PT91647B

PT91647B - Processo para a preparacao de antibiotico ge 2270

Info

Publication number: PT91647B
Application number: PT91647A
Authority: PT
Inventors: Enrico Selva; Graziella Beretta; Nicoletta Montanini; P Goldstein Beth; Denaro Maurizio
Original assignee: Lepetit Spa
Priority date: 1988-09-09
Filing date: 1989-09-07
Publication date: 1995-05-31
Also published as: KR900004938A; FI894237A; IE63191B1; JPH02149593A; CN1041182A; DK436189D0; JP2997480B2; GB8821160D0; KR0137944B1; IL91518A0; EP0359062A2; NZ230524A; RU1838414C; FI894237A0; EP0359062A3; AU629851B2; NO176026B; DE68913107D1; NO176026C; IL91518A

Description

presente invento dirige-se a um novo antibiótico designado por GE 2270, a seus sais de adição, a composições farmacêuticas suas e à sua utilização como medicamento, especia1mente no tratamento de doenças infecciosas envolvendo microorganismos que lhes sejam susceptí ve i s .

Os compostos do invento também são agentes activos na promoção do crescimento em animais, como aves de criação, suínos, ruminantes, etc.

Outro objecto do invento é um processo para a preparação do antibiótico GE 2270 que inclui a cultura de Planobispora rósea ATCC 53773 ou de uma variante produtora do antibiótico GE 2270 ou mutante seu, e o isolamento do antibiótico do invento do micélio e/ou das culturas de fermentação.

A Planobispora rósea ATCC 53773 foi isolade uma amostra de solo e depositada em 14 de Junho de 1988 com o American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 Maryland, U.S.A., de acor do com as condições previstas no Tratado de Budapeste.

Atribuiu-se à espécie o número

ATCC 53773.

A produção do antibiótico GE

2270 é efectuada através da cultura de uma espécie de Planobispora capaz de o produzir, i.e. Planobispora rosea ATCC 53773 ou de uma variante ou mutante sua produtora de um anti^ biótico GE 2270, sob condições aeróbicas num meio nutriente aquoso, contendo fontes assimiláveis de carbono, azoto, e sais inorgânicos. Podem ser utilizados muitos dos meios nutrientes habituais na arte da fermentação, sendo, contudo, preferidos alguns meios. Fontes de carbono preferidas são glucose, manose, galactose, amido, farinha de milho e equiva lentes. Fontes preferidas de azoto são amoniaco, nitratos, farinha de soja, peptona, extracto de carne, extracto de levedura, triptone, aminoácidos e afins. Entre os sais inorgânicos que podem ser incorporados no meio de cultura encontram-se os sais solúveis habituais, capazes de dar sódio, potássio ferro, zinco, cobalto, magnésio, cálcio, amónio, cloreto, car bonato, sulfato, fosfato, nitrato e iões equivalentes.

Vulgarmente, a espécie produtora de antibiótico é pré-cultivada num balão com agitação e a cultura é, então, utilizada para inocular os recipientes fermentadores para a produção de quantidades substanciais de substâncias antibióticas. 0 meio utilizado para a pré-cultura pode ser o mesmo que o utilizado para fermentações maiores, mas também se podem utilizar outros meios. A espécie produtora de antibiótico GE 2270 pode crescer a temperaturas entre 20°C e o _Λ o

C, de preferencia entre 24 e 35 C.

A produção de antibiótico pode, durante a fermentação, ser controlada por testes em amostras do caldo ou do extracto micelial com avaliação da actividade antibiótica, por exemplo, por meio de ensaios biológicos ou por procedimentos TLC ou HPLC.

Podem utilizar-se como organismos de teste organismos sensíveis ao antibiótico GE 2270 como o Baccilus subti1i s e S. aureus. 0 bio-ensaio é convenientemente levado a cabo pelo, método de difusão em agar sobre placas de agar. A produção de actividade antibiótica máxima verifica-se, em regra, entre o segundo e o quinto dia de fermentação .

antibiótico GE 2270 é produzido cultivando a espécie Planobispora rosea ATCC 53773 ou uma variante ou mutante sua produtora de um antibiótico GE 2270, e encontra-se principalmente no micelio.

Na presente descrição, quando se fizer referência a compostos do invento no que diz respei to às suas propriedades físico-químicas ou biológicas, o ter mo antibiótico GE 2270 significará habitualmente o complexo GE 2270 tal como recuperado no fim do processo de fermentação (ver Exemplo 2), bem como o factor A do antibiótico GE 2270 que é o seu componente principal.

Características morfológicas da P1anob i sp ora rosea ATCC 53773

A Planobi spora rosea ATCC 53773 cresce com facilidade na maioria dos meios padrão. 0 micélio vegetativo forma filamentos longos e ramificados (0,5 a 1,0 micrometro) penetrando a agar e crescendo compactamente na sua superfície. 0 micélio permanece inteiro quer o crescimento se faça em meios líquidos quer em meios sólidos. A sua cor varia de rosa claro e avermelhado na maior parte dos meios de teste. 0 micélio aéreo é constituído por hifas largas e afins com poucas remificações laterais e cresce no ar principalmente numa posição paralela â superfície de agar.

micélio aéreo, quando presente, tem uma cor rosada. Formam-se esporângios isolados ou em grupos ao longo das hifas do micélio aéreo que têm de 6,0 a 8,0 micron de comprimento e 1,0 a 1,2 micron de largura. Ligam-se à hifa por meio de um curto esporangioforo (1,0 a 2,0 micrometro de comprimento). Em cada esporângio forma-se um

-6par de esporas longitudinais e fusiformes (3,0 a 3,5 x 1,0 a 1,2 micrometro). Nos esporângios, as esporas estão separadas por um septo transversal. Após a libertação do revestimento esporangial as esporas tornam-se móveis por meio de flagelos peritricosos .

Características de Cultura de Planobispora rosea ATCC 53773.

Para observação das caracterís ticas da cultura de Planobispora rosea ATCC 53773 procedeu-se ao se cultivo em vários meios padrão sugeridos por Shirling e Gottlieb (Shirling E. B. e Gottlieb D., 1966, Method for characterization of Streptomyces species - Int. J. Syst. Bacteriol, 16, 313-340) com adição de vários meios recomenda dos por Waksman (Waksman, S.A. 1961 - The Actinomycetes - The Williams and Wilkins Co. Baltimore; Vol. 2, 328-334).

A determinação da cor foi feita quando necessário, pelo método de Maerz and Paul (Maerz A. and M. Rea Paul, 1950 - A Dictionary of Color - 2nd Edition McGraw-Hill Book Company Inc. New York).

A capacidade do organismo para utilizar diversas fontes de carbono foi investida pelo método descrito por Shirling e Gottlieb.

As características fisiológicas e de cultura e as fontes de carbono utilizadas, encontram-se nas Tabelas I, II e III.

Os valores da Tabela I foram tomadas após duas semanas de incubação a 28°C.

TABELA I

Características de Culturas da espécie Planobispora rósea ATCC 53773

Meios de Cultura

Agar de farinha de aveia 6%

Características Morfológicas

Crescimento abundante com súper fície lisa, coral rosa (2-H-10) produção abundante de micélio aéreo de coral brilhante (l-A-9).

ISP 2 (agar de extracto de levedura de malte)

Crescimento abundante com super fície rugosa, rosa claro (2-E-9), traços de micélio aéreo claro.

ISP 3 (agar de farinha de aveia 2%)

Crescimento moderado com super fície lisa, rosa claro (2-E-8), traços de micélio aéreo rosa claro.

ISP 4 (agar de sais inorgânicos amido)

Crescimento moderado com super fície lisa, coral rosa (2-E-10).

-8Meios de Cultura

TABELA I (continuação)

Características de Culturas da espécie

Planobispora rosea ATCC 53773

Características Morfológicas

ISP 5 (agar de glicerol asparagina)

ISP 6 (agar peptona extracto de leve dura ferro)

ISP 7 (agar de tirosina)

Agar Hichey e Tresner

Crescimento moderado com superfície plana e lisa, rosa claro (2-A-9), produção abundante de micélio aéreo branco.

Crescimento moderado, ligeiramen te enrugado rosa coral claro (l-A-10).

