DE68913107T2

DE68913107T2 - Antibiotikum GE 2270.

Info

Publication number: DE68913107T2
Application number: DE68913107T
Authority: DE
Inventors: Graziella Beretta; Maurizio Denaro; Beth P Goldstein; Nicoletta Montanini; Enrico Selva
Original assignee: Lepetit SpA
Current assignee: Vicuron Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1988-09-09
Filing date: 1989-09-01
Publication date: 1994-06-09
Anticipated expiration: 2009-09-02
Also published as: EP0359062B1; PT91647B; NO176026B; IL91518A0; ZA896875B; DK436189A; FI894237A; AR242635A1; ES2061847T3; EP0359062A2; FI95930C; JP2997480B2; EP0359062A3; DK171026B1; HUT51675A; NO893608D0; FI95930B; NO893608L; KR0137944B1; CN1041182A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum mit der Bezeichnung Antibiotikum GE 2270, Additionssalze davon, pharmazeutische Präparate damit und ihre Verwendung als Medikamente, insbesondere zur Behandlung von infektiösen Erkrankungen, an denen gegenüber diesen Produkten empfindliche Mikroorganismen beteiligt sind.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen wirken auch als wachstumsfördernde Mittel bei Tieren, wie Geflügel, Schwein, Wiederkäuer, etc.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums GE 2270, das die Züchtung von Planobispora rosea ATCC 53773 oder einer das Antibiotikum GE 2270 produzierenden Variante oder Mutante davon und die Isolierung des erfindungsgemäßen Antibiotikums aus dem Mycel und/oder den Fermentationsbrühen einschließt.
Planobispora rosea ATCC 53773 wurde aus einer Bodenprobe isoliert und wurde am 14. Juni 1988 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 Maryland, U.S.A. nach dem Budapester Vertrag hinterlegt. Dem Stamm wurde die Hinterlegungsnummer ATCC 53773 zugeteilt.
Die Herstellung des Antibiotikums GE 2270 wird durch Züchten eines Planobispora-Stammes mit der Fähigkeit zu dessen Produktion, d.h. Planobispora rosea ATCC 53773 oder einer das Antibiotikum GE 2270 produzierenden Variante oder Mutante davon, unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen enthält, erzielt. Viele der üblicherweise auf dem Gebiet der Fermentation verwendeten Nährmedien können verwendet werden, jedoch sind bestimmte Medien bevorzugt. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Glucose, Mannose, Galactose, Stärke, Maismehl und dgl. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Ammoniak, Nitrate, Sojabohnenmehl, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trypton, Aminosäuren und dgl. Unter den anorganischen Salzen, die den Kulturmedien zugesetzt werden können, sind übliche lösliche Salze mit der Fähigkeit zur Abgabe von Natrium, Kalium, Eisen, Zink, Cobalt, Magnesium, Calcium, Ammonium, Chlorid, Carbonat, Sulfat, Phosphat, Nitrat und ähnlicher Ionen.
Üblicherweise wird der das Antibiotikum produzierende Stamm in einem Schüttelkolben vorgezüchtet, und dann wird die Kultur verwendet, um Flaschenfermentatoren zur Produktion beträchtlicher Mengen der antibiotischen Substanzen zu inokulieren. Das Medium, das für die Vorkultur verwendet wird, kann das gleiche sein wie dasjenige, das für größeren Fermentationen verwendet wird, aber andere Medien können auch verwendet werden. Der das Antibiotikum GE 2270 produzierende Stamm kann bei Temperaturen zwischen 20 und 40ºC, bevorzugt zwischen 24 und 35ºC gezüchtet werden. Während der Fermentation kann die Antibiotikaproduktion durch Testen von Proben der Brühe oder des Mycelextrakts auf die Antibiotikaaktivität, beispielsweise durch biologische Tests oder TLC- oder HPLC-Verfahren verfolgt werden.
Gegenüber dem Antibiotikum GE 2270 empfindliche Organismen, wie Bacillus subtilis und S. aureus, können als Testorganismen verwendet werden. Der biologische Test wird geeigneterweise nach dem Agardiffusionsverfahren auf Agarplatten durchgeführt. Die maximale Produktion der Antibiotikaaktivität tritt im allgemeinen zwischen dem zweiten und dem fünften Fermentationstag ein.
Das Antibiotikum GE 2270 wird durch Züchten des Stammes Planobispora rosea ATCC 53773 oder einer das Antibiotikum GE 2270 produzierenden Mutante oder Variante davon erzeugt und befindet sich hauptsächlich in dem Mycel.
In der vorliegenden Beschreibung soll im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Verbindungen hinsichtlich ihrer physikalisch-chemischen oder biologischen Eigenschaften der Ausdruck "Antibiotikum GE 2270" allgemein den Antibiotikum-GE 2270-Komplex, wie er am Ende des Fermentationsprozesses (vergleiche Beispiel 2) gewonnen wird, ebenso bezeichnen, wie den Antibiotikum GE 2270 Faktor A, der dessen Hauptkomponente ist.

Morphologische Eigenschaften von Planobispora rosea ATCC 53773

Planobispora rosea ATCC 53773 wächst gut auf den meisten Standardmedien. Das vegetative Mycel bildet lange und unregelmäßig verzweigte Filamente (0,5 bis 1,0 um), die den Agar durchdringen und ein kompaktes Wachstum auf dessen Oberfläche zeigen. Das Mycel bleibt, unabhängig davon, ob es in einem flüssigen oder einem festen Kulturmedium gezüchtet wurde, unfragmentiert. Seine Farbe liegt im Bereich von hellem Korallenrot bis rosafarbigem Korallenrot auf den meisten der Testmedien. Das Luftmycel ist aus langen, welligen und dünne Hyphen mit wenigen Querverzweigungen gebildet und wächst in der Luft im wesentlichen parallel zur Agaroberfläche. Das Luftmycel ist, sofern vorhanden, weiß-rosa gefärbt. Sporangien werden einzeln oder in Gruppen entlang der Hyphen des Luftmycels gebildet und besitzen eine Länge von etwa 6,0 bis 8,0 um und eine Breite von 1,0 bis 1,2 um. Sie sind durch ein kurzes Sporangiophor (1,0 bis 2,0 um lang) mit den Hyphen verbunden. Ein längsgerichtetes Paar fusiformer gerader Sporen (3,0 bis 3,5 x 1,0 bis 1,2 um) werden in jedem Sporangium gebildet. In den Sporangien sind die Sporen durch ein transversales Septum getrennt. Nach Freisetzen aus der Sporangienumhüllung werden die Sporen mittels peritricher Flagellen beweglich.

Kultureigenschaften von Planobispora rosea ATCC 53773

Zur Untersuchung der Kultureigenschaften wurde Planobispora rosea ATCC 53773 auf verschiedenen Standardmedien, die von Shirling und Gottlieb vorgeschlagen wurden (Shirling E.B. und Gottlieb D., 1966 - Method for characterization of Streptomyces species - Int. J. Syst. Bacteriol, 16, 313-340) unter Zugabe verschiedener Medien, die von Waksman (Waksman, S.A. 1961 - The Actinomycetes - The Williams and Wilkins Co. Baltimore; Bd 2, 328-334) empfohlen wurden, gezüchtet.
Die Farbbestimmung wurde, sofern notwendig, nach dem Verfahren von Maerz und Paul (Maerz A. and M. Rea Paul, 1950 - A Dictionary of Color - 2nd Edition McGraw-Hill Book Company Inc. New York) durchgeführt.
Die Fähigkeit des Organismus, verschiedene Kohlenstoffquellen zu verwerten, wurde nach dem von Shirling und Gottlieb beschriebenen Verfahren untersucht.
Die Kultur- und physiologischen Eigenschaften und die Verwertung der Kohlenstoffquellen sind in den Tabellen I, II und III dargestellt.
Die Ablesungen in Tabelle I wurden nach 2-wöchiger Inkubation bei 28ºC vorgenommen. TABELLE I Kultureigenschaften des Stammes Planobispora rosea ATCC 53773 Kulturmedien Morphologische Eigenschaften Hafermehlagar 6% ISP 2 (Hefeextrakt-Malzagar) ISP 3 (Hafermehlagar 2%) ISP 4 (anorganische Salze-Stärkeagar) ISP n 5 (Glycerin-Asparaginagar) ISP 6 (Pepton-Hefeextrakt-Eisenagar) ISP 7 (Tyrosinagar) Reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche, korallenrot-rosa (2-H-10), reichliche Produktion eines hellrosa Luftmycels (1-A-9). Reichliches Wachstum mit gefältelter Oberfläche, hellrosa (2-E-9), Spuren eines hellen Luftmycels. Mäßiges Wachstum mit glatter Oberfläche, hellrosa (2-E-8), Spuren eines rosa-weißen Luftmycels. Mäßiges Wachstum mit glatter Oberfläche, korallenrot-rosa (2-E-10). Mäßiges Wachstum mit glatter und flacher Oberfläche, hellrosa (2-A-9), reichliche Produktion eines weißen Luftmycels. Mäßiges Wachstum, leicht gefältelt hellkorallenrot-rosa (1-A-10). Mäßiges Wachstum mit glatter und dünner Oberfläche, hellrosa (1-A-9) reichliche Bildung eines hellrosa (1-C-9) Luftmycels. Hichey- und Tresner-Agar Czapek-Glucoseagar Glucose-Asparaginagar Nähragar Bennett Agar Calciummalatagar Magermilchagar Eialbuminagar Reichliches Wachstum mit dicker und gefältelter Oberfläche, hellkorallenrot-rosa (1-A-10), mäßige Produktion eines hellrosa Luftmycels. Sehr spärliches Wachstum mit glatter und dünner Oberfläche, mäßige Produktion eines hellrosa Luftmycels. Mäßiges Wachstum mit glatter und dünner Oberfläche, farblos, kein Luftmycel. Gutes Wachstum mit glatter Oberfläche, hellorange mit einer rosaartigen Tönung (9-A-7). Mäßiges Wachstum mit leicht gefältelter Oberfläche, hellbernsteinfarbig-rosa (10-A-6). Schlechtes Wachstum mit glatter und flacher Oberfläche, farblos. Mäßiges Wachstum mit glatter Oberfläche, korallenrot-rosa (2-F-9). Schlechtes Wachstum mit glatter und dünner Oberfläche, farblos bis hellrosa (2-A-8). Dextrose-Tryptoseagar Kartoffelagar Kein Wachstum. Gutes Wachstum mit glatter Oberfläche, hellorange mit einer rosaartigen Tönung (9-A-7).
Buchstaben und Ziffern beziehen sich auf die Farbbestimmung gemäß Maerz und Paul (siehe vorstehend). TABELLE II Physiologische Eigenschaften von Planobispora rosea ATCC 53773 Tests Ergebnisse Stärkehydrolyse Schwefelwasserstoffbildung Tyrosinreaktion Caseinhydrolyse Calciummalatabbau Gelatineverflüssigung Koagulation von Milch Peptonisation von Milch Nitratreduktion positiv negativ schwach positiv TABELLE III Kohlenhydratverwertung Kohlenstoffquelle Wachstum Arabinose Xylose Ribose Fructose Galactose Glucose Rhamnose Lactose Saccharose Maltose Raffinose Cellulose Mannit Salicin Inosit Cellobiose + mäßiges Wachstum +/- spärliches Wachstum - kein Wachstum
Für diesen Test wird Medium Nr. 8 verwendet und die Ergebnisse werden nach 2-wöchiger Inkubation bei 28-30ºC bewertet.

