FI95930B - Menetelmä antibiootin GE 2270 tekijä A:n valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä antibiootin GE 2270 tekijä A:n valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI95930B FI95930B FI894237A FI894237A FI95930B FI 95930 B FI95930 B FI 95930B FI 894237 A FI894237 A FI 894237A FI 894237 A FI894237 A FI 894237A FI 95930 B FI95930 B FI 95930B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- antibiotic
- eluent
- nujol
- under
- following
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/02—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/06—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using actinomycetales
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
- 95930
Menetelmä antibiootin GE 2270 tekijä A:n valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää uuden antibioottisen aineen, jota kutsutaan antibiootiksi GE 2270, valmistamiseksi. Antibioottia GE 2270 voidaan käyttää lääkeaineena, erityisesti hoidettaessa infektiosairauksia, joita sille herkät mikro-organismit saavat aikaan.
Antibiootti GE 2270 on aktiivinen myös kasvua edistävänä aineena eläimillä, kuten siipikarjalla, sioilla, märehtijöillä, jne.
Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä viljellään kantaa Planobispora rosea ATCC 53773 tai sen antibioottia GE 2270 tuottavaa varianttia ja antibiootti eristetään myseelistä ja/tai käymisliemistä.
Planobispora rosea ATCC 53773 eristettiin maanäytteestä ja talletettiin kesäkuun 14. päivänä 1988 American Type Culture Collection'iin (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 Maryland, USA, Budapestin sopimuksen ehtojen mukaisesti.
Kanta on saanut liittymisnumeron ATCC 53773.
Antibiootin GE 2270 valmistus tapahtuu viljelemällä Planobispora-kantaa. joka pystyy tuottamaan sitä, t.s. viljelemällä kantaa Planobispora rosea ATCC 53773 tai sen antibioottia GE 2270 tuottavaa varianttia aerobisissa olosuhteissa vesipitoisessa ravintoalustassa, joka sisältää assimuloituvat hiili-, typpilähteet ja epäorgaanisia suoloja. Monia ravintoalustoja, joita tavallisesti käytetään käymisessä, voidaan käyttää, kuitenkin tietyt kasvatusalustat ovat edullisia. Edullisia hiililähteitä ovat glukoosi, mannoosi, galaktoosi, tärkkelys, maissijauho ja vastaavat. Edullisia typpilähteitä ovat ammoniakki, nit 2 95930 raatit, soijapapujauho, peptoni, lihauute, hiivauute, tryptoni, aminohapot ja vastaavat. Epäorgaanisia suoloja, joita voidaan lisätä viljelyalustaan, ovat tavanomaiset liukenevat suolat, joista saadaan natrium-, kalium-, rauta-, sinkki-, koboltti-, magnesium-, kalsium-, ammonium-, kloridi-, karbonaatti-, sulfaatti-, fosfaatti-, nitraatti-ioneja ja vastaavia.
Tavallisesti antibioottia tuottavaa kantaa esiviljellään ravistelupullossa, jonka jälkeen viljelmää käytetään ympättäessä käymisfermenttorit antibioottisten aineiden oleellisten määrien tuottamiseksi. Esiviljelyyn käytetty kasvatusalusta voi olla samanlainen kuin suurempiin fermenttoreihin käytetty mutta myös muita kasvatusalustoja voidaan käyttää. Antibioottia 2270 tuottava kanta voi kasvaa lämpötiloissa, jotka ovat välillä 20 °C - 40 °C, mieluimmin 24 °C - 35 eC.
Fermentoinnin aikana antibioottituotantoa voidaan seurata testaamalla kasvatusliemi- tai myseeliuutenäytteistä antibioottinen aktiivisuus, esimerkiksi biotesteillä tai TLC- tai HPLC-menetelmillä.
Antibiootille GE 2270 herkkiä organismeja, kuten Bacillus subtilista ja S.aureusta voidaan käyttää testiorganismei-na. Biotesti suoritetaan parhaiten agardiffuusiomene-telmällä agarlevyillä. Antibioottisen aktiivisuuden mak-simituotanto tapahtuu tavallisesti fermentoinnin toisen ja viidennen päivän välisenä aikana.
Antibioottia GE 2270 tuotetaan viljelemällä kantaa Plano-1*. bispora rosea ATCC 53773 tai sen antibioottia GE 2270 tuottavaa varianttia ja antibiootti löytyy pääasiassa myseelistä.
Tässä selityksessä, käsiteltäessä keksinnön mukaista yhdistettä, viitattaessa sen fysiko-kemiallisiin tai •.
Il 3 95930 biologisiin ominaisuuksiin, käsitteellä "antibiootti GE 2270" on yleisesti ymmärrettävä tarkoitettavan antibiootin GE 2270 tekijä A:ta, joka on sen pääkomponentti.
Kannan Planobisnora rosea ATCC 53773 morfologiset tunnusmerkit :
Planobispora rosea ATCC 53773 kasvaa hyvin useimmilla standardialustoilla. Kasvumyseeli muodostaa pitkiä ja epäsäännöllisesti haarautuvia filamentteja (0,5 - 1,0 μιη) , jotka tunkeutuvat agariin ja muodostavat tiiviin kasvuston sen pinnalle. Myseeli pysyy katkeamattomana kasvatettaessa sekä nestemäisissä että kiinteissä kasvatusalustoissa. Sen väri vaihtelee vaaleankorallista vaaleanpunaiseen koralliin useimmilla testatuilla kasvatusalustoilla. Ilmamyseeli muodostaa pitkiä, aaltomaisia ja kapeita hyyfejä, joissa muutamia lateraalisia haaroja, ja se kasvaa ilmassa pääasiallisesti agarpinnan suuntaisesti. Ilmamyseeli, esiintyessään, on väriltään valkoinen-vaaleanpunainen. Sporangioita muodostuu yksittäin tai ryhmissä pitkin ilmamyseelin hyyfejä ja ne ovat noin 6,0 - 8,0 mikronia pitkiä ja 1,0 - 1,2 mikronia leveitä. Ne ovat liittyneet hyyfeihin lyhyellä sporan-gioforilla (1,0 - 2,0 μη pitkä). Jokaiseen sporangioon muodostuu yhteenliittyneiden suorien itiöiden muodostama pitkittäispari (3,0 - 3,5 x 1,2 μια) . Sporangiossa itiöt erottaa poikkiväliseinä. Sen jälkeen, kun itiöt vapautuvat sporangiokuoresta, ne muuttuvat liikkuviksi peritri-koisten flagellojen avulla.
« • · • · « 4 95930
Kannan Planoblspora rosea ATCC 53773 viljelytunnusmerkit:
Kannan Planoblspora rosea ATCC 53773 viljelytunnusmerkkien tutkimiseksi sitä kasvatettiin erilaisilla standardikasva-tusalustoilla, joita Shirling ja Gottlieb ovat esittäneet (Shirling E.B. and Gottlieb D., 1966 - Method for characterization of Streptomyces species - Int.J.Syst.Bacteriol, 16, 313-340) ja lisäksi useilla kasvatusalustoilla, joita Waks-man suosittelee (Waksman S.A., 1961 - The Actinomycetes -The Williams and Wilkins Co. Baltimore; Voi. 2, 328-334).
Värin määritys tehtiin tarvittaessa menetelmällä, jonka ovat esittäneet Maerz ja Paul (Maerz A. and M.Rea Paul, 1950 - A Dictionary of Color - 2nd Edition McGraw-Hill Book Company Inc. New York).
Organismin kykyä käyttää hyväkseen erilaisia hiililähteitä arvioitiin menetelmällä, jonka ovat esittäneet Shirling ja Gottlieb.
viljely- ja fysiologiset tunnusmerkit ja hiililähteiden hyväksikäyttö on esitetty taulukoissa I, II ja III.
Taulukon I lukemat on otettu kahden viikon inkuboinnin jälkeen, joka suoritettiin 28 °C:ssa.
Taulukko I
Kannan Planoblspora rosea ATCC 53773 viljelytunnusmerkit viljelyalusta morfologiset tunnusmerkit kaurajauhoagar runsas kasvu, pehmeä pinta, korallin 6%:inen vaaleanpunainen (2-H-10), tuottaa 5 95930 runsaasti vaalean vaaleanpunaista ilmamyseeliä (l-A-9) ISP 2 runsas kasvu, rypistynyt pinta, vaa- (hiivauute-mallasagar) lea vaaleanpunainen (2-E-9), jälkiä vaaleasta ilmamyseellstä ISP 3 (kaurajauho- kohtuullinen kasvu, pehmeä pinta, agar 2 %:inen) vaalea vaaleanpunainen (2-Ε-Θ), jälkiä vaaleanpunertavan valkoisesta ilmamyseelistä ISP 4 (epäorgaanisia kohtuullinen kasvu, pehmeä pinta, suoloja, tärkkelysagar) korallin vaaleanpunainen (2-E-10) ISP n 5 (glyseroli- kohtuullinen kasvu, pehmeä ja tasai-asparagiini-agar) nen pinta, vaalea vaaleanpunainen (2-A-9), tuottaa runsaasti valkoista ilmamyseeliä ISP 6 (peptoni-hiiva- kohtuullinen kasvu, hiukan rypisty-uute-rauta-agar) nyt, vaalea korallin vaaleanpunainen (l-A-10) ISP 7 kohtuullinen kasvu, pehmeä ja ohut (tyrosiiniagar) pinta, vaalea vaaleanpunainen (l-A-9), muodostaa runsaasti vaaleaa vaaleanpunaista (l-C-9) ilmamyseeliä
Hichey'n ja Tresner'in runsas kasvu, paksu ja rypistynyt agar pinta, vaalea korallin vaaleanpunai nen (l-A-10), muodostaa kohtuullisesti vaaleaa vaaleanpunaista ilmamyseeliä 6 95930
Czapek-glukoosiagar hyvin niukka kasvu, pehmeä ja ohut pinta, muodostaa kohtuullisesti vaaleaa vaaleanpunaista ilmamyseeliä
Glukoosi-asparagiini- kohtuullinen kasvu, pehmeä ja ohut agar pinta, väritön, ilmamyseeli puuttuu ravintoagar hyvä kasvu, pehmeä pinta, vaalean- oranssi, jossa vaaleanpunertava vivahdus (9-A-7)
Bennett'in agar kohtuullinen kasvu, hiukan rypisty nyt pinta, vaaleankullanruskean vaaleanpunainen (10-A-6) calsium-malaatti-agar huono kasvu, pehmeä ja tasainen pinta, väritön kuorittumaitoagar kohtuullinen kasvu, pehmeä pinta, korallin vaaleanpunainen (2-F-9) munanvalkuaisagar huono kasvu, pehmeä ja ohut pinta, värittömästä vaaleaan vaaleanpunaiseen (2-A-8) dekstroosi-tryptoosi- ei kasvua agar peruna-agar hyvä kasvu, pehmeä pinta, vaalean- oranssi, jossa vaaleanpunertava vivahdus (9-A-7)
Kirjaimet ja numerot viittaavat väriin, joka määritetty Ma- erzin ja Paulin mukaan (katso edellä).
