhalten, die mit einer Flussrate von 27 ml/min mit dem folgenden Mehrstufenprogramm eluiert wurde: Zeit=O min (32% Phase B); Zeit=8 min (32% Phase B); Zeit=20 min (36% Phase B), Zeit=32 min (90% Phase B). Phase A war 0,05% (V/V) Ameisensäure in Wasser, Phase B war CH₃CN.

Diese Substanzen zeigten antibakterielle Aktivität gegen Staphylococci und Enterococci, wie es in Tabelle IV dargestellt ist. In LC-MS-Experimenten zeigten die zwei Substanzen [M+2H]⁺⁺-Signale doppelt protonierte Ionen, die den Antibiotika MF-BA-1768α₁ und MF-BA-1768β₁ entsprechen, wie es im US-Patent 6 551 591 B1 beschrieben wurde. Tabelle IV
Die Experimentalbedingungen der antimikrobiellen Tests waren die gleichen, wie jene, die für die Tests, die in der nachstehenden Tabelle VI angegeben sind, verwendet wurden.
Die LC-MS-Untersuchungen der isolierten Antibiotika MF-BA-1768α₁ und MF-BA-1768β₁ wurden an einer Säule vom Typ Symmmetry C₁₈ (5:m), 4,6 × 250 mm (Waters; Milford MA, USA), ausgestattet mit einer Vorsäule vom Typ Symmetry C₁₈ (5 :m), 3,9 × 20 min, (beide in einem Ofen bei einer Temperatur von 50°C gehalten), durchgeführt. Die Elution wurde bei einer Flussrate von 1 ml/min mit dem folgenden Mehrstufen-Elutionsprogramm durchgeführt: Zeit=O min (30% Phase B), Zeit=8 min (30% Phase B); Zeit=20 min (45% Phase B); Zeit=24 min (90% Phase B) und Zeit=28 min (90% Phase B). Phase A war 25 mM HCOONH₄-Puffer, pH 4,5:CH₃CN 95:5 (V/V) und Phase B war CH₃CN. Die HPLC-Ausrüstung war mit einem Finnigan LCQ-Ionenfalle-Massenspektrometer (Thermoquest, Finnigan MAT, San Jose, CA, USA) gekoppelt. 100 μl/min der Effluenten aus der Säule wurden zu der (ESI)-Schnittstelle des LCQ-Massenspektrometers geführt. Die MS-Untersuchung wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Probeneintritt: Hüllgasfluss (N₂) 25 psi; Hilfsgasfluss 5 psi; Kapillarenerhitzer: 210°C; Spannungspolarität am Probeneintritt: sowohl positiv als auch negativ; Ionensprühspannung +/– 4,5 KV; Kapillarenspannung +/– 12 V; Abtastungsbedingungen: maximale Ionisierungszeit 50 ms; full micro: Scan 3.
Die einzelnen Antibiotikum-Faktoren MF-BA-1768α₁ und MF-BA-1768β₁ und Antibiotika 107891-Faktoren A1 und A2 wurden einzeln und im Gemisch untersucht. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle V zusammengefasst. TABELLE V
Im gleichen Chromatographiesystem wurde Ramoplanin-Faktor A2 (L. Gastaldo, R. Ciabatti, F. Assi, E. Restelli, J.K. Kettenring, L.F. Zerilli, G. Romanò, M. Denaro und B. Cavalleri, (1992): " Isolation, structure determination and biological activity of A-16686 Factors A'1, A'2 and A'3 glycolipodepsipeptide antibiotics", J. Ind. Microbiol. 11: 13-18) mit einer Retentionszeit von 11,00 min eluiert.
NMR-SPEKTROSKOPIE VON ANTIBIOTIKUM 107891-FAKTOR A1 UND -FAKTOR A2
¹H-NMR-Spektrum von Antibiotikum 107891-Faktor A1 und -Faktor A2 wurden in dem Gemisch CD3CN:D20 (1:1) bei 298 K an einem Bruker AMX 600-Spektrometer, das eine Wassersuppressionssequenz anwendet, aufgezeichnet. Als innerer Standard wurde das Restsignal von Acetonitril-d₃ bei 1.94 ppm verwendet.

A) Das ¹H-NMR-Spektrum von Antibiotikum 107891-Faktor A1 ist in 8 dargestellt. Das ¹H-NMR-Spektrum von Antibiotikum 107891-Faktor A1, gelöst in CD₃CN:D₂O (1:1) weist die folgenden Signalgruppen (in ppm) bei 600 MHz auf, wobei CD₃CN als innerer Standard (1.94 ppm) verwendet wird, [δ=ppm, Multiplizität; (Zuordnung)]: 0.84 d (CH₃), 0.89 d (CH₃), 0.94 t (überlappende CH₃s), 1.1 d (CH₃), 1.13 d (CH₃), 1.15 t (überlappende CH₃s), 1.49 m (CH₂), 1.69 d (CH₃), 1.75 m (CH₂), 2.11 m (CH), 2.26 m (CH), 2.5 m (CH₂), 2.68-3.8 m (peptidische CH_βs), 3.8-5.0 m (peptidische CH_αs), 5.45-6.17 s (CH₂), 5.58 d (CH, Dop pelbindung), 6.36 m (CH), 6.86 d (CH, Doppelbindung), 7.0-7.45 m (aromatische CHs). Das Dimethylsulfoxid-Signal liegt bei 2.58 ppm vor, und das Formiat-Signal liegt auch bei 8.33 ppm vor, als Verunreinigungen.
B) Das bb-entkoppelte ¹H-NMR-Spektrum von Antibiotikum 107891-Faktor A2 ist in 9 dargestellt. Das ¹H-NMR-Spektrum von Antibiotikum 107891-Faktor A2, gelöst in CD₃CN:D₂O (1:1), weist die folgenden Signalgruppen (in ppm) bei 600 MHz unter Verwendung von CD₃CN als inneren Standard (1.94 ppm) auf, [δ=ppm, Multiplizität; (Zuordnung)]: 0.84 d (CH₃), 0.88 d (CH₃), 0.94 d (CH₃), 1.06 d (CH₃), 1.14 d (CH₃), 1.48 m (CH₂), 1.65-1.75 m (CH₂), 1.67 d (CH₃), 2.15 m (CH), 2.25 m (CH), 2.5 m (CH₂), 2.77-3.8 m (peptidische CH_βs), 3.8-4.9 m (peptidische CH_αs), 5.45-6.14 s (CH₂), 5.59 d (CH, Doppelbindung), 6.34 m (CH), 6.84 d (CH, Doppelbindung), 7.0-7.42 m (aromatische CHs). Das Dimethylsulfoxid-Signal liegt bei 2.58 ppm vor, und das Formiat-Signal liegt auch bei 8.32 ppm vor, als Verunreinigungen. Die ¹³C-NMR-Spektren von Antibiotikum 107891-Faktor A1 und -Faktor A2 wurden im Gemisch CD₃CN:D₂O (1:1) bei 298 K an einem Bruker AMX 600-Spektrometer aufgenommen, wobei das Restsignal von Acetonitril-d₃ bei 1.39 ppm als innerer Standard verwendet wurde.
C) Das ¹³C-NMR-Spektrum von Antibiotikum 107891-Faktor A1 ist in 10 gezeigt. Das ¹³C-NMR-Spektrum von Antibiotikum 107891-Faktor A1, gelöst in CD₃CN:D₂O (1:1), weist die folgenden Signalgruppen (in ppm) bei 600 MHz unter Verwendung von CD₃CN als innerem Standard (1.39 ppm) auf, [δ=ppm; (Zuordnung)]: 13.6-23.03 (aliphatische CH₃s), 25.69-77.9 (aliphatische CH₂s und peptidische CH_αs), 105-137.3 (aromatische und Doppelbindungs-CHs und quaternäre Kohlenstoffatome), 165.6-176.6 (peptidische Carbonyle).