Temperaturempfindlichkeit

Die optimale Wachstumstemperatur liegt im Bereich von 28ºC bis 37ºC. Kein Wachstum wird bei 15ºC und 50ºC beobachtet, mäßiges Wachstum bei 20ºC.

Chemotaxonomische Eigenschaften

Zellwandanalyse:

Die Analyse der in der Zellwand vorhandenen Aminosäuren wurde nach dem von Becker et al. ("Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole cell hydrolyzates", Appl. Microbiol. 12 421-423, 1964) beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Die Analyse des Gesamtzellhydrolysats zeigte das Vorhandensein von meso-Diaminopimelinsäure.
Kein Glycin wurde bei der Analyse des reinen Zellwandpräparats, das nach dem Verfahren von Kawamoto et al. (Kawamoto I., O. Tetsuo, and N. Takashi, "Cell Wall composition of Micromonospora olivoasterosporia, Micromonospora sagamiensis and related organism." J. Bacteriol. 146, 527- 534, 1981) erhalten wurde, gefunden.

Zuckermuster der Gesamtzelle:

Die Analyse des Zuckergehalts in dem Gesamtzellhydrolysat wurde nach dem Verfahren von Lechevalier M.P. ("Identification of aerobe actinomycetes of clinical importance" J. Lab. Clin. Med 71 934-944, 1968) durchgeführt, wobei Celluloseplatten für die Dünnschichtchromatographie, wie von Staneck J. L. und G.D. Roberts ("Simplified approach to identification of aerobic actinomycetes by thin layer chromatography", Appl. Microbiol. 28, 226- 231, 1974) beschrieben, mit dem folgenden Lösungsmittelsystem: Ethylacetat-Pyridin-Wasser (100:35:25 Vol./Vol.), verwendet wurden.
Die so erhaltenen Ergebnisse zeigten das Vorhandensein von Madurose (3-O-Methyl-D-galactose) und das Fehlen von Arabinose und Galactose.

