HU203580B

HU203580B - Process for producing ge 2270 antibiotic a factor and pharmaceutical compositions containing them

Info

Publication number: HU203580B
Application number: HU894802A
Authority: HU
Inventors: Enrico Selva; Graziella Beretta; Nicoletta Montanini; Beth P Goldstein; Maurizio Denaro
Original assignee: Lepetit Spa
Priority date: 1988-09-09
Filing date: 1989-09-08
Publication date: 1991-08-28
Also published as: KR900004938A; FI894237A; IE63191B1; JPH02149593A; CN1041182A; DK436189D0; JP2997480B2; GB8821160D0; KR0137944B1; IL91518A0; EP0359062A2; NZ230524A; RU1838414C; FI894237A0; EP0359062A3; AU629851B2; NO176026B; DE68913107D1; NO176026C; IL91518A

Description

A találmány tárgya eljárás új, GE 2270-nek nevezett antibiotikum A faktor, valamint ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására,

A találmány szerinti gyógyszerkészítmények különösen olyan fertőző betegségek kezelésére alkalmasak, amelyek az antibiotikumra érzékeny mikroorganizmusok hatására alakulnak ki.

A találmány szerinti vegyületek aktívak mint növekedést elősegítő szerek is állatokban, így a baromfi, sertés, kérődzőkstb. esetében.

A találmány tárgya eljárás a GE 2270 antibiotikum A faktor előállítására, amely abból áll, hogy a Planobispora rosea ATCC 53773 mikroorganizmust vagy ennek egy GE 2270 antibiotikum A faktort termelő mutánsát vagy variánsát tenyésztjük, és az antibiotikumot elkülönítjük a micéliumból és/vagy a fermentléből.

A Planobispora rosea ATCC 53773-at egy talajmintából különítettük el és helyeztünk letétbe — a Budapesti Szerződés előírása szerint — 1988. 06. 14., az ATCC-ben (Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok).

A törzs az ATCC 53773 letéti számot kapta.

A GE 2270 antibiotikum A faktor előállítását úgy hajtjuk végre, hogy egy, a termelésére képes Planobispora törzset — azaz a Planobispora rosea ATCC 53773-at vagy ennek a GE 2270 antibiotikum

A faktort termelő variánsát vagy mutánsát—aerób körülmények között egy vizes táptalajban tenyésztjük, amely táptalaj asszimilálható szén- és nitrogén-forrásokat és szervetlen sókat tartalmaz. Számos, a fermentációs területen általában alkalmazott táptalaj felhasználható, bizonyos táptalajokat azonban előnyben részesítünk. Kitüntetett szén forrás a glükóz, maunóz, galaktóz, keményítő, kukoricaliszt. Kitüntetett nitrogén-forrás az ammónia, nitrátok, szójaliszt, peptonok, húskivonat, élesztőkivonat, tripton, aminosavak. A táptalajban alkalmazható szervetlen sók között jelen vannak a szokásos oldható sók, amelyek képesek nátrium-, kálium-, vas-, cink-, kobalt-, magnézium-, kalcium-, ammónium-, klorid-, karbonát-, szulfát-, foszfát-, nitrát stb. ionok leadására.

Az antibiotikumot termelő törzset rendszerint elő-tenyésztjük rázott lombikban, majd ezt a tenyészetet használjuk fel közepes méretű üvegfermentorok beoltására lényegesebb mennyiségű antibiotikum előállítására. Az elő-tenyésztéshez használt táptalaj ugyanaz lehet, amelyet nagyobb fermentációkhoz használunk, de más táptalajok is alkalmazhatók. A GE 2270 antibiotikum A faktort termelő törzs 20 és 40 ’C közötti hőmérsékleten, előnyösen 24 és 35 ’C között tenyészthető.

A fermentáció közben az antibiotikum-termelés oly mód on követhető, hogy a fermentlé vagy a micélium-kivonatok antibiotikus aktivitását pl. biológiai vizsgálatokkal vagy TLC vagy HPLC eljárással meghatározzuk

Kísérleti organizmusként a GE 2270 antibiotikum A faktorra érzékeny organizmusok—pl. a Bac. subtilis és a S. aureus — használhatók. A biológiai vizsgálatot előnyösen agar-diffúziós módszerrel végezzük, agar lemezeken. A maximális antibiotikumtermelés általában a fermentáció 2. és 5. napja kö2 zött következik be.