D) Das bb-entkoppelte ¹³C-NMR-Spektrum von Antibiotikum 107891-Faktor A2 ist in 11 gezeigt.

Das ¹³C-NMR-Spektrum von Antibiotikum 107891-Faktor A2, gelöst in CD₃CN:D₂O (1:1), weist die folgenden Signalgruppen (in ppm) bei 600 MHz unter Verwendung von CD₃CN als innerem Standard (1.39 ppm) auf, [δ=ppm, Multiplizität; (Zuordnung)]: 13.6-22.9 (aliphatische CH₃s), 25.65-73 (aliphatische CH₂s und peptidische CH_αs), 105-137.3 (aromatische und Doppelbindungs-CHs und quaternäre Kohlenstoffatome), 165.7-176.1 (peptidische Carbonyle);
UV- UND IR-SPEKTREN VON ANTIBIOTIKUM 107891-FAKTOR A1 UND -FAKTOR A2

A) Das Infrarotspektrum von Antibiotikum 107891-Faktor A1, aufgenommen in KBr mit einem Bruker FT-IR-Spektralphotometer, Modell IFS 48, weist Absorptionsmaxima auf bei (cm^–1): 3294, 3059, 2926, 1661, 1529, 1433, 1407, 1287, 1114, 1021. Das Infrarotspektrum ist in 12 dargestellt.
B) Das UV-Spektrum von Antibiotikum 107891-Faktor A1, aufgenommen in Methanol:H₂O 80:20 (V/V) mit einem Perkin-Elmer-Spektralphotometer Lambda 16, weist zwei Schultern bei 226 und 267 nm auf. Das UV-Spektrum ist in 13 dargestellt.
C) Das Infrarotspektrum von Antibiotikum 107891-Faktor A2, aufgenommen in KBr mit einem Bruker FT-IR-Spektralphotometer, Modell IFS 48, weist Absorptionsmaxima auf bei (cm^–1): 3296, 3060, 2928, 1661, 1529, 1433, 1407, 1288, 1116. Das Infrarotspektrum ist in 14 dargestellt.
D) Das UV-Spektrum von Antibiotikum 107891-Faktor A2, aufgenommen in Methanol:H₂O 80:20 (V/V) mit einem Perkin-Elmer-Spektralphotometer Lambda 16, weist zwei Schultern bei 226 und 267 nm auf. Das UV-Spektrum ist in 15 dargestellt.

Auf der Grundlage der oben stehend berichteten physiko-chemischen Daten kann dem Antibiotikum 107891-Faktor A1, der zusammen mit den pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung darstellt, die folgende Strukturformel vorläufig zugeordnet werden:
Auf der Grundlage der oben stehend berichteten physiko-chemischen Daten kann dem Antibiotikum 107891-Faktor A2, der zusammen mit den pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung darstellt, die folgende Strukturformel vorläufig zugeordnet werden:
BIOLOGISCHE AKTIVITÄT VON ANTIBIOTIKUM 107891 IN VITRO
Die antimikrobielle Aktivität des Antibiotikums 107891 wurde durch das Bouillon-Mikroverdünnungs-Verfahren ("broth microdilution method") gemäß den National Committee for Clinical Laboratory Standards-Empfehlungen (NCCLS, Dokument M7-A5) bestimmt.
Die verwendeten Stämme waren klinische Isolate oder Stämme aus der American Type Culture Collection (ATCC). Das Ergebnis der Tests ist in Tabelle VI und Tabelle VII angegeben.
Antibiotikum 107891 wurde in DMSO gelöst, um eine 1000 μg/ml-Stammlösung zu erhalten, und wurde nachfolgend in Wasser verdünnt, um eine Arbeitslösung zu erhalten. Die verwendeten Medien waren Kationen-eingestellte Mueller-Hinton-Bouillon (CAMHB) für Staphylococci, M. catarrhalis, Enterococci und L. monocytogenes; Todd-Hewitt-Bouillon (THB) für Streptococci; GC-Medium + 1 % Isovitalex +1 % Haemin für Neisseria spp.; Hirn-Herz-Infusion +1 % C-Supplement für H. influenzae; Lactobacillus-Bouillon für Lactobacilli; Middlebrook 7H9 mit Middlebrook-OADC-Anreicherung für M. smegmatis; RPMI 1640-Medium für C. albicans. Wilkins-Chalgren-Bouillon + Oxyrase (1:25 V/V) für Clostridia; Brucella-Bouillon, enthaltend Cystein (0,5 g/l) für Propionibacteria. Inokula für Bakterien waren 10⁵ KbE/ml. Das C. albicans-Inokulum war 1 × 10⁴ KbE/ml. Alle Tests wurden in Gegenwart von 0,02% Rinderserumalbumin (BSA) durchgeführt. Die Kulturen wurden bei 35°C in Luft inkubiert, außer Clostridia- und Propionibacteria-Stämmen, die eine anaerobe Atmosphäre benötigten. Nach 18-24 Stunden wurden visuelle Ablesungen vorgenommen und MICs bestimmt. Die MIC war als die niedrigere Konzentration an Antibiotikum definiert, bei der es kein sichtbares Wachstum gab. TABELLE VI: Antimikrobielle Aktivität von Antibiotikum 107891
TABELLE VII: Antimikrobielle Aktivität von Antibiotikum 107891 gegen anaerobe Bakterien
Das Antibiotikum 107891 zeigt eine gute antibakterielle Aktivität gegen Gram-positive Bakterien.
Der MIC-Bereich gegen Staphylococcus spp., einschließlich Methicillin-resistenter (MRSA) und Glycopeptide-Intermediat (GISA)-resistenter Stämme, beträgt 0,13-5 μg/ml und beträgt 0,5-4 μg/ml gegen neue klinische Isolate von Enterococcus spp., die Vancomycin-Resistente (VRE) einschließen. Gegen Streptococcus spp. sind MICs ≤ 0,13 μg/ml.
Das Antibiotikum 107891 ist auch aktiv gegen anaerobe Gram-positive Stämme; die MICs sind ≤ 0,13 μg/ml gegen Clostridia und ≤ 0,004-4 μg/ml gegen Propionibacteria. Es wurden antimikrobielle Aktivitäten gegen L. monocytogenes (MIC 0,125 μg/ml) und Lactobacilli-Stämme (MIC-Bereich ≤ 0,13-4 μg/ml) gezeigt. Einige Gram-negative Bakterien sind empfindlich gegenüber Antibiotikum 107891; die MICs betragen 1-0,25 μg/ml gegen M. catharralis, 0,5-0,25 μg/ml gegen Neisseria spp. und 32 μg/ml gegen H. influenzae.
Antibiotikum 107891 ist nicht aktiv gegen die getesteten E. coli- und C. albicans-Stämme.
In Zeit-Abtötungsexperimenten zeigt das Antibiotikum 107891 eine bakterizide Aktivität gegen S. aureus GISA- und E. faecalis VanA-Stamm; bei 24 Stunden ist die bakterizide Konzentration der MIC-Wert in Mueller-Hinton-Bouillon.