Crescimento moderado com superfície lisa e fina rosa claro (l-A-9), formação de micélio aéreo abundante rosa claro (l-C-9)

Crescimento abundante com super fície enrugada e grossa rosa co ral claro (l-A-10), produção mo derada de micélio aéreo rosa claro.

-9TABELA I (continuação)

Características de Culturas da espécie Planobispora rósea ATCC 53773

Meios de Cultura

Características Morfológicas

Agar de	glucose Czapek	Crescimento muito fraco com superfície lisa e fina, produção moderada de micélio aéreo rosa claro.
Agar de	glucose asparagina	Crescimento moderado com superfície lisa e fina, incolor, ausência de micélio aéreo.
Agar de	Nutriente	Bom crescimento com superfície lisa laranja claro com um tom rosa (9-A-7).
Agar de	Bennett	Crescimento moderado com uma su perfície ligeiramente enrugada rosa âmbar claro (10-A-6).

-10Meios de Cultura

TABELA I (continuação)

Características de Culturas da espécie Planobispora rósea ATCC 53773

Características Morfológicas

Agar de malato de cálcio

Agar de nata de leite

Agar de albumina de ovo

Agar de tripose dextrose

Agar de batata

Crescimento pobre com superfície plana e lisa incolor.

Crescimento moderado com superfície lisa rosa coral (2-F-9).

Crescimento pobre com superfície lisa e fina de incolor a rosa claro (2-A-8)

Ausência de crescimento

Bom crescimento com superfície lisa laranja claro com um tom rosa (9-A-7).

As letras e os números referem-se à cor determinada de acordo com Maerz e Paul (ver a referência anterior)

Características Fisiológicas de Planobispora rosea ATCC 53773

TABELA II

TESTES

RESULTADOS

Hidrólise de amido	positivo
Formação de sulfureto de hidrogénio	negativo
Reacção de tirosina	positivo
Hidrólise de caseína	fracamente	positivo
Digestão de malato de cálcio	negativo
Liquefação de gelatina	fracamente	positivo
Coagulação do leite	negativo
Peptonização do leite	negativo
Redução do nitrato	positivo

TABELA III

Utilização de Carbo-hidrato

Fonte de Carbono	Crescimento
Arabinose	+
Xilose	+
Ribose	-
Frutose	+/-
Galactose	-
Glucose	+
Ramno s e	-
Lactose	-
Sacarose	-
Maltose	+
Raf inose	-
Celulose	-
Manitol	-
Salicina	+
Inositol	+
Celobiose

+ + /crescimento crescimento ausência de moderado raro crescimento

Para este teste utilizou-se o meio N⁵ 8 e os resul tados foram após duas semanas de incubação a 28-30°C.

-13Sensibi1 idade à temperatura

A temperatura de crescimento óptimo varia de 28°C a 37°C. Não se regista crescimento a 15°C e a 50°C sendo o crescimento a 20°C ligeiro.

Características Quimicotaxonómicas

Análise da membrana celular

A análise dos aminoácidos presentes na parede celular foi levada a cabo pelo processo des crito por Becker et al (Distruição rápida entre Nocardia e Streptomyces por cromatografia em papel de toda a célula hidrolisada, Appl. Microbiol. _12 , 421-423, 1964).

A análise de toda a célula hidrolisada revelou a presença do ácido meso-diaminopimélico.

Não foi encontrada glicina na análise da preparação da parede da célula pura, obtida de acordo com o método de Kawamoto et al. (Kawamoto I., O.Tetsuo, e N.Takashi, Composição da membrana celular de Micromonospora olivoasterosporia, Micromonospora sagamiensis e organismos afins. J. of Bacteriol. 146, 527-534, 1981).

-14Modelo de conteúdo em açúcar de toda a célula

A análise do conteúdo em açúcar em toda a célula hidrolisada foi levada a cabo pelo método de Lechevalier M.P. (Identification of aerobe actinomycetes of clinicai importance J.Lab.Clin.Med. 71, 934-944, 1968), com a utilização de cromatografia de camada fina em folhas de ce lulose como descrito por Staneck J.L. e G.D.Roberts (Simplified approach to Identification of aerobic actinomycetes by thin layer chromatography, Appl. Microbiol. 28, 226-231, 1974) com o seguinte sistema de solventes: Acetato de etilo-Piridina-Agua (100:35:25 v/v).

Os resultados obtidos mostraram a presença de madurose (3-0-meti1-D-galactose ) e a ausência de arabinose e galactose

Identidade da espécie Planobispora rósea ATCC 53773

Esta espécie foi atribuída ao género Planobispora e classificada como Planobispora rósea na sequência das seguintes características químicas e morfológicas :

a) Presença do ácido meso-diaminopimélico e ausência de glicina na membrana celular (membrana celular quimotipo III )

b) Presença de madurose no conjunto de toda a célula hidrolisada (modelo B para o açúcar de toda a célula)

c) Formação de micélio aéreo com esporângios cilíndri^ cos e compridos contendo um par de esporas móveis

d) A cor rosa do micélio vegetativo.

As características morfológicas do Planobispora rosea ATCC 53773 mencionadas atrás não são significativamente diferentes das de uma espécie de Planobispora rosea que foi descrito por J.E. Thieman et al em The Actinomycetales , The Jena Intern. Symp. on Taxon., Setembro de 1968, ed. H. Prauser, Jena. Foi depositado com o American Type Culture Collection onde recebeu o número 23866. Não foi descrita qualquer produção de antibiótico para esta espécie.

Como se verifica com outras mi cro-organismos, as características das espécies que produzem GE 2270 estão sujeitas a variações. Por exemplo, podem obter-se variantes ou mutantes artificiais da espécie por tratamento com vários mutagenes conhecidos como raios U.V. raios X, ondas de alta frequência, para efeito radioactivo e por métodos químicos como com o ácido nitroso, o N-meti1-N'-nitro-N-nitrosoguanidina e muitos outros. Todos os variantes e mutantes naturais e artificiais que pertencem a espécies do gene Planobispora e produzem antibiótico GE 2270 são, considera dos equivalentes à espécie Ρ1anobispora rosea ATCC 53773 no que se relaciona com aspectos deste invento e são integrados no domínio do invento.

-16Como se referiu anteriormente, o antibiótico GE 2270 encontra-se, geralmente, em grande par te no micélio da espécie produtora, enquanto que uma quantidade menor da substância se encontra no caldo de fermentação.

A recuperação do antibiótico

GE 2270 do micélio ou do caldo de fermentação dos micro-orga nismos produtores, realiza-se de acordo com técnicas conheci das per se como a extracção com solventes, a precipitação por adição de não-solventes ou por alteração do pH da solução, por cromatografia de partição, por cromatografia de partição de fase invertida, por cromatografia de fermuta iónica, por cromatografia de exclusão molecular e equivalente.

Procedimento preferidos para a recuperação da subtância antibiótica do invento, a partir do micélio, inclui a extracção do micélio filtrado ou centrifugado com um solvente orgânico miscível com a água ou cromato grafia de adsorção seguida de eluição, do produto desejado, da matriz de adsorção.

Um procedimento preferido para a recuperação da substância antibiótica do invento do caldo de fermentação, inclui a extracção com um solvente orgânico imiscivel com a água, seguido por precipitação a partir dos extractos concentrados, possivelmente por adição de um agente precipitante ou de uma extracção suplementar de um resíduo aquoso seu, com um solvente imiscivel com a água. Em alterna tiva, o caldo de fermentação pode ser colocado em contacto com uma matriz de adsorção sendo em seguida efectuada eluição com uma mistura de eluição polar. Este procedimento cromatográfico também pode ser aplicado a um extracto concentrado obtido do caldo de fermentação em vez de ser efectuado no pró prio caldo.

-170 termo solvente miscível com a água com se utiliza nesta descrição tem o significado habitualmente dado na arte a este termo e refere-se a solventes que, nas condições de utilização, são miscíveis com a água numa gama de concentrações razoavelmente larga.