Identität des Stammes Planobispora rosea ATCC 53773

Dieser Stamm wurde der Gattung Planobispora zugeordnet und als Planobispora rosea aufgrund der folgenden morphologischen und chemischen Eigenschaften klassifiziert:
a) Vorhandensein von meso-Diaminopimelinsäure und Fehlen von Glycin in der Zellwand (Zellwand Chemotyp III)
b) Vorhandensein von Madurose in dem Gesamtzellhydrolysat (Zuckermuster der Gesamtzelle B)
c) Bildung langer und zylindrischer Sporangien, die ein Paar motiler Sporen enthalten, auf dem Luftmycel
d) rosafarbiges vegetatives Mycel.
Die vorstehend beschriebenen morphologischen Eigenschaften von Planobispora rosea ATCC 53773 unterscheiden sich nicht wesentlich von denen eines Planobispora rosea- Stammes, der von J.E. Thieman et al. in "The Actinomycetales", The Jena Intern. Symp. on Taxon., September 1968, Hrg. H. Prauser, Jena, beschrieben wurde. Er wurde bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer 23866 hinterlegt. Für diesen Stamm wurde keine Antibiotikaproduktion beschrieben.
Wie bei anderen Mikroorganismen unterliegen die Eigenschaften der GE 2270 produzierenden Stämme Schwankungen. Beispielsweise können künstliche Varianten und Mutanten des Stammes durch Behandlung mit verschiedenen bekannten Mutagenen, wie z.B. UV-Strahlen, Röntenstrahlen, Hochfrequenzwellen, radioaktive Strahlen und Chemikalien, wie salpetrige Säure, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin und vielen anderen erhalten werden. Alle natürlichen und künstlichen Varianten und Mutanten, die zu einer Art der Gattung Planobispora gehören und das Antibiotikum GE 2270 produzieren, gelten als dem Stamm Planobispora rosea ATCC 53773 für die Zwecke dieser Erfindung äquivalent und sollen in den Schutzbereich dieser Erfindung fallen.
Wie vorstehend erwähnt, findet sich das Antibiotikum GE 2270 hauptsächlich in dem Mycel eines produzierenden Stammes, während eine geringere Menge an Substanz auch in der Fermentationsbrühe gefunden wird.
Die Gewinnung des Antibiotikums GE 2270 aus dem Mycel oder den Fermentationsbrühen des produzierenden Mikroorganismus wird nach an sich bekannten Techniken, wie Extraktion mit Lösungsmitteln, Präzipitation durch Zugabe von Nicht-Lösungsmitteln oder durch Veränderung des pH-Werts der Lösung, Verteilungschromatographie, Umkehrphasen-Verteilungschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Molekülausschlußchromatographie und dgl. durchgeführt.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Gewinnung des erfindungsgemäßen Antibiotikums aus dem Mycel umfaßt die Extraktion des filtrierten oder zentrifugierten Mycels mit einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel, die Konzentrierung der Extrakte und die Gewinnung des Rohantibiotikums durch Präzipitation, gegebenenfalls unter Zugabe eines Präzipitationsmittels, durch Extraktion des wäßrigen Rückstands mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel oder durch Adsorptionschromatographie mit anschließender Elution des gewünschten Produkts von der Adsorptionsmatrix.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Isolierung des erfindungsgemäßen Antibiotikums aus der Fermentationsbrühe umfaßt die Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, anschließende Präzipitation aus den konzentrierten Extrakten, gegebenenfalls unter Zugabe eines Präzipitationsmittels, oder weitere Extraktion eines wäßrigen Rückstands davon mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel. In einer anderen Ausführungsform kann die Fermentationsbrühe mit einer Adsorptionsmatrix in Kontakt gebracht werden und anschließend mit einem polaren Elutionsgemisch eluiert werden. Dieses chromatographische Verfahren kann auch auf einen konzentrierten Extrakt, der aus der Fermentationsbrühe erhalten wurde, anstelle auf die Fermentationsbrühe selbst angewendet werden.
Der in dieser Anmeldung verwendete Ausdruck "wassermischbares Lösungsmittel" soll die gegenwärtig auf diesem Fachgebiet übliche Bedeutung für diesen Ausdruck besitzen und bezieht sich auf Lösungsmittel, die bei Verwendungsbedingungen mit Wasser in einem angemessen weiten Konzentrationsbereich mischbar sind.
Beispiele für wassermischbare organische Lösungsmittel, die zur Extraktion des erfindungsgemäßen Antibiotikums aus der Mycelmasse verwendet werden können, sind: niedere Alkanole, z.B. (C&sub1;-C&sub3;)Alkanole, wie Methanol, Ethanol und Propanol; Phenyl(C&sub1;-C&sub3;)alkanole, wie Benzylalkohol; niedere Ketone, z.B. (C&sub3;-C&sub4;)Ketone, wie Aceton und Ethylmethylketon; cyclische Ether, wie Dioxan und Tetrahydrofuran; Glycole und ihre teilveretherten Produkte, wie Ethylenglycol, Propylenglycol und Ethylenglycolmonomethylether; niedere Amide, wie Dimethylformamid und Diethylformamid.
Der in dieser Anwendung verwendete Ausdruck "mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel" soll die gegenwärtig auf dem Fachgebiet für diesen Begriff verwendete Bedeutung besitzen und bezieht sich auf Lösungsmittel, die bei Verwendungsbedingungen geringfügig oder praktisch nicht mit Wasser in einem angemessen weiten Konzentrationsbereich, der für die beabsichtigte Verwendung geeignet ist, mischbar sind.
Beispiele für mit Wasser nicht mischbare organische Lösungsmittel, die zur Extraktion des erfindungsgemäßen Antibiotikums aus der Fermentationsbrühe verwendet werden können, sind: die üblichen Kohlenwasserstofflösungsmittel, die linear, verzweigt oder cyclisch sein können, wie Hexan oder Cyclohexan; halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Dichlorethan, Fluorbromethan, Dibromethan, Trichlorpropan, Chlortrifluoroctan, und dgl.; aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol, Xylol und dgl.; Ester mit mindestens vier Kohlenstoffatomen, wie Ethylacetat, Propylacetat, Ethylbutyrat und dgl.; Alkanole mit mindestens vier Kohlenstoffatomen, die linear, verzweigt oder cyclisch sein können, wie Butanol, 1-Pentanol, 2-Pentanol, 3-Pentanol, 1-Hexanol, 2-Hexanol, 3-Hexanol, 3,3-Dimethyl-1-butanol, 4-Methyl-1-pentanol; 3-Methyl-1-pentanol, 2,2-Dimethyl-3- pentanol, 2,4-Dimethyl-3-pentanol, 4,4-Dimethyl-2- pentanol, 5-Methyl-2-hexanol, 1-Heptanol, 2-Heptanol, 5- Methyl-1-hexanol, 2-Ethyl-1-hexanol, 2-Methyl-3-hexanol, 1-Octanol, 2-Octanol, Cyclopentanol, 2-Cyclopentylethanol, 3-Cyclopentyl-1-propanol, Cyclohexanol, Cycloheptanol, Cyclooctanol, 2,3-Dimethylcyclohexanol, 4-Ethylcyclohexanol, Cyclooctylmethanol, 6-Methyl-5-hepten-2-ol, 1- Nonanol, 2-Nonanol, 1-Decanol, 2-Decanol und 3-Decanol; geradkettige oder verzweigtkettige Alkylether und Gemische davon, wie Petrolether, Ethylether, Propylether, Butylether, etc.; und Gemische oder funktionelle Derivate davon.
Wie einem Fachmann bekannt, kann die Phasentrennung durch Salzzugabe verbessert werden.
Wenn nach einer Extraktion eine wäßrige Phase, die eine wesentliche Menge eines organischen Lösungsmittels enthält, erhalten wird, kann es zweckmäßig sein, das Wasser azeotrop daraus abzudestillieren. Im allgemeinen ist dazu die Zugabe eines Lösungsmittels mit der Fähigkeit, ein minimales azeotropes Gemisch mit Wasser zu bilden, und gegebenenfalls die anschließende Zugabe eines Präzipitationsmittels zur Ausfällung des gewünschten Produkts erforderlich. Repräsentative Beispiele für organische Lösungsmittel mit der Fähigkeit zur Bildung eines minimalen azeotropen Gemisches mit Wasser sind n- Butanol, Benzol, Toluol, Butylether, Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform, Cyclohexan, 2,5- Dimethylfuran, Hexan und m-Xylol; das bevorzugte Lösungsmittel ist n-Butanol.
Beispiele für Präzipitationsmittel sind Petrolether, Niederalkylether, wie Ethylether, Propylether, und Butylether und Niederalkylketone wie Aceton.
Beispiele für chromatographische Systeme, die zweckmäßigerweise zur Gewinnung des erfindungsgemäßen Antibiotikums verwendet werden können, sind Polystyrol oder gemischte Polystyrol-Divinylbenzolharze, wie Amberlite XAD2 oder XAD4 (Rohm and Haas), S112 (Dow Chemical Co.) und Diaion HP 20 (Mitsubishi); Acrylharze, wie XAD7 oder XAD8 (Rohm and Haas); Polyamide, wie Polycaprolactame, Nylone und vernetzte Polyvinylpyrrolidone, im allgemeinen mit einem Porenvolumen (ml/g) im Bereich zwischen 1 und 5, einer spezifischen Oberfläche (m²/g) im Bereich zwischen 1 und 100, einer relativen Dichte (g/ml) im Bereich zwischen 0,15 und 0,50, einem durchschnittlichen Porendurchmesser (Angströmeinheiten) im Bereich zwischen 100 und 3000 und einer Teilchengrößenverteilung, bei der mindestens 40% der Teilchengröße unter 300 um liegt, wie Polyamid-CC 6, Polyamid-SC 6, Polyamid-CC 6,6, Polyamid-CC 6AC und Polyamid-SC 6AC (Macherey-Nagel & Co., Westdeutschland), Polyvinylpyrrolidonharz PVP-CL (Aldrich Chemie GmbH & Co. KG, Westdeutschland), Polyamidharz PA 400 (M. Woelm AG, Westdeutschland); und Kohlenstoff.
Im Falle eines Polystyrol- oder Acrylharzes ist ein bevorzugtes Elutionsmittel ein polares Lösungsmittelgemisch aus wassermischbaren Lösungsmitteln, wie den vorstehend angegebenen. Im Falle eines Polyamidharzes ist das Elutionsmittel bevorzugt ein wäßriges Gemisch mit einem wassermischbaren Lösungsmittel, wie den vorstehend erwähnten, während für Kohlenstoff ein bevorzugtes Elutionsmittel ein niederes Keton, wie Aceton, oder ein niederer Alkohol, wie Methanol, ist.
Die weitere Reinigung eines Rohpräparats des Antibiotikums GE 2270 kann nach irgendeiner der bekannten Techniken durchgeführt werden, aber wird bevorzugt mittels chromatographischer Verfahren durchgeführt.
Beispiele für diese chromatographischen Verfahren sind die vorstehend für die Stufe der Gewinnung beschriebenen und umfassen auch Chromatographie auf stationären Phasen, wie Silicagel, Aluminiumoxid, Florisil und dgl., mit einer organischen Elutionsphase aus Gemischen aus Lösungsmitteln, einschließlich halogenierter Kohlenwasserstoffe, Ether, höherer Ketone des bereits vorstehend erwähnten Typs, oder Umkehrphasen-Chromatographie auf silanisiertem Silicagel mit verschiedenen funktionellen Derivatisierungen und Elutionen mit einem wäßrigen Gemisch aus wassermischbaren Lösungsmitteln der vorstehend erwähnten Art.
Zweckmäßigerweise kann auch die sogenannte sterische Ausschlußchromatographietechnik mit guten Reinigungsergebnissen verwendet werden. Insbesondere werden quervernetzte Dextrane mit kontrollierter Porengröße, in denen die meisten Hydroxylgruppen alkyliert wurden, z.B. Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals, AB) nützlicherweise bei dieser Technik verwendet.
Wie auf dem Fachgebiet üblich, können die Produktions- ebenso wie die Gewinnungs- und Reinigungsschritte mittels einer Vielzahl analytischer Verfahren, einschließlich biologischer Tests, wie Papierscheibchen- oder Agardiffusionstests auf empfindliche Mikroorganismen, oder TLC- oder HPLC-Verfahren, die einen UV- oder mikrobiellen Detektionsschritt umfassen, verfolgt werden.
Eine bevorzugte HPLC-Technik ist die Umkehrphasen- HPLC, bei der eine Säule mit porösen und kugelförmigen Teilchen aus silanisiertem Silicagel z.B. mit C-18-Alkylgruppen derivatisiertem Silicagel mit einem gleichförmigen Durchmesser (wie z.B. 5 um Ultrasphere ODS Altex; Beckman Co.), eine Vorsäule, die aus mit C-18-Alkylgruppen derivatisiertem Silicagel (z.B. RP 18 Brownlee Labs) besteht, und ein Elutionsmittel, das ein Gemisch in einem linearen Gradienten aus einem polaren mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie einem der vorstehend beschriebenen, in einer wäßrigen gepufferten Lösung ist, verwendet werden.
Vorzugsweise wird diese Lösung auf einen PH-Wert von 5-7 eingestellt. Ein besonders bevorzugtes Elutionsmittel ist ein linearer Gradient von 45 bis 70% Elutionsmittel A in Elutionsmittel B, wobei das Elutionsmittel B ein Gemisch aus Acetonitril/wäßrigem Puffer, pH 5-7, 10:90 ist, und das Elutionsmittel A ein Gemisch aus Acetonitril/wäßrigem Puffer, pH 5-7, 70:30 ist.