S. aureus kann lebensbedrohliche Infektionen verursachen, und MRSA ist von besonderer klinischer Bedeutung, da er gegenüber allen Penicillinen und Cephalosporinen resistent ist und auch gegenüber mehrfachen anderen Antibiotika. Zusätzlich breitet er sich leicht von Patient zu Patient aus, wodurch Infektionsausbrüche mit bedeutenden Verwicklungen für Gesundheitspflege-Einrichtungen ("healthcare facilities") verursacht werden (W. Witte, (1999): "Antibiotic resistance in Gram-positive bacteria: epidemiological aspects", Journal of Antimicrobial Chemotherapy 44:1-9). Das National Nosocomial Infection Surveillance System (NNIS) des Center for Disease Control (CDC) berichtete, dass sich die Methicillin-Resistenz unter S. aureus in US-Krankenhäusern von 2,4% im Jahre 1975 auf 29% im Jahre 1991 erhöhte, wobei ein höherer Resistenzgrad in Intensivpflegeeinheiten festgestellt wurde (L. Archibald, L. Philips, D. Monnet, J.E. Jr Mc Gowan, F. Tenover, R. Gaynes, (1997): "Antimicrobial resistance in isolates from inpatients and outpatients in the United States: incrasing importance of the intensive care unit", Clinic Infect. Dis. 24: 211-5). Nosokomiale Staphylococcus-Infektionen sind mit beträchtlicher Morbidität und Mortalität verbunden, verlängern die Aufenthaltsdauer und erhöhen die Hospitalisierungskosten. Die Mehrheit der MRSA-Stämme sind gegenüber etlichen der am häufigsten verwendeten antimikrobiellen Wirkstoffe, einschließlich Makroliden, Aminoglykosiden und den β-Lactam-Antibiotika, die gegenwärtig in Verwendung sind, einschließlich der neuesten Generation an Cephalosporinen, resistent.
Vancomycin-resistente im Krankenhaus erworbene Pathogene, die für Infektionen (wie z.B. Endokarditis, Meningitis und Septikämie bzw. Blutvergiftung) verantwortlich sind, stellen eine steigende therapeutische Herausforderung dar (J. Cetinkaya, P. Falk und C.G. Mayhall, (2000): "Vancomycin-resistant enterococci", Clin. Microbiol. Rev. 13: 686-707; L.B. Rice, (2001): "Emergence of vancomycin-resistant enterococci", Emerg. Infec. Dis. 7:183-7).
S. pneumoniae und M. catarrhalis sind anerkannte, wichtige pathogene Keime von Menschen. Sie sind eine häufige Ursache für Atemwegsinfektionen, insbesondere Otitis media bei Kindern, und Infektionen der unteren Atemwege bei älteren Personen. M. catarrhalis und S. pneumoniae sind seit kurzem als die häufigsten bzw. verbreitetsten Pathogene der Atemwege anerkannt worden (M.C. Enright und H. McKenzy, (1997): "Moraxella (Branhamella) catarrhalis. Clinical and molecular aspect of a rediscovered pathogen", J. Med. Microbiol. 46:360-71).
Clostridien sind für verschiedene Erkrankungen verantwortlich: Gasgangrän und damit zusammenhängende Wundinfektionen, Tetanus, Botulismus, Antibiotika-assoziierte Diarrhoe (CDAD) und pseudomembranöse Colitis. Die meisten dieser Mikroorganismen produzieren Exotoxine, die eine bedeutende Rolle in der Pathogenese dieser Erkrankungen spielen. C. difficile ist das verursachende Agens, das für 25% der CDAD-Fälle und für nahezu alle Fälle von pseudomembranöser Colitis verantwortlich ist. Über die letzten Jahre hinweg ist das Auftreten von C. difficile-Coinfektion bei Patienten mit Vancomycin-resistenter Enterococcus-Infektion oder -Kolonisation aufgetreten (J.G. Bartlett, (1992): "Antibiotic associated diarrhea", Clinic. Infect. Dis. 15: 573-581).
BIOLOGISCHE AKTIVITÄT DER ANTIBIOTIKUM 107891-FAKTOREN A1 UND A2 IN VITRO
Tabelle VIII gibt die antimikrobiellen Aktivitäten der einzelnen Faktoren A1 und A2 des Antibiotikums 107891 an. MICs wurden durch das Mikrobouillon-Verdünnungs-Verfahren ("microbroth dilution method"), wie es obenstehend beschrieben ist, bestimmt. TABELLE VIII: Antimikrobielle Aktivität der Antibiotikum 107891-Faktoren A1 und
BIOLOGISCHE AKTIVITÄT VON ANTIBIOTIKUM 107891 IN VIVO
Weibliche ICR-Mäuse (Harlan Italia SpA-S. Pietro al Natisone, Italien), mit einem Gemischt von 23-25 g, wurden in Experimenten zur akuten letalen Infektion in immunkompetenten oder neutropenischen Mäusen verwendet. Neutropenie wurde durch zwei intraperitoneale Verabreichungen von Cyclophosphamid, 200 bzw. 100 mg/kg, an vier Tagen bzw. einem Tag, induziert, bevor die Mäuse infiziert wurden.
Die Infektion wurde durch intraperitoneales Inokulieren einer Bakteriensuspension von entweder einem klinischen Methicillin-resistenten Staphylococcus-Isolat (Staph. aureus SA3817) oder einem Methicillin-empfindlichen Standardstamm (Staph. aureus Smith ATCC19636) in immunkompetente Mäuse (8 Tiere/DosisBehandlungsgruppe) oder durch Inokulieren eines klinischen Glykopeptid-resistenten Enterococcus-Isolats (Ent. faecalis A533) in neutropenische Mäuse induziert. Die bakteriellen Provokationen (ca. 10⁶ Zellen/Maus) wurden suspendiert in 0,5 ml 5%igem bakteriologischen Mucin (Difco) gegeben. Unbehandelte Tiere starben innerhalb von 24-72 h nach der Infektion. Die Antibiotikabehandlung begann innerhalb von 10-15 min nach der Provokation. Das Antibiotikum 107891 wurde einmalig intravenös oder subkutan in verschiedenen wässrigen Formulierungen verabreicht. Die 50%-Effektivdosis (ED₅₀) und 95%-Vertrauensgrenzen wurden mit dem Spearman-Kärber-Verfahren (D.J. Finney, (1952): "The Spearman-Kärber method", in: Statistical methods in biological assay. S. 524-530, Charles Griffin & Co., Ltd., London) aus dem prozentualen Anteil der an Tag 7 überlebenden Tiere berechnet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IX angegeben.
Antibiotikum 107891 ist bis zu der maximalen getesteten Dosis von 200 mg/kg nicht toxisch. Tabelle IX: ED₅₀ von Antibiotikum 107891 in akuten letalen Infektionen von Mäusen.
Formulierungen:

A: 10% (V/V) DMSO, 10% (G/V) beta-Hydroxypropylcyclodextrin (Sigma), 80% (V/V) von 5% (G/V) Glucose in H₂O
B: 10% (V/V) DMSO, 40% (V/V) PEG 400 in wässriger 0,1 M CH₃COOH
C: 50% (V/V) PEG 400 in H₂O

Stämme:

I. MSSA: Staph. aureus Smith 819 ATCC19636
II. MRSA: Staph. aureus 3817, klinisches Isolat
III. VanA: Ent. faecalis A533, klinisches Isolat, in neutropenischen Mäusen

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1A (Spektrum mit vollständiger Abtastung und niedriger Auflösung) und 1B (Spektrum mit Zoom-Abtastung und hoher Auflösung) geben Massenspektren des Antibiotikums 107891 wieder, die ein doppelt protoniertes Ion mit m/z 1124 und m/z 1116 zeigen.
2 gibt das IR-Absorptionsspektrum von in KBr dispergiertem Antibiotikum 107891 wieder.
3 gibt das UV-Spektrum von in Methanol:H₂O gelöstem Antibiotikum 107891 wieder.
4 gibt das in dem Gemisch Methanol-d₄:H₂O (pH 4,3 HCl) 40:10 (V/V) bei 40°C an einem Bruker AMX 600-Spektrometer, das eine Wassersuppressionssequenz anwendet, aufgezeichnete ¹H-NMR-Spektrum wieder.