Exemplos de solventes orgânicos miscíveis com água que podem ser utilizados na extracção da substância antibiótica do invento da massa de micélio são: alcanóis inferiores, p.e. alcanóis (¾^-¾) como metanol, eta nol e propanol ; alcanóis fenilo como o álcool benzíli^ co; cetonas inferiores, p.e., cetonas (C3-C4) como a acetona e eti1meti1cetona; éteres cíclicos como dioxano e tetra-hidro furano; glicóis e seus produtos de esterificação parcial como o eti1eno-glico1, propileno-glicol e éter monometílico de eti leno-glicol; amidas inferiores como a dimeti1formamida e dietilformamida.

termo solvente imiscível com a água na forma como ê utilizado nesta descrição de patente pretende significar o que na arte é habitualmente atribuído a este termo e diz respeito a solventes que nas condições de utilização são ligeiramente miscíveis ou praticamente imiscíveis com a água num largo intervalo de concentração, adequada à utilização pretendida.

Exemplos de solventes imiscíveis com a água que se podem utilizar na extracção da substância antibiótica do invento a partir do caldo de fermentação são: os solventes hidrocarbonetos habituais que podem ser lineares ou ramificados ou cíclicos como o hexano ou cíc1o-hexano; hidrocarbonetos halogenados como o cloroformio, tetracloreto de carbono, dicloro-etano, fluoro-bromo-etano, dibromo-metano, tricloro-propano, cloro-trifluoro-octano e equivalentes; hidrocarbonetos aromáticos como benzino, tolueno, xileno e equi valentes; ésteres com pelo menos quatro átomos de carbono co-18mo o acetato de etilo, acetato de propilo, butirato de etilo e equivalentes; alcanois com pelo menos quatro átomos de car bono, lineares, ramificados ou cíclicos como butanol, 1-pentanol, 2-pentanol, 3-pentanol , 1-hexanol, 2-hexanol, 3,3-dimeti1-1-butanol, 4-meti1-1-pentanol; 3-meti1-1-pentano1, 2,2-dimetil-3-pentanol, 2,4-dimeti1-3-pentanol, 4,4-dimeti1-2-pentanol, 5-metil-2-hexanol, 1-heptanol, 2-heptanol, 5-raeti1-1-hexanol, 2-eti1-1-hexanol, 2-meti1-3-hexano1, 1-octanol, 2-octanol, ciclopentano1, 2-ciclopenti1-etanol, 3-cic1openti1-1-propanol, ciclo-hexanol, ciclo-heptanol, ciclo-octanol,

2,3-dimeti1-cic1o-hexano1, 4-eti1-cic1o-hexano1, ciclo-octil-metanol, )-metil-5-hepten-2-ol, 1-nonanol, 2-nonanol, 1-decanol e 3-decanol; éteres alquilicos lineares ou ramificados e misturas suas como éter de petróleo, éter etílico, éter pro pilico, éter butílico, etc; e misturas ou derivados funcionais seus .

Como é conhecido na arte, a se paração de fases pode melhorar com a introdução de um sal.

Quando após uma extracção, uma fase aquosa recuperada continuar uma quantidade substancial de um solvente orgânico pode ser conveniente retirar a água por destilação azeotrópica. Habitualmente é necessário adicio nar um solvente capaz de formar um mínimo azeotrópico com a água, e em seguida adicionar um agente precipitante para conseguir precipitar o produto desejado, se necessário. Exemplos representativos de solventes orgânicos capazes de formar misturas com um mínimo azeotrópico, com a água, são n-butanol, benzino, tolueno, éter butílico, tetracloreto de carbono, cio rofórmio, cic1o-hexano, 2,5-dimetil-furano, hexano e m-xileno; o solvente preferido é o n-butanol.

-19Exemplos de agentes precipitadores são éter de petróleo, éteres de alquilo inferior, como éter etílico, éter propilico e éter butílico, e alquil-cetonas inferiores como a acetona.

Exemplos de sistemas cromatográ ficos que podem ser convenientemente utilizados na recuperação da substância antibiótica do invento, são resinas de poliestireno ou de misturas de po1iestireno-divini1benzeno como Amberlite XAD2 ou XAD4 (Rohm e Haas), S112 (Dow Chemical Co.) e Diaion HP 20 (Mitsubishi); resinas acrílicas como XAD7 ou XAD8 (Rohm e Haas); poliamidas como policaprolactames, nylons e polivinilpirrolidonas de ligação cruzada tendo habitualmente em baixo volume (ml/g) que se situa entre 1 e 5, área específica (m /g) entre 1 e 100, massa especifica aparen te (g/ml) entre 0,15 e 0,50, baixo diâmetro médio (Angstrom) que varia entre 100 e 3000 e uma distribuição de partículas em que pelo menos 40% das partículas tem dimensões inferiores a 300 micrometro, como a Polamida-CC 6, Poliamida-SC 6, Poliamida-CC 6,6, Poliamida-CC 6AC e Poliamida-SC 6AC (Macherey-Nagel e Co., RFA), a resina polivinilpirrolidona PVP-CL (Aldrich Chemie GmbH e Co., KG, RFA) a resina poliamida PA 400 (M. Woelm AG, RFA); e carbono.

No caso do poliestireno ou da resina acrílica um elemento preferido é uma mistura solvente polar de solventes miscíveis com água como, os referidos anteriormente; no caso de uma resina poliamida o elemento prefe rido é uma mistura aquosa de um solvente miscível com a água com as onas anteriormente referidas, enquanto que para o car bono um elemento preferido é uma cetona inferior como a acetona ou um álcool inferior como o metanol.

A purificação suplementar de uma mistura bruta de antibiótico GE 2270 pode conseguir-se por qualquer das técnicas conhecidas, mas é preferencialmen te levada a cabo por métodos cromatográficos.

Exemplos destes métodos croma tográficos são os referidos anteriormente em relação à fase de recuperação e também inclue a cromatografia em fases esta cionarias como a silica-gel, alumina, Florisil e equivalentes com uma fase eluente orgânica constituída por misturas de solventes incluindo hidrocarbonetos halogenados, éteres, cetonas superiores do tipo já referidas anteriormente ou cro matografia de fase invertida sobre silica gel silanizada tendo várias derivações funcionais e eluindo com uma mistura aquosa de solventes miscíveis com água do tipo dos mencionados anteriormente.

A chamada técnica cromatograf£ ca de exclusão esteroquímica pode, convenientemente, se util£ zada com resultados de purificação bons. Em especial, utilizam-se nesta técnica, com utilidade, dextranos de ligação cruzada de poros controlados em que a maioria dos grupos hidroxilo foram alquilados, p.e., Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals, Ab).

Como habitualmente nesta arte, a produção e a recuperação e purificação podem ser controladas por uma diversidade de procedimento analíticos incluindo bio-ensaios como os de disco de paper ou de difusão em agar sobre micro-organismos sensíveis ou procedimentos TLC ou HPLC, que podem envolver um passo de detecção microbial ou por UV.

Uma técnica de HPLC preferida é representada por HPLC de fase inversa utilizando uma coluna com partículas esféricas porosas de sílica gel silanizada, p.e., silica gel funeionalizada com grupos alquilo C-18 ten-21do ub diâmetro uniforme (ooao Utraephere ODS Altex; Beokaan Co de 5 micronetro), uma pri-coluna que 4 eilica gel funcio nalizada com grupo· alquilo C—18 (ooao RP 18 Brownlee Labs) e ua eluente que 4 uma aietura de gradiente linear de um soJL vente miecivel com a égua, polar, como ub doe descritoe ante riormente, numa eoluçSo aquosa taafonisada. Beta eoluçXo deve preferenoialmente, ter o pH ajustado para 5-7, Um eluente com maior preferSnoia 4 representado por um gradiente linear de 45 a 70% de eluente λ no eluente B em que o eluente B 4 uaa aietura de acetonitrilo/taaplo aquoso, pH 5-7, 10:90 e o 5-7, 70:30,

Caracteristicas físico químicas do factor A de antibiótico QE 2270

A) 0 espectro de absorção de ultravioleta que se mostra ne Figura 1 doe gráficos Juntos, exibe oe seguintes máximo· de absorção:

bad ORIGINAL

-221%

Ε lcm

0,1 Μ HC1

Lambda max (nm)

0,1 Μ ΚΟΗ

Tampão de fosfato pH 7,4

Metanol

265

245 (patamar) 310

245 (patamar)

313

245 (patamar)

314

244 (patamar)

310

Β) o espectro de absorção de infravermelho em pasta de nujol que se apresenta na Figura 2 que acompanha esta descrição e apresenta os seguintes máximos de absor ção (cm 1):

3700-3060; 3060-2660 (nujol); 1650; 1590-1490; 1490-1420 (nujol); 1375 (nujol); 1310; 1245; 1210; 1165; 1090;