Il 7 95930
Taulukko II
Kannan Planobispora rosea ATCC 53773 fysiologiset tunnusmerkit testit tulokset tÄrkkelyshydrolyysi positiivinen rikkivedyn muodostus negatiivinen tyrosiini-reaktio positiivinen kaseiinihydrolyysi heikosti positiivinen kalsiummalaatin hajottaminen negatiivinen liivatteen nesteyttäminen heikosti positiivinen maidon koagulointi negatiivinen maidon peptonointi negatiivinen nitraatti-pelkistys positiviinen • « 1 i β - 95930
Taulukko III
Hiilihydraatin hyväksikäyttö
Hiililähde kasvu arabinoosi + ksyloosi + riboosi fruktoosi +/- galaktoosi glukoosi + ramnoosi laktoosi sakkaroosi maltoosi + raffinoosi selluloosa mannitoli salisiini + inositoli + sellobioosi
I I
+ kohtuullinen kasvu +/- niukka kasvu ei kasvua Tässä testissä käytetään kasvatusalustaa nro 8 ja tulokset arviodaan 2 viikon inkuboinnin jälkeen, joka suoritetaan 2:8-30 eC:ssa.
Il 9 . 95930 Lämpötilaherkkyys
Optimikasvatuslämpötila vaihtelee 28 °C:sta 37 °C:seen. Kasvua ei havaita 15 eC:ssa eikä 50 *C:ssa, kohtuullinen kasvu 20 *C:ssa.
Kemotaksonomiset tunnusmerkit:
Soluselnäanalyysl:
Soluseinässä esiintyvien aminohappojen analyysi suoritettiin menetelmällä, jonka on kuvannut Becker et ai. ("Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole cell hydrolyzated", Appi.Microbiol. 12, 421-423, 1964).
Analyysi, jossa koko solu hydrolysoitiin, paljasti, että meso-diaminopimeliinihappo oli läsnä.
Glysiiniä ei todettu analysoitaessa puhdas soluseinävalmis-te, joka saatiin menetelmän mukaan, jonka on esittänyt Kawamoto et ai. (Kawamoto I., O.Tetsuo and N.Takashi, "Cell wall composition of Micromonospora olivoasterosporia, Micromonos-pora sagamiensis and related organism.", J. of Bacteriol. 146, 527-534, 1981).
Koko solun sokerlkaavlo:
Hydrolysoitaessa koko solu suoritettiin sokeripitoisuuden analyysi menetelmällä, jonka on esittänyt Lechevalier M.P. ("Identification of aerobe actinomycetes of clinical importance", J.Lab.Clin.Med. 71, 934-944, 1968), käyttäen ohut-kerroskromatografiassa selluloosakalvoja, kuten kuvaavat Staneck J.L. ja G.D.Roberts ("Simplified approach to identification of aerobic actinomycetes by thin layer chromato- 95930 10 graphy", Appi.Microbiol. 28, 226-231, 1974) seuraavassa liu-otinsysteemissä: etyyliasetaatti:pyridiini:vesi (100:35:25; til./til./til.).
Saadut tulokset osoittivat, että läsnä oli maduroosi (3-0-metyyli-D-galaktoosi) ja arabinoosi ja galaktoosi puuttuivat.
Kannan Planobispora rosea ATCC 53773:n identifiointi Tämä kanta merkittiin kuuluvaksi Planobispora-sukuun ja luokiteltiin Planobispora rosea'ksi seuraavien morfologisten ja kemiallisten tunnusmerkkien perusteella: a) soluseinässä esiintyy meso-diaminopimeliinihappo ja glysiini puuttuu (soluseinä-kemotyyppi III); b) maduroosin esiintyminen hydrolysoitaessa koko solu (koko solun sokerikaavio B); c) pitkien ja synlinterin muotoisten sporangioiden, jotka sisältävät liikkuvien itiöiden muodostaman parin, muodostuminen ilmamyseelille; ’ d) kasvumyseelin vaaleanpunainen väri.
Edellä esitetyt kannan Planobispora rosea ATCC 53773 morfologiset tunnusmerkit eivät olennaisesti eroa niistä Planobispora rosea-kannan tunnusmerkeistä, jotka J.E.Thiemen et ai. kuvasivat julkaisussa "The Actinomycetales", The Jena • Intern.Symp. on Taxon., September 1968, ed. H.Prauser, Jena.
Se talletettiin American Type Culture Collection'iin, jossa sille annettiin liittymisnumero 23866. Mitään antibiootti-tuotantoa ei kuvattu tälle kannalle.
il 11 95930
Kuten muidenkin mikro-organismien, GE 2270:tä tuottavien kantojen tunnusmerkit ovat alttiit muunnokselle. Esimerkiksi kannan keinotekoisia variantteja voidaan saada käsittelemällä erilaisilla tunnetuilla mutageeneilla, kuten UV-säteillä, röntgensäteillä, korkeataajuuksisilla aalloilla, radioaktiivisilla säteillä ja kemikaaleilla, kuten typpihapolla, N-metyyli-N'-nitro-N-nitrosoguanidii-nilla ja monilla muilla. Kaikki luontaiset ja keinotekoiset variantit, jotka kuuluvat Planobisoora-sukuun ja tuottavat antibioottia GE 2270, ovat ekvivalenttisia kannan Planobispora rosea ATCC 53773 kanssa tämän keksinnön tarkoituksiin ja kuuluvat tämän keksinnön piiriin.
Kuten edellä mainittiin antibiootti GE 2270 löytyy yleensä tuottavan kannan myseelistä, kun taas pienempi määrä ainetta löytyy myös käymisliemestä.
Antibiootin GE 2270 talteenottaminen tuottavan mikro-organismin myseelistä tai käymisliemistä tapahtuu sinänsä tunnettujen menetelmien mukaisesti, kuten uuttamalla liuottimilla, seostamalla siten, että lisättään ei-liuottimia tai muuttamalla liuoksen pH-arvoa, jakaantumiskromatografiällä, käänteisfaasisella jakaantumiskromagrafiällä, ioninvaihto-kromatografiällä, molekulaariekskluusiokromatografiällä ja :· vastaavilla.
Edullinen menetelmä keksinnön mukaisen antibiootin talteen-ottamiseksi myseelistä käsittää suodatetun tai sentrifugoi-dun myseelin uuttamisen veteen sekoittuvalla orgaanisella liuottimena, uutteiden konsentroimisen ja raa'an antibioo-.· tin talteenottamisen seostamalla, mahdollisesti seostavaa ainetta lisäämällä, uuttamalla vesipitoinen jäännös veteen sekoittumattomalla orgaanisella liuottimena tai adsorptio-kromatografisesti, jonka jälkeen suoritetaan halutun tuotteen eluointi absorptiomatriisista.
12 95930
Edullinen menetelmä keksinnön mukaisen antibiootin talteen-ottamiseksi käymisliemestä käsittää uuttamisen veteen se-koittumattomalla, orgaanisella liuottimena, jonka jälkeen seostetaan konsentroiduista uutteista mahdollisesti lisäämällä saostavaa ainetta tai sen vesipitoinen jäännös uutetaan edelleen veteen sekoittumattomalla liuottimena, vaihtoehtoisesti käymisliemi voidaan saattaa kosketukseen ad-sorptiomatriisin kanssa, jonka jälkeen seuraa eluointi polaarisella eluointiseoksella. Tätä kromatografista menetelmää voidaan soveltaa konsentroidulle uutteelle, joka saadaan käymisliemestä liemen itsensä sijasta.
Käsitteen "veteen sekoittuva liuotin", jota tässä hakemuksessa käytetään, on tarkoitettu omaavan sen merkityksen, joka tälle käsitteelle alalla yleisesti annetaan ja tarkoittavan liuottimia, jotka käytetyissä oloissa ovat veden kanssa sekoittuvia jokseenkin laajalla konsentraatioalueella.
Esimerkkejä veteen sekoittuvista, orgaanisista liuottimista, joita voidaan käyttää keksinnön mukaisen antibiootin uut-toon myseelimassasta, ovat alempialkanolit, esim. (C^-Cj)-alkanolit, kuten metanoli, etanoli ja propanoli, fenyyli- ^l-C3)alkanolit, kuten bentsyylialkoholi, alemmat keto-nit, esim. (C3-C4)ketonit, kuten asetoni ja etyylimetyylike-. töni, sykliset eetterit, kuten dioksaani ja tetrahydrofuraa- ni, glykolit ja niiden osittaisessa eetteröinnissä muodostuneet tuotteet, kuten etyleeniglykoli, propyleeniglykoli ja etyleeniglykolimonometyylieetteri, alemmat amidit, kuten dlmetyyliformamidi ja dietyyliformamidi.
: Käsitteen "veteen sekoittumaton liuotin", jota tässä hake- * muksessa käytetään, on tarkoitettu omaavan sen merkityksen, joka tälle käsitteelle alalla yleisesti annetaan ja tarkoittavan liuottimia, jotka käytetyissä oloissa ovat huonosti veteen sekoittuvia tai käytännöllisesti katsoen veteen se- »· «
II
l3 95930 koittumattomia jokseenkin laajalla konsentraatioalueella, joka sopiva tarkoitettuun käyttöön.
Esimerkkejä veteen sekoittumattomista, orgaanisista liuottimista, joita voidaan käyttää keksinnön mukaisen antibiootin uuttamiseksi käymisliemestä, ovat tavanomaiset hiilivetyliu-ottimet, jotka voivat olla lineaarisia, haarautuneita tai syklisiä, kuten heksaani tai sykloheksaani, halogenoidut hiilivedyt, kuten kloroformi, hiilitetrakloridi, dikloori-etaani, fluoribromietaani, dibromietaani, triklooripropaani, klooritrifluorioktaani ja vastaavat, aromaattiset hiilivedyt, kuten bentseeni, tolueeni, ksyleeni ja vastaavat, ainakin 4 hiiliatomia sisältävät esterit, kuten etyyliasetaatti, propyyliasetaatti, etyylibutyraatti ja vastaavat, ainakin 4 hiiliatomia sisältävät alkanolit, jotka voivat olla lineaarisia, haarautuneita tai syklisiä, kuten butanoli, 1-penta-noli, 2-pentanoli, 3-pentanoli, 1-heksanoli, 2-heksanoli, 3-heksanoli, 3,3-dimetyyli-l-butanoli, 4-metyyli-l-pentano-li, 3-metyyli-l-pentanoli, 2,2-dimetyyli-3-pentanoli, 2,4-di-metyyli-3-pentanoli, 4,4-dimetyyli-2-pentanoli, 5-metyyli-2-heksanoli, l-heptanoli, 2-heptanoli, 5-metyyli-l-heksanoli, 2-etyyli-l-heksanoli, 2-metyyli-3-heksanoli, 1-oktanoli, 2-oktanoli, syklopentanoli, 2-syklopentyylietanoli, 3-syklo-pentyyli-l-propanoli, sykloheksanoli, sykloheptanoli, syklo-oktanoli, 2,3-dimetyylisykloheksanoli, 4-etyylisykloheksano-li, syklo-oktyylimetanoli, 6-metyyli-5-hepten-2-oli, 1-nona-noli, 2-nonanoli, 1-dekanoli, 2-dekanoli ja 3-dekanoli, suorat tai haarautuneet alkyylieetterit ja niiden seokset, kuten petrolieetteri, etyylieetteri, propyylieeteri, butyyli-eetteri, jne. ja näiden funktionaalisten johdannaisten seokset.
Kuten on alalla tunnettua faasierottumista voidaan parantaa suolauksella.