5 gibt das in dem Gemisch Methanol-d₄:H₂O (pH 4,3 HCl) 40:10 (V/V) bei 40°C an einem Bruker AMX 600-Spektrometer aufgezeichnete ¹³C-NMR-Spektrum wieder.
6A (Spektrum mit vollständiger Abtastung und geringer Auflösung) und 6B (Spektrum mit Zoom-Abtastung und hoher Auflösung) geben die Massenspektren von Antibiotikum 107891-Faktor A1 wieder, die ein doppelt protoniertes Ion [M+2H]²⁺ mit m/z 1124 zeigen.
7A (Spektrum mit vollständiger Abtastung und geringer Auflösung) und 7B (Spektrum mit Zoom-Abtastung und hoher Auflösung) geben die Massenspektren von Antibiotikum 107891-Faktor A2 wieder, die ein doppelt protoniertes Ion [M+2H]²⁺ mit m/z 1116 zeigen.
8 stellt das ¹H-NMR-Spektrum von Antibiotikum 107891-Faktor A1, aufgezeichnet in dem Gemisch CD₃CN:D₂O (1:1) bei 298 K an einem Bruker AMX 600-Spektrometer, das eine Wassersuppressionssequenz anwendet, wieder.
9 gibt das ¹H-NMR-Spektrum von Antibiotikum 107891-Faktor A2, aufgezeichnet in dem Gemisch CD₃CN:D₅O (1:1) bei 298 K an einem Bruker AMX 600-Spektrometer, das eine Wassersuppressionssequenz anwendet, wieder.
10 gibt das ¹³C-NMR-Spektrum von Antibiotikum 107891-Faktor A1, aufgezeichnet in dem Gemisch CD₃CN:D₂O (1:1) bei 298 K an einem Bruker AMX 600-Spektrometer, das eine Wassersuppressionssequenz anwendet, wieder.
11 gibt das ¹³C-NMR-Spektrum von Antibiotikum 107891-Faktor A2, aufgezeichnet in dem Gemisch CD₃CN:D₂O (1:1) bei 298 K an einem Bruker AMX 600-Spektrometer, das eine Wassersuppressionssequenz anwendet, wieder.
12 gibt das IR-Absorptionsspektrum von in KBr dispergiertem Antibiotikum 107891-Faktor A1 wieder.
13 gibt das UV-Spektrum von in Methanol:H₂O gelöstem Antibiotikum 107891-Faktor A1 wieder.
14 gibt das IR-Absorptionsspektrum von in KBr dispergiertem Antibiotikum 107891-Faktor A2 wieder.
15 gibt das UV-Spektrum von in Methanol:H₂O gelöstem Antibiotikum 107891-Faktor A2 wieder.
BEISPIELE
Beispiel 1: Fermentationsverfahren für Microbispora sp. ATCC PTA-5024
Der Microbispora sp.-Stamm ATCC PTA-5024 wurde 2-3 Wochen lang bei 28°C auf Hafermehl-Schrägagar gehalten. Der mikrobielle Inhalt eines Schrägagars bzw. Schrägagarröhrchens wurde mit 5 ml sterilem Wasser abgekratzt und in 500 ml-Erlenmeyer-Kolben inokuliert, die 100 ml Beimpfungsmedium ("seed medium") (AF/MS) enthielten, das besteht aus (g/l): Dextrose 20, Hefeextrakt 2, Sojabohnenmehl 8, NaCl 1 und Calciumcarbonat 4. Das Medium wurde in destilliertem Wasser hergestellt, und der pH wurde vor der Sterilisation bei 121 °C für 20 min auf 7,3 eingestellt. Die inokulierten Kolben wurden bei 28°C auf einem mit 200 U/min betriebenen Rotationsschüttler wachsen gelassen. Nach 4-6 Tagen wurden 5% dieser Kultur in eine zweite Reihe Kolben inokuliert, die das gleiche Fermentationsmedium enthielten. Nach 72 Stunden der Inkubation wurden 200 ml in einen 4 l-Bioreaktor transferiert, der 3 l des gleichen Wachstumsmediums enthielt.
Die Fermentation wurde bei 30°C mit Rühren bei 700 U/min und 0,5 vvm Belüftung durchgeführt. Nach 72 Stunden wurde die Kultur (1,5 l) in einen 20 l-Bioreaktor, der 15 l des gleichen Wachstumsmedium enthielt, transferiert. Die Fermentation wurde für 48 Stunden bei 30°C unter Rühren mit 500 U/min und bei 0,5 vvm Belüftung durchgeführt und wurde dann in den Produktionstank transferiert. Die Produktion von Antibiotikum 107891 wurde in einem 300 l-Fermenter durchgeführt, der 2001 des Produktionsmediums M8 enthielt, das besteht aus (g/l): Stärke 20, Glucose 10, Hefeextrakt 2, hydrolysiertes Casein 4, Fleischextrakt 2 und Calciumcarbonat 3. Das Medium wurde in entionisiertem Wasser hergestellt, und der pH wurde vor der Sterilisation bei 121 °C für 25 min auf 7,2 eingestellt. Nach Abkühlen des Fermenters wurde mit näherungsweise 141(7%) der Vorkultur inokuliert. Der Fermenter wurde bei 29°C und Rühren mit 180 U/min und bei 0,5 vvm Belüftung mit einem Kopfdruck von 0,36 bar betrieben. Der Fermenter wurde nach 98 Stunden der Fermentation abgeerntet.
Die Produktion des Antibiotikums 107891 wurde durch HPLC, wie es vorstehend beschrieben ist, nach Extraktion der gesamten Kulturbrühe mit dem gleichen Volumen Methanol überwacht. Die Extraktion wurde bei Raumtemperatur durchgeführt, wobei eine Stunde lang gerührt wird.
Beispiel 2: Alternatives Fermentationsverfahren für Microbispora sp. ATCC PTA-5024
Microbispora sp. ATCC PTA-5024 wurde in 500 ml-Erlenmeyer-Kolben inokuliert, die 100 ml Wachstumsmedium (G1) enthielten, das besteht aus g/l: Glucose 10, Maltose 10, Sojabohnenöl 10, Sojabohnenmehl 8, Hefeextrakt 2 und Calciumcarbonat 4. Das Medium wurde in entionisiertem Wasser hergestellt und bei 120°C × 20 min ohne pH-Einstellung sterilisiert. Die inokulierten Kolben wurden 120-168 Stunden lang bei 28°C inokuiert, wobei mit 200 U/min gerührt wurde, bis ein gutes Wachstum beobachtet wurde. Die Kolben wurden dann verwendet, um einen 4 l-Bioreaktor, der 3 l Beimpfungsmedium AF/MS enthielt, das zusammengesetzt ist, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, zu inokulieren (3%). Nach 120 Stunden der Fermentation bei 30°C, Rühren bei 700 U/min und 0,5 vvm Belüftung wurden 1,5 l der Kultur in einen 20 l-Bioreaktor, der 15 l des gleichen Wachstumsmediums enthielt, transferiert. Die Fermentation wurde für 96 Stunden bei 30°C, Rühren bei 600 U/min und 0,5 vvm Belüftung durchgeführt und wurde dann in den Produktionstank transferiert.
Die Antibiotikum-Produktion wurde in einem 300 l-Fermenter erhalten, der 200 l des Produktionsmediums (V6) enthielt, bestehend aus (g/l): Dextrose 20, Hefeextrakt 5, Fleischextrakt 5, hydrolysiertes Casein 3, Pepton 5 und NaCl 1,5. Das Medium wurde in entionisiertem Wasser hergestellt, wobei der pH mit NaOH auf 7,5 eingestellt wurde, und wurde bei 121 °C 20 min sterilisiert.