A GE 2270 antibiotikum A faktort úgy állítják elő, hogy a Planobispora rosea ATCC 53773 törzset vagy ennek egy 2270 antibiotikum A faktort termelő mutánsát vagy variánsát tenyésztjük. Az antibiotikum főleg a micéliumban található.

A találmány leírásában a „GE 2270 antibiotikum” kifejezést általában úgy tekintjük, hogy az a GE 2270 antibiotikum komplexre — ahogyan azt a fermentációs eljárás végén kinyerjük (1· a 2. példa) —vonatkozik. AGE 2270 antibiotikum Afaktora a komplex fő komponense.

A Planobispora rosea ATCC 53773 morforlógiai jellemzői

APlanobispora rosea ATCC 53773 jól növekszik a legtöbb szokásos táptalajon. A vegetatív micélium hosszú, szabálytalanul elágazófonalakat képez (0,5-1,0 μιη), amelyek áthatolnak az agaron és annak felületén összefüggő növekményt képeznek. A micélium nem fragmentálódik, függetlenül attól, hogy folyékony vagy szilárd táptalajon tenyésztjük. Színe — a legtöbb vizsgált táptalajon — a világos korall színűtől a rózsaszínű korallig változik, A légmicélium hosszú, hullámos és vékony hifákból áll, kevés oldalirányú elágazással és a levegőben lényegében az agar felületével párhuzamosan növekszik.

A légmicélium — ha képződik — fehéres-rózsaszín színű. A sporangiumok különállóan, vagy csoportokban alakulnak ki a légmicélium hifái mentén; kb. 6,0-8,0 μ hosszúak és 1,0-1,2 μ szélesek. A hifákhoz rövid sporagium-hordozók (hosszúságuk 1,0-2,0 μ) közvetítésével kapcsolódnak. Mindegyik sporangiumban egy hosszirányú egyenes spóra-pár alakul ki (3,0-3,5 x 1,0-1,2 μπι). A sporangiumokban a spórákat keresztirányú válaszfal különíti el egymástól. A sporangium burkából való kiszabadulás után a spórák csíllós ostorok segítségével válnak mozgékonnyá.

A Planobispora rosea ATCC 53773 tenyészetének jellemzői

A tenyésztési jellemzők vizsgálatára a Plonobispora rosea ATCC 53773-at különböző standard táptalajokon tenyésztjük, amelyeket Shirling és Gottlieb javasol (E. B. Shirling, D. Gottlieb, Method fór characterization of Streptomyces species. Int. J. Syst. Bacteriol. 313-340,1966), és ezek körét kiegészítettük több olyan táptalajjal, amelyet Waksman ajánl (S. A. Waksman: The Actinomycites. The Williams and Wilkins Co„ Baltimore, Vol 2,328-334).

A szín-meghatározást, szükség esetén, Maerz és Paul módszerével végeztük (A. Maerz, M. Reá Paul: ADictionary of Color. 2. kiadás, McGraw-Hill BookCo.Inc.,NewYork, 1950).

Az organizmusnak azt a képességét, hogy különböző szénforrásokat hasznosítson, a Shirling és Gottlieb által leírt módszerrel vizsgáltuk.

A tenyésztési, a fiziológiai jellemzőket és a szénforrás-hasznosításra vonatkozó információt azl., II. és ΙΠ. Táblázatban mutatjuk be.

Az I. táblázat adatait 2 héten át 28 ’C-on való tenyésztés után határoztuk meg.

