CN1041182A

CN1041182A - 抗生素ge2270

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Publication number: CN1041182A
Application number: CN89107873A
Authority: CN
Inventors: 恩里科·塞娃; 格拉塞拉·贝里特; 尼古来特·蒙坦尼; 贝斯·P·高尔茨太; 莫里佐·迪纳罗
Original assignee: GRUPPO LEPETIT SA
Current assignee: Then Ron pharmaceutical Co.; WASCO Co.
Priority date: 1988-09-09
Filing date: 1989-09-08
Publication date: 1990-04-11
Anticipated expiration: 2004-09-08
Also published as: FI894237A0; NO176026C; DK171026B1; ZA896875B; EP0359062B1; JP2997480B2; KR0137944B1; IL91518A; JPH02149593A; FI95930C; DE68913107T2; AU4115189A; DK436189A; PT91647B; DK436189D0; NO893608D0; AU629851B2; HUT51675A; EP0359062A2; AR242635A1

Abstract

本发明涉及一种新的命名为抗生素GE2270的抗生素物质，其加成盐、药物组合物以及它们作为药物的应用，特别是用于治疗涉及对其敏感微生物的感染的疾病。

Description

本发明涉及一种命名为抗生素GE2270的新的抗生素物质、其加成盐、药物组合物以及它们作为药物的应用，特别是在治疗对它们敏感的微生物所引起的感染疾病的应用。

本发明的化合物在动物中如家禽、猪、反刍动物等还具有生长促进剂的活性。

本发明的另一目的是制备抗生素GE2270的方法，其中包括培养玫瑰游动双孢菌（Planobispora rosea）ATCC53773或它的产生抗生素GE2270的变异体或突变体。并从菌丝体和/或发酵肉汤中分离出本发明的抗生素。

玫瑰游动双孢菌ATCC53773是从土壤样品中分离出来的，并且根据布达佩斯条约的规定于1988年6月14日寄存于美国典型菌种保藏中心（ATCC）（12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852 Maryland，U.S.A）。

该菌株的保藏号为ATCC53773。

通过培养一个可产生抗生素GE2270的游动双孢菌菌株即玫瑰游动双孢菌ATCC53773或它的产生抗生素GE2270的变异体或突变体，可以得到抗生素GE2270的产物，培养在有氧条件下，在水性营养培养基中进行，该培养基含有可同化碳源、氮源及无机盐。在发酵技术中经常使用的许多营养培养基都可以使用，但是某些培养基更好些。优选的碳源为葡萄糖、甘露糖、半乳糖、淀粉、谷粉等。优选的氮源为氨、硝酸盐、大豆粉、胨、肉提取物、酵母膏、胰蛋白胨、氨基酸等。可用于培养基中的无机盐为通常可产生钠、钾、铁、锌、钴、镁、钙、铵、氯化物、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐等离子的可溶性盐。

通常将可产生抗生素的菌株在振荡瓶中预培养，然后将培养物接种于发酵罐中，从而产生大量的抗生素物质。用于预培养的培养基可与大量发酵使用的相同，也可以用其他的培养基。产生抗生素GE2270的菌株可以在20～40℃生长，最好在24～35℃生长。

在发酵过程中，可通过例如生物鉴定或TLC或HPLC方法检验培养液或菌丝体提取物样品中抗生素的活性来监测该抗生素的生产。

对于抗生素GE2270敏感的生物体如枯草杆菌和金黄色葡萄球菌都可以作为试验生物体。生物鉴定可以很方便地通过在琼脂板上的琼脂扩散方法进行。一般在发酵的第2天至第5天产生最大量的抗菌活性。

抗生素GE2270是通过培养菌株玫瑰游动双孢菌ATCC53773或它的产生抗生素GE2270的突变体或变异体产生的。并且发现主要存在于菌丝体中。

在本申请中，当论述本发明化合物的物理化学或生物学性质时，术语“抗生素GE2270”一般被认为是指发酵过程终止时回收的抗生素GE2270复合物（见例2），也可以是它的主要成分抗生素GE2270因子A。

玫瑰游动双孢菌ATCC53773的形态特征

玫瑰游动双孢菌ATCC53773可生长在大多数标准培养基中。植物菌丝体形成长的不规则分枝丝状体（0.5至1.0微米）穿透琼脂，并在其表面紧密的生长。无论生长在液体还是固体培养基中，菌丝体都不破碎。在大多数试验培养基中其颜色变化范围从浅珊瑚色至粉红珊瑚色。需氧菌丝体形成长的波状的细长菌丝，侧面很少分枝，并且与琼脂表面基本平行地生长在空气中。需氧菌丝体如果有的话呈白-粉红色。孢子囊单独地或成组地沿着需氧菌丝体的菌丝生长，其长约6.0～8.0微米，宽约1.0～1.2微米。它们通过短的孢子囊柄（1.2～2.0微米长）与菌丝相连。在每个孢子囊上形成一对纵向的棱形直的孢子（3.0至3.5×1.0至1.2微米）。在孢子囊中，孢子被横向隔膜分开。在从孢子囊被膜中释放出来以后，孢子靠其周围的鞭毛活动。

玫瑰游动双孢菌ATCC53773的培养特征

为进行培养特征的检测，在含有几种由Waksman所建议的培养基添加物（Waksman，S.A.1961-放线菌-The Williams and Wilkins Co.Baltimore;Vol.2，328-334）的Shirling和Gottlieb所建议的各种标准培养基中培养（Shirling E.B和Gottlieb D.，1966-测定链球菌种特征的方法-Int.J.Syst.Bacteriol，16，313-340）。

需要时可通过Maerz和Paul的方法进行颜色测定（Mearz A.和M.Rea Paul，1950-颜色词典-第2版McGraw-Hill Book Company Inc.New York）。