Physikalisch-chemische Eigenschaften des Antibiotikum GE 2270-Faktors A:

A) UV-Absorptionsspektrum mit den folgenden Absorptionsmaxima (gezeigt in Fig. 1 der beigefügten Figuren) Lambda max (nm) 0,1 MHCl 0,1 M KOH Phosphatpuffer pH 7,4 Methanol (Schulter)
B) Infrarotabsorptionsspektrum in Nujolsuspension mit den folgenden Absorptionsmaxima (cm&supmin;¹) (gezeigt in Fig. 2 der beigefügten Figuren):
3700-3060; 3060-2660 (Nujol) ; 1650; 1590-1490; 1490-1420 (Nujol) ; 1375 (Nujol) ; 1310; 1245; 1210; 1165; 1090; 1060; 1020; 970; 930; 840, 810, 750, 720 (Nujol), 700;
die Haupt-IR-Absorptionsbanden dieses Spektrums können folgendermaßen zugeordnet werden: Zuordnung ν NH, ν OH Amid I (ν C=0) heterocyclisches ν C=C und ν C=N Amid II (δ NH) aromatisches δ CH heterocyclisches γ CH aromatisches γ CH
C) ¹H-NMR-Spektrum mit den folgenden Signalgruppen (in ppm) bei 500 MHz, aufgenommen in DMSO-d&sub6; (Hexadeuterodimethylsulfoxid) unter Verwendung von TMS als internem Standard (0,00 ppm) (gezeigt in Fig. 3); die Zahl der Protonen für jedes Signal ist in Klammern angegeben.
9,02 (1); 8,68 (1); 8,70 (1); 8,57 (1); 8,50 (1); 8,43 (1); 8,37 (1); 8,26 (1); 8,25 (1) ; 7,4-7,20 (9); 6.96 (2); 6,02 (1); 5.30-5,18 (3); 5,01 (1); 4,97 (2); 4,80 (1); 4,56 (1); 4,30 (1); 4,26 (1); 3,98 (1); 3,81 (1); 3,79 (1); 3,38 (3); 2,72 (1); 2,58 (3); 2,48 (3); 2,16 (1); 2,13 (1); 1,96 (2); 1,88 (1); 1,34 (1); 0,87 (3); 0,84 (3);
D) ¹³C-NMR-Spektrum mit den folgenden Signalgruppen (ppm) bei 125 MHz in DMSO-d&sub6; mit TMS als internem Standard (0,00 ppm), wobei Q quaternäre C-Atome oder C=O-Gruppen bedeutet (gezeigt in Fig. 4);
173,69, Q; 171,10, Q; 169,83, Q; 169,51, Q; 168,45, Q; 168,26, Q; 167,84, Q; 165,68, Q; 164,75, Q; 161,40, Q; 161,23, Q; 160,46, Q; 160,29, Q; 159,35, Q; 153;42, Q; 150,31, Q; 150,11, Q; 149.41, Q; 146,93, Q; 144,73, Q; 143,75, Q; 142,10, Q; 141,78, Q; 141,33, CH; 140,97, Q; 139,53, Q; 128,68, CH; 127,99, 2 ; 127,67, Q; 127,67, CH; 126,88, CH; 126,76, 2 ; 123,17, CH; 118,66, CH; 116,42, CH; 73,81, CH; 69,41, CH&sub2;; 67,97, CH; 67,36, CH&sub2;; 60,12, CH; 58,63, CH&sub3;; 58,24, CH; 55,41, CH; 48,15, CH; 47,03, CH&sub2;; 41,19, CH&sub2;; 37,60, CH&sub2;; 34,06, CH; 29,76, CH&sub2;; 25,85, CH&sub3;; 24,28, CH&sub2;; 18,49, CH&sub3;; 17,98, CH&sub3;; 11,99, CH&sub3;;
E) Retentionszeit (Rt) von 14,9 Minuten bei der Analyse durch die Umkehrphasen-HPLC unter den folgenden Bedingungen:
Säule: Ultrasphere ODS (Umkehrphasen-silanisiertes Silicagel; 5 um) Altex (Beckman) 4,6 mm (Innendurchmesser) x 250 mm
Vorsäule: Brownlee Labs RP 18 (Octadecylsilan- Silicagel; 5 um)
Elutionsmittel A: Acetonitril-18mM Natriumphosphat 70:30 (Vol.Vol.), eingestellt auf einen pH-Wert von 7,0
Elutionsmittel B: Acetonitril-18mM Natriumphosphat 10:90 (Vol./Vol.), eingestellt auf einen pH-Wert von 7,0
Elutionsart: linearer Gradient von Elutionsmittel A in Elutionsmittel B von 45% bis 70% in 20 Minuten
Fließgeschwindigkeit: 1,8 ml/min
UV-Detektor: 254 nm
Interner Standard: Chloramphenicol (Rt = 3,7 min)
F) Elementaranalyse, nachdem die Probe vorher bei etwa 140ºC in einer inerten Atmosphäre getrocknet wurde, ergibt die folgende Zusammensetzung: Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Schwefel.
G) Rf-Wert von 0,37 im folgenden chromatographischen System: Dichlormethan:Methanol, 9:1 (Vol./Vol.) unter Verwendung von Silicagelplatten (Silicagel 60F&sub2;&sub5;&sub4;, Merck Co) Sichtbarmachung: UV-Licht bei 254 nm, gelber Fleck mit Ioddämpfen oder Bioautographie unter Verwendung von B. subtilis ATCC 6633 auf Minimal-Davis-Medium; interner Standard: Chloramphenicol (Rf 0,56)
H) FAB-MS-Analyse, die das niedrigste Massenisotop des protonierten Molekülions bei m/z 1290,3 + 0,1 Dalton zeigt. Alle anderen Peaks über 800 m/z-Masseneinheiten (wobei Isotop-Peaks nicht gezählt werden) im Spektrum waren niederer als 20% des Molekülions, bei Analyse mit einem Kratos MS-50-Doppelfokus-Massenspektrometer unter den folgenden experimentellen Bedingungen: Xe-Fast-Atom-Bombardment bei 6 kV; Glycerinmatrix; positive Ionisierungsart
I) Eine Aminosäureanalyse des Salzsäurehydrolysats zeigt die Gegenwart der folgenden natürlichen Aminosäuren: Glycin, (L)-Prolin und (L)-Serin unter den folgenden experimentellen Bedingungen:
die Probe wird bei 105ºC 20 Stunden lang in Gegenwart von 6N HCl, die 1% Phenol enthält, hydrolysiert und dann in zwei Schritten folgendermaßen derivatisiert:
a) Bildung der n-Propylester der Carbonsäurefunktionen mit 2M HCl in wasserfreiem Propanol (90ºC, 1 h) und anschließende Trocknung unter Stickstoff;
b) Umwandlung der freien Aminogruppen zu Amiden mit Pentafluorpropionsäureanhydrid/wasserfreiem Dichlormethan, 1/9 (Vol./Vol.) bei Raumtemperatur für eine Stunde, gefolgt von Trocknen unter Stickstoff; der so erhaltene derivatisierte Rest wird in Dichlormethan gelöst und durch GC-MS unter Verwendung eines HP5985B-Systems unter den folgenden Bedingungen analysiert:
Säule: chirale n-Propionyl-L-Valin-t-butylamid-Polysiloxan beschichtete Fused-Silica-Capillarsäule (25 m x 0,2 mm Innendurchmesser; C.G.C. ANALYTIC); Temperaturprogramm 80ºC für 4 Minuten, dann 4ºC/min.

L) Ionisierungsstudien

Es werden keine ionisierbaren Funktionen durch Titration mit 0,1 N HCl und 0,1 N NaOH in Methylcellosolve/Wasser entdeckt; eine schwach-basische Funktion wird durch Titration mit 0,1 N HClO&sub4; in einem nicht-wäßrigen Medium (Essigsäure) nachgewiesen;