«·« • 95930 14
Kun uuttamisen jälkeen otetaan talteen vesipitoinen faasi, joka sisältää olennaisen määrän orgaanista liuotinta, siltä voidaan edullisesti tislata atseotrooppisesti vesi pois. Yleensä tällöin täytyy lisätä liuotinta, joka pystyy muodostamaan minimiatseotrooppisia seoksia veden kanssa, jonka jälkeen lisätään tarvittaessa saostavaa ainetta halutun tuotteen saostamiseksi. Tyypillisiä esimerkkejä orgaanisista liuottimista, jotka pystyvät muodostamaan minimiatseotrooppisia seoksia veden kanssa, ovat n-butanoli, bentseeni, to-lueeni, butyylieetteri, hiilitetrakloridi, kloroformi, syk-loheksaani, 2,5-dimetyylifuraani, heksaani ja m-ksyleeni, edullinen liuotin on n-butanoli.
Esimerkkejä saostavista aineista ovat petrolieetteri, alem-pialkyylieetterit, kuten etyylieetteri, propyylieetteri ja butyylieetteri, ja alempialkyyliketonlt, kuten asetoni.
Esimerkkejä kromatografisista systeemeistä, joita voidaan edullisesti käyttää talteenotettaessa keksinnön mukainen antibiootti, ovat polystyreeni- tai sekoitetut polystyreeni-divinyylibentseenihartsit, kuten Amberlite XAD2 tai XAD4 (Rohm ja Haas), S112 (Dow Chemical Co.) ja Diaion HP 20 (Mitsubishi), akryylihartsit, kuten XAD7 tai XAD8 (Rohm ja Haas), polyamidit, kuten polykaprolaktaamit, nailonit ja ristiinkytketyt polyvinyylipyrrolidonit, joilla yleensä : huokostilavuus (ml/g) vaihtelee välillä 1-5, pinta-ala (m2/g) vaihtelee välillä 1-100 ja todennäköinen tiheys (g/ml) vaihtelee välillä 0,15-0,50, keskimääräinen huokos-halkaisija (Angström-yksiköissä) vaihtee välillä 100-3000 ja hiukkaskokojakaantuma, jossa ainakin 40 %:lla hiukkaskoko on alle 300 mikrometriä, tällaisia ovat Polyamide-CC 6, Poly- < . . amide-SC 6, Polyamide-CC 6,6, Polyamide-CC 6AC ja Polyamide- SC 6AC (Macherey-Nagel & Co., Länsi-Saksa), polyvinyylipyr-rolidonihartsi PVL-CL (Aldrich Chemie GmbH & Co., KG, Länsi-Saksa), polyamidihartsi PA 400 (M.Woelm AG, Länsi-Saksa), ja hiili.
ii
• · I
15 95930
Kun kyseessä on polystyreeni- tai akryylihartsi edullinen eluointiaine on veteen sekoittuvien liuottimien, kuten edellä esitettyjen liuottimien, polaarinen liuotinseos, polyami-dihartsin ollessa kyseessä eluointiaine on mieluimmin veteen sekoittuvan liuottimen, kuten jonkin edellä mainitun, vesipitoinen seos, kun taas hiilellä edullinen eluointiaine on alempiketoni, kuten asetoni tai alempialkoholi, kuten meta-noli.
Antibiootin GE 2270 raakatuotteen puhdistaminen edelleen voidaan tehdä millä tahansa tunnetulla menetelmällä mutta mieluimmin se suoritetaan käyttäen kromatografisia menetelmiä.
Esimerkkejä näistä kromatografisista menetelmistä ovat ne, jotka esitettiin edellä taltteenottovaiheen yhteydessä ja näihin kuluu myös kromatografia stationäärifaasilla, kuten piihappogeelillä, aluminiumoksidilla, Florisil'la ja vastaavilla, jolloin orgaanisen eluointifaasin muodostaa liuottimien, mukaan luettuna jo edellä mainitun tyyppisten haloge-noitujen hiilivetyjen, eettereiden, korkeampien ketonlen seokset, tai käänteisfaasinen kromatografia silanoidulla piihappogeelillä, jossa erilaisia funktionaalisia johdannaisia ja eluointialneena edellä mainitunlaisten veteen sekoittuvien liuottimen vesipitoinen seos.
Tavallisesti myös niin kutsuttua steeristä ekskluusiokroma-tografiatekniikkaa voidaan käyttää ja saadaan hyvät puhdis-tustulokset. Erityisesti kontrolloidun huokoskoon omaavat, ristiinkytketyt dekstraanit, joissa useimmat hydroksyyliryhmät on alkyloitu, esim. Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals, Ab), ovat käyttökelpoisia tässä menetelmässä.
Kuten on tavallista tällä alalla tuotanto- sekä talteenotto-että puhdistusvaihe!ta voidaan seurata erilaisilla analyyt- 16 95930 tisillä menetelmillä, Joihin kuuluvat biokokeet, kuten pape-rikiekko- tai agardiffuusiokokeet herkillä mikro-organismeilla, tai TLC- tai HPLC-menetelmät, joihin sisältyvät UV-tai mikrobiaalinen havaitsemisvaihe.
Edullinen HPLC-menetelmä on käänteisfaasinen HPLC, jossa käytetään kolonnia, joka täytetty silanoidun piihappogeelin huokoisilla ja pallomaisilla hiukkasilla, esim. piihappogee-lillä, joka funktionalisoitu C-18-alkyyliryhmillä, ja joilla yhtenäinen halkaisija (kuten 5 mikrometrinen ultrasphere ODS Altex; Beckman Co.), esikolonnia, joka on piihappogeeli, joka funktionalisoitu C-18-alkyyliryhmillä (kuten RP 18 Brownlee Labs), ja eluointiainetta, joka on polaarisen, veteen sekoittuvan liuottimen, kuten jonkin edellä kuvatun, lineaarinen gradientti vesipitoisessa puskuroidussa liuoksessa. Mieluimmin tämän liuoksen pH säädetään arvoon 5-7. Kaikkein edullisin eluointiaine on lineaarinen gradienttiseos, jossa on eluenttia A 45 %:sta 70 %:iin eluentissa B, jossa eluent-ti B on asetonitriilin ja vesipitoisen puskurin, pH 5-7, 10:90-seos, ja eluentti A on asetonitriilin ja vesipitoisen puskurin, pH 5-7, 70:30-seos.
• »
II
17 95930
Antibiootin GE 2270 tekijän A fyslko-kemlalllset tunnusmerkit A) ultraviolettiabsorptiospektri, joka on esitetty liitteenä olevien piirustusten kuviossa 1 ja jossa esiintyy seuraavat absorptiomaksimit: e1 \ cm Lambda maks (nm) 0,1 M HCl 245 (Olka) 310 0,1 M KOH 245 (olka) 313 fosfaattipuskuri pH 7,4 245 (olka) 314 metanoli 244 (olka) 265 310 B) infrapuna-absorptiospektri, joka on esitetty liitteenä olevien piirusten kuviossa 2, mitattuna NujOlissa ja jossa esiintyy seuraavat absorptiomaksimit (cm-1): 3700-3060; 3060-2660 (Nujol); 1650; 1590-1490; 1490-1420 (Nujol); 1375 (Nujol); 1310; 1245; 1210; 1165; 1090; 1060; 1020; 970; 930; 840; 810; 750; 720 (Nujol); 700; • · 18 95930 tämän spektrin pääasialliset funktionaaliset IR-absorp-tiojuovat voidaan tunnistaa seuraavasti: (cm-1) merkitys
3600-3100 VnH, VOH
1650 amidi I ( C=0)
1545 heterosyklinen Vc=C ja ^C=N
1525, 1495 amidi II (S NH)
1250, 1205 aromaattinen &CH
870 heterosyklinen yCH
745, 700 aromaattinen^ CH
C) ^^H-NMR-spektri, joka on esitetty kuviossa 3 ja jossa esiintyy seuraavat signaaliryhmät (ppm:ssä) ja joka on rekisteröity 500 MHzrllä DMSO-dg:ssa (heksadeuterodimetyy-lisulfoksidi) käyttäen sisäisenä standardina (0,00 ppm) TMS:ää; protonien lukumäärä jokaiselle signaalille on esitetty suluissa: 9,02 (1); 8,68 (1); 8,70 (1); 8,57 (1); 8,50 (1); 8,43 (1) ; 8,37 (1); 8,26 (1); 8,25 (1); 7,4-7,20 (9); 6,96 (2) ; 6,02 (1); 5,30-5,18 (3); 5,01 (1); 4,97 (2); 4,80 (1); 4,56 (1); 4,30 (1); 4,26 (1); 3,98 (1); 3,81 (1); 3,79 (1); 3,38 (3); 2,72 (1); 2,58 (3); 2,48 (3), 2,16 (1); 2,13 (1); 1,96 (2); 1,88 (1); 1,34 (1); 0,87 (3); 0,84 (3); D) 13C-NMR-spektri, joka esitetty liitteenä olevien piirustusten kuviossa 4 ja jossa esiintyy seuraavat signaali- .· ryhmät (ppm) ja joka rekisteröity 125 MHz:llä DMSO-dg: ssa, sisäisenä standardina TMS (0,00 ppm), ja jossa Q tarkoittaa kvaternäärisiä hiiliatomeja tai C=0-ryhmiä: 173,69, Q; 171,10, Q; 169,83, Q; 169,51, Q; 168,45, Q; 168,26, Q; 167,84, Q; 165,68, Q; 164,75, Q; 161,40, Q;
II
19 95930 161,23, Q; 160,46, Q; 160,29, Q; 159,35, Q; 153,42, Q; 150,31, 0; 150,11, Q; 149,41, Q; 146,93, Q; 144,73, Q; 143,75, Q; 142,10, Q; 141,78, Q; 141,33, CH; 140,97, Q; 139,53, Q; 128,68, CH; 127,99, 2[CH]; 127,67, Q; 127,67, CH; 126,88, CH; 126,76, 2[CH]; 123,17, CH; 118,66, CH; 116,42, CH; 73,81, CH; 69,41, CH2; 67,97, CH; 67,36, CH2; 60,12, CH; 58,63, CH3; 58,24, CH; 55,41, CH; 48,15, CH; 47,03, CH2; 41,19, CH2; 37,60, CH2; 34,06, CH; 29,76, CH2; 25,85, CH3; 24,28, CH2; 18,49, CH3; 17,98, CH3; 11,99, CH3; E) retentioaika (Rt) 14,9 minuuttia, analysoitaessa kään-teisfaasisella HPLC:llä seuraavissa olosuhteissa: kolonni: Ultrasphere ODS (käänteisfaasinen, silanoitu piihappogeeli; 5 mikrometriä) Altex (Beckman) 4,6 mm (sisähalkaisija) x 250 mm esikolonni: Brownlee Labs RP 18 (oktadekyylisilaani-piihappogeeli; 5 mikrometriä) eluentti A: asetonitriili:18 mM natriumfosfaatti 70:30 (til./til.), pH säädetty arvoon 7,0 eluentti B: asetonitriili:18 mM natriumfosfaatti 10:90 (til./til.), pH säädetty arvoon 7,0 eluointimalll: lineaarinen gradientti, jossa eluenttia A 45 %:sta 70 %:iin eluentissa B 20 minuutissa virtausnopeus: 1,8 ml/min UV-detektori: 254 nm sisäinen standardi: kloramfenikoli (R^ = 3,7 min); 20 95930 