Der Fermenter wurde mit 141 der Beimpfungskultur (7%) inokuliert, und die Fermentation wurde bei 29°C durchgeführt, wobei mit 180 U/min gerührt, mit 100 l Standardluft pro Minute (0,5 vvm) belüftet wurde. Die Antibiotikum 107891-Produktion wurde wie vorstehend beschrieben durch HPLC überwacht. Die Fermentation wurde nach 160 Stunden abgeerntet.
Beispiel 3 Gewinnung von Antibiotikum 107891
Die in Beispiel 1 beschriebene Fermentationsbrühe wurde mittels eines Tangentialfiltrationssystems (Membran mit 0,1 um Porengröße, Koch Carbo-Cor, Koch Wilmington, USA) filtriert, um 170 l Überstand und 30 l konzentriertes Mycelium zu erhalten. Der Antibiotikum 107891-Komplex wurde sowohl im Filtrat (A), als auch im Mycelium (B) gefunden.

(A) Die filtrierte Brühe wurde eine Nacht lang bei Raumtemperatur in Gegenwart von Polystyrolharz vom Typ Diaion HP-20 (41) gerührt. Das Harz wurde dann abgetrennt, mit 10 l Methanol: Wasser 4:6 (V/V) gewaschen und chargenweise anfänglich mit 10 l Methanol:Wasser 9:1 (V/V) und dann mit 101 Methanol:Butanol:Wasser 9:1:1 (V/V) eluiert. Die ver einigten eluierten Fraktionen, die Antibiotikum 107891 enthielten, wurden an einem Rotationsverdampfer auf ein kleines Volumen konzentriert bzw. eingeengt und wurden dann gefriergetrocknet, was 32 g Rohmaterial ergab. Dieses Rohmaterial wurde in N-Butanol(1 l) gelöst und dann dreimal in Folge mit 800 ml Wasser extrahiert. Die organische Schicht wurde unter reduziertem Druck bis zu einem öligen Rückstand konzentriert, der in Methanol gelöst wurde. Bei Zugabe von Petrolether wurden durch Präzipitation 5 g an roher Antibiotikum-Zubereitung erhalten.
(B) Nach Zugabe von 25 l Methanol wurde der Retentatanteil, der das Mycelium enthielt, 1 Stunde lang gerührt und wurde filtriert, wodurch 45 l Myceliumextrakt erhalten wurden. Diese Lösung wurde dann mit Wasser (20 l) verdünnt und eine Nacht lang bei Raumtemperatur mit Polystyrolharz vom Typ Diaion HP-20 (1 l) gerührt. Das Harz wurde dann abgetrennt, mit 2 l Methanol:Wasser 40:60 (V/V) gewaschen und chargenweise sequenziell mit 3 l Methanol:Wasser 85:15 (V/V) und dann mit 2 l Methanol:Wasser 90:10 (V/V) eluiert. Die eluierten Fraktionen wurden hinsichtlich des Vorhandenseins von Antibiotikum 107891 durch einen Agar-Diffusionsassay an Staphylococcus aureus und durch ein analytisches HPLC-Verfahren, wie es vorstehend beschrieben ist, überwacht.

Die eluierten Fraktionen, die das Antibiotikum 107891 enthielten, wurden vereinigt, wurden unter reduziertem Druck konzentriert und wurden gefriergetrocknet, was 8,1 g an rohem Antibiotikum 107891 ergab.
Beispiel 4: Alternative Gewinnung von Antibiotikum 107891
Die geerntete Brühe aus der 200 l-Tankfermentation, beschrieben in Beispiel 2, wurde auf pH 6,8 gebracht, und in die Brühe wurde mittels Tangentialfiltration (Membran mit 0,1 μ Porengröße, Koch Carbo-Cor) filtriert. Das Permeat (180 l) wurde chargenweise über Nacht bei Raumtemperatur mit 2 l Harz vom Typ Diaion HP20 (Mitsubishi Chemical) gerührt, und das Harz wurde dann gesammelt.
Methanol (25 l) wurde zu dem Retentatanteil in der Tangentialfiltrationsausrüstung (näherungsweise 20 l) gegeben, der das konzentrierte Mycelium enthielt. Diese Suspension wurde 1 Stunde lang gerührt und wurde dann mit dem Mikrofiltrationssystem bis zu einem Rest Retentatvolumen von näherungsweise 20 l filtriert. Zusätzliches Methanol (25 l) wurde dann zugegeben, und das obenstehende Verfahren wurde sequenziell für eine Gesamtzahl von 5 Zyklen wiederholt. Die vereinigten Methanolextrakte (näherungsweise 125 l) wurden mit 160 l entmineralisiertem Wasser verdünnt und wurden chargenweise über Nacht bei Raumtemperatur mit 3 1 Harz vom Typ Diaion HP20 gerührt. Das Harz wurde dann gesammelt und wurde mit dem Harz vom Typ Diaion HP20, das verwendet worden war, um das Brühenpermeat gemäß dem obenstehend beschriebenen Verfahren zu extrahieren, vereinigt. Das vereinigte Harz wurde mit 20 l Wasser:Methanol 6:4 (V/V) in eine Chromatographiesäule gespült. Das Antibiotikum 107891 wurde mit 23 l Methanol:50 mM Ammoniumformiat-Puffer pH 3,5:n-Butanol 9:1:1 (V/V) eluiert. Dieses Eluat wurde dann unter Vakuum auf ein Endvolumen von 3 l konzentriert.
Die konzentrierte Lösung wurde dann bei pH 4,5 auf eine Säule von 2,5 l aus Polyamid vom Typ CC 6 0,1-0,3 mm (Macherey-Nagel) geladen, die mit Wasser:Methanol 7:3 (V/V) konditioniert worden war. Die Säule wurde mit Wasser:Methanol 7:3 (V/V) und dann mit 25 mM Ammoniumformiat-Puffer pH 3,5:Methanol 7:3 (V/V) gewaschen. Das Antibiotikum wurde mit Wasser:Methanol 3:7 (V/V) und dann mit einem 1:9 (V/V)-Gemisch eluiert. Die Elution wurde abgeschlossen mit 25 mM Ammoniumformiat-Puffer pH 2,8:Methanol im Verhältnis 1:9 (V/V). Die das Antibiotikum 107891 enthaltenden Eluate wurden vereinigt und unter Vakuum auf ein Endvolumen von 1 l konzentriert. Der pH der konzentrierten Lösung wurde mit 7 M Ammoniumhydroxid von 4 auf 5,7 gebracht, und dann wurde das Gemisch zentrifugiert, um das Präzipitat zu sammeln. Dieser Feststoff wurde in Wasser suspendiert und gefriergetrocknet, wodurch 6,96 g Antibiotikum 107891-Zubereitung erhalten wurden.
Beispiel 5: Reinigung von Antibiotikum 107891
Rohes Antibiotikum 107891 (3,6 g), hergestellt wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde durch Mitteldruckchromatographie an 100 g Umkehrphase vom Typ C8 (EC) mit einer Partikelgröße von 40-70 μm, 60A Porengröße, IST (International Sorbent Technology, Mid-Glamorgan, UK) gereinigt, wobei ein Mitteldruckchromatographie-System vom Typ Bùchi B-680 (Bùchi Laboratoriums-Technik AG, Flawil, Schweiz), ausgestattet mit einem Gradientenmischer vom Typ B-687, einem Fraktionensammler vom Typ B-684, einer 70 × 460 mm-Glassäule vom Typ B-685, verwendet wurde. Das Harz wurde vorher mit einem Gemisch aus Phase A: Phase B 8:2 (V/V) konditioniert und wurde dann bei 25 ml/min mit einem 60-minütigen linearen Gradienten von 20% bis 60% Phase B in 60 min eluiert.