-2HU 203580Β

I. Táblázat

A Planobispora rosea ATCC 53773 törzs tenyészetének jellemzői

Táptalaj

Morfológiai jellemzők

6%-os zabliszt-agar	bőséges növekedés, síma felszín, korall szín (2-H-10), bőséges légmicélium-termés (világos-rózsaszín, l-A-9)
ISP 2 (élesztőkivonat-malátaagar)	bőséges növekedés, ráncos felszín, világos rózsaszín (2-E-9); nyomokban világos légmicélium
ISP 3 (2%-os zabliszt agar	mérsékelt növekedés, sima felület; világos rózsaszín (2-E-8); nyomokban rózsaszín-fehér légmicélium
ISP-4 (szervetlen sókat tartalmazó keményítős agar)	mérsékelt növekedés, sima felület; korall-rózsaszín (2-E-10)
ISP 5 (glicerin-aszparagin agar)	mérsékelt növekedés sima és sík felülettel; világos rózsaszín (2-A-9), bőséges fehér légmicélium termelés
ISP 6 (pepton-élesztőkivonat-vas agar)	mérsékelt növekedés, enyhén ráncos, vüágos korall-rózsaszín (l-A-10)
ISP 7 (tirozin agar)	mérsékelt növekedés, sima és vékony felület; világos rózsaszín (1 -A-9); bőségesen képződő világos rózsaszín (1 -C-9) légmicélium
Hichey-Tresner-f. agar	bőséges növekedés, vastag és ráncos felület; világos korall-rózsaszín (l-A-10), mérsékelt légmicélium-termelés (világos rózsaszín)
Czapek-f. glükóz-agar	nagyon gyenge növekedés, sima és vékony felület; mérsékelt légmicélium termelés (világos rózsaszín)
Glükóz-aszparagin agar	mérsékelt növekedés, sima és vékony felület, színtelen; légmicélium nem termelődik
Tápagar	jó növekedés, sima felszín, világos narancsszínű, rózsaszínes árnyalattal (9-A-7)
Bennett-f.agar	mérsékelt növekedés, enyhén ráncos felszín, világos borostyán-rózsaszín (10-A-6)
Kalcium-malát agar	gyér növekedés, sima és sík felszín, színtelen
Lefölözött tejes agar	mérsékelt növekedés, sima felszín, korall-rózsaszín (2-F-9)
Tojásalbumin agar	Gyér növekedés, sima és vékony felszín, színtelen-világos rózsaszín (2-A-8)
Dextróz-triptóz agar	nincs növekedés
Burgonyás agar	jó növekedés, sima felszín, világos narancsszínű, rózsaszín árnyalattal (9-A-7)

A betűk és számok a Maerz és Paul (1. az előbbiekben) szerint végzett szín-meghatározásra vonatkoznak.

II. Táblázat APlanobispora rosea ATCC 53773 fiziológiai jel- 1ρ.τΠ7ηί	III. Táblázat Szénhidrát-felhasználás
Vizsgálat	Eredmények	Szénforrás	Növekedés
keményítő-hidrolízis	pozitív	arabinóz	+
H 25 képződés	negatív	xilóz	+
tirozin-reakció	pozitív	ribóz	-
kazein-hidrolízis	enyhén pozitív	fruktóz	+/-
kalcium-malát bontás	negatív	galaktóz	-
zselatin-folyósítás	enyhén pozitív	glükóz	+
tej-koagulálás	negatív	ramnóz	-
tej-peptonizálás	negatív	laktóz	-
nitrát-redukció	pozitív	szacharóz	-
		maltóz	+ 3

-3HU 203580Β

III. Táblázat folyt. Szénhidrát-felhasználás

Szénforrás	Növekedés
raffinóz	-
cellulóz	-
mannit	-
szalicin	+
mozit	+
cellobióz	-

Jelölések:

+mérsékelt növekedés +/-gyér növekedés

-nincs növekedés

Ehhez a vizsgálathoz az JSP 8 táptalajt (E. B. Shirling and D. Gottlieb, (1966) Method fór characterisation of Streptomyces species — int. f. Syst. Bacteriol) alkalmazzuk, és az eredményeket 2 héten át 28-30 °C-on végzett inkubálás után értékeljük.

Hőmérséklet-érzékenység:

Az optimális növekedési hőmérséklet 28-37 ’C. Nem figyelhető meg növekedés 15 °C-on és 50 ’Con; mérsékelt a növekedés 20 ’C-on.

Kemotaxonómiai jellemzők

Sejtfal-elemzés

A sejtfalban jelenlevő aminosavak elemzését a Becker és munkatársai által leírt módszerrel (Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole cellhydrolysates. Appl. Microbiol. 12, 421-423, 1964) végezzük.

A teljes sejt hidrolizátumának elemzése mezodiamino-pimelinsav jelenlétére mutat.

Nem találunk glicint annaka tiszta sejtfal készítménynek a meghatározása során, amelyet Kawamoto és munkatársai (I. Kawamoto et al., Cell wall composition of Micromonospora olivoasterosporia, Micromonospora sagamiensis and related organisms, J. Bact. 146,527-534,1981) módszere szerint állítottunk elő.

A teljes sejt cukor metabolizmusa

A teljes sejt hidrolizátum cukor-tartalmának meghatározását Μ. P. Lechevalier módszerével végezzük (Identification of aerobe Actinomycetes of clinical importance. J. Láb. Clin. Med. 71,934-944, 1968), vékonyrétegkromatográfiás cellulóz-lemezek alkalmazásával, a J. L. Staneck és G. D. Roberts által leírt módon (Simplified appreach to identification of aerobic Actinomycetes by thin layer chromatography. Appl. Microbiol. 28, 226-231, 1974), a következő oldószer-rendszerrel: etilacetát:pirimidin.víz 100:35:25 térf/térf.