F) alkuaineanalyysi, sen jälkeen kun näytettä on etukäteen kuivattu 140 eC:ssa inerttikaasuatmosfäärissä, osoittaa seuraavan koostumuksen: hiiltä, vetyä, typpeä, rikkiä; G) Rf-arvo = 0,37 seuraavassa kromatografisessa systeemissä: dikloorimetaani:metanoli, 9:1 (til./til.) käytettäessä piihappogeelilevyjä (piihappogeeli 60 F254, Merck CO.); näkyväksi tekeminen: UV-valo aallonpituudella 254 nm, keltainen täplä jodihöyryillä tai bioautografia käyttäen organismia B.subtilis ATCC 6633 Davidin mini-maalikasvatusalustalla, sisäisenä standardina kloramfe-nikoli (Rf = 0,56); H) FAB-MS-analyysillä todetaan protonoidun molekyyli-ionin alhaisin massaisotooppi m/z 1290,3±0,1 daltonia. Kaikki muut piikit yli 800 m/z massayksikköä (ei laskettu iso-tooppipiikkejä) spektrissä olivat alle 20 % molekyyli-ionista, analyysin jälkeen, joka suoritettiin Kraton MS-50-kaksoisfokusoivalla massa-spektrometrillä seuraa-vissa kokeellisissa olosuhteissa: Xe-nopea-atomipommitus 6 Kv:llä, glyserolimatriisi; positiivinen ionisaatiomalli; I) hydrokloridihydrolysaatin aminohappoanalyysi osoitti seuraavien luonnollisten aminohappojen esiintymisen: ;·, glysiini, (L)-proliini ja (L)seriini seuraavissa kokeel lisissa olosuhteissa: näyte hydrolysoidaan 105 eC:ssa 20 tuntia 6 N HCl:n, joka sisältää 1 % fenolia, läsnäollessa, jonka jälkeen derivoidaan kahdessa vaiheessa seuraavalla tavalla: a) muodostetaan karboksyylihappofunktioiden n-propyylies-terit 2 M HCl:llä vedettömässä propanolissa (90 eC, 1 h), jonka jälkeen kuivataan typpiatmosfäärissä; il 21 95930 b) vapaat aminoryhmät muutetaan amideiksi pentafluoripro-pionianhydridillä/vedettömällä dikloorimetaanilla (1/9 (til./til.) huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan, jonka jälkeen kuivataan typpiatmosfäärissä; näin saatu, derivoitu jäännös liuotetaan dikloorimetaa-niin ja analysoidaan GC-MS:llä käyttäen HP5985B-systee-miä seuraavissa olosuhteissa: kolonni: kiraalinen n-propionyyli-L-valiini-tert.-butyy-liamidi-polysiloksaanilla päällystetty, fuusioitu pii-happokapillaarikolonni (25 m x 0,2 mm sisähalk.; C.G.C. ANALYTIC): lämpötilaohjelma 80 *C 4 minuutin ajan, sen jälkeen 4 *C/min; L) ionisaatiotutkimukset
Ei ionisoituvat funktiot todetaan titraamalla 0,1 N HCl:llä ja 0,1 N NaOH:lla metyylisellosolve/vedessä; heikko emäksinen funktio paljastuu titrattaessa 0,1 N HCl04:llä vedettömässä väliaineessa (etikkahappo); M) ominaiskierto [alfa]20D = +140,8; absoluuttinen etanoli, konsentraatl-ossa noin 5 g/1.
Keksinnön mukaisten yhdisteiden antimikrobinen aktiivisuus voidaan todeta sarjalla standarditestejä in vitro.
MIC kannoille Clostridium difficile, Propionibacterlum acnes ja Bacteroldes fragills määritetään agarlaimennoksella (ymppi 104 CFU). MIC muille organismeille määritetään mikro-kasvatusliemilaimennoksella (ymppi 104 - 105 CFU/ml). Ymppi kannalle Ureaplasma urealytlcum on suunnilleen 104 väriä vaihtavaa yksikköä/ml. Inkubointiajat ovat 18-24 tuntia, paitsi kannoille N.gonorrhoeae, Branhamella catarrhalis, H. Influenzae, C.difficile, P.acnes ja B.fragills (48 h). Kaikkia organismeja inkuboidaan noin 37 *:ssa paitsi kantaa Can- 22 95930 dlca albicans (30 1C). Kantoja N.qonorrhoeae ja H.Influenzae inkuboidaan 5%:lsessa C02-atmosfäärissä, anaerobeja anaerobisessa kaasuseoksessa. Käytetyt kasvatusalustat ovat: Iso-Sensitest-kasvatusliemi (Oxold) (stafylokokit, Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, Escherichia coll, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae); Todd-Hewitt-kasvatusliemi (Difco) (muut sterptokokit); GC-peruskasvatusliemi (Difco) + 1 % isoVitalex BBL:ää (N.go-norrhoaea); aivo-sydän-infuusiokasvatusliemi (Difco) + 1 % Supplement C:tä (Difco) (H.Influenzae); Mueller-Hinton-kas-vatusliemi (BBL) (Branhamella catarrhalls); AC-kasvatusalus-ta (Difco) (C.perfringens); Wilkins-Chalgren-agar (Oxold) (muut anaerobit) (T.D.Wilkins ja S.Chalgren, Antimicrob. Ag. Chemother. 10, 926, 1976); Evans ja Taylor-Robinson-kasva-tusliemi (Difco) lisäyksineen kannalle U.urealytlcum; hiiva-typpi-kasvatusliemi (Difco) (Candida albicans).
Pienimmät estävät konsentraatiot (the minimal inhibitory concentrations 1 MIC, mikrogramma/ml) eräille mikro-organismeille on esitetty seuraavassa taulukossa IV.
II
· . · · 23 9 5 9 3 0
TAULUKKO IV
Kanta M.I.C. (mi krogramma/ml)
Antibiootti GE 2270 tekijä A
Staph, aureus Tour LI65 0.25
Staph. aureus Tour L165(10^ cfu/ml) 0.25
Staph, aureus Tour L165 + 30% naudanseerumi 0.25 Staph, epidermidis L147 ATCC 12228 0.13
Staph. haemolyticus L602 0.5
Staph, haemolyticus L602 (10^ cfu/ml) 1
Strep, pyogenes C203 0.25
Strep, pneumoniae UC41 0.13
Strep. faecalis ATCC 7080 0.13
Strep, mitis L796 0.13
Clostridium perfringens ISS 30543 0.03
Clostridium difficile ATCC 9689 0.03
Propionibacterium acnes ATCC 6919 £0.004
Bacteroides fragilis ATCC 23745 2
Neisseria gonorrhoeae ISM68/126 32
Branhamella catarrhalis ATCC 8176 1
Haemophilus influenzae ATCC 19418 128 :v Ureaplasma urealyticum L 1479 32
Escherichia coli SKF 12140 >128
Proteus vulgaris ATCC 881 >128
Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 >128
Klebsiella pneumoniae L142 >128
Candida albicans SKF 2270 >128 95930 24
Antibiootin GE 2270 aktiivisuus varmistettiin myös in vitro-kokeissa kliinisesti eristettyjä enterokokkeja vastaan.
Taulukossa V on esitetty tulokset näistä kokeista.
Taulukko v
Antibiootin GE 2270 aktiivisuus enterokokkeja vastaan lajit kantojen MIC-alue MIC5q MIC90 lkm mikrogramma/ml
Strep.
faecalis 151 0,03-0,25 0,06 0,25 4r mukaan luettuna 4 vankomysiinille resistenttiä kantaa Strep.
faecium 151 0,06-0,5 0,06 0,13 mukaan luettuna 5 vankomysiinille resistenttiä kantaa 11 » 25 95930
Tulokset, jotka saatiin eräistä in vitro testeistä kliinisesti eristettyjä, koagulaasi-negatiivisia stafylokokkeja vastaan, on esitetty seuraavassa taulukossa VI.
Taulukko VI
Antibiootin GE 2270 aktiivisuus koagulaasi-negatiivisia stafylykokkeja vastaan MIC (mikrogramma/ml) GE 2270
Staph.epidermidis L408 0,5 L423 0,25 L410 0,5 L393 0,5 L425 0,25
Staph.haemolyticus L353 0,25 L602 1 L383 0,5 L626 0,5 .· L382 1 L620 1 L381 0,5 ♦ « · ft ft .
95930 26
Antibiootin GE 2270 aktiivisuuden antimikrobinen kirjo käsittää myös anaerobit, kuten tulokset osoittavat in vitro-kokeista, jotka esitetty seuraavassa taulukossa VII.
Taulukko VII
Antibiootin GE 2270 aktiivisuus anaerobeja vastaan MIC (mikrogramma/ml) GE 2270
Bacteroides fraqilis L1236 2 L1237 1 L1226 1 L1228 1 L1010 2
Propionibacterium L1014 0,004 acnes L1560 0,004 L1563 0,03 L1565 0,008 » 1
II
· 27 95930
Aktiivisuus organismia P.acnes vastaan varmistettiin myös in vitro-kokeella, joka käsitti 11 kliinisesti eristettyä kantaa, kokeen tulokset esitetty seuraavassa.
Antibiootin GE 2270 aktiivisuus organismia P.acnes vastaan kantojen MIC-alue MIC50 MICgo lkm mikrogramma/ml 11 0,004-0,008 0,008 0,008
Bakterlsldlnen aktiivisuus organismia Enterococcus faecalis vastaan
Alka-tappo (time-killed) kokeet suoritettiin 10 ml:ssa Todd-Hewitt-kasvatuslientä 100 ml:n Erlenmeyer-pulloissa, inku-bointi suoritettiin 37 °C:ssa ilman sekoitusta. Enterococcus faecalis-kannan L149 logaritminen kasvuviljemä ympättiin 1,4 x 107 CFU/ml.
Referenssiantibiootti (teikoplaniini, 8 mg/1) tappoi 99 % infektoivista bakteereista 48 tunnissa, kun taas antibiootin GE 2270 tekijä A (0,13 mg/1) tappoi 99,8 % bakteereista 2 tunnissa ja 99,99 % 48 tunnissa tällä annoksella ja 24 tunnissa annoksella 4 mg/1.
, Tämä aktiivisuus organismia Enterococcus faecalis vastaan ulottuu myös kantoihin, jotka ovat resistenttejä glykopepti-disille antibiooteille. 1 · 95930 28
Aktiivisuus organismia Gardnerella vaginalis vastaan 13 kliinisesti eristettyä G.vaginalis-kantaa testattiin Casman-agarilla, jossa 5 % kaniinin verta ja 0,15 % lysoitua kaniinin verta (ymppi noin 104 CFU). Antibiootin GE 2270 tekijän A MIC oli alueella 2-4 mg/1; MIC50 oli 2 mg/1. Inku-bointi tapahtui 48 tunnin ajan 37 eC:ssa aenaerobisessa kaa-suseoksessa.
Kokeellinen verenmyrkytys hiirillä
Keksinnön mukaisen yhdisteen antimikrobinen aktiivisuus varmistettiin myös kokeellisessa verenmyrkytyksessä hiirillä.