1060; 1020; 970; 930; 840, 810, 750, 720 (nujol), 700;

-23As principais bandas de absorção funcionais de I.V. deste es pectro podem ser atribuídas da seguinte forma:

niu, (cm l)	Atribuição
3600-3100	niuNH, niuOH
1650	amida I (niu C=0)
1545	heterocíclico niuC=C e niuC=N
1525, 1495	amido II (§NH)
1250, 1205	aromático §CH
870	heterocíclico ΓΟΗ
745, 700	aromático ΓΟΗ

espectro de '‘H-RMN que se apresenta na Figura 3 apresenta os seguintes grupos de sinais (em ppm) a 500 MHz registada em DMSO-d_ (hexadenterodimetilsulfóxido) utilizando TMS drão interno (0,00 ppm); o número de protões nal está registado entre parenctesis:

como pade cada si

9,02	(D ;	8,68	(D ;	8,70	(D ;	8,57	(D ;	8,50	(D
8,43	Cl);	8,37	(D ;	8,26	(D ;	8,25	(D ;	7,4-	7,20
(9) ;	6,96	(2);	6,02	(D;	5,30	-5,18	(3) ;	5,01	(D
4,97	(2) ;	4,80	(D;	4,56	(1) ;	4,30	(D ;	4,26	(1)
3,98	(D ;	3,81	(D ;	3,79	(D ;	3,38	(3) ;	2,72	(D
2,58	( 3 ) ;	2,48	(3) ;	2,16	(D ;	2,13	(D ;	1,96	(2)
1,88	(D ;	1,34	(D ;	0,87	(3) ;	0,84	(3) ;

D) 0 espectro C-RMN que se apresenta na Figura 4 que acompanha esta descrição apresenta os seguintes grupos de sinais (ppm) a 125 MHz em DMSO-d_ com TMS com refeo rência interna (0,00 ppm), Q representa átomos de carbono quaternário ou grupos 0=0;

173,69, Q;	171,10,	Q;	169,83, Q;	169,51	, Q;	168,45,
Q; 168,26,	Q;	167 ,	84,	Q; 165,68,	Q; 164	,75,	Q;
161,40, Q;	161,23,	Q;	160,46, Q;	160,29	, Q;	159,35,
Q; 153,42,	Q;	150 ,	31 ,	Q; 150,11,	Q; 149	,41 ,	0;
146,93, Q;	144	,73,	Q;	143,75, Q;	142,10	, 0;	141,78,
Q ; 141,33,	CH ;	140	,97	, Q; 139,53,	Q; 128,68	, CH;
127,99, 2[CH] ;	127	,67	, Q; 127,67,	CH; 126,88, CH;
126,76, 2 [CH] ;	123	,17	, CH; 118,66	, CH;	116 ,	42, CH;
73,81, CH;	69 ,	41,	^CH2	; 67,97, CH;	67,36	, CH	2 ’
60,12, CH;	58 ,	63 ,	^CH3	; 58,24, CH;	55,41	, CH	; 48,15,
CH; 47,03,	ch₂	; 41	,19	, CH₂; 37,60	, CH₂;	34,	06, CH;
29,76, CH₂	; 25	,85,	CH	₃; 24,28, CH	₂; 18,	49,	CH₃;
17,98, CH₃	; li	,99,	CH	3 ’

E) tempo de retenção (R^) de 14,9 min quando analisado por HPLC de fase inversa sob as seguintes condições:

coluna: Ultrasphere ODS (fase inversa de silica gel sisilonada; 5 micrometro) Altex (Beckman) 4,6 (i.d.)x250 mm pré-coluna: Brownles Labs RP 18 (octadecilsilano silica gel; 5 micrometro) eluente A: acetonitri1o: 18 mM fosfato de sódio 70:30 (v/v), ajustado a pH 7,0 eluente B: acetonitrilo: 18 mM fosfato de sódio 10:90 (v/v), ajustado a pH 7,0 modo de eluição: gradiente linear do eluente A no eluen te B de 45% a 70% durante 20 min débito: 1,8 ml/min detector U.V.: 254 nm padrão interno: cloranfenicol (R =

3,7 min)

λ

F) a análise elementar, depois da amostra ter sido previamente seca a cerca de 140°C sob atmosfera inerte, indicou a composição seguinte: carbono, hidrogénio, azoto, enxofre;

G) valor de 0,37 no seguinte sistema cromatográfico:

diclorometano: metanol, 9:1 (v/v) utilizando placas de sílica gel (sílica gel 60F„^., Merck Co) Visualização:

64 luz U.V. 254 nm, zona amarela com vapores de iodo ou bioautografia utilizando B. subtili s ATCC 6633 em meio Davis mínimo;

padrão interno: cloranfenicol (Rf 0,56)

H) análise FAB-MS mostrando o isótopo de massa mais baixo do ião molecular protonado a m/Z 1290,3 + 0,1 dalton. Todos os outros picos acima de 800 m/Z unidades de massa (sem picos de isótopo) no espectro foram inferiores a 20% do ião molecular, na sequência da análise com o espectrómetro de massa de dupla focagem Kratos MS-50, sob as seguintes condições experimentais: bombardeamento por átomos rápidos de Xe a 6 KV; matriz de glicerol; modo de ionização positivo

I) uma análise de aminoácido do hidrolisato hidroclórico mostrou a presença dos seguintes aminoácidos naturais: glicina, (L) prolina e (L) serina.sob as seguintes condições experimentais:

a amostra é hidrolisada a 105°C durante 20 horas na pre sença de HC1 6N contendo 1% de fenol e em seguida trans formada em derivados em dois passos como se segue:

a) formação de ésteres n-prpílicos das funções ácido carboxílico com HC1 2M em propanol anidro (90°C, lh) e em seguida é efectuada a secagem sob azoto

b) conversão dos grupos amino livres em amidas com anidrido pentafluoropropiónico/diclorometano anidro 1/9 (v/v) à temperatura ambiente durante 1 ho ra, efectuando-se em seguida a secagem sob azoto; o resíduo obtido é dissolvido em diclorometano e analisado por GC-MS utilizando um sistema HP5985B sob as seguintes condições:

coluna: coluna capilar de sílica fundida revestida por n-propionil-L-valina t-butilamida polisiloxano quiral (25mx0,2 mm i.d.; C.G.C. ANALYTIC); programa de temperatura 80°C durante 4 min seguida de 4°C/min

L) estudos de ionização

Por titulação com HC1 O,1N e NaOH O,1N em metilcelulo se/água, não se detectaram funções ionizáveis; por ti tulação com HCIO^ num meio não aquoso (ácido acético) revelou-se uma função básica fraca;

rotação específica Calfa] ²⁰ = +140,8;

D etanol absoluto a uma concentração de 5 g/1 .

-28A actividade antimicrobial dos compostos do invento pode ser demonstrada por um conjunto de testes padrão in vitro.

Por diluição em agar (inóculos 4

CFU) determina-se o MIC para Clostridium difficile, Propionibacterium acnes e Bacteroides f ragi lis. Por diluição de 4 5 microcaldo (inóculos 10 a 10 CFU/ml) determina-se o MIC pa ra outros organismos.

Para Ureaplasma urealyticum os inóculos foram aproximadamente 10^ unidades/ml de modificado res de cor. Os tempos de incubação foram 18-24 h, excepto pa ra N. gonorrhoeae, Branhame11a catarrhalis, H. influenzae, C. difficile, P. acnes e B. fragilis (48 h). Todos os organismos foram incubados a 37°C excepto Candida albicans (30°C). N. gonorrhoeae e H. influenzae incubam-se em atmosfera com 5%

CO^, anaeróbicos numa mistura de gás anaeróbico. Meios utili zados: Caldo Iso-Sensitest (Oxoid) (Estafilococus, STreptococcus faecalis, Streptococcus f aec ium, Escherichia co1i, Pseu domonas aeruginosa. Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae) ; Caldo Todd-Hewitt (Difco) (outros estreptococus); Caldo base GC (Difco) + 1% IsoVitalex BBL (N. gonorrhoeae); Caldo de in fusão cérebro coração (Difco) + 1% Suplemento C (Difco) (H. influenzae); Caldo Mueller-Hinton (BBL) (Branhamella catarrhalis); Meio AC (Difco) (C^ perfringens); agar Wi1kins-Chalgren (Oxoid) (outros anaeróbicos) (T.D. Wilkins e S. Chalgren, Antimicrob. Ag. Chemother. 10, 926, 1976) ; Caldo Evans e Taylor-Robinson (Difco), com suplementos para U.urealyticum; Caldo de levedura de azoto (Difco) (Candida albicans)

As concentrações inibidoras mínimas (MIC, micrograma/ml) apresentam-se na Tabela IV que se segue.