M) Spezifische Rotation

[α]²&sup0;D = + 140,8; absolutes Ethanol bei einer Konzentration von etwa 5 g/l.
Die antimikrobielle Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen kann durch eine Reihe von in vitro-Standardtests nachgewiesen werden.
Die MHK-Werte für Clostridium difficile, Propionibacterium acnes, und Bacteroides fragilis wurden durch Agarverdünnung (Inocula 10&sup4; KBE) bestimmt. Die MHK-Werte für die anderen Organismen wurden durch Mikrobrühenverdünnung (Inocula 10&sup4; bis 10&sup5; KBE/ml) bestimmt. Die Inocula für Ureaplasma urealyticum betrugen etwa 10&sup4; farbverändernde Einheiten/ml. Die Inkubationszeiten betrugen 18-24 Stunden, ausgenommen für N. gonorrhoeae, Branhamella catarrhalis, H. influenzae, C. difficile, P. acnes, und B. fragilis (48 h). Alle Organismen wurden bei etwa 37ºC inkubiert, ausgenommen Candida albicans (30ºC). N. gonorrhoeae und H. influenzae wurden in einer 5%igen CO&sub2;-Atmosphäre, Anaerobier in einem anaeroben Gasgemisch inkubiert. Die verwendeten Medien waren: Iso-Sensitest-Brühe (Oxoid) (Staphylococcen, Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae); Todd-Hewitt- Brühe (Difco) (sonstige Steptococcen); GC-Basenbrühe ("GC- base broth") (Difco) + 1% IsoVitalex BBL (N. gonorrhoeae); Hirn-Herz-Infusionsbrühe (Difco) + 1% Supplement C (Difco) (H. influenzae); Mueller-Hinton-Brühe (BBL) (Branhamella catarrhalis); AC medium (Difco) (C. perfringens); Wilkins- Chalgren-Agar (Oxoid) (sonstige Anaerobier) (T.D. Wilkins und S. Chalgren, Antimicrob. Ag. Chemother. 10, 926, 1976); Evans und Taylor-Robinson-Brühe (Difco) mit Supplementen für U. urealyticum; Hefestickstoffbrühe (Difco) (Candida albicans).
Die minimalen Hemmkonzentrationen (MHK, ug/ml) für einige Mikroorganismen sind in der nachstehenden Tabelle IV angegeben. TABELLE IV Stamm MHK (ug/ml) Antibiotikum GE-2270-Faktor A Staph. aureus Tour L165 Staph. aureus Tour L165 (10&sup6; KBE/ml) Staph. aureus Tour L165 + 30% Rinderserum Staph. epidermidis L147 ATCC 12228 Staph. haemolyticus L602 Staph. haemolyticus L602 (10&sup6; KBE/ml) Strep. pyogenes C203 Strep. pneumoniae UC41 Strep. faecalis ATCC 7080 Strep. mitis L796 Clostridium perfringens ISS 30543 Clostridium difficile ATCC 9689 Propionibacterium acnes ATCC 6919 Bacteroides fragilis ATCC 23745 Neisseria gonorrhoeae ISM68/126 Branhamella catarrhalis ATCC 8176 Haemophilus influenzae ATCC 19418 Ureaplasma urealyticum L 1479 Escherichia coli SKF 12140 Proteus vulgaris ATCC 881 Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 Klebsiella pneumoniae L142 Candida albicans SKF 2270
Die Wirksamkeit des Antibiotikums GE 2270 wurde auch in in-vitro-Versuchen gegen klinische Enterococcen-Isolate bestätigt.
Tabelle V zeigt die Ergebnisse dieser Versuche. TABELLE V Wirksamkeit des Antibiotikums GE 2270 gegen Enterococcen Art Anzahl der Stämme MHK-Bereich Strep. faecalis * einschließlich 4 Vancomycin-resistenter Stämme Strep. faecium * einschließlich 5 Vancomycin-resistenter Stämme
Die Ergebnisse, die sich auf einige in-vitro-Tests gegen in Kliniken isolierte Coagulase-negative Staphylococcen beziehen, sind in der nachstehenden Tabelle VI dargestellt. TABELLE VI Wirksamkeit des Antibiotikums GE 2270 gegen Coagulase-negative Staphylococcen Staph. epidermidis Staph. haemolyticus
Das antimikrobielle Aktivitätsspektrum des Antibiotikums GE 2270 umfaßt auch Anaerobier, wie durch in der nachstehenden Tabelle VII dargestellte Ergebnisse des in- vitro-Versuchs gezeigt wird. TABELLE VII Wirksamkeit von GE 2270 gegen Anaerobier Bacteroides fragilis Propionibacterium acnes
Die Wirksamkeit gegen P. acnes wurde auch in einem in-vitro-Versuch mit 11 klinisch-isolierten Stämmen, dessen Ergebnisse nachstehend dargestellt sind, bestätigt. Wirksamkeit des Antibiotikums BE 2270 gegen P. acnes Anzahl der Stämme MHK-Bereich

Bakterizide Wirksamkeit gegen Enterococcus faecalis

Zeit-Abtötungskurven wurden in 10 ml Todd-Hewitt- Brühe in 100ml-Erlenmeyer-Kolben unter Inkubation bei 37ºC ohne Rühren erstellt. Eine logarithmisch wachsende Kultur des Enterococcus faecalis-Stammes L 149 wurde mit 1,4 x 10&sup7; KBE/ml inokuliert.
Das Referenzantibiotikum (Teicoplanin, 8 mg/l) tötete 99% der infizierenden Bakterien in 48 Stunden ab, während der Antibiotikum GE 2270 Faktor A (0,13 mg/l) 99,8% der Bakterien innerhalb von 2 Stunden und 99,99% innerhalb von 48 Stunden in dieser Dosierung oder innerhalb von 24 Stunden in einer Dosierung von 4 mg/l abtötete.
Diese Wirksamkeit gegen Enterococcus faecalis erstreckt sich auch auf Stämme, die gegen Glycopeptidantibiotika resistent sind.

Wirksamkeit gegen Gardnerella vaginalis

13 klinische Isolate von G. vaginalis wurden auf Casman-Agar mit 5% Kaninchenblut und 0,15% lysiertem Kaninchenblut (Inoculum etwa 10&sup4; KBE) getestet. Der MHK-Wert des Antibiotikum GE 2270-Faktors A lag im Bereich von 2-4 mg/l; der MHK&sub5;&sub0;-Wert betrug 2 mg/l. Die Inkubation wurde 48 Stunden lang bei 37ºC in einem anaeroben Gasgemisch durchgeführt.

Experimentelle Sepsis bei Mäusen

Die antimikrobielle Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindung wurde auch bei experimenteller Sepsis bei Mäusen bestätigt.
Gruppen von acht CD1-Mäusen beiderlei Geschlechts (Charles River, durchschnittliches Gewicht 18-22 g) wurden intraperitoneal mit Staphylococcus aureus ATCC 19636 infiziert. Die antibakterielle Stimulierungsdosis (10&sup6; Zellen/Maus) wurde in Suspension in 0,5 ml 5%igem bakteriologischem Mucin (Difco) verabreicht. Die Testverbindung wurde intravenös einmal unmittelbar nach Infektion in einer sterilen wäßrigen Lösung, die 5% Dimethylformamid und 10% Cremophor EL (polyethoxyliertes Rhizinusöl) enthielt, verabreicht.
Die ED&sub5;&sub0; wurde am siebten Tag aus dem Prozentsatz der bei jeder Dosierung überlebenden Tiere nach dem Spearman und Kaerber Verfahren berechnet; der Wert betrug 1,13 mg/kg.

Experimentelle Endocarditis bei Ratten

Endocarditis wurde in männlichen CD-Ratten (Charles River) mit einem Gewicht von etwa 200 g induziert. Ein Polyethylenkatheter (pP.25 Portex) wurde durch die Aortaklappe in den linken Ventrikel über die rechte Carotisarterie eingeführt und mit einer Seidenklemme gesichert. Die korrekte Anordnung des Katheters wurde unter Verwendung eines aufzeichnenden Verstärkers (Hewlett Packard Modell 7782A) mit einem Drucküberträger kontrolliert. Zwei Tage später wurden die Ratten durch intravenöse Injektion mit 0,5 ml Kochsalzlösung, die 10&sup4; KBE S. aureus L 1524 enthielt, infiziert. Es wurde 5 Tage lang beginnend 16 Stunden nach der Infektion behandelt. Der Antibiotikum GE 2270-Faktor A, der in Propylenglycol:Cremophor EL:5% Glucose (10:20:70) solubilisiert war, wurde i.v. in einer Dosierung von 20 mg/kg zweimal täglich verabreicht. Die überlebenden Ratten wurden am sechsten Tag nach der Behandlung getötet und ihre Herzen wurden entnommen. Jedes Tier, das vor dem Ende der Therapie gestorben war, wurde autopsiert, und sein Herz wurde entnommen. Jedes Herz wurde gewogen und homogenisiert. Die Homogenate wurden schrittweise verdünnt und auf Todd-Hewitt-Agar zur Bestimmung des Bakteriengehalts plattiert. Das Vorhandensein von Blut in den Gesamtherzhomogenaten beeinflußte die Ergebnisse nicht, da die Bakterientiter in dem Blut immer mindestens 1000-fach niedriger als im Herzen waren. Die Daten wurden statistisch mittels des Mehrfachvergleichstests nach Scheffe analysiert. Die Ratten, die innerhalb von 40 Stunden nach der Infektion gestorben waren, wurden von der statistischen Analyse ausgeschlossen. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind nachstehend angegeben: Wirksamkeit des Antibiotikum GE 2270-Faktors A bei Staphylococcen-Endocarditis bei Ratten. Infizierender Organismus ** Therapie Tagesdosis (mg/kg) Weg Anzahl der Ratten Log&sub1;&sub0; KBE/g Herz (Mittelwert ± SA) *** S. aureus L1524 keine Träger GE 2270-Faktor A
* p < 0,001 gegen Kontrollen (ohne Behandlung oder behandelt mit dem Träger)
*** Bakterielle Belastung des Herzens zu Beginn der Therapie: 7,36±0,32 (Mittelwert ± SA des log&sub1;&sub0; KBE/g Herz für 5 Tiere)
** MHK-Wert des Antibiotikum GE 2270-Faktors A für S. aureus L1524: 0,25 ug/ml.