Ryhmät, joissa oli 8 CDl-hiirtä molempia sukupuolia (Charles River, keskimääräinen paino 18-22 g), infektoitiin intrape-ritoneaalisesti kannalla Staphylococcus aureus ATCC 19636. Antibakteerinen ymppi (10® solua/hiiri) annettiin suspendoi-tuna 0,5 ml:aan 5%:ista bakteriologista musiinia (Difco). Testattava yhdiste annostettiin intravenoosisti kerran välittömästi infektion jälkeen steriilissä vesipitoisessa liuoksessa, joka sisälsi 5 % dimetyyliformamidia ja 10 % Cremophor®EL:ää (polyetoksyloitu risiiniöljy).
;·, EDcjQ-arvo laskettiin 7. päivänä elossa olevien eläinten pro senttiosuudesta jokaisella annoksella Spearmanin ja Kaerbe-rin esittämän menetelmän mukaisesti; tulokseksi saatiin 1,13 mg/kg.
Kokeellinen sydämen sisäkalvon tulehdus rotilla * ,
Sydämen sisäkalvon tulehdus indusoitiin CD-urosrotilla (Charles River), jotka painoivat noin 200 g. Polyetyleenika-tetri (PP.25 Portex) laitettiin aorttasuonen läpi vasempaan kammioon oikean yhteisen päävaltimon kautta ja varmistettiin t
II
29 95930 silkkisidelangalla. Katetrin oikea asema kontrolloitiin käytteen rekisteröivää vahvistinta (Hewlett Packard model 77Θ2Α) yhdessä paineensiirtojärjestelmän kanssa. Kaksi päivää myöhemmin rotat infektoitiin injektoimalla i.v.:sti 0,5 ml suolaliuosta, joka sisälsi 104 CFU:ta kantaa S.aureus L 1524. Käsittely kesti 5 päivää alkaen 16 tuntia infektion jälkeen. Antibiootin GE 2270 tekijä A tehtiin liukoiseksi seokseen propyleeniglykoli:Cremophor EL:5%:inen glukoosi (10:20:70), ja annostettiin i.v.:sti 20 mg/kg kaksi kertaa päivässä. Eloon jäänneet rotat tapettiin 6. päivänä käsittelystä ja niiden sydämet poistettiin. Jokainen eläin, joka kuoli ennen hoidon päättymistä, avattiin ja sen sydän poistettiin. Jokainen sydän punnittiin ja homogenoitiin; homoge-naateille suoritettiin sarjalaimennos ja siirrettiin Todd-Hewitt-agarlevyille bakteerikuorman määrittämiseksi. Veren esiintyminen kokosydänhomogenaateissa ei vaikuttanut tuloksiin, koska bakteeritiitterit veressä olivat joka kerta ainakin 1000-kertaa alhaisemmat kuin sydänkuormat. Tulokset analysoitiin tilastollisesti Scheffe'n multiplevertailutes-tin avulla. Ne rotat, jotka kuolivat 40 tunnin sisällä infektiosta, jätettiin tilastoanalyysin ulkopuolelle. Tämän kokeen tulokset on esitetty seuraavassa: »· 30 95930
Antibiootin GE 2270 tekijän A aktiivisuus stafylokokklsessa sydämen sisäkalvon tulehduksessa rotilla infektoiva hoito päiväannos rottien L'°9io CFU/g organismi** (mg/kg) lkm sydän annostamistapa (keskiarvotSD)*** S.aureus L1524 ei 11 9,48 ± 0,33 kantoaine i.v. 13 9,61 ± 0,31 GE 2270 tekijä A (20x2) 12 4,89 ± 1,29* i.v.
* p < 0,001 kontrolleihin verrattuna (käsittelemättömät tai kantoaineella käsitellyt) *** sydämen bakteerikuorma hoidon alkaessa: 7,36 ± 0,32 (viiden eläimen sydämen keskiarvo ± log10 CFU/g:n SD) ** antibiootin GE 2270 tekijän A MIC-arvo kannalle S.aureus : : L1524: 0,25 mikrogramma/ml.
Akuutti myrkyllisyys
Kokeet, jotka suoritettiin hiirillä akuutin myrkyllisyyden toteamiseksi, osoittivat, että LD50 antibiootin GE 2270 tekijälle A on suurempi kuin 100 mg/kg i.v. ja suurempi kuin 500 mg/kg i.p. tällä eläinlajilla.
Omineisuuksiensa vuoksi keksinnön mukaista yhdistettä voidaan käyttää aktiivisena aineosana valmistettaessa lääkkeitä ihmisten ja eläinten hoitamiseksi.
31 95930
Erityisesti antibiootin GE 2270 tekijä A on antimikrobinen aine, joka on ensi sijassa aktiivinen gram-positiivisia ja gram-negatiivisia bakteereja vastaan sekä gram-negatiivisia anaerobeja vastaan. Sen on todettu olevan erittäin aktiivinen myös stafylokokin aiheuttamassa sydämen sisäkalvontuleh-duksessa (Staphylococcal endocarditis) ilman minkäänlaista "cross-resistenssiä" metisilliinin, aminoglykosidien tai glykopeptidisten antibioottien kanssa.
Näin ollen tämän keksinnön mukaisen antibiootin pääasiallinen terapeuttinen indikaatio on infektioiden hoidossa, jotka johtuvat tälle antibiootille herkän mikro-organismin esiintymisestä.
Käsitteellä "hoito" tarkoitetaan myös ennaltaehkäisyä (prophylaxis), hoitoa (therapy) sekä parantamista (cure).
Tätä hoitoa saava potilas on mikä tahansa sitä tarvitseva eläin, mukaan luettuna kädelliset, erityisesti ihmiset ja muut imettäväiset, kuten hevoset, karja, siat ja lampaat ja siipikarja ja yleensä lemmikkieläimet.
Keksinnön mukainen yhdiste voidaan annostaa sellaisenaan tai seoksessa farmaseuttisesti hyväksyttävien kantoaineiden • kanssa ja se voidaan annostaa myös yhdessä muiden antimikro- bisten aineiden, kuten penisilliinien, kefalosporlinien, aminoglykosidien ja glykopeptidien kanssa. Yhdistetty hoito käsittää aktiivisen yhdisteen peräkkäin tapahtuvan, samanaikaisen ja erillisen annostuksen tavalla, jossa ensiksi annostetun lääkkeen terapeuttiset vaikutukset eivät ole koko-naan hävinneet kun seuraava annostetaan.
Edullinen farmaseuttinen koostumus on valmiste, joka soveltuu tooppiseen annostukseen vahingoittumattomalle tai vahingoittuneelle iholle tai limakalvomembräänille. Esimerkkejä 32 9 5 9 3 0 tällaisista valmisteista ovat jauheet, voiteet, salvat ja lotionit. Täyteaineet näissä valmisteissa ovat tavallisia, farmaseuttisesti hyväksyttäviä kantoaineita, kuten rasvaiset salvaperusaineet (esim. setyyliesterivaha, öljyhappo, oliiviöljy, parafiini, valaanpäärasva, tärkkelysglyseriitti), absorboivat salvaperusaineet (esim. vedetön lanoliini, hyd-rofiilinen vaseliini), emulsiosalvaperusaineet (esim. setyy-lialkoholi, glyseryylimonostearaatti, lanoliini, steariini-happo), vesiliukoiset salvaperusaineet (esim. glykolieette-rit ja niiden johdannaiset, joihin kuuluvat polyetyleenigly-kolit, poly(oksi-1,2-etaanidiyyli)-alfa-hydro-omega-hydrok-si-oktadekanoaatti, polysorbaatit ja polyetyleeniglykolien monostearaatit).
Nämä valmisteet voivat sisältää muita tunnettuja täyteaineita, kuten säilöntäaineita, ja ne valmistetaan alalla tunnetulla tavalla, kuten esitetään viitekäsikirjoissa, esim. Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. edition, 19Θ5, Mack Publishing Co.
Keksinnön mukaiset yhdisteet voidaan valmistaa myös parente-raaliseen annostukseen sopiviksi valmisteiksi alalla sinänsä tunnettujen menetelmien mukaisesti, kuten esitetään viite-kirjoissa, esim. edellä mainitussa.
Esimerkiksi keksinnön mukainen yhdiste formuloidaan injektoitavaksi liukoiseksi tekevän aineen, kuten polypropylee-niglykolin tai dimetyyliasetamidin, ja pinta-aktiivisen aineen, kuten polyoksietyleenisorbitaani-mono-oleaatin tai po-lyoksietoksyloidun risiiniöljyn, kanssa steriilissä vedessä.
Esimerkiksi tyypillinen, parenteraaliseen annostukseen tarkoitettu valmiste sisältää 10 mg antibiootin GE 2270 tekijää A millilitrassa lopullista valmistetta, 10-20 % pinta-aktiivista ainetta, joka voi olla polyoksietyleenisorbitaaniras- i m « *
II
33 - 95930 vahappoesteri, polyoksietyleenirisiiniöljyjohdannainen tai polyoksietyleeni-hydrattu risiiniöljyjohdannainen, ja 0-20 % ja mieluimmin 10-20 % liukoiseksi tekevää ainetta, kuten propyleeniglykolia, dimetyyliasetamidia, dimetyyliformami-dia, tert.-butyyli-N-hydroksikarbamaattia, 1;2-, 1,3- tai 1,4-butaanidiolia, etyylioleaattia, tetrahydrofurfuryyli-polyetyleeni-glykoll 200:aa, dimetyyli-isosorbidia, bentsyy-lialkoholia ja vastaavia. Edullinen liukoiseksi tekevä aine on propyleeniglykoli.
Polyoksietyleenisorbitaanirasvahappoesterit ovat kaupallisesti saatavilla olevia ja muutamia niistä markkinoidaan kauppanimellä "Tween". Ne tunnetaan myös ei-rekisteröidyllä nimellä "polysorbaatit". Esimerkkejä niistä ovat polysor-baatti 20, 21, 40, 60, 61, 65, 80, 81 ja 85. Edullinen käytettäväksi tämän keksinnön mukaisissa valmisteissa on poly-sorbaatti 80 (sorbitaani-mono-9-oktadekanoaatti, poly(oksi- 1,2-etaanidiyyli)johdannaiset).
Polyoksietyleenirisiiniöljyt ja polyoksietyleeni-hydratut risiiniöljyt ovat myös kaupallisesti saatavissa. Muutamia niistä myydään kauppanimellä "Cremophor". Esimerkkejä näistä yhdisteitä ovat sellaiset, jotka tunnetaan nimellä Cremophor EL (polyetoksyloitu risiiniöljy), Cremophor RH 40 (polyetok-syloitu, hydrattu risiiniöljy), Cremophor RH 60 (PEG 60 hyd- rattu risiiniöljy) tai Emulphor EL-719 (polyetoksyloitu kas viöljy) .
Mieluimmin injektoitavan valmisteen pH:n tulisi olla alueella 7 ± 0,5. Tarvittaessa voisi olla suositeltavaa säätää valmisteen pH sopivalla puskuroivalla aineella. Tavallisesti puskuroivina aineina voidaan käyttää TRIS:iä (t.s. trihyd-roksimetyyliaminometaania) tai fosfaattia.
Edullinen, parenteraaliseen annostukseen sopiva valmiste sisältää seuraavat täyteaineet: 34 95930
Cremophor®EL (polyoksyyli-35-risiiniöljy (JSP/NF) 20 %, propyleeniglykoli 5 %:sta 20 %:iin, mieluimmin 10-20 %.