A kapott eredmények arra mutatnak, hogy maduróz (3-O-metü-D-galaktóz) van jelen és nincs jelen arabinóz és galaktóz.

A Planobispora rosea ATCC 53773 törzs azonosítása

Ezt a törzset a Planobispora genusba soroljuk és Planobispora rosea-ként osztályozzuk, a következő morfológiai és kémiai jellemzők alapján:

a) a sejtfalban mezo-diamino-pimelmsav van jelen és hiányzik a glicin (HL kemotípusú sejtfal)

b) a teljes sejt hidrolizátumában maduróz van jelen (B típusú teljes sejt cukor metabolizmus)

c) a légmicéliumon hosszú és hengeres spóratartók képződnek, amelyek egy pár mozgékony spórát tartalmaznak

d) a vegetatív micélium rózsaszínű.

A Planobispora rosea ATCC 53773 fent leírt morfológiai jellemzői nem különböznek lényegesen annak a Planobispora rosea törzsnek a jellemzőitől, amelyeket J. E. Thiman et al. ír le (The Actinomycetales. The Jena Intern. Symp. on Texon., 1968 szeptember. Kiadó: H. Prauser, Jena). Ezt az ATCC-ben helyezték letétbe, 23866 letéti számon. Erről a törzsről nem írnak le antibiotikum termelést.

Mint más mikroorganizmusok, a GE 2270-t termelő törzsek jellemzői is változásoknak vannak kitéve. A törzs mesterséges variánsai és mutánsai állíthatók elő pl. különböző ismert mutagénekkel — így UV besugárzással, X-sugárral, nagyfrekvenciájú hullámokkal, radioaktív sugarakkal — és vegyszerekkel (amilyen pl. a salétromossav, N-metil-N’mtro-N-mtrozo-guanidin és számos más anyag). Minden olyan természetes és mesterséges variánst és mutánst, amely a Planobispora rosea ATCC 53773-ból származik és GE 2270 antibiotikumot termel, egyenértékűnek tekintünk a Planobispora rosea ATCC 53773 törzzsel, a találmány céljai vonatkozásában és a találmány oltalmi köréhez tartozónak tekintsünk.

A GE 2270 antibiotikum általában főként a termelő törzs micéliumában fordul elő, míg kisebb mennyiségű anyag található a fermentlében is.

A GE 2270 antibiotikumnak a micéliumból vagy a termelő törzs fermentlevéből való kinyerését ismert eljárások segítségével végezzük, amilyen az oldószeres extrakció, kicsapás nem-oldószerek hozzáadásával vagy az oldat pH-jának megváltoztatásával, megosztásos kromatográfia, fordított fázisú megosztásos kromatográfia, ioncserélő kromatográfia, molekula-kizárásos kromatográfia stb.

Egy kitüntetett eljárás szerint, amely a találmány szerinti antibiotikumnak a micéliumból való kinyerésére irányul, a szűrt vagy centrifugált micéliumot egy vízzel elegyedő szerves oldószerrel extraháljuk, az extraktumokat betöményítjük és a nyers antibiotikumot kinyerjük:

- kicsapással, előnyösen egy kicsapószer hozzáadásával;

- a vizes maradéknak egy vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel végzett extrakciójával vagy

- adszorpciós kromatográfiával, amelyet a keresett terméknek az abszorpciós mátrixból való eluálása követ.

Kitüntetett eljárás a szóbanforgó antibiotikumnak a fennen tlébő való kinyerésére az extrakció egy vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, majd a betöményített extraktumokból való kicsapással — célszerűen egy kicsapószer hozzáadásával—vagy a vizes maradék további extrakciója egy vízzel nem elegyedő oldószerrel. Egy másik megoldás szerint a fermentlevet egy adszorpciós mátrixszal hozzuk érintkezésbe, majd egy poláris eluciós eleggyel eluá-4HU 203580Β ι

lünk. Ez a kromatográfiás eljárás alkalmazható olyan koncentrált extraktumok esetében is, amelyeket a fermentléből állítottunk elő (tehát nemcsak a fermentlé esetében).

A leírásban használt értelemben a „vízzel nem elegyedő oldószer” kifejezéssel—a szakterületen e kifejezés elfogadott jelentésével összhangban — olyan oldószereket kívánunk jelölni, amelyek az alkalmazás körülményei között vízzel ésszerűen tág koncentráció-tartományban kevéssé vagy egyáltalán nem elegyednek.