Akute Toxizität

An Mäusen durchgeführte Tests auf die akute Toxizität zeigten, daß der LD&sub5;&sub0;-Wert für den Antibiotikum GE 2270- Faktor A höher als 100 mg/kg i.v. war und höher als 500 mg/kg i.p. bei dieser Tierart war.
Angesichts dieser Eigenschaften kann die erfindungsgemäße Verbindung als Wirkstoff zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Menschen oder Tieren verwendet werden.
Insbesondere ist der Antibiotikum GE 2270-Faktor A ein antimikrobielles Mittel, das hauptsächlich gegen grampositive Bakterien und grampositive sowie gramnegative Anaerobier wirksam ist. Bei der Staphylococcen-Endocarditis scheint es auch ohne irgendeine Kreuzresistenz mit Meticillin, Aminoglycosiden oder Glycopeptidantibiotika sehr wirksam zu sein.
Die therapeutische Hauptindikation des erfindungsgemäßen Antibiotikums ist somit die Behandlung von Infektionen mit einem gegenüber dem Antibiotikum empfindlichen Mikroorganismus.
Der Ausdruck "Behandlung" soll auch Prophylaxe, Therapie und Heilung umfassen.
Der Patient, der diese Behandlung erhält, ist ein beliebiges Tier, das der Behandlung bedarf, einschließlich Primaten, insbesondere Menschen und anderer Säugetiere, wie Pferde, Rinder, Schweine und Schafe, und Geflügel und Haustieren im allgemeinen.
Die erfindungsgemäße Verbindung kann als solche oder im Gemisch mit pharmazeutisch verträglichen Trägern verabreicht werden, und kann auch zusammen mit anderen antimikrobiellen Mitteln, wie Penicillinen, Cephalosporinen, Aminoglycosiden und Glycopeptiden verabreicht werden. Eine Verbundtherapie umfaßt so die aufeinanderfolgende, gleichzeitige und getrennte Verabreichung des Wirkstoffs derart, daß die therapeutischen Wirkungen der zuerst verabreichten Substanz nicht vollständig verschwunden sind, wenn die nachfolgende verabreicht wird.
Eine bevorzugte pharmazeutische Formulierung ist eine Formulierung, die für eine topische Anwendung auf eine intakte oder beschädigte Haut oder Schleimhautmembran geeignet ist. Beispiele für solche Formulierungen sind Pulver, Salben, Cremes und Lotionen. Die Excipientien in diesen Formulierungen sind die üblichen pharmazeutisch verträglichen Träger, wie ölhaltige Salbengrundlagen (z.B. Cetylesterwachs, Ölsäure, Olivenöl, Paraffin, Walrat, Stärkeglycerid); absorbierende Salbengrundlagen (z.B. wasserfreies Lanolin, hydrophiles Petrolatum), Emulsionsalbengrundlagen (z .B. Cetylalkohol, Glycerylmonostearat, Lanolin, Stearinsäure), wasserlösliche Salbengrundlagen (z.B. Glycolether und ihre Derivate, die Polyethylenglycole, Poly(oxy-1,2-ethandiyl)-alpha-hydro-omega-hydroxyoctadecanoat, Polysorbate und Polyethylenglycolmonostearate umfassen).
Diese Formulierungen können andere bekannte Excipientien, wie Konservierungsstoffe, enthalten und werden wie auf dem Fachgebiet bekannt, und in den Referenzhandbüchern, wie Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Auflage, 1985, Mack Publishing Co. beschrieben, hergestellt.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch zu Formulierungen, die für die parenterale Verabreichung geeignet sind, nach auf dem Fachgebiet bekannten und in Referenzbüchern, wie dem vorstehend erwähnten, beschriebenen Verfahren, formuliert werden.
Beispielsweise wird eine erfindungsgemäße Verbindung mit einem Solubilisierungsmittel, wie Polypropylenglycol oder Dimethylacetamid, und einem grenzflächenaktiven Mittel, wie Polyoxyethylensorbitanmonooleat oder polyethoxyliertem Rhizinusöl, in sterilem Wasser zur Injektion formuliert.
Ein Beispiel für eine typische Formulierung zur parenteralen Verabreichung enthält 10 mg des Antibiotikum GE 2270-Faktors A pro ml Endpräparat, 10-20% eines grenzflächenaktiven Mittels, das ein Polyoxyethylensorbitanfettsäureester, ein Polyoxyethylen-Rhizinusölderivat oder ein Polyoxyethylen-hydriertes Rhizinusölderivat sein kann, und 0-20%, vorzugsweise 10-20% eines Solubilierungsmittels, wie Propylenglycol, Dimethylacetamid, Dimethylformamid, tert.-Butyl-N-hydroxycarbamat, 1,2-, 1,3-, oder 1,4- Butandiol, Ethyloleat, Tetrahydrofurfurylpolyethylenglycol 200, Dimethylisosorbat, Benzylalkohol und dgl. Ein bevorzugtes Solubilisierungsmittel ist Propylenglycol.
Polyoxyethylensorbitanfettsäureester sind im Handel erhältlich und einige von ihnen werden unter dem Warenzeichen "Tween" vertrieben. Sie sind auch unter dem freien Namen "Polysorbate" bekannt. Beispiele dafür sind Polysorbat 20, 21, 40, 60, 61, 65, 80, 81 und 85. Bevorzugt zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Formulierungen ist Polysorbat 80 (Sorbitanmono-9-octadecanoat, Poly(oxy-1,2- ethandiyl)derivate).
Polyoxyethylen-Rhizinusöle und Polyoxyethylen-hydrierte Rhizinusöle sind ebenfalls im Handel erhältlich. Einige von ihnen werden unter dem Warenzeichen "Cremophor" vertrieben. Beispiele für solche Verbindungen sind solche, die als Cremophor EL (polyethoxyliertes Rhizinusöl), Cremophor RH 40 (polyethoxyliertes hydriertes Rhizinusöl), Cremophor RH 60 (PEG 60 hydriertes Rhizinusöl) oder Emulphor EL-719 (polyoxyethyliertes Pflanzenöl) bekannt sind.
Vorzugsweise eine Formulierung zur Injektion einen pH-Wert im Bereich von 7 ± 0,5 besitzen. Gegebenenfalls kann es ratsam sein, den pH-Wert des Präparats mit einem geeigneten Puffermittel einzustellen. Zweckdienlicherweise können TRIS (d.h. Trihydroxymethylaminomethan) oder Phosphat als Puffermittel verwendet werden.
Eine bevorzugte Formulierung zur parenteralen Verabreichung umfaßt die folgenden Excipientien: Cremophor EL (Polyoxyl-35-Rhizinusöl USP/NF) 20%, Propylenglycol 5 bis 20%, vorzugsweise 10-20%).
Im allgemeinen können diese Formulierungen durch Auflösen des Wirkstoffs in dem organischen Lösungsmittel, anschließende Zugabe des grenzflächenaktiven Inhaltsstoffs unter Rühren und abschließende Verdünnung auf das gewünschte Injektionsvolumen mit sterilem Wasser hergestellt werden.
Andere Excipientien, wie Konservierungsstoffe oder stabilisierende Mittel, können, wie auf dem Fachgebiet bekannt, zugesetzt werden.
Ein Beispiel für eine parenterale Formulierung ist nachstehend angegeben:
Antibiotikum GE-2270 Faktor A 10 mg
PEG 40-Rhizinusöl (Cremophor EL) 0,2 ml
Propylenglycol 0,2 ml
Methylparahydroxybenzoat 0,5 mg
Propylparahydroxybenzoat 0,05 mg
Wasser zur Injektion q.s. 1 ml
In einer anderen Ausführungsform kann der Wirkstoff als gefriergetrocknetes Pulver zur Rekonstitution vor Gebrauch hergestellt werden.
Wenn das gefriergetrocknete Material ausgehend von einem Gemisch hergestellt wird, das den Wirkstoff und das grenzflächenaktive Mittel enthält, wie Polyethylenglycol 60-hydriertes Rhizinusöl, kann es zweckdienlicherweise mit dem wäßrigen Medium allein, ohne Zugabe eines organischen Lösungsmittels rekonstituiert werden.
Gegebenenfalls kann ein übliches Gefriergtocknungshilfsmittel, sofern notwendig, zugesetzt werden, um ein gefriergetrocknetes Material in Pulverform zu erhalten.
Bevorzugt werden alle diese Formulierungen zur i.v.- Verabreichung bei der Behandlung jeder Infektion verwendet, an der ein Mikroorganismus beteiligt ist, der auf das erfindungsgemäße Antibiotikum anspricht.
Bei der Behandlung von pseudomembranöser Colitis oder anderen Erkrankungen, die auf das Vorhandensein von Anaerobiern in dem Magen-Darm-Trakt zurückzuführen sind, kann eine effektive Dosis der erfindungsgemäßen Verbindung oral in einer geeigneten pharmazeutischen Form, wie einer Kapsel, einer Tablette oder einer wäßrigen Suspension, verabreicht werden.
Die Dosierung des Wirkstoffes hängt von vielen Faktoren ab, einschließlich des Typs, des Alters und des Zustands des Patienten, des für die Verabreichung ausgewählten spezifischen Wirkstoffs und seiner Formulierung, des Verabreichungsschemas, etc. ab.
Im allgemeinen werden effektive antimikrobielle Dosierungen pro Einzeleinheitsdosisform verwendet.
Wiederholte Anwendungen/Verabreichungen, z.B. 2 bis 6 mal täglich, sind im allgemeinen bevorzugt. Eine effektive Dosierung kann im allgemeinen im Bereich von 0,5-50 mg/kg Körpergewicht/Tag liegen.
Ein bevorzugtes topisches Präparat ist eine Salbe, die 1% bis 10% einer erfindungsgemäßen Verbindung enthält.
Jedenfalls wird der verschreibende Arzt in der Lage sein, die optimale Dosierung für einen gegebenen Patienten in einer gegebenen Situation zu bestimmen.
Neben ihrer Verwendung als Medikamente in der Human- und Veterinärtherapie können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch als wachstumsfördernde Mittel für Tiere verwendet werden.
Zu diesem Zweck wird eine erfindungsgemäße Verbindung in einem geeigneten Futter oral verabreicht. Die exakte verwendete Konzentration ist diejenige, die benötigt wird, um den Wirkstoff in einer für die Förderung des Wachstums wirksamen Menge bei Konsum normaler Futtermengen bereitzustellen.
Die Zugabe des erfindungsgemäßen Wirkstoffs zu einem Tierfutter wird bevorzugt durch Herstellen eines geeigneten Futtervorgemisches, das den Wirkstoff in einer wirksamen Menge enthält, und Einarbeiten des Vorgemisches in die vollständige Ration durchgeführt.
In einer anderen Ausführungsform kann ein Zwischenkonzentrat oder Futtersupplement, das den Wirkstoff enthält, dem Futter zugemischt werden. Die Art, auf die solche Futtervorgemische und vollständige Futterrationen hergestellt und verabreicht werden können, sind in Referenzbüchern (z.B. "Applied Animal Nutrition", W.H. Freedman and Co., S. Francisco, USA, 1969 oder "Livestock Feeds and Feeding" O and B books, Corvallis, Oregon, USA, 1977) beschrieben.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 zeigt das UV-Spektrum des Antibiotikum GE 2270-Faktors A. Die Symbole und die verwendeten Lösungsmittel entsprechen einander wie folgt:
- - - - bedeutet den Test in CH&sub3;OH
bedeutet den Test in 0,1 N HCl
bedeutet den Test in Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,4
bedeutet den Test in 0,1 N KOH
Figur 2 zeigt das IR-Absorptionsspektrum des Antibiotikum GE 2270-Faktors A in Nujolsuspension
Figur 3 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum des Antibiotikum GE 2270-Faktors A, aufgenommen bei 500 MHz in DMSO-d&sub6;
Figur 4 zeigt das ¹³C-NMR-Spektrum des Antibiotikum GE 2270-Faktors A bei 125 MHz in DMSO-d&sub6;.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher und sollen sie auf keine Weise beschränken.