-29TABELA IV

M.I.C. (micrograma/ml) Factor A de antibiótico GE 2270

Staph. aureus Tour LI65 0.2 5

Staph. aureus Tour L165(10^ cfu/ml) 0.25

Staph. aureus Tour L165 + 30%soro bovino 0.25

Staph. epidermidis L147 ATCC 12228 0,13

Staph. haemolyticus L602 0.5

Staph. haemolyticus L602 (10θ cfu/ml) 1

Strep. pyogenes C203 0.25

Strep. pneumoniae UC41 0.13

Strep. faecalis ATCC 7080 0.13

Strep. mitis L796 0.13

Clostridium perfringens ISS30543 0.03

Clostridium difficile ATCC 9 6 8 9 0.03

Propionibacterium acnes ATCC 6919 £0.004

Bacteroides fragilis ATCC 23745 2

Neisseria gonorrhoeae ISM68/126 32

Branhamella catarrhalis ATCC 8176 1

Haemophilus influenzae ATCC 19418 128

Ureaplasma urealyticum L 1479 32

Escherichia coli SKF 12140 >128

Proteus vulgaris ATCC 881 >128

Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 >128

Klebsiella pneumoniae L142 >128

Candida albicans SKF 2270 >128

-30A actividade do antibiótico GE 2270 também foi confirmada em experiências vitro com isoladas clínicas de Enterococci.

A Tabela V apresenta os resulta dos dessas experiências.

TABELA V

Actividade do antibiótico GE 2270 contra enterococus

Espécies

No. de espécies _micrograma/ml_

Intervalo MIC MIC-- MIC-50 90

Strep.

* faecalis 15

0,03-0,25

0,06 0,25 * incluindo 4 espécies resistentes à vancomicina

Strep. 15* 0,06-0,5 faecium * incluindo 5 espécies resistentes à vancomicina

0,06 0,13

-31Os resultados referentes a alguns testes _in vitro contra estafi 1 ococus coagulase-negativa clinicamente isolados encontram-se na Tabela VI que se segue

TABELA VI

Actividade do antibiótico GE 2270 contra estafilococus coagulase-negativa

		MIC (microgram/ml) GE 2270
Staph. epidermidis	L408	°)⁵
	L423	0.25
-	L410	0.5
	L393	0Í 5
	L425	0l25

Staph. haemolyticus L353	0_f 25
L602	1
L383	0.5
L626	0Í5
L382	1
L620	1
L381	0.5

-320 espectro de actividade micro bial do antibiótico GE 2270 também inclui anaeróbicos como se mostra pelos resultados da experiência in vitro referida na seguinte Tabela VII

TABELA VII

Actividade do GE 2270 contra Anaeróbicos

	MIC (microgram/ml) GE 2270
Bacteroides fragilis L1236	2
L1237	1
L1226	1
L1228	1
L1010	2

Propionibacterium
acnes	L1014	0,004
	L1560	0j004 0^03
	L1563
	L1565	0.008

I

-33A actividade contra P. acnes também foi confirmada numa experiência £n vi.tro envolvendo 11 espécies isoladas clinicamente, cujos resultados se apre sentam a seguir.

Actividade do antibiótico GE 2270 contra P. acnes

No. de espécies	mi crograma/ml
Intervalo MIC	^MIC50	^MIC90
11	0,004-0,008	0,008	0,008

Actividade Bactericida contra Enterococcus faecalis

Curvas de tempo de morte foram efectuadas em 10 ml de caldo Todd-Hewitt em balões Erlenmeyer de 100 ml, incubado a 37°C sem agitação. Inoculou-se a 1,4 x 7 x 10 CFU/ml uma cultura logaritmicamente crescente da especie L 14 9 Enterococcus faecalis.

antibiótico de referência (teicoplanina, 8 mg/1) matou 99% das bactérias infectantes em 48 h, enquanto o factor A do antibiótico GE 2270 (o,13 mg/ /1) matou 99,8% de bactérias em 2 h e 99,99% em 48 h com a dose referida ou em 24 h com 4 mg/1.

-34E s t a actividade contra o Entero coccus faecalis alarga-se, também, a espécies resistentes aos antibióticos glicopeptídicos.

Actividade contra Gardnerella vaginalis

Testaram-se 13 Isoladas Clinicas de G. vaginalis em agar Casman com 5% de sangue de coelho e 0,15% de sangue de coelho lisado (inóculos de aproximadamen te 10⁴ CFU). A MIC do factor A do antibiótico GE 2270 situou-se no intervalo de 2-4 mg/1; a MIC_5Q foi 2 mg/1. A incubação foi de 48 h a 37°C numa mistura gasosa anaeróbica.

Septicemia experimental em ratos

A actividade antimicrobial do composto do invento também é confirmada na septicemia experimental em ratos.

Infectaram-se grupos de oito ratos CD1 de ambos os sexos (Charles River, peso médio 18-22

g) intraperitonealmente com Staphylococcus aureus ATCC 19636. 0

A provocação antibacterial (10 cé1ulas/rato) foi dada suspensa em 0,5 ml de mucinas bacteriológica (Difco). 0 composto de teste foi administrado por via intravenosa, uma vez, imediatamente após a infecção numa solução aquosa estéril con tendo 5% de dimeti1formamida e 10% de Cremophor EL (óleo de rícino polietoxilado).

dia a partir da percentagem dose pelo método Spearman e 1,13 mg/kg.

foi calculado no sétimo

0 de amimais sobreviventes a cada Kaerber; o valor determinado foi

Endocardite experimental em ratazanas

Induziu-se endocardite em rata zanas macho CD (Charles River) pesando cerca de 200 g. Inseriu-se um cateter de polietileno (PP.25 Pontex) através da valva aórtica no interior do ventícrulo esquerdo por meio da carótida direita e fixou-se com uma ligadura de seda. Contro lou-se a posição do cateter utilizando um registador amplificador com um indicador de pressão (Hewlett Packard modelo 7782A). Dois dias mais tarde as ratazanas foram infectadas por injecção intravenosa de 0,5 ml de uma solução salina con 4 tendo 10 CFU de S. aureus L 1524. 0 tratamento foi efectuado durante 5 dias com início 16 h após a infecção. Administrou-se factor A do antibiótico GE 2270 solubilizado em propilenoglicol: Cremophor EL: glucose 5% (10:20:70), por via intra venosa em doses de 20 mg/kg, duas vezes por dia. As ratazanas sobreviventes foram mortas seis dias após o início do tratamento e os corações removidos. Qualquer animal que morresse antes do fim do tratamento era autopsiado e o seu coração re movido. Cada coração foi pesado e homogeneizado; os homogenei zados foram diluídos em série e colocados em placas com agar Todd-Hewitt para determinar a carga bacterial. A presença de sangue nos meios homogéneos obtidos não influenciou os resul tados visto que os valores no sangue foram sempre 100 vezes inferiores aos do coração. Os valores foram estatisticamente analisados por meio do teste de comparação múltipla de Scheffe As ratazanas que morreram num período de 40 h após a infecção

-36foram excluídas da análise estatística. Os resultados desta experiência apresentam-se a seguir:

Actividade do factor A do anti_ biótico GE 2270 contra endocardite provocada por estafilococos em ratazanas.

Organismo ·»* infectante	Terapia	Dose diária (mg/kg) via	No. de ratazanas	Log₁₀ CFU/g coração
(média	*** + SD)
S. aureus
L1524	nenhuma		11	9,48 +	0,33
	veiculo	i. v,	13	9,61 +	0,31
	factor A	(20x2)
	GE 2270	i .V.	12	4,84 +	•ΜΙ,29

* p 0,001 em relação ao controlo (não tratados ou tratados com o veículo) *** Carga bacterial no coração no inicio da terapia: 7,36 + 0,32 (média + SD do log^ CFU/g do coração de 5 animais) ** MIC de factor A de antibiótico GE 2270 para S. aureus L1524: 0,25 microgram/ml.