A találmány szerinti antibiotikumnak a micélium-tömegből való extrakciójához használható vízzel elegyedő szerves oldószerrel, majd a betöményített extraktumokból való kicsapással — célszerűen egy kicsapószer hozzáadásával — vagy a vizes maradék további extrakciója egy vízzel nem elegyedő oldószerrel. Egy másik megoldás szerint a fermentlevet egy adszorpciós mátrixszal hozzuk érintkezésbe, majd egy poláris eluciós eleggyel eluálunk. Ez a kromatográfiás eljárás alkalmazható olyan koncentrált extraktumok esetében is, amelyeket a fermentléből állítottunk elő (tehát nemcsak a fertmentlé esetében).

A találmány szerinti antibiotikumnak a micélium-tömegből való extrakciójához használható vízzel elegyedő szerves oldószerek például a következők lehetnek:

- rövidszénláncú alkanolok, pl. 1-3 szénatomos alkanolok, mint metanol, etanol és propanol;

- fenil-(l-3 szénatomos)-alkanolok, pl. benzilalkohol;

- rövidszénláncú ketonok, pl. 3-4 szénatomos ketonok, így aceton és etil-metü-keton;

- gyűrűs éterek, pl. dioxán és tetrahidrofurán;

-glikolok és részleges észterezésük termékei, így etilén-glikol, propilén-glikol és etüén-glikol-monometü-éter;

- rövidszénláncú amidok, így dimetü-formamid és dietil-formamid.

Az antibiotikumnak a fermentléből való kivonásához használható vízzel nem elegyedő szerves oldószerekre példák a következők:

- a szokásos szénhidrogén oldószerek, amelyek egyenes vagy elágazó láncúak vagy gyűrűs vegyűletek lehetnek, mint a hexán vagy a ciklohexán;

- halogénezett szénhidrogének, pl. a kloroform, széntetraklorid, diklór-etán, fluor-bróm-etán, dibróm-etán, triklór-propán, klór-trifluor-oktán stb.;

- aromás szénhidrogének, mint benzol, toluol, xilol stb.;

- legalább 4 szénatomos észterek, így etil-acetát, propil-acetát, etil-butirát stb.;

- legalább 4 szénatomos alkanolok, amelyek egyenes, elágazó láncúak vagy gyűrűs vegyületek lehetnek, mint a butanol, 1-pentanol, 2-pentanol, 3pentanol, 1-hexanol, 2-hexanol, 3-hexanol, 3,3-dimetü-1-butanol, 4-metü-l-pentanol, 3-metü-l8 pentanol, 2,2-dimetil-3-pentanol, 2,4-dimetü-3pentanol, 4,4-dimetü-2-pentanol, 5-metil-2-hexanol, 1-heptanol, 2-heptanol, 5-metil-1-hexanol, 2etü-1-hexanol, 2-metil-3-hexanol, 1-oktanol, 2-ok5 tanol, ciklopentanol, 2-ciklopentil-etanol, 3-ciklopentil-1 -propánok ciklohexanol, cikloheptanol, ciklooktanol, 2,3-dimetü-ciklohexanol, 4-etíl-ciklohexanol, ciklooktü-metanol, 6-metü-5-heptén-2ol, 1-nonanol, 2-nonanol, 1-dekanol, 2-dekanol és

3-dekanol;

- egyenes vagy elágazó alkil-éterek vagy ezek keverékei, így petroléter, dietil-éter, dipropil-éter, dibutü-éter, stb. és az előbbiek elegyei vagy funkciós származékai.

Mint ez a szakember számára ismert, a fázisok szétválasztása sózással javítható.

Ha egy extrakciót követően rendelkezésünkre áll egy vizes fázis, amely jelentős mennyiségű szerves oldószert tartalmaz, előnyösen úgy járhatunk el, hogy a vizet ebből azeotróp desztülációval távolítjuk el. Ehhez általában olyan oldószer hozzáadására van szükség, amely képes vízzel minimális azeotróp elegy képzésére. Ezt követően egy kicsapószert adagolunk a keresett tennék kicsapására, ha ez szüksé25 gesnek látszik. Jellegzetes példák az olyan szerves oldószerekre, amelyek képesek vízzel minimális azeotróp elegy képzésére, a következők: n-butanol, benzol, toluol, dibutü-éter, széntetraklorid, kloroform, ciklohexán, 2,5-dimetü-furán, hexán és m-xi30 lol. Kitüntetett oldószer a n-butanol.