该生物体利用不同碳源的能力通过Shirling和Gottlieb所描述的方法测定。

培养特征、生理学特征及碳源的利用列于表Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ中。

表Ⅰ是在28℃培养2周后的结果。

表Ⅰ

菌株玫瑰游动双孢菌ATCC53773的培养特征

培养基形态学特征

燕麦片琼脂6% 充分生长，具有光滑的表面，珊瑚粉红色（2-

H-10），充分产生浅粉红色需氧菌丝体（1

-A-9）。

ISP2（酵母青充分生长，表面皱褶、淡粉红色（2-E-9），

麦芽琼脂）少量淡色需氧菌丝体。

ISP3（燕麦片适度生长，表面光滑，淡粉红色（2-E-8），

琼脂2%）少量带粉红色的白色需氧菌丝体。

ISP4（无机盐适度生长，表面光滑，珊瑚粉红色（2-E-

淀粉琼脂） 10）。

ISP n 5（甘油适度生长，表面光滑平坦，淡粉红色（2-A-

天门冬酰胺琼脂） 9），丰富的白色需氧菌丝体产生。

ISP6（胨酵母适度生长，有细长的皱褶，淡珊瑚粉红色（1-

膏铁琼脂） A-10）。

ISP7（酪氨酸适度生长，表面光滑且薄，淡粉红色（1-A-

琼脂） 9），产生丰富的淡粉色（1-C-9）需氧菌

丝体。

Hichey与充分生长，表面厚且有皱褶，淡珊瑚粉红色（1

Tresner′s琼脂 -A-10），中等量产生淡粉红色需氧菌丝体

Czapek葡萄糖生长不足，表面光滑且薄，中等量产生淡粉红色

琼脂需氧菌丝体。

（接上）

葡萄糖天门冬酰适度生长，表面光滑且薄，无色，不存在需氧菌

胺琼脂丝体。

营养琼脂生长良好，表面光滑，带粉红色的淡橙色（9-

A-7）。

Bennett′s 适度生长，表面有细长的皱褶，淡琥珀粉红色

琼脂（10-A-6）。

苹果酸钙琼脂少量生长，表面光滑平坦，无色。

脱脂牛奶琼脂适度生长，表面光滑，珊瑚粉红色（2-F-9）。

鸡蛋白蛋白琼脂少量生长，表面光滑且薄，无色至淡粉红色（2

-A-8）。

右旋糖tryptose 不生长

琼脂

马铃薯琼脂生长良好，表面光滑，带粉红色的淡橙色（9-

A-7）。

所涉及到的颜色的字母和数据是根据Maerz和Paul的方法测定的（如上所提及的）。

玫瑰游动双孢菌ATCC53773的生理学特征

表Ⅱ

试验结果

淀粉水解阳性

硫化氢的形成阴性

（接上）

酪氨酸反应阳性

酪蛋白水解弱阳性

苹果酸钙消化阴性

明胶液化作用弱阳性

牛奶凝结作用阴性

牛奶胨化阴性

硝酸盐还原阳性

表Ⅲ

碳水化合物的利用

碳源生长

阿拉伯糖 +

木糖 +

核糖 -

果糖 +/-

半乳糖 -

葡萄糖 +

鼠李糖 -

乳糖 -

蔗糖 -

麦芽糖 +

蜜三糖 -

纤维素 -

（接上）

甘露糖醇 -

水杨苷 +

肌醇 +

纤维二糖 -

+ 适度生长

+/- 生长不足

- 不生长

在本试验中使用第8号培养基，在28-30℃培养2周后对结果进行评估。

对温度的敏感性

最适生长温度范围为28-37℃。在15℃和50℃不生长，在20℃适度生长。

化学分类特征

细胞壁分析：

通过Becker等人描述的方法进行细胞壁内存在的氨基酸分析（“通过全细胞水解的纸层析法快速鉴别土壤丝菌属与链霉菌属”，Appl.Microbiol.12，421-423，1964）。

全细胞水解分析表明存在正-二氨基庚二酸。

对按照Kawamoto等人的方法获得的纯细胞壁制剂的分析，未发现甘氨酸存在（Kawamoto I.，O.Tetsuo，和N.Takashi，“Micromonospora Olivoasterosporia，Micromonospora sagamiensis及相关生物体的细胞壁组合物”，J.of Bacteriol.146，527-534，1981）。

全细胞糖模型

根据Lechevalier M.P.的方法进行水解的全细胞糖含量的分析（“需氧放线菌的临床重要性鉴定”J.Lab.Clin.Med.71，934-944，1968），用Staneck J.L.和G.D.Roberts描述的薄层色谱纤维纸（“通过薄层色谱法简单测定需氧放线菌”，Appl.Microbiol.28，226-231，1974）采用如下的溶剂系统：乙酸乙酯-吡啶-水（100∶35∶25V/V）。

所得到的结果表明存在Madurose（3-氧-甲基-D-半乳糖），不存在阿拉伯糖和半乳糖。

菌株玫瑰游动双孢菌ATCC53773的归属

由于下述形态和化学特征，将此菌株归入游动双孢菌属（Planobispora）分类为玫瑰游动双孢菌属（Planobispora rosea）：

a）在细胞壁中存在正-二氨基庚二酸，缺乏甘氨酸（细胞壁化学类型Ⅲ）。

b）全细胞水解物中存在madurose（全细胞糖B型）。

c）在产生菌丝体的长园柱状孢子囊上的形成物中含有一对能动的孢子。

d）植物菌丝体为粉红色

上面所述的Planobispora rosea ATCC 53773的形态学特征与J.E.Thieman等人在“放线菌”（The JenaIntern.Symp.on Taxon，1968年9月，ed.H.Prauser，Jena.）中所描述的那些玫瑰游动双孢菌菌株没有本质上的不同。该菌株寄存于美国典型菌种保藏中心（ATCC），寄存号为23866。没有该菌株的抗生素生产物被描述过。

如同其它微生物一样，GE2270产生菌的特性也会发生变化。例如，通过用各种已知的诱变剂，如紫外线、X-射线、高频波、放射线及化学剂如亚硝酸、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍及许多其它的化学药品处理，可以获得该菌株的人工变异体和突变体。所有属于游动双孢菌属并产生抗生素GE2270的天然及人工变异体和突变体被认为是适合于本发明目的的玫瑰游动双孢菌ATCC53773菌株的等同物，并被认为在本发明的范围之内。

如上所述，抗生素GE2270一般地主要在产生菌的菌丝体中发现，同时也有少量物质在发酵液中发现。

从产生微生物的菌丝体或发酵液中回收抗生素GE2270是按照本身已知的技术完成的，如用溶剂萃取，通过加入非溶剂或改变溶液的PH值进行沉淀，分配色谱法、反相分配色谱法、离子交换色谱、分子排阻色谱法等。

优选的从菌丝体中回收本发明抗生素物质的方法包括用与水互溶的有机溶剂萃取经过滤或离心的菌丝体、浓缩萃取液以及选择地加入沉淀剂，用沉淀法回收抗生素物质粗品，用不与水互溶的有机溶剂萃取水相残渣或用吸附色谱法、然后将所需的产物从吸附基质上洗脱。

优选的从发酵液中回收本发明的抗生素物质的方法包括用不与水互溶的有机溶剂萃取，然后通过加入合理的沉淀剂从浓缩提取物中进行沉淀，或用不与水互溶的溶剂对其水状余留物进一步萃取。也可以使发酵液与吸附基接触，然后用极性洗脱混合物洗脱。也可将色谱分析方法不用于发酵液而用于从发酵液得到的浓缩提取物中。