-37Toxicidade aguda

Testes de toxicidade aguda leva dos a cabo em ratos revelaram que o LD_r„ para o factor A do b u antibiótico GE 2270 foi superior a 100 mg/kg i.v. e superior a 500 mg/kg i.p. naquelas espécies animais.

Na sequência das suas proprieda des o composto do invento pode ser utilizado como ingrediente activo na preparação de medicamentos para tratamento humano ou animal.

factor A do antibiótico GE

2270, especialmente, é um agente anti-microbial activo princi palmente contra as bactérias gram-positivas assim como as anaeróbicas gram-negativas. Também se apresenta muito activo na endocardite estafilocoquica sem qualquer resistência cru zada com meticilina, aminoglicosideos ou antibióticos glicopeptídicos.

A indicação terapêutica princi pai da substância antibiótica do invento é, portanto para o tratamento de infecções relacionadas com a presença de micro-organismos a ele susceptíveis.

termo tratamento pretende abranger também a profilaxia, o tratamento e a cura.

doente a receber este tratamento é qualquer animal em necessidade, incluindo primatas, especialmente humanos e outros mamíferos como os equinos, bo vinos, suínos e ovinos! e aves de criação e animais de estima ção em geral.

-380 composto do invento pode ser administrado tal qual ou misturado com transportadores farma ceuticamente aceitáveis e também pode ser administrado em conjunto com outros agentes antimicrobiais com as penicilinas, cefalosporinas, aminoglicosídeos e glicopeptídeos. A te rapia conjunta, inclui, assim, a administração conjunta e se parada do composto activo de uma forma que os efeitos terapêuticos do composto administrado em primeiro lugar não tenha desaparecido inteiramente quando o seguinte é administra do .

Uma formulação farmacêutica pre ferida é representada por uma formulação adequada para uma aplicação tópica sobre a pele intacta ou danificada ou uma membrana mucosa. Exemplos de tais formulações são pós unguen tes, cremes e loções. Os excipientes nestas formulações são os veículos habituais farmaceuticamente aceitáveis com bases de unguento oleaginoso (p.e., ceras de éster cetílico, ácido oleico, azeite, parafina, espermacete, glicereto de amido; bases de unguento absorvente (p.e. , lanolina anidra, pretrolato hidrofí1ico), bases de unguento de emulsão (p.e., álcool cetílico, mono-estearato de glicerilo, lanolina, ácido esteárico) , bases de unguento solúveis em água (p.e. , éteres de glicol e seus derivados que incluem polieti1eno-glicóis, poli (oxi-1,2-etano-di-il)-alfa-hidro-omega-hidroxi-octadecanoato, polissorbatos e mono-estearatos de po1i-eti1eno-glicóis).

Estas formulações podem conter outros excipientes conhecidos como conservantes e preparam-se como se conhece na arte e se relata na literatura como em Remington's Pharmaceutical Sciences, Seventeenth edition, 1985 Mack Publishing Co.

Os compostos do invento também podem ser preparados em formulação adequados à administração parentérica de acordo com procedimentos conhecidos per se na arte e referidos na literatura como o mencionado acima.

Por exemplo, um composto do in vento prepara-se com um agente solubi1izante como o propileno-glicol ou dimeti1acetamida e um agente tensio-activo como o mono-oleato de sorbitano polioxieti1eno ou óleo de rícino po1ietoxi1ado em água esterilizada para injecção.

Um exemplo de uma formulação típica para administração parentérica contem 10 mg de factor A do antibiótico GE 2270 por ml da preparação final, 10-20% de agente tensio-activo que pode ser derivado de polioxietileno éster de ácido gordo de polioxietiieno-sorbitano, ou um derivado de polioxietileno de óleo de rícino hidrogenado e 0-20%, preferencialmente 10-20%, de um agente solubilizante como o propileno glicol, dimeti1acetamida, dimetilformamida, ter-butil-N-hidroxicarbamato, 1,2- 1,3- ou 1,4-butano-diol, oleato de etilo, tetra-hidrofurfuri1-polieti1eno-glico1 200, isossorbito de dimetilo, álcool benzilico e equivalentes. Um agente solubilizante preferido é o propileno glicol.

Os ésteres de ácidos gordos po lioxietileno sorbitano estão comercialmente disponíveis e al. guns deles são comercializados sob a designação comercial Tween. Também são conhecidos pelo nome não registado de polissorbatos. Exemplos seus são o polissorbato 20, 21, 40,

60, 61, 65, 80, 81 e 85. Preferidos para utilização na formu lação do invento são polissorbatos 80 (derivados de sorbitano mono-9-octadecanoato, poli(oxi-l,2-etanodiil) .

Polioxietileno de óleos de rícino e polioxietileno hidrogenado de óleos de rícino encontram-se comercialmente disponíveis. Alguns deles são comer-40-

cializados sob a designação registada de Cremophor. Exemplos destes compostos são os conhecidos por Cremophor EL (óleo de rícino polioxilado) , Cremophor RH 40 (óleo de ríc_i no polioxilado hidrogenado), Cremophor RH 60 (óleo de rícino PEG 60 hidrogenado) ou Emulphor EL-719 (óleo vegetal poli, ox i1ado).

Uma formulação para injecção deve, de preferência, ter um pH no intervalo de 7 + 0,5. Pode ser conveniente, se necessário, ajustar o pH da preparação com um agente tampão adequado. Podem utilizar-se como agentes tampão o TRIS (i.e. tri-hidroximeti1aminometano) ou o fosfato.

Uma formulação preferida para aplicação parentérica inclui os seguintes excipientes:

p

Cremophor EL (polioxil 35 óleo de rícino USP/NF) 20%, pro pileno glicol de 5 a 20%, de preferência de 10-20%.

Estas preparações podem, em re gra, ser preparadas por dissolução do ingrediente activo no solvente orgânico e em seguida adicionando, com repouso, o ingrediente tensio-activo e, finalmente, diluindo para o volume desejado com água estirilizada para injecção.

Podem adicionar-se, como se conhece na arte, outros excipientes como agentes estabilizan tes ou conservantes.

Um exemplo de formulação para aplicação parentérica é a seguinte:

Factor A do antibiótico GE 2270 óleo de rícino PEG 40 (Cremophor EL)	10 0,2	mg mg
propileno-glicol	0,2	mg
para-hidroxibenzoato de metilo	0,5	mg
para-hidroxibenzoato de propilo	0,05	mg
água para injecção q.s.	1	ml
0 ingrediente	activo,	pode

alternativa, ser preparado como pó liofilizado para reconstituição antes da utilização.

Se a substância liofilizada for preparada a partir de uma mistura contendo o ingrediente activo e o surfactante, como polieti1eno-glico1 60 hidrogena do de óleo de rícino, pode ser convenientemente reconstituída com o meio aquoso somente, sem a adição de um solvente or gânico.

Se necessário pode, por opção, adicionar-se um coadjuvante de liofilização para obter a substância liofilizada na forma de pó.

Todas estas formulações são, de preferência, utilizadas, para administração i.v. no tratamen to de qualquer infecção que envolva um microganismo que apre sente susceptibi1idade ao antibiótico do invento.

No tratamento de colite pseudo membranosa ou de outras doenças atribuíveis à presença de anaeróbicos no trajecto gastrointestinal, pode administrar-se oralmente uma dose efectiva do composto do invento, numa forma farmacêutica adequada como cápsulas, comprimidos ou suspensão aquosa.

-42A dose do ingrediente activo depende de muitos factores que incluem o tipo, a idade e condições do doente, a actividade específica do ingrediente e da formulação seleccionada para aplicação, o programa de administração, etc.

Em regra, utilizam-se doses antimicrobiais efectivas em formas unitárias.

Em geral preferem-se aplicações/administrações repetidas, p.e., de duas as 6 vezes por dia. Uma dose efectiva pode, em geral, situar-se no interva lo de 0,5-50 mg/kg de corpo/dia.

Uma preparação tópica preferi da é um unguento contendo de 1% a 10% de um composto do pre sente invento.

De qualquer forma, o médico po derá determinar a dose óptima para um determinado doente, nu ma situação especifica.

Para além da sua utilização co mo medicamento na terapia humana, e veterinária, os compostos do invento também podem ser utilizados como produtores do crescimento animal.