Példák a kicsapószerekre: petroléter, rövidszénláncú alkil-éterek, így dietil-éter, dipropü-éter és dibutü-éter, és rövidszénláncú alkil-ketonok, így aceton.

Példák az olyan kromatográfiás rendszerekre, amelyek előnyösen alkalmazhatók a találmány szerinti antibiotikum kinyerésére:

- polisztirol vagy vegyes polisztirol-divinil-benzol gyanták, így Amberlite XAD2 vagy XAD4 (Rohm és Haas), SÍ 12 (Dow Chemical Co.) és Diaion HP 20 (Mitsubishi);

- akril-gyanták, így XAD7 vagy XDA8 (Rohm és Haas);

- poliamidok, így polikaprolaktámok, nylonok és keresztkötéses polivinil-pirrolidonok, amelyek pórus-térfogata (ml/g) általában 1-5, felülete (m7g) 1-100, látszólagos sűrűsége (g/ml) 0,15-0,50, átlagos pórus-átmérője (A) 100-3000 és részecskenagyság-eloszlása olyan, hogy a részecskenagyság legalább 40%-ban 300 pm-nél alacsonyabb; Uyen Polyamide-CC 6, Polyamide-SC 6, Polyamide-ÚC 6.6, Polyamide-CC 6AC és Polyamide-SC 6AC (Macherey-Nagel and Co., NSZK); a PVP-CL polivinü-pirrolidon gyanta) Aldrich Chemie GmbH and

Co., KG, NSZK), a PA400 poharaid gyanta (M. WoelmAG,NSZK)és

-ászén.

A polisztirol vagy az akril gyanták esetében kitüntetett eluálószer az előbbiekben említett vízzel elegyedő oldószerek poláris oldószer elegye. Poliamid gyanta esetében az eluálószer előnyösen egy vízzel elegyedő oldószer (pl. az előbbiekben említettek egyike) vizes elegye, míg szén esetében egy rövidszénláncú keton, pl. az aceton vagy egy rÖvid65 szénláncú alkohol, pl. a metanol a kitüntetett oldó-5HU 203580Β szer.

A nyers GE 2270 antibiotikum készítmény további tisztítása bármely ismert technika segítségével történhet, előnyösen kromatográfiás megoldásokat alkalmazunk, miáltal a GE 2270 antibiotikum A faktort állítjuk elő.

Példák az ilyen kromatográfiás eljárásokra azok, amelyeket az előbbiekben a kinyerési lépéssel kapcsolatban említettünk és ide sorolhatók a stacionáris fázison (így szilikagélen, alumínium-oxidon, florisil-en stb.) szerves eluáló fázissal végzett kromatográfia — amelynek során oldószer-elegyeket alkalmazunk, ideértve a halogénezett szénhidrogéneket, étereket, hosszabb szénláncú ketonokat, amelyek jellemző típusait az előbbiekben már megadtuk —, vagy a szilanizált, különböző funkciós származékká alakított szilikagélen végzett fordított fázisú kromatográfia, amely esetben az eluálást az előbbiekben említett típusú vízzel elegyedő oldószerek vizes elegyeivel végezzük.

Célszerűen alkalmazható az ún. sztérikus kizárásos kromatográfiás technika is, amely jó tisztítási eredményeket szolgáltat.

E technika keretében konkréten hasznosan alkalmazhatók a meghatározott pórus-méretű keresztkötéses dextránok, amelyekben a hidroxil-csoportok többsége alkilezett; ilyen pl. a Sephadex LH20 (Pharmacia Fine Chemicals, Ab).

Mint ez a szakember számára ismert, a termelési, valamint a kinyerési és a tisztítási lépés is számos analitikai eljárással követhető, ideértve a biológiai vizsgálatokat (amilyen a papírkorongos vagy agardiffúziós meghatározás érzékeny mikroorganizmusok alkalmazásával), vagy a TLC vagy a HPLC technika, amelyek egy UV-vel való vagy mikrobiális kimutatási lépést foglalhatnak magukban.