Beispiel 1

Herstellung des Antibiotikums GE 2270

Eine Kultur Planobispora rosea ATCC 53773 wird auf einem Hafermehl-Schrägagar 2 Wochen lang bei 28-30ºC gezüchtet und dann zur Inokulierung von 500 ml-Kolben, die 100 ml eines Anzuchtmediums der folgenden Zusammensetzung enthalten, verwendet:
Stärke 20 g/1
Polypepton 5 g/l
Hefeextrakt 3 g/l
Rindfleischextrakt 2 g/l
Sojabohnenmehl 2 g/l
Calciumcarbonat 1 g/l
Destilliertes Wasser q.s. 100 ml
(Einstellung auf pH 7,0 vor der Sterilisation)
Der Kolben wird auf einem rotierenden Schüttler (200 UpM) bei 28-30ºC 92 Stunden lang inkubiert. Die so erhaltene Kultur wird dann zum Inokulieren eines Flaschenfermenters, der 4 l des gleichen Mediums enthält, verwendet, und die Kultur wird bei 28-30ºC 48 Stunden lang unter Rühren (etwa 900 UpM) und Belüftung (etwa ein Standardliter Luft pro Volumen pro Minute) inkubiert.
Die so erhaltene Brühe wird in einen Fermenter, der 50 l des folgenden Produktionsmediums enthält, überführt:
Stärke 20 g/l
Pepton 2,5 g/l
Hydrolysiertes Casein 2,5 g/l
Hefeextrakt 3 g/l
Rindfleischextrakt 2 g/l
Sojabohnenmehl 2 g/l
Calciumcarbonat 1 g/l
Destilliertes Wasser q.s.
(Einstellung auf pH 7,0 vor der Sterilisation)
und etwa 72 Stunden lang bei 28-30ºC inkubiert.
Die Antibiotikaproduktion wird durch einen Papierscheiben-Agartest unter Verwendung von B. subtilis ATCC 6633, der auf Minimal-Davis-Medium gezüchtet wurde, überwacht. Die Hemmzonen werden nach einer Inkubation über Nacht bei 35ºC bewertet.

Beispiel 2

Gewinnung des Antibiotikums GE 2270

Der vorstehend erhaltene Fermentationskuchen (50 l) wird geerntet und in Gegenwart eines Filtrierhilfsmittels (Clarcell) filtriert.
Das Antibiotikum GE 2270 befindet sich hauptsächlich in dem Mycel, selbst wenn eine bestimmte Menge davon auch aus den Filtraten gewonnen werden kann.
a) Das Filtrat wird auf etwa pH 7,0 eingestellt und mit Ethylacetat (50 l) extrahiert. Die organische Phase wird durch Zentrifugation abgetrennt und unter verringertem Druck auf ein kleines Volumen eingeengt. Der so erhaltene ölige Rückstand wird dann mit Petrolether behandelt, um das Rohantibiotikum GE 2270 auszufällen, das durch Filtration gewonnen und getrocknet wird. 415 mg des Rohantibiotikum GE 2270-Komplexes werden erhalten.
b) Das Mycel wird zweimal mit 20 l Methanol extrahiert und die vereinigten Extrakte werden unter verringertem Druck unter Erhalt eines wäßrigen Rückstandes, der zweimal mit Ethylacetat extrahiert wird, eingeengt. Das Rohantibiotikum GE 2270 (6,06 g) wird durch Zugabe von Petrolether aus der konzentrierten organischen Phase ausgefällt.

Beispiel 3

Reinigung des Antibiotikum GE 2270-Faktors A

3 g des aus dem Mycel gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhaltenen Rohprodukts werden in Tetrahydrofuran aufgelöst und unter verringertem Druck in Gegenwart von Silicagel (230-400 Mesh) eingeengt. Der so erhaltene feste Rückstand wird gewonnen und auf eine Chromatographiesäule, die 300 g Silicagel (230-400 Mesh) enthält, das in Methylenchlorid (CH&sub2;Cl&sub2;) aufbereitet wurde, aufgebracht. Die Säule wird zuerst mit 2 l Methylenchlorid und dann nacheinander mit 1,5 l-Gemischen aus Methylenchlorid und Methanol in den folgenden Verhältnissen entwickelt: 98/2, 96/4, 94/6, 92/8, 90/10 und 88/12 (Vol./Vol.).
Die Fraktionen werden gewonnen, mittels TLC, HPLC oder mikrobiologisch gegen B. subtilis analysiert und gemäß ihres Gehalts an dem Antibiotikum vereinigt.
Die vereinigten Fraktionen, die den reinen Antibiotikum GE 2270-Faktor A (HPLC-Retentionszeit 14,9 Minuten, vergleiche die vorstehenden physikalisch-chemischen Daten, Punkt E) enthalten, werden unter verringertem Druck eingeengt, wodurch ein öliger Rückstand erhalten wird, der mit Tetrahydrofuran solubilisiert wird. Aus dieser Lösung werden 600 mg Antibiotikum GE 2270-Faktor A durch Zugabe von Petrolether ausgefällt.

Beispiel 4

Eine weitere Charge des Antibiotikum GE 2270-Faktors A wird aus anderen Fraktionen erhalten, die durch das vorstehende Chromatographiesystem getrennt wurden, die ihn aber in unreiner Form (HPLC) enthalten. Auch diese Fraktionen werden vereinigt, eingeengt und behandelt, wodurch ein Feststoff, wie vorstehend beschrieben, erhalten wird. Das Rohpräparat des Antibiotikum GE 2270-Faktors A wird mittels HPLC nach dem folgenden Verfahren gereinigt:
Ein Aliquot von 6 mg dieses Präzipitats wird in Acetonitril:Wasser 1:1 (Vol./Vol.) aufgelöst und in ein HPLC- Chromatographiesystem, das mit einer silanisierten Silicagelsäule (Lichrosorb RP 18, 7 um, 250 x 10 mm, Merck, Darmstadt) ausgestattet ist, injiziert.
Es wird mit einem linearen Gradienten eines Gemisches aus Lösung A und B von 50% bis 85% A in B in 20 Minuten mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 4 ml/min eluiert. Die Lösung A ist ein Gemisch aus Acetonitril und 18 mM Natriumphosphatpuffer 70/30 (Vol./Vol.), das auf pH 6 eingestellt wurde, während Lösung B ein Gemisch aus Acetonitril und 18 mM Phosphatpuffer, 10/90 (Vol./Vol.) ist, das auf pH 6 eingestellt wurde.
Die Säule wird mit einem Perkin Elmer LC85 UV-Detektor mit einer Wellenlänge von 330 nm verbunden. Die Fraktionen von 11 aufeinanderfolgenden chromatographischen Läufen mit einem homogenen Gehalt werden vereinigt und unter verringertem Druck eingeengt, wodurch das Acetonitril entfernt wird. Dadurch werden abgetrennte Restlösungen erhalten, die den Antibiotikum 2270-Faktor A enthalten. Diese Lösungen werden zweimal mit einem gleichen Volumen Ethylacetat extrahiert, und das antibiotische Produkt wird durch Präzipitation aus der konzentrierten organischen Phase durch Zugabe von Petrolether erhalten. Nach Gewinnung durch Filtration und Trocknen werden 27 mg des Antibiotikum GE 2270-Faktors A erhalten.