Para este fim, administra-se em composto do invento, oralmente, numa alimentação adequada. A concentração exacta utilizada éa.requerida para proporcionar que o agente activo se encontre numa quantidade efectiva para a promoção do crescimento, quando se consomem quantidades de alimento normais.

A adição do composto activo do invento à alimentação animal é realizada, de preferência, por preparação de uma pré-mistura contendo o composto activo numa quantidade efectiva e incorporando a pré-mistura na ração com pleta.

-43Em alternativa, pode misturar-se na alimentação um concentrado intermédio ou suplemento alimentar contendo o ingrediente activo. A forma como as pré-misturas e rações completas podem ser preparadas e alimenta das estão descritas na literatura (como em Applied Animal Nutrition, W.H. Freedman e CO., S. Francisco, USA, 1969 ou Livestock Feeds and Feeding 0 and B books, Corvallis, Oregon USA, 1977).

Breve descrição das figuras

A figura 1 refere-se ao espectro UV do factor A do antibiótico GE 2270. A correspondência entre os símbolos e os solventes utilizados é a seguinte:

---- refere-se refere-se ao ensaio em CH^ ao ensaio em HC1 0,1 N refere-se ao ensaio em tampão de fosfato pH 7,4 refere-se a ensaio em KOH 0,1 N

A Fig 2 representa o espectro de absorção I.R. do factor A do antibiótico GE 2270 em pasta de nuj o1

A Fig 3 representa o ¹H-RMN do factor A do antibiótico GE 2270 determinado a 500 MHz em

DMS0-d_

A Fig 4 representa o C-RMN do factor A do antibiótico GE 2270, a 125 MHz em DMSO-dg.

Os exemplos seguintes ilustram o invento e não deve, de qualquer forma, se considerados limitadores .

Exemplo 1

Produção do antibiótico GE 2270

Efectuou-se uma cultura de

Planobispora rosea ATCC 53773 nem plano inclinado de agar com farinha de aveia durante duas semanas a 28-30°C e em seguida utilizou-se para inocular em balões de 500 ml contendo 100 ml de um meio de desenvolvimento com a seguinte composição:

Amido 20 g/1 Poliptona 5 g/l Extracto de levedura 3 g/l Extracto de carne 2 g/1 Farinha de soja 2 g/1 Carbonato de cálcio 1 g/i Agua destilada q.s. 100 ml (pH ajustado para 7,0 antes da esterilização)

-450 balão fica a incubar num agitador rotativo (200 rpm) a 28-30°C durante 92 h. A cultu ra obtida é, então utilizada para inocular um vaso fermenta dor contendo 4 1 do mesmo meio e a cultura é mantida em incubação a 28-30°C durante 48 horas com agitação (cerca de 900 rpm) e arejamento (cerca de 1 1 padrão de ar por volume por minuto).

caldo obtido é transferido para um fermentador contendo 50 1 do seguinte meio de produção :

Amido	20	g/i
Pep tona	2,5	g/i
Caseína hidrolisada	2,5	g/i
Extracto de levedura	3	g/1
Extracto de carne	2	g/1
Farinha de soja	2	g/i
Carbonato de cálcio	1	g/1
Agua destilada	q . s .

(pH ajustado para 7,0 antes da esterilização) e incubado durante cerca de 72 h a 28-30°C.

A produção de antibiótico é controlada por ensaio de agar em disco de papel, utilizando subtilis ATCC 6633 crescida em meio Davis minimo. As zonas de inibição são avaliadas após incubação durante a noite a 35°C

Exemplo 2

Recuperação do antibiótico GE 2270

A massa de fermentação obtida anteriormente (50 1) é colhida e submetida a filtragem com a ajuda de um filtro (Clarcell).

antibiótico GE 2270 encontra-se principalmente no micélio, podendo também uma certa quantidade dele ser recuperada dos filtrados.

a) 0 pH do filtrado é ajustado a 7,0 e extraído com ace tato de etilo (50 1). A fase orgânica é separada por centrifugação e concentrada até um volume baixo sob pressão reduzida. 0 resíduo oleoso obtido é, então, tratado com éter de petróleo para precipitar o antibiótico GE 2270 bruto que é recolhido por filtragem e seco. Obtêm-se 415 mg do complexo do antibiótico GE 2270 bruto.

b) 0 micélio é extraído duas vezes com 20 1 de metanol e os extractos combinados são concentrados sob pressão reduzida para dar um resíduo aquoso que é extraí do duas vezes com acetato de etilo. 0 antibiótico GE 2270 bruto (6,06 g) é precipitado por adição de éter de petróleo da fase orgânica concentrada.

-47Exemplo 3

Purificação do factor A do antibiótico GE 2270 antibiótico bruto obtido do micélio de acordo com o procedimento descrito atrás (3 g) é dissolvido em tetra-hidrofurano e concentrado sob pressão reduzida na presença de sílica gel (230-400 mesh). 0 resíduo sólido obtido é recolhido e aplicado a uma coluna de cromato grafia contendo 300 g de silica gel (230-400 mesh) preparada em cloreto de metileno (CH^Cl ). Utilizou-se na coluna, em primeiro lugar, cloreto de metileno (2 1) e, então, sequenci almente com misturas de 1,5 1 de cloreto de metileno e metanol nas seguintes proporções: 98/2; 96/4, 96/4, 92/8, 90/10 e 88/12 (v/v).

As fracções foram recolhidas, analisadas por TLC, HPLC ou microbiologicamente contra ^e combinadas de acordo com o seu conteúdo de antibiótico .

As fracções combinadas contendo factor A do antibiótico GE 2270 puro (HPLC com tempo de retenção de 14,9 min ver os dados físico-quimicas, ponto E, anterior) são concentradas sob pressão reduzida para dar um resíduo oleoso que é solubilizado com tetra-hidrofurano. 0 factor A do antibiótico é precipitado (600 mg) nesta solução por meio da adição de éter de petróleo.

-48Exemplo 4

Das outras fracções obtem-se outra colheita do factor A do antibiótico 2270 por separação por cromatografia como descrito atrás, mas que o contem numa forma impura (HPLC). Também estas fracções são combina das, concentradas e tratadas para obter um sólido como descrito anteriormente. Esta preparação bruta do factor A do antibiótico 2270 é purificada por HPLC de acordo com os seguintes procedimentos:

Dissolve-se uma porção do precipitado (6 mg) em acetonitrilo: água, 1:1 (v/v) e injectado no sistema cromatográfico HPLC equipado com uma coluna de si lica gel silanizada (Lichrosorb RP 18, 7 micrometro, 250 x x 10 mm, Merck, Darmstadt).

A eluição é feita com um gradi ente linear de uma mistura da solução A e B de 50% a 85% de A em B, durante 20 min, a um débito de cerca de 4 ml/min. A solução A é uma mistura de acetonitrilo e tampão de fosfato de sódio 18 mM 70/30 (v/v), ajustado para pH 6 enquanto a so lução B é uma mistura de acetonitrilo e tampão de fosfato 18 mM 10/90 (v/v) ajustado para pH 6.

A coluna é ligada a um detector Perkin Elmer LC85 UV de 330 nm. As fracções de 11 ensaios cro matográficos subsequentes tendo um conteúdo homogénio são com binadas e concentradas sob pressão reduzida para remover o acetonitrilo, obtendo—se assim, soluções residuais separadas contendo o factor A do antibiótico GE 2270. Estas soluções são extraídas duas vezes com um volume igual de acetato de etilo e o antibiótico é obtido por precipitação a partir de fase orgânica concentrada por adição de éter de petróleo. Após recuperação por filtração e secagem obtêm-se 27 mg de factor A do antibiótico GE 2270.