本申请中所使用的术语“可与水互溶的溶剂”是指具有在该领域中此术语通常给定的含意并涉及这样的溶剂，即在使用条件下，在适当宽的浓度范围中可与水互溶。

可用于从菌丝体团中萃取本发明的抗生素物质的可与水互溶的有机溶剂实例为：低级烷醇，例如（C₁-C₃）烷醇如甲醇、乙醇和丙醇;苯基（C₁-C₃）链烷醇如苄基乙醇;低级酮，例如（C₃-C₄）酮如丙酮和乙基甲基酮;环醚如二氯六环和四氢呋喃;脂肪族二元醇类及其部分醚化产物，如1，2-亚乙基二醇、丙二醇和乙二醇单甲基醚;低级胺如二甲基甲酰胺和二乙基甲酰胺。

在本申请中所使用的术语“不与水互溶的溶剂”是指通常本领域中该术语的含意并涉及在使用条件下，在适当宽的范围内适合于所需用途的微溶于水或几乎不溶于水的溶剂。

可用于从发酵液中萃取本发明的抗生素物质的不与水互溶的有机溶剂实例为：通常的直链、支链或环状碳水化合物溶剂，如己烷或环己烷、卤代烃如氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、氟溴乙烷、二溴乙烷、三氯丙烷、氯三氟辛烷等;芳香烃如苯、甲苯、二甲苯等;至少四个碳原子的酯，如乙酸乙酯、乙酸丙酯、丁酸乙酯等;至少四个碳原子的直链、支链或环状烷醇，如丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、1-己醇、2-己醇、3-己醇、3，3-二甲基-1-丁醇、4-甲基-1-戊醇、3-甲基-1-戊醇、2，2-二甲基-3-戊醇，2，4-二甲基-3-戊醇、4，4-二甲基-2-戊醇、5-甲基-2-己醇、1-庚醇、2-庚醇、5-甲基-1-己醇、2-己基-1-己醇、2-甲基-3-己醇、1-辛醇、2-辛醇、环戊醇、2-环戊基乙醇、3-环戊基-1-丙醇、环己醇、环庚醇、环辛醇、2，3-二甲基环己醇、4-乙基环己醇、环辛基甲醇、6-甲基-5-庚-2-醇、1-壬醇、2-壬醇、1-癸醇、2-癸醇和3-癸醇;直链或支链烷基醚及其混合物，如石油醚、乙醚、丙醚、丁醚等;以及其混合物或其功能衍生物。

如同在本技术中已知的，相分离可通过盐析改进。

萃取时，回收含有大量有机溶剂的水相，对它进行共沸，蒸馏出水是很方便的。一般需要加入可以与水形成最低共沸混合物的溶剂，然后如果需要的话加入沉淀剂沉淀出所需的产物。可与水形成最低共沸点混合物的有机溶剂的典型实例为：n-丁醇、苯、甲苯、丁醚、四氯化碳、氯仿、环己烷、2，5-二甲基呋喃、己烷和间二甲苯;优选的溶剂为正丁醇。

沉淀剂的实例为石油醚、低级烷醚如乙醚、丙醚和丁醚，以及低级烷酮如丙酮。

可方便地用于回收本发明抗生素物质的层析系统实例为：聚苯乙烯或混合的聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂如Amberlite XAD2或XAD4（Rohm和Haas），S112（Dow Chemical Co.）和Piaion HP20（Mitsubishi）;丙烯酸树脂如XAD7或XAD8（Rohm和Haas）;聚酰胺如聚己内酰胺，尼龙和交联聚乙烯吡咯烷酮，通常其孔体积的范围是1-5ml/g，表面积为1-100m²/g，表观密度为0.15-0.50g/ml，平均孔径为100-3000埃单位以及粒度分布为至少40%的粒子大小低于300微米，如聚酰胺-CC6，聚酰胺-SC6，聚酰胺-CC6.6，聚酰胺-CC6AC和聚酰胺-SC6AC（Macherey-Nagel & Co.，西德），聚乙烯吡咯烷酮树脂PVP-Cl（Aldrich Chemie Gmblt & Co.，KG，西德），聚酰胺树脂PA400（M.Woelm AG，西德）;和碳。

对于聚苯乙烯或丙烯酸树脂，优选的洗脱剂为如上面所述的可与水互溶的极性溶剂混合物，对于聚酰胺树脂，优选的洗脱剂为如上面所说的可与水互溶溶剂的水的混合物，而对于碳，较好的洗脱剂为低级酮如丙酮或低级醇如甲醇。

抗生素GE2270粗制品的进一步纯化可以通过任何一种已知的技术完成，但是优选的是用色谱法处理。

色谱法的实例是那些在上述有关回收步骤中所叙述的，并且也包括固定相色谱法，如硅胶、氧化铝、硅酸镁载体等、其有机洗脱相由混合溶剂制成，包括前面所提及的典型的卤代烃、醚、高级酮，或在具有各种功能衍生作用的硅烷化硅胶上进行的反相色谱法，其洗脱剂含有如上所说的可与水互溶溶剂的水的混合物。

也可以方便地使用称为空间排阻色谱技术，它有良好的纯化结果，特别是大部份羟基已被烷基化的可控孔交链葡聚糖，即Sephadex LH-20（Pharmacia Fine Chemicals，Ab）用于本技术中是有益的。

通常在本技术中，生产回收与纯化步骤可以通过各种分析方法，包括生物鉴定方法监控，如对敏感微生物的纸盘或琼脂扩散分析或薄层层析法（TLC）或高压液相色谱法（HPLC），其中可以包括紫外（UV）或微生物滞留步骤。

优选的HPLC技术是使用多孔球形粒状硅烷化硅胶柱的反相HPLC，即具有相同直径的用C-18烷基官能化的硅胶（如5微米Ultrasphere ODS Altex;Beckman Co.），预置柱为用C-18烷基官能化的硅胶（如PR18 Brownlee labs），洗脱剂为如上面所述之一的可与水互溶的极性溶剂的线性梯度混合物的缓冲水溶液。最好将该溶液PH调至5-7。最优选的洗脱剂为：在洗脱剂B中洗脱剂A从45%至70%的线性梯度洗脱剂，其中洗脱剂B为乙腈/水的缓冲液混合物10∶90，PH5-7洗脱剂A为乙腈/水的缓冲液混合物70∶30，PH5-7。

抗生素GE2270因子A的物理化学特征：

A）在附图1中的紫外吸收图谱给出下列最大吸收值：

E^1% _1CMλ_max（nm）

0.1MHCl 245（肩峰）

310

0.1MKoH 245（肩峰）

313

磷酸盐缓冲液，PH7.4 245（肩峰）

314

甲醇 244（肩峰）

265 310

B）附图2为石蜡糊中的红外吸收图谱，显示下列最大吸收值（Cm^-1）：3700-3060;3060-2660（液体石蜡）;1650;1590-1490;1490-1420（液体石蜡）;1375（液体石蜡）;1310;1245;1210;1165;1090;1060;1020;970;930;840;810;750;720（液体石蜡）;700;