Phase A war Acetonitril:20 mM Ammoniumformiat-Puffer (pH 6,6) 10:90 (V/V); und Phase B war Acetonitril:20 mM Ammoniumformiat-Puffer (pH: 6,6) 90:10 (V/V).
Die das Antibiotikum 107891 enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, unter Vakuum konzentriert und zweimal aus Wasser lyophilisiert, wodurch 430 mg gereinigtes Antibiotikum 107891 erhalten wurden.
Beispiel 6: Reinigung von Antibiotikum 107891 durch präparative HPLC
Antibiotikum 107891 wurde durch präparative HPLC an einer vorgepackten Säule vom Typ Hibar lichrosorb RP8 (7 μm Partikelgröße) RT 250-25 mm, Merck, weiter gereinigt, wobei eine 25-minütige lineare Gradientenelution von 30% bis 45% Phase B bei einer Flussrate von 30 ml/min eingesetzt wurde. Phase A war 25 mM Ammoniumformiat-Puffer pH 4,5:Acetonitril 95:5 (V/V), und Phase B war Acetonitril.
Eine Probe von Antibiotikum 107891 aus Beispiel 5 (300 mg) wurde in 1,5 ml 350:1 DMSO:Ameisensäure 95:5 (V/V) gelöst, und 300 μl wurden je Chromatographielauf bearbeitet. Antibiotikum 107891 wurde typischerweise in 15-16 Minuten eluiert. Die eluierten Fraktionen von 5 Chromatographieläufen, die Antibiotikum 107891 enthielten, wurden vereinigt und unter Vakuum konzentriert. Die zurückbleibende Lösung wurde dreimal in Folge aus Wasser lyophilisiert, wodurch 31 mg Antibiotikum 107891 als ein weißes Pulver erhalten wurden.
Beispiel 7: Trennung und Reinigung der einzelnen Faktoren A1 und A2 von Antibiotikum 107891
Die Faktoren A1 und A2 wurden durch präparative HPLC an einer Säule vom Typ Symmetry Prep C18 (7 μm Partikelgröße), 7,8 × 300 mm Waters (Mildfold USA) unter Verwendung von zwei verschiedenen Elutionsprogrammen aus dem Antibiotikum 107891-Komxplex von Beispiel 5 abgetrennt und gereinigt.

A) Faktor A1 wurde durch eine 25-minütige lineare Gradientenelution von 30% bis 45% Phase B bei einer Flussrate von 3,5 ml gereinigt. Phase A war 25 mM Ammoniumformiat-Puffer pH 4,5:Acetonitril 95:5 (V/V), und Phase B war Acetonitril. Gereinigter Antibiotikum 107891-Komplex (15 mg) wurde in 350 μl DMSO:Ameisensäure 95:5 (V/V) gelöst und wurde pro Chromatographielauf bearbeitet. Die Faktoren A1 und A2 wurden typischerweise in einem Zeitrahmen von 11-13 Minuten eluiert. Die eluierten Fraktionen wurden dann durch HPLC unter den obenstehend beschriebenen Analysenbedingungen untersucht. Die Fraktionen von 14 Chromatographieläufen, die reinen Antibiotikum 107891-Faktor A1 enthielten, wurden vereinigt und unter Vakuum konzentriert. Die zurückbleibende Lösung wurde dreimal in Folge aus Wasser lyophilisiert, wodurch 15 mg reiner Faktor A1 als ein weißes Pulver erhalten wurden.
B) Faktor A2 wurde durch isokratische Elution bei einer Flussrate von 7 ml mit 100 mM Ammoniumformiat-Puffer pH 4:Acetonitril 82,5:17,5 (V/V) gereinigt. Gereinigter Antibiotikum 107891-Komplex (5 mg) wurde in 250 μl eines Gemischs aus Essigsäure:Acetonitri1:100 mM Ammoniumformiat-Puffer pH 4 50:120:80 (V/V) gelöst und wurde pro Chromatographielauf bearbeitet. Die Faktoren A1 und A2 wurden typischerweise in einem Zeitrahmen von 9-10 Minuten eluiert. Die eluierten Fraktionen wurden dann durch HPLC unter den obenstehend beschriebenen Analysenbedingungen untersucht. Die Fraktionen von 20 Chromatographieläufen, die reinen Antibiotikum 107891-Faktor A2 enthielten, wurden vereinigt und wurden unter Vakuum konzentriert. Die zurückbleibende Lösung wurde zweimal aus Wasser lyophilisiert, wodurch 8 mg reiner Faktor A2 als ein weißes Pulver erhalten wurden.

Claims

Antibiotikum 107891-Komplex, umfassend Faktor A1 und Faktor A2, der ein weißes Pulver mit den folgenden Characteristika ist: A) Massenspektrum, aufgezeichnet mit einer 0,2 mg/ml-Lösung in Methanol:Wasser 80/20 (V/V) mit 0,1% Trifluoressigsäure (1A und 1B) an einem Thermofinnigan LCQ-deca-Gerät, das mit einer Elektrospray-Quelle ausgestattet ist, unter Verwendung einer Thermofinnigan-Kalibrierungsmischung bei den folgenden Elektrospraybedingungen: Sprühspannung: 4,7 kV; Kapillarentemperatur: 220°C; Kapillarenspannung: 3V; Infusionsmodus 10 μl/min, das zwei doppelt protonierte Ionen mit m/z 1124 und m/z 1116 zeigt, was der niedrigsten Isotopenzusammensetzung von Faktor A1 beziehungsweise A2 entspricht; B) Infrarot-Spektrum (2), aufgezeichnet in KBr mit einem Bruker FT-IR-Spektralphotometer, Modell IFS 48, das Absorptionsmaxima bei (cm^–1): 3263; 2929; 1661; 1533; 1402; 1114; 1026 aufweist; C) UV-Spektrum (3), aufgenommen in Methanol:H₂O 80:20 (V/V) mit einem Perkin-Elmer-Spektralphotometer Lambda 16, das zwei Schultern bei 226 und 267 nm aufweist; D) ¹H-NMR-Spektrum (4), aufgezeichnet bei 600 MHz in dem Gemisch Methanol-d4:H₂O (pH 4, 3 HCl) 40: 10 (V/V) bei 40°C an einem Bruker AMX 600-Spektrometer, das eine Wassersuppressionsequenz anwendet, unter Verwendung des Restsignals von Methanol-d4 bei 3,31 ppm als innerem Standard, das die folgenden Signale aufweist [δ=ppm, Multiplizität; (Zuordnung)]: 0,93 d (CH₃), 0.98 d (CH₃), 1.07 t (überlappende CH₃s), 1.18 t (überlappende CH₃s), 1.26 d (CH₃), 1.30 t (überlappende CH₃s), 1.62-1.74 m (CH₂), 1. 78 d (CH₃), 1. 80 d (CH₃), 2. 03 m (CH₂), 2.24 m (CH), 2.36 m (CH₂), 2.72-3.8 m (peptidische α-CHs), 3.8-5.2 m (peptidische α-CHs), 5.53-6.08 s (CH₂), 5.62 d (CH, Doppelbindung), 6.42 m (CH), 6.92 d (CH, Doppelbindung), 7.0-7.55 m (aromatische CHs), 7.62-10.4 d und m (aromatische und peptidische NHs); E) ¹³C-NMR-Spektrum (5), aufgezeichnet in dem Gemisch Methanol-d4:H₂O (pH 4, 3 HCl) 40:10 (V/V) bei 40°C an einem Bruker AMX 600-Spektrometer unter Verwendung des Restsignals von Methanol-d4 bei 49.15 ppm als innerem Standard, das die folgenden Signale aufweist: [δ=ppm; (Zuordnung)]: 13.6-23.2 (aliphatische CH₃s), 26.16-73 (aliphatische CH₂s und peptidische α-CHs), 105-136 (aromatische und Doppelbindungs-CHs und quarternäre Kohlenstoffatome), 164.3-176.3 (peptidische Carbonyle); F) das Säurehydrolysat in 6N HCl, (105°C, 24 h) zeigt nach Derivatisierung mit 6-Aminochinolyl-N-Hydroxysuccinimidylcarbamat das Vorliegen der folgenden Aminosäuren zusammen mit anderen nicht-identifizierten Peaks: Lanthionin, Methyllanthionin, Glycin, Prolin, Valin, Asparaginsäure (Hydrolyseprodukt von Asparagin), Phenylalanin und Leucin; G) das Säurehydrolysat in 4N Methansulfonsäure, die 0,2% (G/V) 3-(2-Aminoethyl)indol als Katalysator enthält, (115°C, 16h), zeigt das Vorliegen von 5-Chlortryptophan; H) eine basische ionisierbare Funktion, die durch Säure/Base-Titration detektiert wird, welche mit 0,01 N Kaliumhydroxid in 2-Methoxyethanol (MCS):H₂O 12:3 (V/V), enthaltend einen molaren Überschuss an 0,01 N Salzsäure, durchgeführt wird; und seine Salze mit Säuren.