Claims

1. Antibiotikum GE 2270-Faktor A mit den folgenden Eigenschaften in der Nichtsalz-Form:

A) UV-Absorptionsspektrum mit den folgenden Absorptionsmaxima: Lambda max (nm) 0,1 M HCl 0,1 M KOH Phosphatpuffer pH 7,4 Methanol (Schulter)

B) Infrarotabsorptionsspektrum in Nujol-Suspension mit den folgenden Absorptionsmaxima (cm&supmin;¹):

3700-3060; 3060-2660 (Nujol); 1650; 1590-1490; 1490- 1420 (Nujol); 1375 (Nujol); 1310; 1245; 1210; 1165; 1090; 1060; 1020; 970; 930; 840; 810; 750, 720 (Nujol) 700;

die Haupt-IR-Absorptionsbanden dieses Spektrums können folgendermaßen zugeordnet werden: Zuordnung νNH, νOH Amid I (ν C=O) heterocyclisches νC=C und νC=N Amid II (δNH) aromatisches δCH heterocyclisches γCH aromatisches γCH

C) ¹H-NMR-Spektrum mit den folgenden Signalgruppen (in ppm) bei 500 MHz, aufgenommen in DMSO-d&sub6; (Hexadeuterodimethylsulfoxid) unter Verwendung von TMS als innerem Standard (0,00 ppm); die Zahl der Protonen für jedes Signal ist in Klammern angegeben:

9,02 (1); 8,68 (1); 8,70 (1); 8,57 (1); 8,50 (1); 8,43 (1); 8,37 (1); 8,26 (1); 8,25 (1); 7,4-7,20 (9); 6,96 (2); 6,02 (1); 5,30-5,18 (3); 5,01 (1); 4,97 (2); 4,80 (1); 4,56 (1); 4,30 (1); 4,26 (1); 3,98 (1); 3,81 (1); 3,79 (1); 3,38 (3); 2,72 (1); 2,58 (3); 2,48 (3); 2,16 (1); 2,13 (1); 1,96 (2); 1,88 (1); 1,34 (1); 0,87 (3); 0,84 (3);

D) ¹³C-NMR-Spektrum mit den folgenden Signalgruppen (ppm) bei 125 MHz in DMSO-d&sub6; mit TMS als innerem Standard (0,00 ppm), wobei Q quaternäre C-Atome oder C=O-Gruppen bedeutet;

173,69 , Q; 171,10, Q; 169,83, Q; 169,51; Q; 168,45, Q; 168,26, Q; 167,84, Q; 165,68, Q; 164,75, Q; 161,40, Q; 161,23, Q; 160,46, Q; 160,29, Q; 159,35, Q; 153,42, Q; 150,31, Q; 150,11, Q; 149,41, Q; 146,93, Q; 144,73, Q; 143,75, Q; 142,10, Q; 141,78, Q; 141,33, CH; 140,97, Q; 139,53, Q; 128,68, CH; 127,99, 2[CH]; 127,67, Q; 127,67, CH; 126,88, CH; 126,76, 2[CH]; 123,17, CH; 118,66, CH; 116,42, CH; 73,81, CH; 69,41, CH&sub2;; 67,97, CH; 67,36, CH&sub2;; 60,12, CH; 58,63, CH&sub3;; 58,24, CH; 55,41, CH; 48,15, CH; 47,03, CH&sub2;; 41,19, CH&sub2;; 37,60, CH&sub2;; 34,06, CH; 29,76, CH&sub2;; 25,85, CH&sub3;; 24,28, CH&sub2;; 18,49, CH&sub3;; 17,98, CH&sub3;; 11,99, CH&sub3;;

E) Retentionszeit (Rt) von 14,9 Minuten bei der Analyse durch Reversphasen-HPLC unter den folgenden Bedingungen:

Säule: Ultrasphere ODS (Reversphasen-silianisiertes Silicagel; 5 um) Altex (Beckman) 4,6 mm (Innendurchmesser) x 250 mm

Vorsäule: Brownlee Labs RP 18 (Octadecylsilan-Silicagel; 5 um)

Eluent A: Acetonitril-18mM Natriumphosphat 70:30 (Vol./Vol.), eingestellt auf einen pH-Wert von 7,0

Eluent B: Acetonitril-18mM Natriumphosphat 10:90 (Vol./Vol.), eingestellt auf einen pH-Wert von 7,0

Elutionsart: linearer Gradient von Eluent A in Eluent B von 45 % bis 70 % in 20 Minuten

Fließgeschwindigkeit: 1,8 ml/min

UV-Detektor: 254 nm

Interner Standard: Chloramphenicol (Rt = 3,7 min)

F) Elementaranalyse, nachdem die Probe vorher bei etwa 140ºC in einer inerten Atmosphäre getrocknet wurde, ergibt die folgende Zusammensetzung: Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Schwefel;

G) Rf-Wert von 0,37 im folgenden chromatographischen System: Dichlormethan-Methanol, 9:1 (Vol./Vol.) unter Verwendung von Silicagelplatten (Silicagel 60F&sub2;&sub5;&sub4;, Merck Co)

Sichtbarmachung: UV-Licht bei 254 nm, gelber Fleck mit Joddämpfen oder Bioautographie unter Verwendung von B. subtilis ATCC 6633 auf Minimal Davis-Medium; Interner Standard: Chloramphenicol (Rf 0,56)

H) FAB-MS-Analyse, die das niedrigste Massenisotop des protonierten Molekülions bei m/z 1290,3 ± 0,1 Dalton zeigt. Alle anderen Peaks über 800 m/z-Masseneinheiten (wobei Isotop-Peaks nicht gezählt werden) im Spektrum waren niedriger als 20 % des Molekülions bei Analyse mit einem Kratos MS-50-Doppelfocus-Massenspektrometer unter den folgenden experimentellen Bedingungen; Xe-Fast-Atom-Bombardment bei 6 kV; Glycerinmatrix; positive Ionisierungsart

I) Eine Aminosäureanalyse des Salzsäurehydrolysats zeigt die Gegenwart der folgenden natürlichen Aminosäuren: Glycin, (L)-Prolin und (L)-Serin unter den folgenden experimentellen Bedingungen:

die Probe wird bei 105ºC 20 Stunden in Gegenwart von 6 N HCl, die 1 % Phenol enthält, hydrolysiert und dann in zwei Schritten folgendermaßen derivatisiert:

a) Bildung der n-Propylester der Carbonsäurefunktionen mit 2 M HCl in wasserfreiem Propanol (90ºC, 1 Std.) und anschließend Trocknung unter Stickstoff;

b) Umwandlung der freien Aminogruppen zu Amiden mit Pentafluorpropionsäureanhydrid/wasserfreiem Dichlormethan 1:9 (Vol./Vol.) bei Raumtemperatur 85 für 1 Stunde, gefolgt von Trocknung unter Stickstoff;

der so erhaltene derivatisierte Rest wird in Dichlormethan gelöst und durch GC-MS unter Verwendung eines HP5985B-Systems unter den folgenden Bedingungen analysiert:

Säule: chirale n-Propionyl-L-Valin-t-butylamid- Polysiloxan-beschichtete Fused Silica-Kapillarsäule (25 m x 0,2 mm Innendurchmesser; C.G.C. Analytic); Temperaturprogramm 80ºC für 4 Minuten, dann 4ºC/Min.

L) Ionisierungsstudien

es werden keine ionisierbaren Funktionen durch Titration mit 0,1 N HCl und 0,1 N NaOH in Methylcellosolve/Wasser entdeckt; eine schwach basische Funktion wird durch Titration mit 0,1 N HClO&sub4; in einem nicht-wäßrigen Medium (Essigsäure) nachgewiesen;

M) Spezifische Rotation

[α]²&sup0;D = +140,8; absolutes Ethanol, bei einer Konzentration von etwa 5 g/Liter.

2. Antibiotikum GE 2270-Komplex, der den Antibiotikum GE 2270-Faktor A gemäß der Definition in Anspruch 1 als Hauptkomponente enthält und der einen antibiotischen Stoff enthält, der erhältlich ist durch Gewinnung aus dem Mycel von Planobispora rosea ATCC 53773 oder einer GE 2270 produzierenden Variante oder Mutante davon.

3. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, umfassend die Züchtung von Planobispora rosea ATCC 53773 oder einer GE 2270 produzierenden Variante oder Mutante unter submers-aeroben Bedingungen in Gegenwart von assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganischen Salzen und Gewinnung des produzierten Antibiotikums daraus.

4. Arzneimittel, enthaltend eine Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

5. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 zur Verwendung als Medizin.

6. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung als Antibiotikum.

7. Planobispora rosea ATCC 53773.

8. Biologisch reine Kultur von Planobisrora rosea ATCC 53773 oder einer GE 2270 produzierenden Mutante oder Variante davon, mit Ausnahme von Planobispora rosea ATCC 23866, die zur Produktion von Antibiotikum GE 2270-Faktor A gemäß der Definition in Anspruch 1 unter aeroben Fermentationsbedingungen in Gegenwart von assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganischen Salzen befähigt ist.