该图谱的主要官能红外吸收带归成为

ν（Cm^-1）说明

3600-3100 νNH，νOH

1650 酰胺Ⅰ（νC＝0）

1545 杂环νC＝C和νC＝N

1525，1495 酰胺Ⅱ（δNH）

1250，1205 芳香族δCH

870 杂环γCH

745，700 芳香族γCH

C）图3给出的¹H-NMR图，以三甲基硅烷（TMS）作内标（0.00PPM），在DMSO-d₆（六氘二甲基亚砜）中，在500MHz记录的各组信号（PPM）如下;每一信号的质子数标在括号内：

9.02（1）;8.68（1）;8.70（1）;8.57（1）;8.50（1）;8.43（1）;8.37（1）;8.26（1）;8.25（1）;7.4-7.20（9）;6.96（2）;6.02（1）;5.30-5.18（3）;5.01（1）;4.97（2）;4.80（1）;4.56（1）;4.30（1）;4.26（1）;3.98（1）;3.81（1）;3.79（1）;3.38（3）;2.72（1）;2.58（3）;2.48（3）;2.16（1）;2.13（1）;1.96（2）;1.88（1）;1.34（1）;0.87（3）;0.84（3）;

D）附图4为¹³C-NMR图谱，以TMS作内标（0.00PPM），在DMSO-d₆中，在125MHz的各组信号（PPM）如下，Q代表四价碳原子或C＝0基因;173.69，Q;171.10，Q;169.83，Q;169.51，Q;168.45，Q;168.26，Q;167.84，Q;165.68，Q;164.75，Q;161.40，Q;161.23，Q;160.46，Q;160.29，Q;159.35，Q;153.42，Q;150.31，Q;150.11，Q;149.41，Q;146.93，Q;144.73，Q;143.75，Q;142.10，Q;141.78，Q;141.33，CH;140.97，Q;139.53，Q;128.68，CH;127.99， 127.67，Q;127.67，CH;126.88，CH;126.76， 123.17，CH;118.66，CH;116.42，CH;73.81，CH;69.41，CH₂;67.97，CH;67.36，CH₂;60.12，CH;58.63，CH₃;58.24，CH;55.41，CH;48.15，CH;47.03，CH₂;41.19，CH₂;37.60，CH₂;34.06，CH;29.76，CH₂;25.85，CH₃;24.28，CH₂;18.49，CH₃;17.98，CH₃;11.99，CH₃;

E）在下述条件下进行反相HPLC分析时，保留时间（Rt）为14.9分钟：

柱：Ultrasphere ODS（反相硅烷化硅胶，5微米）

Altex（Beckman） 4.6mm（i，d，）×250mm

预置柱：Brownlee Labs RP18（八癸基硅烷硅胶;5微米）

洗脱剂A：乙腈∶18mM磷酸钠70∶30（V/V），

调至PH7.0

洗脱剂B：乙腈∶18mM磷酸钠10∶90（V/V），

调至PH7.0

洗脱方式：在20分钟内，洗脱剂A在洗脱剂B中从45%至70%的线性梯度洗脱

流速：1.8ml/min

紫外检测器：254nm

内标：氯霉素（R_t＝3.7分钟）

F）在惰性气氛下，在约140℃将样品预先干燥后进行元素分析，结果表明有如下组成：碳、氢、氮、硫;

G）在如下色谱系统中R_f值为0.37∶二氯甲烷∶甲醇＝9∶1（V/V），使用硅胶板（硅胶60下₂₅₄，Merck Co）显色：紫外线254nm，使用碘蒸气或用在最低量Davis培养基中枯草杆菌ATCC 6633生物自柱法，呈黄色色斑;内标：氯霉素（R_f0.56）。

H）FAB-MS分析在质/荷比（m/z）1290.3±0.1道尔顿处显示出该质子化分子离子的最低质量同位素。在下述实验条件下，用Kratos MS-50双焦质谱仪分析，在图谱中所有其它高于800m/z质量单位的峰（同位素峰不计）比该分子离子低20%：以6千伏（Kv）Xe快原子轰击;甘油基质;阳离子化方式。

I）氨基酸的盐酸水解分析表明有如下天然氨基酸存在：甘氨酸、（L）脯氨酸和（L）丝氨酸，该分析的实验条件如下：

样品在含1%苯酚的6N Hcl存在下，在105℃水解20小时，然后按如下两步衍生：

a）在无水丙酮中用2M Hcl生成该羧酸官能团的正丙酯，（90℃，1小时），然后在氮气氛下干燥。

b）用五氟丙酸酐/无水二氯甲烷（1∶9V/V）在室温下1小时，将游离氨基转化为酰胺，然后在氮气氛下干燥;如此获得的衍生物溶解于二氯甲烷中，并在如下条件下，使用HP5985B系统进行气相色谱-质谱（GC-MS）分析：

柱：将手性n-丙酰-L-缬氨酸、叔丁酰胺、聚硅氧烷涂于溶凝的硅石毛细管柱上（25m×0.2mm直径，毛细管气相色谱法分析），温度为80℃保持4分钟，然后每分钟4℃。

L）离子化研究

通过在甲基溶纤剂/水中的0.1N Hcl和0.1N NaoH滴定测检不到离子官能团，用在非水基质（乙酸）中的0.1N HclO₄滴定显示出弱碱性官能团。

M）旋光率〔α〕²⁰ _D＝±140.8;无水乙醇，浓度约为5克/升。

本发明化合物的抗菌活动可以通过一系列标准试管内试验得到证明。

对难辨棱状芽孢杆菌（Clostridium difficile）、痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）和脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）的最低抑制浓度（MIC）可以通过琼脂稀释法检测（接种体10⁴CFU）。对于其他生物体的MIC可以通过微量肉汤稀释法测定（接种10⁴至10⁵CFU/ml）。Ureaplasma arealyticum接种体大约为10⁴颜色变化单位/每毫升，除淋病奈氏球菌（N.gonorrhoeae），Branhamella catarrhalis、流感嗜血杆菌（H.influenzae）、难辨棱状芽孢杆菌、痤疮丙酸杆菌和脆弱拟杆菌48小时外，培养时间为18-24小时，除白色念珠菌（Candida albicans）在30℃外，所有生物体均在约37℃培养。淋病奈氏球菌和流感嗜血杆菌在5%CO₂气氛中、厌氧菌在绝氧混合物中培养。所使用的培养基为：等灵敏肉汤（Oxoid）、〔葡萄球菌（Staphylococci），类链球菌（Streptococcus faecalis），Streptococcus faecium，大肠杆菌、铜绿色极毛杆菌（Pseudomonas aeruginosa），普通变形菌（Proteus vulgaris），肺炎克氏杆菌（Klebsiella pneumoniae）〕;Todd-Hewitt肉汤（Difco）（对其它链球菌）;GC基肉汤（Difco）+1% Isovitalex BBL（对淋病奈氏球菌）;脑心浸渍肉汤（Difco）+1%添加物C（Difco）（对流感嗜血杆菌）;Mueller-Hinton肉汤（BBL）（对Branhamella catarrhalis）;AC培养基（Difco）〔对产气夹膜杆菌（C.Perfringens）〕;Wilkins-Chalgren琼脂（oxoid）（对其他厌氧菌）（T.D.Wilkins和S.Chalgren，Antimicrob.Ag.Chemother.10，926，1976）;含添加物的Evans和Taylor-Robinsou肉汤（Difco）（对于U.urealyticum），酵母氮肉汤（Difco）（对白色念球菌）。