Faktor A1 des Antibiotikums 107891, der ein weißes Pulver ist, der zeigt: A) ein doppelt protoviertes Ion bei m/z 1124, das der niedrigsten Isotopenzusammensetzung im Massenspektrum entspricht, das aus einer 0,1 mg/ml-Lösung in Aceto nitril:Wasser 50:50 (V/V) mit 0,5% Essigsäure an einem Thermofinnigan LCQ-deca-Gerät, das mit einer Elektrospray-Quelle ausgestattet ist, unter Verwendung einer Thermofinnigan-Kalibrierungsmischung bei den folgenden Elektrospraybedingungen: Sprühspannung: 4,7 kV; Kapillarentemperatur: 250°C; Kapillarenspannung: 8V; Infusionsmodus 10 μl/min, aufgezeichnet wurde (6A und 6B); B) die exakte Masse des Antibiotikums, bestimmt unter Verwendung eines Bruker Daltonics APEX II, 4.7 Tesla-Spektrometers, das mit einer Elektrospray-Quelle ausgestattet ist, entspricht einem Molekulargewicht von 2246,71 ± 0,06, wobei die berechnete monoisotopische Masse von [M+2H]²⁺ bei m/z 1124,36124 ist (Genauigkeit 30 ppm); C) bei Lösen in CD₃CN:D₂O (1:1) weist das ¹H-NMR-Spektrum (8) bei 600 MHz unter Verwendung von CD₃CN als innerem Standard (1.94 ppm) die folgenden Signalgruppen (in ppm) auf: 0.84 d (CH₃), 0.89 d (CH₃), 0.94 t (überlappende CH₃s), 1.1 d (CH₃), 1.13 d (CH₃), 1.15 t (überlappende CH₃s), 1.49 m (CH₂), 1.69 d (CH₃), 1.75 m (CH₂), 2.11 m (CH), 2.26 m (CH), 2.5 m (CH₂), 2.68-3.8 m (peptidische CH_βs), 3.8-5.0 m (peptidische CH_αs), 5.45-6.17 s (CH₂), 5.58 d (CH, Doppelbindung), 6.36 m (CH), 6.86 d (CH, Doppelbindung), 7.0-7.45 m (aromatische CHs); D) bei Lösen in CD₃CN:D₂O (1:1) weist das ¹³C-NMR-Spektrum (10) bei 600 MHz unter Verwendung von CD₃CN als innerem Standard (1.39 ppm) die folgenden Signale (in ppm) auf, [δ=ppm; (Zuordnung)]: 13.6-23.03 (aliphatische CH₃s), 25.69-77.9 (aliphatische CH₂s und peptidische CH_αs), 105-137.3 (aromatische und Doppelbindungs-CHs und quaternäre Kohlenstoffatome), 165.6-176.6 (peptidische Carbonyle); E) das Infrarotspektrum, aufgezeichnet in KBr mit einem Bruker FT-IR-Spektralphotometer, Modell IFS 48 (12), weist Absorptionsmaxima auf bei (cm^–1): 3294; 3059; 2926; 1661; 1529; 1433; 1407; 1287; 1114; 1021; F) das UV-Spektrum, aufgezeichnet in Methanol:H₂O (im Verhältnis 80:20) mit einem Perkin-Elmer-Spektralphotometer Lambda 16 (13) zeigt zwei Schultern bei 226 und 267 nm; G) das Säurehydrolysat in 6N HCl, (105°C, 24 h), zeigt nach Derivatisierung mit 6-Aminochinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat das Vorliegen der folgenden Aminosäuren zusammen mit anderen nicht-identifizierten Peaks: Lanthionin, Methyllanthionin, Glycin, Prolin, Valin, Asparaginsäure (Hydrolyseprodukt von Asparagin), Phenylalanin und Leucin; H) das Säurehydrolysat in 4N Methansulfonsäure, die 0,2% (G/V) 3-(2-Aminoethyl)indol als Katalysator enthält, (115°C, 16 h), zeigt das Vorliegen von 5-Chlortryptophan; und seine Salze mit Säuren.
Antibiotikum 107891-Faktor A1 nach Anspruch 2, dem die folgende Strukturformel zugeordnet werden kann:
Faktor A2 des Antibiotikums 107891, der ein weißes Pulver ist, der zeigt: A) ein doppelt protoniertes Ion mit m/z 1116, das der niedrigsten Isotopenzusammensetzung im Massenspektrum ent spricht, das mit einer 0,1 mg/ml-Lösung in Acetonitril:Wasser 50:50 (V/V) mit 0,5% Essigsäure an einem Thermofinnigan LCQ-deca-Gerät, das mit einer Elektrospray-Quelle ausgestattet ist, unter Verwendung einer Thermofinnigan-Kalibrierungsmischung bei den folgenden Elektrospraybedingungen: Sprühspannung: 4,7 kV; Kapillarentemperatur: 250°C; Kapillarenspannung: 8V; Infusionsmodus: 10 μl/min, aufgezeichnet wurde (7A und 7B); B) die exakte Masse, bestimmt unter Verwendung eines Bruker Daltonics APEX II, 4.7 Tesla-Spektrometers, das mit einer Elektrospray-Quelle ausgestattet war, entspricht einem Molekulargewicht von 2230,71 ± 0,06, wobei die errechnete monoisotopische Masse aus [M+2H]²⁺ bei m/z 1116,36260 ist (Genauigkeit 30 ppm); C) bei Lösung in CD₃CN:D₂O (1:1) weist das ¹H-NMR-Spektrum (9) bei 600 MHz unter Verwendung von CH₃CN als innerem Standard (1.94 ppm) die folgenden Signale (in ppm) auf, [δ=ppm, Multiplizität; (Zuordnung)]: 0.84 d (CH₃), 0.88 d (CH₃), 0.94 d (CH₃), 1.06 d (CH₃), 1.14 d (CH₃), 1.48 m (CH₂), 1.65-1.75 m (CH₂), 1.67 d (CH₃), 2.15 m (CH), 2.25 m (CH), 2.5 m (CH₂), 2.77-3.8 m (peptidische CH_βs), 3.8-4.9 m (peptidische CH_αs), 5.45-6.14 s (CH₂), 5.59 d (CH, Doppelbindung), 6.34 m (CH), 6.84 d (CH, Doppelbindung), 7.0-7.42 m (aromatische CHs); D) bei Lösen in CD₃CN:D₂O (1:1) weist das ¹³C-NMR-Spektrum (11) bei 600 MHz unter Verwendung von CD₃CN als innerem Standard (1.39 ppm) die folgenden Signale (in ppm) auf, [δ=ppm, (Zuordnung)]: 13.6-22.9 (aliphatische CH₃s), 25.65-73 (aliphatische CH₂s und peptidische CH_αs), 105-137.3 (aromatische und Doppelbindungs-CHs und quaternäre Kohlenstoffatome), 165.7-176.1 (peptidische Carbonyle); E) das Infrarotspektrum, aufgezeichnet in KBr mit einem Bruker FT-IR-Spektralphotometer, Modell IFS 48, (14), weist Absorptionsmaxima auf bei (cm^–1): 3296; 3060; 2928; 1661; 1529; 1433; 1407; 1288; 1116; F) das UV-Spektrum, aufgezeichnet in Methanol:H₂O (im Verhältnis 80:20) mit einem Perkin-Elmer-Spektralphotometer Lambda 16, (15), weist zwei Schultern bei 226 und 267 nm auf; G) das Säurehydrolysat in 6N HCl, (105°C, 24 h), zeigt nach Derivatisierung mit 6-Aminochinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat das Vorliegen der folgenden Aminosäuren mit anderen nicht-identifizierten Peaks: Lanthionin, Methyllanthionin, Glycin, Prolin, Valin, Asparaginsäure (Hydrolyseprodukt von Asparagin), Phenylalanin und Leucin; H) das Säurehydrolysat in 4N Methansulfonsäure, die 0,2% (G/V) 3-(2-Aminoethyl)indol als Katalysator enthält, (115°C, 16 h), zeigt das Vorliegen von 5-Chlortryptophan; und seine Salze mit Säuren.