Tavallisesti nämä valmisteet voidaan valmistaa liuottamalla aktiiviaine orgaaniseen liuottimeen, jonka jälkeen lisätään kerralla pinta-aktiivinen aine ja lopuksi laimennetaan haluttuun tilavuuteen steriilillä vedellä injektiota varten.
Muita täyteaineita, kuten säilöntäaineita tai stabiloivia aineita, voidaan lisätä kuten on alalla tunnettua.
Esimerkki parenteraalisesta valmisteesta on seuraava; antibiootin GE 2270 tekijä A 10 mg PEG 40 risiiniöljy (Cremophor EL) 0,2 ml propyleeniglykoli 0,2 ml metyyliparahydroksibentsoaatti 0,5 mg propyyliparahydroksibentsoaatti 0,05 mg vesi injektiota varten q.s. 1 ml
Vaihtoehtoisesti aktiiviaine voidaan valmistaa lyofilisoitu-na jauheena rekonstruoitavaksi ennen käyttöä.
Jos lyofilisoitu materiaali valmistetaan lähtemällä seoksesta, joka sisältää aktiiviaineen ja pinta-aktiivisen aineen, kuten polyetyleeniglykoli-60-hydratun risiiniöljyn, se voi-* daan tavallisesti rekonstruoida pelkästään vesipitoisella aineella, lisäämättä orgaanista liuotinta.
Tavallista lyofilisointiapuainetta voidaan mahdollisesti lisätä tarvittaessa lyofilisoitavan materiaalin saamiseksi j auhemuotoon.
Mieluimmin kaikkia näitä valmisteita käytetään i.v.-annostukseen hoidettaessa mitä tahansa infektiota, jonka aikaansaa keksinnön mukaiselle antibiootille herkkä mikro-organismi.
Il 35 95930
Hoidettaessa pseudomembraanista koliittia tai muita sairauksia, jotka johtuvat anaerobien esiintymisestä gastrointesti-naali-alueella, keksinnön mukaisen yhdisteen tehokas annos voidaan antaa oraalisesti sopivassa farmaseuttisessa muodossa, kuten kapselina, tablettina tai vesipitoisena suspensiona.
Aktiiviaineen annos riippuu monista tekijöistä, joihin kuuluvat potilaan tyyppi, ikä ja vaste, spesifinen aktiiviaine ja annostukseen valittu valmiste, annostuskaavio, jne.
Yleensä tehokkaina antimikrobisina annoksina käytetään yk-sikköannosmuotoa.
Toistetut käytöt/annostukset, esim. kahdesta kuuteen kertaa päivässä, ovat yleensä edullisia. Tehokas annos voi yleensä olla 0,5-50 mg/kehon painokilo/päivä.
Edullinen tooppinen valmiste on salva, joka sisältää 1 %:sta 10 %:iin tämän keksinnön mukaista yhdistettä.
Joka tapauksessa määräävä lääkäri pystyy määrittämään potilaalle annettavan optimiannoksen tietyssä tilanteessa.
Paitsi, että tämän keksinnön mukaista yhdistettä käytetään lääkkeenä hoidettaessa ihmisiä ja eläimiä, keksinnön mukaista yhdistettä voidaan käyttää myös eläinten kasvua edistävänä aineena.
Tätä tarkoitusta varten keksinnön mukaista yhdistettä annos-: tetaan oraalisesti sopivassa ravintoaineessa. Tarkka käyttö- konsentraatio on sellainen, joka on tarpeen kasvun edistämiseksi tehokkaasti käytettäessä normaaleja määriä ravintoa.
Keksinnön mukaisen aktiiviaineen lisääminen eläinten ravintoon suoritetaan mieluimmin valmistamalla sopiva ennalta se- 36 95930 koitettu ravinto, joka sisältää aktiivisen yhdisteen tehokkaassa määrässä, ja tämä ennalta valmistettu ravinto yhdistetään valmiiseen päivän ravintoannokseen.
Vaihtoehtoisesti välituotekonsentraatti tai ravintolisäaine, joka sisältää aktiivisen aineosan, voidaan sekoittaa ravintoon.
Tapa, jolla tällaiset ennalta sekoitetut ravinnot ja valmiit päivän ravintoannokset voidaan valmistaa ja annostaa, on kuvattu viitekirjoissa (kuten "Applied Animal Nutrition", W.H. Freedman and Co., S.Francisco, USA, 1969 tai "Livestock Feeds and Feeding", O and B Books, Corvallis, Oregon, USA 1977).
Piirustusten lyhyt selitys
Kuviossa 1 esitetään antibiootin GE tekijän A UV-spektri.
Symbolien ja käytettyjen liuottimien välinen vastaavuus on seuraava: ----tarkoittaa koetta C^OHissa • tarkoittaa koetta 0,1 N HCl:ssä tarkoittaa koetta fosfaattipuskurissa pH 7,4 A tarkoittaa koetta 0,1 N KOH:ssa
Kuviossa 2 on esitetty antibiootin GE 2270 tekijän A IR-spektri Nujollissa
Kuviossa 3 on esitetty antibiootin GE 2270 tekijän A 1H-NMR-spektri mitattuna 500 MHz:llä DMSO-d6:ssa
Kuviossa 4 on esitetty antibiootin GE 2270 tekijän A
13C-NMR-spektri mitattuna 125 MHz:llä DMSO-dg:ssa
Seuraavat esimerkit kuvaavat edelleen tätä keksintö, niiden tarkoituksena ei ole millään tavoin rajoittaa keksintöä.
II
· « 37 95930
Esimerkki 1
Antibiootin GE 2270 tuottaminen
Planobispora rosea ATCC 53773-viljelmää kasvatetaan kaura-jauhoagarvinopinnalla kaksi viikkoa 28-30 *C:ssa, jonka jälkeen sitä käytetään ympättäessä 500 ml:n pullot, jotka sisältävät 100 ml ymppikasvatusalustaa, jolla seuraava koostumus: tärkkelys 20 g/1 polypeptoni 5 g/1 hiivauute 3 g/1 lihauute 2 g/1 soijapapujauho 2 g/1 kalsiumkarbonaatti 1 g/1 tislattu vesi q.s. 100 ml (pH säädetään arvoon 7 ennen sterilointia)
Pulloa inkuboidaan rotaattoriravistelijassa (200 kierr./min, 28-30 *C:ssa 92 tuntia). Sen jälkeen saatua viljelmää käytetään ympättäessä käymistankit, jotka sisältävät 4 litraa samaa kasvatusalustaa, ja viljelmää inkuboidaan 28-30 *C:ssa 48 tuntia samalla sekoittaen (noin 900 kierr./min) ja ilmastaen (noin yksi standardilitra ilmaa per tilavuus per mi-nuutti).
• · 95930 38
Saatu kasvatusliemi siirretään fermenttoriin, joka sisältää 50 litraa seuraavaa tuotantokasvatusalustaa: tärkkelys 20 g/1 peptoni 2,5 g/1 hydrolysoitu kaseiini 2,5 g/1 hiivauute 3 g/1 lihauute 2 g/1 soijapapujauho 2 g/1 kalsiumkarbonaatti 1 g/1 tislattu vesi q.s.
(pH säädetään arvoon 7 ennen sterilointia) ja inkuboidaan noin 72 tuntia 28-30 cC:ssa.
Antibiootin tuotantoa seurataan paperikiekko-agarkokeella, käyttäen B.subtilis ATCC 6633:a David'in minimikasvatusalus-talla. Inhibitiovyöhykkeet arvioidaan 35 *C:ssa yön yli suoritetun inkuboinnin jälkeen.
Esimerkki 2
Antibiootin GE 2270 talteenotto
Edellä saatu fermentointimassa (50 1) otetaan talteen ja suodatetaan käyttäen mukana suodatusapuainetta (Clarcell).
Antibiootti GE 2270 löytyy ensi sijassa myseelistä vaikkakin tietty määrä sitä voidaan saada talteen myös suodoksista.
a) Suodoksen pH säädetään avoon noin 7,0 ja uutetaan etyyli-: asetaatilla (50 1). Orgaaninen faasi erotetaan sentrifugoi- malla ja konsentroidaan pieneen tilavuuteen alennetussa paineessa. Saatu Öljymäinen jäännös käsitellään sen jälkeen petrolieetterillä raa'an antibiootin GE 2270 saostamiseksi, sakka kerätään suodattamalla ja kuivataan. Saadaan 415 mg raakaa antibiootin GE 2270 kompleksia.
It 39 95930 b) Myseeli uutetaan kaksi kertaa 20 litralla metanolia ja yhdistetyt uutteet konsentroidaan alennetussa paineessa, saadaan vesipitoinen jäännös, joka uutetaan kaksi kertaa etyyliasetaatilla. Raaka antibiootti ge 2270 (6,06 g) seostetaan konsentroidusta orgaanisesta faasista lisäämällä petro-lieetteriä.
Esimerkki 3
Antibiootin GE 2270 tekijän A puhdistus
Edellä kuvatun menetelmän mukaisesti myseelistä saatu raaka antibiootti (3 g) liuotetaan tetrahydrofuraaniin ja konsentroidaan alennetussa paineessa piihappogeelin (230-400 mesh) läsnäollessa. Saatu kiinteä jäännös kerätään ja siirretään kromatografiapylvääseen, joka sisältää 300 g piihappogeeliä (230-400 mesh) ja joka on valmistettu metyleenikloridiin (CH2Cl2)· Pylväs kehitetään ensin metyleenikloridilla (2 1), jonka jälkeen peräkkäin metyleenikloridin ja metanolin 1,5 litran seoksilla, joissa seuraavat suhteet: 98/2; 96/4; 94/6; 92/8; 90/10 ja 88/12 (til./til.).
Kerätään fraktiot, jotka analysoidaan TLC:llä, HPLC:llä tai mikrobiologisesti organismia B.subtilis vastaan, ja fraktiot yhdistetään niiden antibioottisen sisällön mukaan.
Yhdistetyt fraktiot, jotka sisältävät puhtaan antibiootin GE 2270 tekijän A (HPLC-retentioaika 14,9 min, katso fysikoke-mialliset arvot, edellä kohta E), konsentroidaan alennetussa paineessa, jolloin saadaan öljymäinen jäännös, joka liuotetaan tetrahydrofuraanilla. Tästä liuoksesta saostetaan antibiootin GE 2270 tekijä A (600 mg) lisäämällä petrolieetteriä.
40 95930
Esimerkki 4
Toinen erä antibiootin GE 2270 tekijää A saadaan fraktioista, jotka erotettiin edellä kuvatussa kromatografisessa systeemissä mutta jotka sisältävät sen epäpuhtaassa muodossa (HPLC). Myös nämä fraktiot yhdistetään, konsentroidaan ja käsitellään kiinteän materiaalin saamiseksi edellä kuvatulla tavalla. Tämä antibiootin GE 2270 tekijän A raakatuote puhdistetaan HPLC:llä seuraavan menetelmän mukaisesti:
Annos tätä sakkaa (6 mg) liuotetaan asetonltrlllln ja veden l:l-seokseen (til./til.) ja injektoidaan HPLC-kromatografi-seen systeemiin, joka on varustettu silanoidulla piihappo-geelikolonnilla (Lichrosorb RP 18, 7 mikrometriä, 250 x 10 mm, Merck, Darmstadt).