下面表Ⅳ中列出了对某些微生物的最低抑制浓度（MIC，微克/毫升）。

表Ⅳ

抗生素GE2270因子A的

菌株最小抑制浓度（微克/毫升）

金黄色葡萄球菌（Staph.aureus）Tour L165 0.25

金黄色葡萄球菌Tour L165（10⁶cfu/ml） 0.25

金黄色葡萄球菌Tour L165+30%牛血清 0.25

表皮葡萄球菌（Staph.epidermidis）L147ATCC12228 0.13

溶血葡萄球菌L602 0.5

溶血葡萄球菌L602（10⁶cfu/ml） 1

酿脓链球菌（Strep pyogenes）C203 0.25

肺炎链球菌（Strep pneumoniae）UC41 0.13

类链球菌ATCC7080 0.13

和缓链球菌（Strep.mitis）L796 0.13

产气夹膜杆菌ISS30543 0.03

难辨棱状芽孢杆菌ATCC9689 0.03

痤疮丙酸杆菌ATCC6919 ≤0.004

脆弱拟杆菌ATCC23745 2

淋病奈氏球菌ISM68/126 32

Branhamella Catarrhalis ATCC 8176 1

流感嗜血杆菌ATCC19418 128

Ureaplasma urealyticum L1479 32

大肠杆菌SKF12140 ＞128

普通变形菌ATCC881 ＞128

（接上）

铜绿色极毛杆菌ATCC 10145 ＞128

肺炎克氏杆菌L142 ＞128

白色念球菌SKF2270 ＞128

抗生素GE2270的活性也可以被临床分离肠球菌的体外实验证实。

表Ⅴ列出了这些实验结果。

表Ⅴ

抗生素GE2270的抗肠球菌活性

微克/毫升

种菌株数

MIC范围 MIC₅₀MIC₉₀

类链球菌 15^＊0.03-0.25 0.06 0.25

＊包括4个抗万古霉素菌株

类链球菌 15^＊0.06-0.5 0.06 0.13

＊包括5个抗万古霉素菌株

有关临床分离凝固酶阴性的葡萄球菌的一些体外试验结果列于下面表Ⅵ中。

表Ⅵ

抗生素GE2270对抗凝固酶阴性的葡萄球菌的活性

GE2270的MIC（微克/毫升）

表皮葡萄球菌L408 0.5

L423 0.25

L410 0.5

L393 0.5

L425 0.25

溶血葡萄球菌L353 0.25

L602 0.25

L383 0.5

L626 0.5

L382 1

L620 1

L381 0.5

抗生素GE2270的抗菌活性图谱也包括厌氧菌，其体外试验结果列于下面表Ⅶ中。

表Ⅶ

GE2270的抗厌氧菌活性

GE2270的MIC（微克/毫升）

脆弱拟杆菌L1236 2

L1237 1

L1226 1

L1228 1

L1010 2

痤疮丙酸杆菌L1014 0.004

L1560 0.004

L1563 0.03

L1565 0.008

抗痤疮丙酸杆菌的活性在涉及到11个临床分离菌株的体外实验中也被证实，结果如下：

抗生素GE2270的抗痤疮丙酸杆菌活性

微克/毫升

菌株数

MIC范围 MIC₅₀MIC₉₀

11 0.004-0.008 0.008 0.008

抗类肠球菌的杀菌活性

在100ml Erlenmeyer瓶内，10ml Todd-Hewitt肉汤中，不加搅拌下于37℃恒温，画出杀灭一时间曲线。类肠球菌L149对数生长培养物以1.4×10⁷CFU/ml接种。

参照抗生素（teicoplanin，8mg/l）在48小时内杀死99%的感染细菌，而抗生素GE2270因子A（0.13mg/l）在2小时内杀死99.8%的这种细菌，以此剂量在48小时内或以4mg/l在24小时内杀死99.99%的细菌。

这种抗类肠球菌活性也可以推广至对糖肽抗生素具有抗性的菌株。

抗Gardnerella vaginalis活性

用5%兔血和0.15%溶化的兔血在Casman琼脂上进行13个G.vaginalis临床分离体的试验（接种量约10⁴CFU）。抗生素GE2270因子A的最低抑制浓度范围为2-4mg/l，MIC₅₀为2mg/l，于37℃在绝氧混合物中保温48小时。

小鼠败血病实验

本发明化合物的抗菌活性也可以被小鼠败血病实验证实。

用含黄色葡萄球菌ATCC19636使八只一组的雄性与雌性CD1小鼠（Charles River，平均重18-22克）腹膜内感染，在0.5ml5%细菌粘蛋白（Difco）中悬浮，产生抗菌激发（10⁶细胞/小鼠）。感染后，立即将试验化合物在含5%二甲基甲酰胺和10%Cremophor

EL（聚乙氧基蓖麻油）的无菌水溶液中静脉内用药。

ED₅₀是根据Spearman和Kaerber方法的每个剂量，在第7天存活动物的百分数计算的，所得结果为1.13mg/Kg。

大鼠心内膜炎试验

使重约200克的雄性CD大鼠（Charles River）诱发心内膜炎。将聚乙烯导管（PP.25Portex）穿过主动脉瓣膜经右颈动脉插入左心室，并用丝线系牢。用一个带有压力转换器的记录放大器（Hewlett Packard Model 7782A）控制，矫正导管的位置。两天后，通过静脉内注射含10⁴CFU的金黄色葡萄球菌L1524的0.5ml盐水使大鼠感染，感染16小时开始进行5天的治疗。将溶于丙二醇：Cremophor EL：5%葡萄糖（10∶20∶70）中的抗生素GE2270因子A按20mg/Kg的剂量每天两次静脉内注射。从治疗起的第六天将存活的大鼠杀死，取出心脏。每个在该治疗结束前死去的动物进行尸体解剖，取出心脏。将每只心脏称重并打成匀浆;均浆连续稀释并涂于Todd-Hewitt琼脂上以测定细菌负荷，全心匀浆中存在的血液不影响结果，因为血液中的细菌滴定度总是比心脏负荷至少低1000倍。通过Scheffe的多重比较试验对数据进行统计学分析。在感染后40小时内死亡的大鼠被排除在统计学分析之内。这一实验结果如下：