Kitüntetett HPLC technikát képvisel egy olyan fordított fázisú HPLC, amelynek jellemzői a következők:

- porózus és szférikus szilanizált szilikagél részecskéket tartalmazó oszlop; alkalmazhatunk pl. C-18 alkil-csoportokkal funkciós származékká alakított szilikagélt, amelynek részecskéi azonos átmérőjűek (így a Beckman Co. által gyártott 5 pm-es Ultrasphere ODS Altex);

- egy elő-oszlop, amely C-18 alkil-csoportokkal funkcionálisan átalakított szilikagélt tartalmaz (ilyen pl. az RP 18, Brownlee Labs) és

- egy eluálószer, mégpedig egy pl. az előbbiekben leírtaknak megfelelő — poláris, vízzel elegyedő oldószer lineáris gradiense egy vizes puffer-oldatban. Ezt az oldatot előnyösen pH 5-7-re állítjuk be.

Egy különösen kitüntetett eluálószer pl. a következő összetételű: 45-70% A eluálószer lineáris gradiense B eluálószerben, amely utóbbi acetonitrü: pH 5-7 vizes puffer 10:90 elegye. Az A eluálószer acetonitril: pH 5-7 vizes oldat 70:30 elegye.

A GE 2270 antibiotikum A faktor fizikokémiai jellemzői

A) az 1. ábrán látható UV abszorpciós spektrum, amely a következő abszorpciós maximumokat mutatja:

0.1MHC1		245 (váll, 310
0.1MKOH		245 (váll) 313
7,4pH-jú foszfát puffer		245 (váll) 314
metanol	265	244 (váll) 310

B) A 2. ábrán látható IR abszorpciós spektrum nujol pólyában, amely a következő abszorpciós maximumokat mutatja (cm y 3700-3060; 30602660 (nujol); 1650; 1590-1490; 1490-1420 (nujol); 1375 (nujol); 1310; 1245; 1210; 1165; 1090; 1060; 1020; 970; 930; 840; 810; 750; 720; 700.

E spektrumban a főbb funkcionális IR abszorpciós sávok a következőképpen minősíthetők:

3600-3100 νΝΗ,νΟΗ

1650 Iamid(vC=O)

1545 heterociklus rC=C és vC=N

1525,1495 Hamid(öNH)

1250,1205 aromás 6CH

870 heterociklus yCH

745,700 aromás ^CH

C) A 3. ábrán látható ^1-NMR spektrum a következő jel-csoportokat (ppm-ben) mutatja 500 MHz-en, DMSO-d 6-ban felvéve: (DMSO- hexadeutero-dimetil-szulfoxid), belső standardként (0,00 ppm) IMS (tetrametil-szilánt) használva. Zárójelben az egyes jelekhez tartozó protonok számát tüntetjük fel:

9,02 (1), 8,68 (1), 8,70 (1), 8,57 (1), 8,50 (1), 8,43 (1), 8,37 (1), 8,26 (1), 8,25 (1),7,4-7,20 (9), 6,96 (2), 6,03 (1), 5,30-5,18 (3), 5,01 (1), 4,97 (2), 4,80 (1), 4,56 (1),4,30 (1), 4,26 (1), 3,98 (1), 3,81 (1), 3,79 (1), 3,38 (3), 2,72 (1), 2,58 (3), 2,48 (3), 2,16 (1), 2,13 (1), 1,96(2), 1,88(1), 1,34(1) (L87 (3), 0,84 (3).

D) A 4. ábrán látható ⁴ C-NMR spektrum a következő jel-csoportokat mutatja (ppm-ben) 125 MHz-en, DMSO-dbban, belső standardként (0,00 ppm) TMS alkalmazásával. Q jelentése kvatemer szénatom vagy C-0 csoport: 173,69, Q; 171,10, Q; 169,83, Q; 169,51, Q; 168,45, Q; 168,26, Q; 167,84, Q; 165,68, Q; 164,75, Q; 161,40, Q; 161,23, Q; 160,46, Q; 160,29, Q; 159,35, Q; 153,42, Q; 150,31, Q; 150,11, Q; 149,41, Q; 146,93, Q, 144,73, Q; 143,75, Q, 142,10, Q; 141,78, Q; 141,33, CH; 140,97, Q; 139,53, Q; 128,68, CH; 127,99, 2(CH); 127,67, Q; 127,67, CH; 126,88, CH; 126,76, 2(CH); 123,17,CH; 118,66,CH; 116,42, CH; 73,81, CH; 69,41, CH2 67,97, CH; 67,36, CH2 60,12, CH; 58,63, CH3 58,24, CH; 55,41, CH; 48,15, CH; 47,03, CH2 41,19, CH2 37,60, CH2 34,06, CH; 29,76, CH2 25,85, CH3 24,28, CH2 18,49, CH3 17,98 CH311,99, CH3