Antibiotikum 107891-Faktor A2 nach Anspruch 4, dem die folgende Strukturformel zugeordnet werden kann:
Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums 107891 und seiner Faktoren A1 und A2 und der Salze davon mit Säuren, wie in Anspruch 1 definiert, umfassend: – Kultivieren von Microbispora sp. ATCC PTA-5024 oder einer Variante oder Mutante davon, die die Fähigkeit zur Produktion dieses Antibiotikums beibehalten hat, unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Nährmedium, das eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält; – Isolieren des resultierenden Antibiotikums aus dem Mycelium und/oder der filtrierten Fermentationsbrühe; – Reinigen des isolierten Antibiotikums 107891 und gegebenenfalls Abtrennen von Faktor A1 und Faktor A2 daraus.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Stamm Microbispora sp. ATCC PTA-5024 oder eine das Antibiotikum 107891 produzierende Variante oder Mutante davon vorkultiviert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 und 7, wobei die Isolierung des Antibiotikums 107891 durch Filtrieren der Fermentationsbrühe durchgeführt wird, und das Antibiotikum aus der filtrierten Fermentationsbrühe nach einer Technik gewonnen wird, die ausgewählt ist aus: Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, Präzipitation durch Zusatz eines Nicht-Lösungsmittels oder durch Ändern des pHs der Lösung, Absorptionschromatographie, Verteilungschromatographie, Umkehrphasenchromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Molekül-Ausschlusschromatographie und einer Kombination von zwei oder mehr der genannten Techniken.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 und 7, wobei die Isolierung des Antibiotikums 107891 durchgeführt wird, in dem das Mycelium aus dem Überstand der Fermentationsbrühe abgetrennt wird, das Mycelium wird mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel extrahiert, wodurch nach Entfernung des verbrauchten Myceliums eine mit Wasser mischbare Lösung, die das rohe Antibiotikum enthält, erhalten wird, welche dann entweder getrennt oder im Pool mit der filtrierten Fermentationsbrühe nach Anspruch 8 verarbeitet werden kann, um das Antibiotikum 107891 zu gewinnen, und zwar mit Hilfe einer Technik, die ausgewählt wird aus: Extraktion mit einem Lö sungsmittel, Präzipitation durch Zugabe eines Nicht-Lösungsmittels oder durch Ändern des pHs der Lösung, Absorptionschromatographie, Verteilungschromatographie, Umkehrphasenverteilungschromatographie, Ionenaustauschchromatographie und Molekül-Ausschlusschromatographie oder einer Kombination aus zwei oder mehr der genannten Techniken.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Konzentration des mit Wasser mischbaren Lösungsmittels in dem Mycelium-Extrakt reduziert wird, bevor dieser zur Gewinnung des Antibiotikums daraus verarbeitet wird.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die filtrierte Fermentationsbrühe mit einem Absorptionsharz, vorzugsweise einem Polystyrol-, einem gemischten Polystyrol-Divinylbenzol- oder einem Polyamidharz, in Kontakt gebracht wird, und das Harz mit einem polaren, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel oder einem Gemisch davon mit Wasser eluiert wird, wodurch eine Lösung, die das rohe Antibiotikum 107891 enthält, erhalten wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 und 10, wobei das Mycelium mit einem C₁-C₃-Alkanol, vorzugsweise Methanol, extrahiert wird und der Myceliumextrakt mit einem Absorptionsharz, vorzugsweise einem Polystyrolharz, in Kontakt gebracht wird und daraus mit einem polaren, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel oder einem Gemisch davon mit Wasser eluiert wird, wodurch eine Lösung, die das rohe Antibiotikum 107891 enthält, erhalten wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8, 9, 10 und 12, wobei die Lösungen, die das rohe Antibiotikum 107891 enthalten, gepoolt werden und für eine weitere Reinigung des Antibiotikums 107891 bearbeitet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11, 12 und 13, wobei die Lösung, die das rohe Antibiotikum 107891 enthält, konzentriert wird und dann unter Erhalt eines festen Produkts des rohen Antibiotikums 107891 gefriergetrocknet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 und 12, wobei die Absorptionsharze, die das absorbierte Antibiotikum enthalten, gepoolt werden und ihr Gemisch mit einem polaren, mit Wasser mischbarem Lösungsmittel oder einem Gemisch davon mit Wasser eluiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 15, wobei das Antibiotikum 107891 durch ein chromatographisches Verfahren, vorzugsweise durch präparative HPLC oder Mitteldruckchromatographie, gereinigt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 16, wobei Faktor A1 und Faktor A2 durch präparative HPLC aus dem gereinigten Antibiotikum 107891 abgetrennt werden.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Antibiotikum, ausgewählt aus Antibiotikum 107891, seinem Faktor A1, seinem Faktor A2 nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und einem Gemisch der Faktoren in einem beliebigen Verhältnis oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon mit einer Säure.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18, die einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Antibiotikum 107891, sein Faktor A1, sein Faktor A2 nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder ein Gemisch der genannten Faktoren in einem beliebigen Verhältnis oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon mit einer Säure zur Verwendung als Medikament.
Verwendung von Antibiotikum 107891, seines Faktors A1, seines Faktors A2 nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eines Gemisches der genannten Faktoren in einem beliebigen Verhältnis oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon mit einer Säure zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Prävention bakterieller Infektionen.
Verwendung des Antibiotikums 107891, seines Faktors A1, seines Faktors A2 nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eines Gemisches der genannten Faktoren in einem beliebigen Verhältnis und eines nicht-toxischen Salzes davon mit einer Säure als Tierwachstumspromotor.
Biologisch reine Kultur des Stamms Microbispora sp. ATCC PTA-5024 oder einer Variante oder Mutante davon, die die Fähigkeit, das Antibiotikum nach Anspruch 1 zu produzieren, hat, wenn sie unter submersen aeroben Bedingungen in Gegenwart von assimilierbaren Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen kultiviert wird.