抗生素GE2270因子A对于大鼠葡萄球菌心内膜炎的活性

感染每天剂量 Log₁₀CFU/g心脏

生物体^＊＊治疗 mg/Kg 鼠号（平均值±标准偏差）^＊＊＊

途径

L1524 无 11 9.48±0.33

赋形剂静脉注射 13 9.61±0.31

GE2270 （20×2）

因子A 静脉注射 12 4.89±1.29^＊

＊与对照组（未治疗或用赋形剂治疗）比较，P＜0.001。

＊＊＊治疗开始时心脏细菌负荷：7.36±0.31（5只动物的log₁₀CFU/g心脏的平均值±标准偏差）。

＊＊抗生素GE2270因子A对于金黄色葡萄球菌L1524的最低抑制浓度：0.25微克/毫升。

急性毒性

小鼠的急性毒性试验表明，在这一动物种中，静脉注射抗生素GE2270因子A的LD₅₀高于100mg/Kg，腹膜内注射LD₅₀高于500mg/Kg。

根据其性质，本发明化合物可以用作人或动物治疗的药物制剂的活性成份。

具体地说，抗生素GE2270因子A是一种主要对抗革兰氏阳性细菌及革兰氏阳性与革兰氏阴性厌氧菌具有活性的抗菌剂。它似乎对葡萄球菌心内膜炎有很大的活性，而与甲氧苯青霉素、氨基苷或糖肽抗生素没有任何交叉抗性。

本发明抗生素物质的主要治疗适应症是治疗由于对其敏感的微生物存在所涉及的感染。

术语“治疗”意欲包括预防、治疗和治愈。

接受这种治疗的对象是任何需要治疗的动物、包括灵长目，特别是人，以及其它哺乳动物如马、牛、猪和羊;以及家禽和一般供玩赏动物。

本发明的化合物可以单独服用或与药物可接受的载体混合使用，也可以与其他抗菌剂如青霉素、头孢菌素、氨基苷和糖肽联合使用。联合治疗包括连续、同时和单独使用该活性化合物，施用方式是在首先施用的一种药物疗效未完全消失时，施用另一种。

优选的药物制剂为适于在未受损的或损伤的皮肤或粘膜上局部使用的制剂。这样一些制剂的例子有粉剂、软膏、乳膏和洗剂。在这些制剂中的赋形剂为通常药物学上可接受的赋形剂如油状软膏基（例如十六烷基酯蜡、油酸、橄榄油、石蜡、鲸蜡、甘油淀粉），吸收性软膏基（例如无水羊毛脂、亲水矿脂），乳状软膏基（例如十六烷醇、单硬脂酸甘油酯、羊毛脂、硬酯酸），可溶于水的软膏基（例如乙二醇醚及其衍生物、包括聚乙二醇、聚（氧-1，2-乙二基（ethanediyl））-α-H-W-羟基-十八烷酸酯、多乙氧基醚以及聚乙二醇单硬脂酸酯）。

这些制剂可以含有其它已知的赋形剂，例如防腐剂，并且按照本领域已知的及参考手册所叙述的方法制备，如Remington′s Pharmaceutical Sciences，17版，1985年Mack出版公司。

按照本领域中本身是已知的方法及如上所述参考书中所报导的方法，本发明的化合物也可以制成适于非肠道使用的制剂。

例如，将本发明化合物配制成在注射用无菌水中含增溶剂如聚丙二醇或二甲基乙酰胺以及含表面活性剂如聚氧乙烯山梨糖醇-油酸或聚乙氧化蓖麻油的制剂。

一个典型的非肠胃道使用制剂的实例为：每毫升最终制剂含10mg抗生素GE2270因子A、10-20%表面活性剂如聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯蓖麻油衍生物或聚氧乙烯氢化蓖麻油衍生物，以及0-20%，最好为10-20%的增溶剂如丙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、叔丁基-N-hydroxycarmabate、1，2-，1，3-或1，4-丁二醇、油酸乙酯、四氢糠基-聚乙二醇200、二甲基异山梨糖醇、苄基乙醇等。优选的增溶剂为丙二醇。

聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯是市售的，其中一些以“Tween”商标名销售，其非专有名称“多乙氧基醚”也是已知的，其实例为多乙氧基醚20，21，40，60，61，65，80，81和85。本发明制剂中优选使用的是多乙氧基醚80（脱水山梨糖醇-单-9-十八烷酸酯、聚（氧-1，2-乙二基）衍生物）。

聚氧乙烯蓖麻油和聚氧乙烯氢化蓖麻油也是市售的。其中一些以“Cremophor”商标名出售。这些化合物的实例是那些已知的如Cremophor EL（聚乙氧基化蓖麻油）、Cremophor RH40（聚乙氧基化氢化蓖麻油）、Cremophor RH60（PEG60氢化蓖麻油）或Emulphor EL-719（聚氧乙烯化植物油）。