Eluointi suoritetaan lineaarisella gradientilla, joka muodostuu liuoksen A ja liuoksen B seoksesta, jossa liuosta A 50 %:sta Θ5 %:iin liuoksessa B, 20 minuutissa virtausnopeuden ollessa noin 4 ml/min. Liuos A on asetonltrlllln ja 1Θ mM natriumfosfaattipuskurin 70/30-seos (til./til.), jonka pH on säädetty arvoon 6, kun taas liuos B on asetonltrlllln ja 18 mM fosfaattipuskurin 10/90-seos (til./til.), jonka pH on säädetty arvoon 6.
Kolonni liitetään Perkin Elmer LC85 (JV-detektoriin aallonpituudella 330 nm. Yhdentoista peräkkäisen kromatografisen ajon fraktiot, joilla on homogeeninen sisältö, yhdistetään ja konsentroidaan alennetussa paineessa asetonltrlllln poistamiseksi, jolloin saadaan erotettua jäännösliuokset, jotka sisältävät antibiootin GE 2270 tekijän A. Nämä liuokset uu- . tetaan kaksi kertaa yhtä suurella tilavuudella etyyliase taattia ja antibioottituote saadaan seostamalla konsentroidusta orgaanisesta faasista lisäämällä petrolieetteriä. Talteenotto tapahtuu suodattamalla, jonka jälkeen kuivataan ja saadaan 27 mg antibiootin GE 2270 tekijää A.
• · I
11
Claims (2)
- - 95930 Patenttivaatimus: Menetelmä antibiootin GE 2270 tekijä A:n valmistamiseksi, jolla on seuraavat tunnusmerkit ei-suolamuodossa: A) ultraviolettiabsorptiospektri, jossa esiintyy seuraavat absorptiomaksimit: Ei * Lambda maks (nm) I cm 0,1 M HCl 245 (olka) 310 0,1 M KOH 245 (olka) 313 fosfaattipuskuri pH 7,4 245 (olka) 314 metanoli 244 (olka) 265 310 B) infrapuna-absorptiospektri mitattuna Nujolissa ja jossa esiintyy seuraavat absorptiomaksimit (cm-1): 3700-3060; 3060-2660 (Nujol); 1650; 1590-1490; 1490-1420 (Nujol); 1375 (Nujol); 1310; 1245; 1210; 1165; 1090; 1060; 1020; 970; 930; 840; 810; 750; 720 (Nujol); 700; 9ΕΓ ?0 tämän spektrin pääasialliset funktionaaliset IR-absorp-tiojuovat voidaan tunnistaa seuraavasti: V (cm 1 merkitys 3600-3100 V NH, VOH 1650 amidi I ( Vc=0) 1545 heterosyklinen V C*C jaVc=N 1525, 1495 amidi II (δΝΗ) 1250, 1205 aromaattinen S CH 870 heterosyklinen yCH 745, 700 aromaattinenγ CH C) 1H-NMR-spektri, jossa esiintyy seuraavat signaaliryhmät (ppm:ssä) ja joka rekisteröity 500 MHz:llä DMSO-dg:ssa (heksadeuterodimetyylisulfoksidi) käyttäen sisäisenä standardina (0,00 ppm) TMS:ää; protonien lukumäärä jokaiselle signaalille on esitetty suluissa: 9,02 (1); 8,68 (1); 8,70 (1); 8,57 (1); 8,50 (1); 8,43 (1) ; 8,37 (1); 8,26 (1); 8,25 (1); 7,4-7,20 (9); 6,96 (2) ; 6,02 (1); 5,30-5,18 (3); 5,01 (1); 4,97 (2); 4,80 (1); 4,56 (1); 4,30 (1); 4,26 (1); 3,98 (1); 3,81 (1); 3,79 (1); 3,38 (3); 2,72 (1); 2,58 (3); 2,48 (3), 2,16 (1); 2,13 (1); 1,96 (2); 1,88 (1); 1,34 (1); 0,87 (3); : 0,84 (3); D) 13C-NMR-spektri, jossa esiintyy seuraavat signaaliryhmät (ppm) ja joka on rekisteröity 125 MHz:llä DMSO-dg:ssa, sisäisenä standardina TMS (0,00 ppm) ja jossa Q tarkoittaa kvaternäärisiä hiiliatomeja tai C*0-ryhmiä: 173,69, Q; 171,10, Q; 169,83, Q; 169,51, Q; 168,45, Q; 168,26, 0; 167,84, Q; 165,68, Q; 164,75, Q; 161,40, Q; 161,23, Q; 160,46, Q; 160,29, Q; 159,35, Q; 153,42, Q; 150,31, Q; 150,11, Q; 149,41, Q; 146,93, Q; 144,73, Q; « · 95930 143,75, Q; 142,10, Q; 141,78, Q; 141,33, CH; 140,97, Q; 139,53, Q; 128,68, CH; 127,99,
- 2[CH]; 127,67, Q; 127,67, CH; 126,88, CH; 126,76, 2[CH]; 123,17, CH; 118,66, CH; 116,42, CH; 73,81, CH; 69,41, CH2; 67,97, CH; 67,36, CH2; 60,12, CH; 58,63, CH3; 58,24, CH; 55,41, CH; 48,15, CH; 47,03, CH2; 41,19, CH2; 37,60, CH2; 34,06, CH; 29,76, CH2; 25,85, CH3; 24,28, CH2; 18,49, CH3; 17,98, CH3; 11,99, CH3; E) retentioaika (R^) 14,9 minuuttia, analysoitaessa kään-telsfaaslsella HPLC:llä seuraavlssa olosuhteissa: kolonnl: Ultrasphere ODS (käänteisfaasinen, silanoltu piihappogeeli; 5 mikrometriä) Altex (Beckman) 4,6 mm (sisähalkaisija) x 250 mm esikolonni: Brownlee Labs RP 18 (oktadekyylisilaani-piihappogeeli; 5 mikrometriä) eluentti A: asetonitriili:18 mM natriumfosfaatti 70:30 (til./til.), pH säädetty arvoon 7,0 eluentti B: asetonitriili:18 mM natriumfosfaatti 10:90 (til./til.), pH säädetty arvoon 7,0 : eluolntimalli: lineaarinen gradienttl, jossa eluenttia A 45 %:sta 70 %:iin eluentissa B 20 minuutissa virtausnopeus: 1,8 ml/min UV-detektori: 254 nm sisäinen standardi: kloramfenikoli (Rt - 3,7 min); F) alkuaineanalyysi, sen jälkeen kun näytettä on etukäteen kuivattu 140 °C:ssa inerttikaasuatmosfäärissä, osoittaa seuraavan koostumuksen: hiiltä, vetyä, typpeä, rikkiä; 95930 G) Rf-arvo * 0,37 seuraavassa kromatografisessa systeemissä: dikloorimetaani:metanoli, 9:1 (til./til.) käytettäessä piihappogeelilevyjä (piihappogeeli 60 F254, Merck CO.); näkyväksi tekeminen: UV-valo aallonpituudella 254 nm, keltainen täplä jodihöyryillä tai bioautografia käyttäen organismia B.subtilis ATCC 6633 Davidin mini-maalikasvatusalustalla, sisäisenä standardina kloramfe-nikoli (Rf » 0,56) H) FAB-MS-analyysillä todetaan protonoidun molekyyli-ionin alhaisin massaisotooppi m/z 1290,3±0,l daltonia. Spektrin kaikki muut piikit yli 800 m/z massayksikköä (ei laskettu isotooppipiikkejä) olivat alle 20 % molekyyli-ionista analyysin jälkeen, joka suoritettiin kaksoisfo-kusoivalla massaspektrometrilla Kratos MS-50 seuraavissa koeolosuhteissa: Xe-nopea-atomipommitus 6 Kv:llä; glyse-rolimatriisi; positiivinen ionisaatiomalli; I) hydrokloridihydrolysaatin aminohappoanalyysissä todettiin seuraavien luonnollisten aminohappojen esiintyminen: glysiini, (L)proliini ja (L)seriini, seuraavissa kokeellisissa olosuhteissa: näyte hydrolysoidaan 105 *C:ssa 20 tuntia 6 N HCl:n, joka sisältää 1 % fenolia, läsnäollessa, jonka jälkeen derivoidaan kahdessa vaiheessa seuraavalla tavalla: a) muodostetaan karboksyylihappofunktioiden n-propyyli-esterit 2 M HCl:llä vedettömässä propanolissa (90 *C, 1 h), jonka jälkeen kuivataan typpiatmosfäärissä; b) vapaat aminoryhmät muutetaan amideiksi pentafluori-propionihappoanhydridin ja vedettömän dikloorimetaanin l/9-seoksella (til./til.) huoneen lämpötilassa 1 tunnin kuluessa, jonka jälkeen kuivataan typpiatmosfäärissä; 45 95930 näin saatu derivoitu tähde liuotetaan dikloorimetaaniin ja analysoidaan GC-MS-laitteella käyttäen HP5985B-sys-teemiä seuraavissa olosuhteissa: kolonni: kiraalinen n-propionyyli-L-valiini-tert.-butyy-liamidi-polysiloksaanilla päällystetty, fuusioitu pii-happokapillaarikolonni (25 m x 0,2 mm sisähalk.; C.G.C. ANALYTIC); lämpötilaohjelma 80 °C 4 minuuttia, jonka jälkeen 4 •C/min; L) ionisaatiotutkimukset ei-ionisoituvat funktiot todetaan titraamalla 0,1 N HCl:llä ja 0,1 N NaOHilla metyylisellosolve/vedessä; heikko emäksinen funktio paljastuu tiirattaessa 0,1 N HCl04:llä vedettömässä väliaineessa (etikkahappo); M) ominaiskierto [alfa]20D = + 140,8; absoluuttinen etanoli, konsentraa-tio noin 5 g/1, tunnettu siitä, että viljellään Planobispora rosea ATCC 53773:a tai sen antibiootin GE 2270 tekijää A tuottavaa varianttia submerssisissä, aerobisissa oloissa assimiloituvien hiili-, typpilähteiden ja epäorgaanisen suolojen läsnäollessa ja tuotettu antibiootti otetaan siitä talteen. 95930 Förfarande för framställning av faktor A av antibiot GE 2270 som i icke-saltform har följande kännetecken: A) ett ultraviolett-absorptionsspektrum, i vilket följande absorptionsmaxima förekommer: E\ *cb lambda max (nm) 0,1 M HC1 245 (skuldra) 310 0,1 M KOH 245 (skuldra) 313 fosfatbuffert pH 7,4 245 (skuldra) 314 metanol 244 (skuldra) 265 310 B) ett infrarött-absorptionsspektrum mätt i Nujol och i vilket följande absorptionsmaxima förekommer (cm-1): 3700-3060; 3060-2660 (Nujol); 1650; 1590-1490; 1490- ·: 1420 (Nujol); 1375 (Nujol); 1310; 1245; 1210; 1165; 1090; 1060; 1020; 970; 930; 840; 810; 750; 720 (Nujol); 700; de väsentliga funktionella IR-absorptionsbanden kan igen-kännas pä följande sätt: 47 95930 γ, (cm'1) betydelse 3600-3100 γ ΝΗ, γ ΟΗ 1650 amid I (γ C=0) 1545 heterosyklisk γ C=C och γ C=N 1525, 1495 amid II ( δ ΝΗ) 1250, 1205 aromatisk δ CH 870 heterosyklisk γ CH 745, 700 aromatisk γ CH C) ett ^-NMR-spektrum, i vilket följande signalgrupper (i ppm) förekommer och som registrerats pä 500 MHz i DMSO-d6 (hexadeuterodimetylsulfoxid) genom att använda TMS som en intern standard (0,00 ppm); mängden av protoner för varje signal har angivits inom parentes: 9,02 (1); 8,68 (1); 8,70 (1); 8,57 (1); 8,50 (1); 8,43 (1) ; 8,37 (1); 8,26 (1); 8,25 (1); 7,4-7,20 (9); 6,96 (2) ; 6,02 (1); 5,30-5,18 (3); 5,01 (1); 4,97 (2); 4,80 (1); 4,56 (1); 4,30 (1); 4,26 (1); 3,98 (1); 3,81 (1); 3,79 (1); 3,38 (3); 2,72 (1); 2,58 (3); 2,48 (3); 2,16 (1); 2,13 (1); 1,96 (2); 1,88 (1); 1,34 (1); 0,87 (3); 0,84 (3); D) ett 13C-NMR-spektrum, i vilket följande signalgrupper • (ppm) förekommer och som registrerats pä 125 MHz i DMSO-d6 med TMS som en intern standard (0,00 ppm) och i vilket Q betecknar kvaternära kolatomer eller C=0-grupper: 173,69, Q; 171,10, Q; 169,83, Q; 169,51, Q; 168,45, Q; 168,26, Q; 167,84, Q; 165,68, Q? 164,75, Q; 161,40, Q; 161,23, Q; 160,46, Q; 160,29, Q; 159,35, Q; 153,42, Q; 150,31, Q; 150,11, Q; 149,41, Q; 146,93, Q; 144,73, Q; 143,75, Q; 142,10, Q; 141,78, Q; 141,33, CH; 140,97, Q; 139,53, Q; 128,68, CH; 127,99, 2[CH); 127,67, Q; 127,67, CH; 126,88, CH; 126,76, 2[CH]; 123,17, CH; 118,66, CH; 116,42, CH; 73,81, CH; 69,41, CH2; 67,97, CH; 67,36, CH2; 60,12, CH; 58,63, CH3; 58,24, CH; 55,41, CH; 48,15, « 95930 CH; 47,03, CH2; 41,19, CH2; 37,60, CH2; 34,06, CH; 29,76, CH2; 25,85, CH3; 24,28, CH2; 18,49, CH3; 17,98, CH3; 11,99, CH3; E) retentionstiden (Rt) 14,9 minuter, vid analys med motfas HPLC under följande förhällanden: kolonn: Ultrasphere ODS (motfas, silaniserad silikagel; 5 mikrometer) Altex (Beckman) 4,6 mm (inre diameter) x 250 mm förkolonn: Brownlee Labs RP 18 (oktadekylsilansilikagel; 5 mikrometer) eluent A: acetonitril:18mM natriumfosfat 70:30 (vol./vol.), pH inställt till värdet 7,0 eluent B: acetonitril:18mM natriumfosfat 10:90 (vol./vol.), pH inställt till värdet 7,0 elueringsmodell: lineär gradient med eluent A frän 45 % till 70 % i eluent B under 20 minuter flödeshastighet: 1,8 ml/min * UV-detektor: 254 nm inre standard: kloramfenikol (Rt = 3,7 min); F) grundämnesanalys, efter det att provet pä förhand har torkats vid 140°C i inert gasatmosfär, visar följande , sammansättning: koi, väte, kväve, svavel; G) Rf-värde = 0,37 i följande kromatografiska system: diklormetan:metanol, 9:1 (vol./vol.) vid användning av silikagelplattor (silikagel 60 F254, Merck Co); visu-alisering: UV-ljus med väglängden 254 nm, gul punkt med II 95930 jodängor eller bioautografi med användning av organismen B.subtills ATCC 6633 pä Davids minimalväxtunderlag, säsom inre standard: kloramfenikol (Rf = 0,56) H) med FAB-MS-analys konstateras den lägsta massaisotopen av den protoniserade molekyljonen vid m/z 1290,3±0,1 dal-ton. Spektrets alla andra spetsar över 800 m/z massaenheter (isotopspetsar ej räknade) var under 20 % av molekyljonerna efter analysen, som utfördes med en dubbelfokuserande masspektrometer Kratos MS-50 under följande experimentella förhällanden: Xe-snabb-atombombning med 6 Kv; glycerolmat-ris; positiv jonisationsmodell; I) vid en aminosyraanalys av hydrokloridhydrolysat konsta-terades förekomst av följande naturliga aminosyror: glycin, (L)prolin och (L)serin, under följande experimentella förhällanden: provet hydrolyseras i 105°C under 20 timmar i närvaro av 6 N HC1, innehällande 1 % fenol, varefter deriveras i tvä steg pä följande sätt: a) n-propylestrarna av karboxylsyrafunktionerna bildas med 2 M HC1 i vattenfri propanol (90°C, 1 h), varefter torkas i kväveatmosfär; b) de fria aminogrupperna ändras tili amider med en 1/9-blandning (voi./voi.) av pentafluorpropionsyraanhydrid och vattenfri diklormetan vid rumstemperatur under 1 timme, varefter torkning i kväveatmosfär; den sälunda erhällna deriverade resten upplöses i diklorme-. tan och analyseras med en GC-MS-anordning under användning av ett HP5985B-system under följande förhällanden: kolonn: chiral n-propionyl-L-valin-tert.-butylamid-poly-siloxan belagd, fusionerad kiselsyrakapillärkolonn (25 m x 0,2 mm inre diam.; C.G.C. ANALYTIC); temperaturprogram 80°C i 4 minuter, varefter 4°C/min; 95930 L) jonisationsstudier Ej-joniserande funktioner konstateras genom titrering med 0,1 N HC1 och 0,1 N NaOH i metylcellosolv/vatten; en svag basisk funktion avslöjas vid titrering med 0,1 N HC104 i vattenfritt medium (ättiksyra); M) specifik rotation [alfa]20D = + 140,8; absolut etanol, koncentration ca. 5 g/i, kännetecknat därav, att man odlar Planobispora rosea ATCC 53773 eller dess antibiot GE 2270 faktor A producerande variant i submers, aerobisk miljö i närvaro av assimileran-de källor av koi, kväve och oorganiska salter och den producerade antibioten tas tillvara ur denna. II
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB8821160 | 1988-09-09 | ||
GB888821160A GB8821160D0 (en) | 1988-09-09 | 1988-09-09 | Antibiotic ge 2270 |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI894237A0 FI894237A0 (fi) | 1989-09-08 |
FI894237A FI894237A (fi) | 1990-03-10 |
FI95930B true FI95930B (fi) | 1995-12-29 |
FI95930C FI95930C (fi) | 1996-04-10 |
Family
ID=10643310
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI894237A FI95930C (fi) | 1988-09-09 | 1989-09-08 | Menetelmä antibiootin GE 2270 tekijä A:n valmistamiseksi |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0359062B1 (fi) |
JP (1) | JP2997480B2 (fi) |
KR (1) | KR0137944B1 (fi) |
CN (1) | CN1031948C (fi) |
AR (1) | AR242635A1 (fi) |
AT (1) | ATE101652T1 (fi) |
AU (1) | AU629851B2 (fi) |
CA (1) | CA1337519C (fi) |
DE (1) | DE68913107T2 (fi) |
DK (1) | DK171026B1 (fi) |
ES (1) | ES2061847T3 (fi) |
FI (1) | FI95930C (fi) |
GB (1) | GB8821160D0 (fi) |
HU (1) | HU203580B (fi) |
IE (1) | IE63191B1 (fi) |
IL (1) | IL91518A (fi) |
NO (1) | NO176026C (fi) |
NZ (1) | NZ230524A (fi) |
PT (1) | PT91647B (fi) |
RU (1) | RU1838414C (fi) |
ZA (1) | ZA896875B (fi) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK0406745T3 (da) * | 1989-07-04 | 1995-02-27 | Lepetit Spa | Antibiotiske GE 2270 faktorer A1, A2, A3 og H |
EP0451486B1 (en) * | 1990-03-08 | 1995-04-19 | GRUPPO LEPETIT S.p.A. | Antibiotic GE 2270 factors B1, B2, C1, C2, D1, D2,E and T |
ES2113391T3 (es) * | 1991-08-30 | 1998-05-01 | Biosearch Italia Spa | Factor c2a de antibiotico ge 2270. |
WO1994005798A1 (en) * | 1992-09-10 | 1994-03-17 | Gruppo Lepetit S.P.A. | Process for the selective increase of production of antibiotic ge 2270 factor a |
-
1988
- 1988-09-09 GB GB888821160A patent/GB8821160D0/en active Pending
-
1989
- 1989-09-01 AT AT89116180T patent/ATE101652T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-09-01 ES ES89116180T patent/ES2061847T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-01 NZ NZ230524A patent/NZ230524A/en unknown
- 1989-09-01 EP EP89116180A patent/EP0359062B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-01 DE DE68913107T patent/DE68913107T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-09-04 DK DK436189A patent/DK171026B1/da not_active IP Right Cessation
- 1989-09-04 IL IL9151889A patent/IL91518A/en not_active IP Right Cessation
- 1989-09-06 AU AU41151/89A patent/AU629851B2/en not_active Ceased
- 1989-09-06 AR AR89314853A patent/AR242635A1/es active
- 1989-09-07 PT PT91647A patent/PT91647B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-09-08 ZA ZA896875A patent/ZA896875B/xx unknown
- 1989-09-08 IE IE287789A patent/IE63191B1/en not_active IP Right Cessation
- 1989-09-08 CN CN89107873A patent/CN1031948C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1989-09-08 FI FI894237A patent/FI95930C/fi active IP Right Grant
- 1989-09-08 CA CA000610698A patent/CA1337519C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-09-08 HU HU894802A patent/HU203580B/hu not_active IP Right Cessation
- 1989-09-08 RU SU894614953A patent/RU1838414C/ru active
- 1989-09-08 KR KR1019890013021A patent/KR0137944B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1989-09-08 JP JP1231832A patent/JP2997480B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1989-09-08 NO NO893608A patent/NO176026C/no unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5322777A (en) | Antibiotic GE 2270 | |
US5747295A (en) | Antibiotic GE 2270 factors B1, B2, C1, C2, D1, D2, E and T | |
EP0529410B1 (en) | Antibiotic GE 2270 factor C2a | |
FI95930B (fi) | Menetelmä antibiootin GE 2270 tekijä A:n valmistamiseksi | |
EP0675900B1 (en) | Antibiotics ge 37468 a, b and c | |
EP0545955B1 (en) | Antibiotic ge1655 complex and its factors a, b and c | |
US5610143A (en) | Antibiotics GE 37468 A, B and C | |
Selva et al. | Antibiotic GE 2270 factors B 1, B 2, C 1, C 2, D 1, D 2, E and T | |
IE913058A1 (en) | Antibiotic ge1655 complex and its factors a, b, and c | |
Selva et al. | Antibiotic GE 2270 factors C 2a |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
BB | Publication of examined application | ||
PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: BIOSEARCH ITALIA S.P.A. |
|
FG | Patent granted |
Owner name: VICURON PHARMACEUTICALS INC. |