Claims

REIVINDICAÇÕES lâ. - Processo para preparação de um composto do antibiótico GE 2270 factor A ou do complexo antibiótico GE 2270 factor A ou do complexo antibiótico GE 2270, caracterizado por compreender a cultura de Pi anob i s pora rosea ATCC 53773 ou de um variante ou mutante produtor de GE 2270, sob condições aeróbicas submersas na presença de fontes assimiláveis de carbono, de azoto ou de sais inorgâni cos e a recuperação do antibiótico assim produzido. 25. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar o antibiótico GE 2270 factor A possuindo as seguintes caracteristicas, na forma não salina: (A) espectro de absorção ultravioleta, que apresenta os seguintes máximos de absorção: -501% E Lambda máx (nm) cm 0,1Μ HC1 Ο,ΙΜ KOH 245 (patamar) 310 245 (patamar) 313 Padrão fosfato pH 7,4 245 (patamar) 314 Metanol 265 244 (patamar) 310 (B) espectro de absorção infravermelho em pastas de nujol que apresenta os seguintes máximos de absorção (cm ^): 3700-3060; 3060-2660 (nujol); 1650; 1590-1490; 1490-1420 (nujol); 1375 (nujol); 1310; 1245; 1210; 1165; 1090; 1060; 1020; 970; 930; 840; 810; 750, 720 (nujol), 700; -51As principais bandas de absorção funcional I.V. deste espectro, podem ser assim atribuídas; niu , (cm 1 ) Atribuição 3600- •3100 niuNH, niuOH 1650 amida I (niu C=0) 1545 heterocíclico niuC=C e niuC=N 1525 , 1495 amido II (§NH) 1250 , 1205 aromático §CH 870 heterocíc1ico TCH 745 , 700 aromático ΓΟΗ (C) Espectro 1H-RMN que apresenta os seguintes grupos de sinais (em ppm) a 500 MHZ registados em DMSO-d_ o (hexadenterodimeti1sulfóxido) utilizando TMS como padrão interno (0,00 ppm); o número de protões para cada sinal encontra-se referido entre parênctesis: 9.02 (D ; 8.68 (D ; 8.70 (1)? 8.57 (1); 8.50 (D ; 8.43 (D ; 8.37 d) ; 8.26 (1); 8.25 (D ; 7.4-1 L20 (9) ; 6.96 (2) ; 6.02 (D ; 5.30-5.18 (3, ; 5.01 (1) ; 4.97 (2) ; 4.80 (1) J 4.56 (1); 4.30 (D ; 4.26 (l) ; 3.98 (D ; 3.81 (1) ; 3.79 (1)? 3.38 (3) ; 2.72 (1) ; 2.58 (3) ; 2.48 (3) ; 2.16 (1); 2.13 (1) ? 1.96 (2) ; 1.88 (D ; 1.34 (1) ; 0.87 (3); 0.84 (3) ;

1 3 (D) Espectro C-RMN que apresenta os seguintes grupos de si nais (ppm) a 125 MHZ em DMSO-d com TMS como referência o interna (0,00 ppm), sendo Q átomos quaternários de carbo no ou grupos C=0;

173.69, Q; 171.10, Q; 169.83, Q; 169.51, Q; 168.45, Q; 168.26, Q; 167.84, Q; 165.68, Q; 164.75, Q; 161.40, Q; 161.23, Q; 160.46, Q; 160.29, Q; 159.35,

Q; 153.42, Q; 150.31, Q; 150.11, Q; 149.41, Q; 146.93, Q; 144.73, Q; 143.75, Q; 142.10, Q; 141.78, Q; 141.33, CH; 140.97, Q; 139.53, Q; 128.68, CH; 127.99, 2/CH7; 127.67, Q; 127.67, CH; 126.88, CH;

126.76, 2/CH7; 123.17, CH; 118.66, CH; 116.42, CH; 73.81, CH; 69.41, CH₂; 67.97, CH; 67.36, CH₂;

60.12, CH; 58.63, CH₃; 58.24, CH; 55.41, CH; 48.15, CH; 47.03, CH₂; 41.19, CH₂; 37.60, CH₂; 34.06, CH;

29.76, CH₂; 25.85, CH₃; 24.28, CH₂; 18.49, CH₃; 17.98, CH₃; 11.99, CH₃;

(E) tempo de retenção (RE) igual a 14,9 min. quando analisado em HPLC de fase reversa sob as seguintes condições:

«Λ

-54coluna: (Jltrsphere ODS (sílica gel de fase reversa silonada; 5 micrometros) Altex (Beckman) 4,6 (d.i.)x250 mm pré-coluna: Brownles Labs RP 18 (sílica gel octadecilsilano; 5 micrometros) eluente A: acetonitrilo: fosfato de sódio 18 mM 70:30 (v/v), ajustado a pH 7,0 eluente B: acetonitrilo: fosfato de sódio 18 mM 10:90 (v/v), ajustado a pH 7,0 modo de eluição: gradiente linear do eluente A no eluente B de 45% a 70% em 20 min caudal: 1,8 ml/min detector U.V.: 254 nm padrão interno: cloranfenicol (Rt = 3,7 min).

(F) análise elementar, após a secagem prévia da amostra a cerca de 140°C sob atmosfera inerte, que apresentou a se guinte composição: carbono, hidrogénio, azoto, enxofre;

(G) Valor Rf de 0,37 no seguinte sistema cromatografico: diclorometano: metanol, 9:1 (v/v) utilizando placas de gel (sílica gel 60 F254, Merck Co.). visualização: luz V.V. a 254 nm, mancha amarela com vapores de iodo ou bioautografia utilizando B. subtilis ATCC 6633 em meio Davis mínimo; padrão interno: cloranfenicol (Rf 0,56) (H) Análises EM-BAR revelando o isótopo de massa mais baixa do ião molecular protonado a m/Z 1290,3F 0,1 dalton. To dos os outros picos no espectro acima de 800 m/Z unidades de massa (sem contar os picos do isótopo) eram menores que 20% do ião molecular, por análise com um espectrómetro de massa Kratos MS-50 de focagem dupla, nas seguintes condições experimentais: bombardeamento atómi^ co rápido Xe a 6 KV; matriz glicerol; modo de ionização positivo (I) análise de aminoácidos do hidrolisato clorídrico revelan do a presença dos seguintes aminoácidos naturais: glicina, (L) prolina e (L) serina, nas seguintes condições ex perimentais: a amostra é hidrolisada a 105°C durante 20 horas na presença de HC1 6N contendo 1% fenol e depois derivatizada em dois passos, conforme se segue:

a) formação dos ésteres de n-propilo das funções ácido carboxílico com HC1 2M em propanol anidro (90°C, lh), se guida de secagem sob azoto

-56b) conversão dos grupos amino livres em amida com anidrJÍ do, anidrido pentafluoropropiónico/diclorometano, 1/9 (v/v) à temperatura ambiente durante 1 h, seguida de secagem sob azoto; o resíduo derivado assim obtido é dissol_ vido em diclorometano e analisado por GC-MS utilizando um sistema HP5985B nas seguintes condições:

coluna: coluna capilar de sílica fundida revestida com t-butilamida de n-peopionil-L-valina quiral revestida com polissiloxano (25mx0,2 mm d.i.; C.G.C. ANALYTIC); progra ma de temperatura de 80°C durante 4 min; depois 4°/min.

(L) Estudos de ionização

Não foram detectadas funções ionizáveis por titulação com HC1 O,1N e NaOH O,1N em metilcelosolve/água; uma função básica fraca foi revelada por titulação com HCP04 O,1N num meio não aquoso (ácido acético);

(M) Rotação específica.

2 0 [alfaj = +140,8; etanol absoluto, com uma concentração D de cerca de 5 g/1.

3^â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar o complexo an tibiótico GE 2270 que é uma substância antibiótica obtida por recuperação a partir do micélio do Planobispora rosea ATCC 53773 ou de um variante ou mutante produtor de GE 2270.

-574a. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizada por incluir na referida composição um composto da reivindicação 1 ou 2, em mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável.

5^a- - Microorganismo, caracterizado por ser Planibospora rosea ATCC 53773, devido às seguiri tes características morfológicas e químicas:

a) A presença de ácido meso-diaminopimélico e a ausência de glicina na parede celular (parede celular quimiotipo III)

b) A presença de madurose no hidrolisado celular total (açúcar celular total padrão B)

c) A formação de micélios aéreos de esporângios longos e cilíndricos contendo um par de esporos móveis

d) A coloração cor-de-rosa do micélio vegetativo.

-586a. - Cultura biologicamente pu ra da Planobispora rosea ATCC 53773 ou um mutante ou variante produtor de GE 2270, com exclusão da Planobispora rosea ATCC 23866, caracterizado por ser capaz de produzir o antibió tico GE 2270 Factor A sob condições de fermentação aeróbicas na presença de fontes assimiláveis de carbono, azoto ou sais inorgânicos.