注射制剂PH范围最好在7±0.15，如果需要可以用合适的缓冲剂适当地调节制剂的PH值。TRIS（即三羟甲基氨基甲烷）或磷酸盐可以很方便地用作缓冲剂。

优选的非肠胃道使用的制剂含有如下的赋形剂：20% Cremophor

EL（聚氧基35蓖麻油UPS/NF），5-20%丙二醇，最好是10-20%丙二醇。

通常，可以通过将活性成分溶于有机溶剂，然后加入合适的表面活性成分，最后用注射用无菌水稀释至所需体积，从而制成这些制剂。

在本领域已知的其它赋形剂如防腐剂或增溶剂也可加入。

非肠胃道制剂的实例如下：

抗生素GE2270因子A 10mg

PEG40蓖麻油（Cremophor EL） 0.2ml

丙二醇 0.2ml

对羟基苯甲酸甲酯 0.5mg

对羟基苯甲酸丙酯 0.05mg

注射用水加至 1ml

此外，活性成份可以制成冻干粉末，在使用前恢复。

如果这种冻干原料是由含活性成份与表面活性剂如聚乙二醇60氢化蓖麻油的混合物制成，那么只用水介质而不加有机溶剂就可以很方便地使其恢复。

如果需要，可任意加入普通的冻干辅剂，从而获得粉末状冻干原料。

在治疗任何涉及对本发明抗生素敏感的微生物感染中，所有这些制剂最好用于静脉注射给药。

在对假膜结肠炎或其他由胃肠道中存在厌氧菌而引起的疾病的治疗中，可以口服有效剂量的本发明化合物，适合的药物剂型如胶囊、片剂或水相悬浮剂。

活性成份的剂量由许多因素决定，其中包括患者的类型、年令及状态，具体的活性成份及用药配方的选择、用药安排等。

通常，有效抗菌剂量按照每一单位剂量剂型使用。

一般，最好是重复敷用/给药，例如每天2-6次，一般有效剂量范围在0.5-50mg/Kg体重/每天。

优选的局部制剂是含1%至10%本发明化合物的软膏。

无论如何，处方医师可以对一定情况下的患者决定适合的剂量。

本发明化合物除了可用作人和兽治疗药物之外，还可以用作动物生长促进剂。

为达到这一目的，将本发明化合物在合适的饲料中使用。所使用的正确浓度应该是当正常量饲料被消耗时，以生成促进有效的量提供活性成份。

将本发明活性化合物加入动物饲料中的方法最好是制备适当的含有有效活性化合物的饲料预混物，并将预混物混合达到完全的定量。

另一种办法可以在饲料中混入含活性成份的中间提浓物或饲料添加剂。制备和施用这种饲料预混物及完全定量的方法在一些参考书中已被描述（例如“应用动物营养”，W.H.Freedman and Co.，S.Francisco，U.S.A，1969或“家禽饲料与饲养”O and B图书公司，Corvallis，Oregon，USA，1977）。

附图的简要说明

图1为抗生素GE2270因子A的紫外图谱。符号与所用溶剂的对应关系如下：

-指在CH₃OH中的分析

● 指在0.1N HCl中的分析

■ 指在pH7.4的磷酸盐缓冲液中的分析

▲ 指在0.1N KoH中的分析

图2为抗生素GE2270因子A在石蜡糊中的红外吸收图谱。

图3为在DMSO-d₆中抗生素GE2270因子A在500MHz下的¹H-NMR图谱。

图4为在DMSO-d₆中抗生素GE2270因子A在125MHz下的¹³C-NMR图谱。

下面的实例是对本发明的进一步说明，而绝不是对本发明的限制。

实例1 抗生素GE2270的生产

将玫瑰游动双孢菌ATCC53773的培养物于28-30℃下在燕麦片琼脂斜面上生长两周，然后接种在含100ml具有以下成分的种子培养基的500ml长颈瓶中：

淀粉 20g/l

多蛋白胨 5g/l

酵母提取物 3g/l

牛肉提取物 2g/l

大豆粉 2g/l

碳酸钙 1g/l

加蒸馏水至 100ml

（灭菌前将PH值调至7.0）

该长颈瓶在旋转振动器（200rpm）上于28-30℃下恒温92小时。然后将所得到的培养物接种于含有4升相同培养基的发酵罐里，并在通气（每体积每秒约1标准升空气）搅拌（约900rpm）下于28-30℃保温48小时。

将所得发酵液转入含50升如下培养基的发酵器中：

淀粉 20g/l

胨 2.5g/l

水解酪朊 2.5g/l

酵母提取物 3g/l

牛肉提取物 2g/l

大豆粉 2g/l

碳酸钙 1g/l

加蒸馏水至足量

（灭菌前将PH值调至7.0）

并在28-30℃下保温72小时。

抗生素生产可通过用枯草杆菌ATCC6633在最低量Davis培养基上生长的纸盘琼脂分析法监测。在35℃保温过夜后评价其抑制作用区。

实例2 抗生素GE2270的回收

收集如上获得的发酵物质（50升），并在有助滤剂（Clarcell）存在下过滤。

抗生素GE2270主要发现于菌丝体中，尽管也可以从滤液中回收一些。

a）将滤液PH值调至约7.0并用乙酸乙酯（50升）萃取。离心分离有机相并减压浓缩至一个小的体积。然后用石油醚处理所得到的油状物，沉淀得到粗抗生素GE2270。将其过滤收集并干燥。于是得到415mg粗抗生素GE2270复合物。

b）用20升甲醇萃取菌丝体两次，合并提取液，减压浓缩，从而得到水相残渣。将此残渣用乙酸乙酯萃取两次。向浓缩的有机相中加入石油醚，沉淀出粗抗生素GE2270（6.06g）。

实例3 抗生素GE2270因子A的纯化

将按照上述方法从菌丝体中得到的粗产品（3克）溶解于四氢呋喃中，并在硅胶（230-400目）存在下减压浓缩。收集所得到的固体残渣，装到含300g在二氯甲烷（CH₂Cl₂）中制备的硅胶（230-400目）的色谱柱上。首先用2升二氯甲烷使柱显色，然后加入1.5升比率为98/2、96/4、94/6、92/8、90/10和88/12（V/V）的二氯甲烷与乙醇的混合物。

收集各个组分，进行TLC、HPLC或抗枯草杆菌微生物分析，并根据其抗生素含量合并组分。

将合并的含有纯抗生素GE2270因子A（HPLC保温时间14.9分钟，见物理-化学数据，E项）的组分减压浓缩，从而产生一个油状物，将此油状物溶于四氢呋喃中。向该溶剂中加入石油醚，沉淀出抗生素GE2270因子A（600mg）。

实例4

另一种得到抗生素GE2270因子A的来源是从上面所述色谱系统分离出的其它组分中获得，但所含的抗生素GE2270因子A是不纯的（HPLC）。还是将这些组分合并、浓缩和处理，从而获得前面所述的固体。按照下面的过程，通过高压液相色谱法（HPLC）纯化抗生素GE2270因子A的粗制剂：

将一部分这种沉淀物（6mg）溶解在1∶1（V/V）的乙腈∶水中并注入配备有硅烷化硅胶柱（Lichrosorb RP18，7微米，250×10mm，Merck，Darmstadt）的色谱系统中。

洗脱剂由流速约为4ml/分、在20分钟内溶液A在溶液B中从50%至85%的线性梯度的A与B的混合溶液组成。溶液A是乙腈与18mM磷酸钠缓冲液70/30（V/V）的混合物，PH值调至6，而溶液B是乙腈与18mM磷酸盐缓冲液10/90（V/V）的混合物，PH值调至6。

将色谱柱与Perkin Elmer LC85紫外监测器连接，于330nm处监测。合并随后的11个具有均匀含量的色谱操作的组分，并减压浓缩除去乙腈，于是得到被分离的含抗生素GE2270因子A的残留溶液。将这些溶液用等体积乙酸乙酯萃取两次，向浓缩的有机相中加入石油醚产生沉淀，得到抗生素产物。通过过滤回收和干燥，得到27mg抗生素GE2270因子A。

Claims

1、具有如下特征的非盐形式的抗生素GE2270因子A：

A)紫外吸谱呈现出如下的最大吸收值：

E^1％ _1cmλmax(nm)

0.1MHCl 245(肩峰)

310

0.1MKOH 245(肩峰)

313

PH7.4的磷酸盐缓冲液 245(肩峰)

314

甲醇 244(肩峰)

265 310

B)石蜡糊中的红外吸收色谱呈现如下的最大吸收值(cm^-1)：

3700-3060；3060-2660(液体石蜡)；1650；1590-1490；1490-1420(液体石蜡)；1375(液体石蜡)；1310；1245；1210；1165；1090；1060；1020；970；930；840；810；750；720(液体石蜡)；700；该图谱的主要官能红外吸收带可归成为：

V，(cm^-1) 指定

3600-3100 VNH，VOH

1650 酰胺Ⅰ(VC=0)

1545 杂环VC=C和VC=N

1524，1495 酰胺Ⅱ(δNH)

1250，1205 芳香族δCH

870 杂环γCH

745，700 芳香族γCH

C)以TMS作内标(0.00ppm)在DMSO-d₆(六氘二甲基亚砜)中的¹H-NMR图谱在500MHz显示出的各组信号(ppm)如下：每一信号的质子数标在括号内

9.02(1)；8.68(1)；8.70(1)；8.57(1)；8.50(1)；

8.43(1)；8.37(1)；8.26(1)；8.25(1)；7.4-

7.20(9)；6.96(2)；6.02(1)；5.30-5.18(3)；

5.01(1)；4.97(2)；4.80(1)；4.56(1)；4.30(1)；

4.26(1)；3.98(1)；3.81(1)；3.79(1)；3.38(3)；

2.72(1)；2.58(3)；2.48(3)；2.16(1)；2.13(1)；

1.96(2)；1.88(1)；1.34(1)；0.87(3)；0.84(3)；

D)以TMS作内标(0.00pm)在DMSO-d₆中的¹³C-NMR图谱在125MHz显示出的各组信号(ppm)如下，Q代表四价碳原子或C=O基团；

173.69Q；171.10，Q；169.83，Q；169.51，Q；

168.45，Q；168.26，Q；167.84，Q；165.68，Q；

164.75，Q；161.40，Q；161.23，Q；160.46，Q；

160.29，Q；159.35，Q；153.42,Q；150.31，Q；

150.11，Q；149.41，Q；146.93，Q；144.73，Q；

143.75，Q；142.10，Q；141.78，Q；141.33，CH；

140.97，Q；139.53，Q；128.68，CH；127.99，2[CH]；

127.67，Q；127.67，CH；126.88，CH；126.76，

2[CH]；123.17，CH；118.66，CH；116.43，CH；

73.81，CH；69.41，CH₂；67.97，CH；67.36，CH₂；

60.12，CH；58.63，CH₃；58.24，CH；55.41，CH；

48.15，CH；47.03，CH₂；41.19，CH₂；37.60，CH₂；

34.06，CH；29.76，CH₂；25.85，CH₃；24.28，CH₂；

18.49，CH₃；17.98，CH₃；11.99，CH₃；

E)在下述条件下进行反相HPLC分析时，保留时间(Rt)为14.9分钟：

柱：Rltrasphere ODS(反相硅烷化硅胶；5微米)

Altex(Beckman)4.6mm(i.d)×250mm前置柱：Brownlee labs RP18(八癸基硅烷硅胶；5微米)。

洗脱剂A：乙腈：18mM磷酸钠70∶30(V/V)，调至PH7.0

洗脱剂B：乙腈：18mM磷酸钠10∶90(V/V)，调至PH7.0

洗脱方式：在20分钟内洗脱剂A在洗脱剂B中从45%至70%的线性梯度洗脱

流速：1.8ml/min

紫外检测器：254nm

内标：氯霉素(Rt=3.7分钟)

F)在惰性气氛下，在约140℃将样品预先干燥后进行元素分析，结果表明有如下组成：碳、氢、氮、硫；

G)在如下色谱系统中Rf值为0.37∶二氯甲烷∶甲醇为9∶1(V/V)，使用硅胶板(硅胶60F₂₅₄，Merck Co)。

显色：紫外线254nm，使用碘蒸气或用在最低量Davis培养基中枯草杆菌(B.subtilis)ATCC6633的生物自检法，呈黄色色斑；内标：氯霉素(Rf0.56)

H)FAB-MS分析在质/荷比(m/z)1290.3±0.1道尔顿显示出质子化分子离子的最低质量同位素。在下述实验条件下，用Kratos MS-50双聚焦质谱仪分析，在图谱中所有具有高于800m/z质量单位的峰(同位素峰不计)低于分子离子的20%；以6千伏Xe快原子轰击，甘油基质；阳离子化方式。

I)盐酸水解氨基酸分析表明有如下天然氨基酸存在：甘氨酸、(L)脯氨酸和(L)丝氨酸，实验条件如下：

样品在存在含1%苯酚的6NHCl下，在105℃水解20小时，然后按如下两步衍生：

a)用在无水丙醇中的2MHCl使羧酸官能团生成正丙酯(90℃，1小时)，然后在氮气下干燥；

b)在室温下用五氟丙酸酐/无水二氯甲烷(1/9，V/V)将游离氨基转化为酰胺，进行一小时，然后在氮气氛下干燥；将如此获得的衍生物溶解于二氯甲烷中，并在如下条件下，使用HP5985B系统进行气相色谱-质谱(GC-MS)分析：柱：将手性正-丙酰-L-缬氨酸叔丁酰胺聚硅氧烷涂于熔凝的二氧化硅毛细管柱上(25m×0.2mm直径；毛细管气相色谱(C.G.C)法分析)；温度方案，80℃4分钟，然后每分钟4℃。

L)离子化研究

通过在甲基溶纤剂/水中的0.1NHCl和0.1NNaOH滴定检测不到离子基团；在非水基质(乙酸)中的0.1NHClO₄滴定显示出弱的碱性基团；

M)旋光率

[a]²⁰ _D=+140.8；无水乙醇，浓度约5克/升。

2、一种可以从玫瑰游动双孢菌ATCC53773的菌丝体或其产生GE2270的变异体或突变体中回收得到的抗生素物质-抗生素GE2270复合物。

3、一种制备权利要求1或2的化合物的方法，包括在可同化碳源、氮源及无机盐存在下，在浸没需氧条件下培养玫瑰游动双孢菌ATCC53773或其产生GE2270的变异体或突变体，并从中回收所产生的抗生素。

4、一种药物组合物，其中含有与一种药物学上可接受的载体相混合的权利要求1或2的化合物。

5、一种作为药物使用的权利要求1或2的化合物。

6、用权利要求1或2化合物制备的用作抗生素使用的药物。

7、玫瑰游动双孢菌ATCC53773。

8、一种在生物学上是纯的玫瑰游动双孢菌ATCC53773或产生GE2270的突变体或变异体，在排除玫瑰游动双孢菌ATCC23866下，它能够在有可同化碳源、氮源和无机盐存在下的需氧发酵条件下产生抗生素GE2270因子A。