E) Retenciós idő (R(t 14,9 perc, fordított fázisú HPLC-vel a következő körülmények között végezve a vizsgálatot:

oszlop: Ultrasphere ODS (fordított fázisú szilanizált szilikagél; 5 pm; Altex, Beckman); 4,6 mm (bel-6HU 203580Β <

ső átmérő) x 250 mm;

első-oszlop: Brownlee Labs RP18 (oktadecil-szilán szilikagél, 5 pm);

A eluálószer: acetonitril: 18 mM—pH 7,0-ra beállított —nátrium-foszfát 70:30 (térf/térf.),

B eluálószer: acetonitril: pH 7,0-ra beállított 18 mM nátrium-foszfát puff er 10:90 (térf/térf.),;

az eluálás módja: az A eluálószer lineáris grádiense a B eluálószerben, 45-70% között, 20 perc alatt;

áramlási sebesség: 1,8 ml/perc;

UV detektor: 254 nm;

belső standard: kloramfenikol (R-fe 3,7 perc).

F) elemanalízis- a minta előzetes, kb. 140 ’C-on közömbös atomszférában való szárítása után — a következő összetevőkre mutat: C, Η, N, S.

G) 0,37 Rf érték a következő kromatográfiás rendszerben:

-diklór-metánmetanol9:l (térf/térf.);

- szilikagél lemezek (szilikagél 60F254Merck Co.);

- kimutatás: 254 nm-es UV fény; jód-gőz hatására sárga folt vagy bioautográfia, B. subtilis ATCC 6633 alkalmazásával, Davis-f. minimál-táptalajon,

- belső standard: kloramfenikol (Rfi),56).

H) FAB-MS elemzés: a protonált molekula ion a legkisebb tömegű izotópot m/z 2390,3 ± 1 daltonnál mutatja. 800 m/z tömeg-egység fölött minden csúcs (eltekintve az izotóp csúcsoktól) a spektrumban a molekula-ion 21%-ánál kisebb mennyiségű. Az elemzéstKratosMs-50 kettősfókuszáló tömegspektrométerrel végezzük, a következő kísérleti körülmények között: Xe gyors atom bombázás 6 Kv mellett;

glicerin mátrix; pozitív ionizációs mód.

I) A sósavas hidrolizátum aminosav-elemzése a következő természetes aminosavak jelenlétére mutat: glicin, L-prolin és L-szerin. A kísérleti körülmények a következők:

A mintát 105 ’C-on 20 órán át 6N HCl-ben hidrolizáljuk (amely HC1 1% fenolt tartalmaz), majd két lépésben származékot képzünk, a következő módon:

a) n-propil-észter képzése a karbonsav-funkció igénybevételével, 2M HCl-lel, vízmentes propanolban (90 ’C, 1 ”, majd szárítás nitrogén alatt;

b) a szabad amino-csoportok amiddá való átalakítása 1:9 (térf/térf.) pentafluor-propionsav-anhidrid: vízmentes diklór-metán eleggyel, szobahőmérsékleten, 1 órán át, majd szárítás nitrogén atmoszférában.

Az így kapott származékot diklór-metánban oldjuk és GC-MS technikával elemezzük HP 5985B rendszer alkalmazásával, a következő körülmények között:

- oszlop: királis n-propionil-L-valin-terc-butilamid-polisziloxánnal bevont ömlesztett szilikagél kapilláris oszlop (25 m x 0,2 mm belső átmérő; C. G. C.ANALYTIC)

- hőmérsékleti program: 80 ’C 4 percen át, majd 4’C/perc

L) Ionizációs vizsgálatok

0,lN HCl-lel és 0,lN NaOH-dal metil-celloszolv/víz közegben titrálva nem mutatható ki ionizálható funkció; 0,lN HC104gyel való titrálással nemvizes közegben (ecetsav) egy gyenge bázisos funkció mutatható ki. __

M) Fajlagos forgatás [oq D“ +140,8, absz. etanolban, kb. 5 g/1 koncentrációban.

A találmány szerint előállított gyógyszerkészítmények antimikrobiális aktivitása in vitro számos standard vizsgálattal kimutatható.

A Clostridium difficile, Propionibacterium acnes és a Bacteroides fragilis esetében az MIC-t agarhírításos módszerrel határozzuk meg (inokulum: HPCFU/10 lelepképző egység/). Más mikroorga20 nizmusok esetében a MIC-t tenyésdé-mikrohígítással mérjük (inokulum: 10 -10⁰ CFU/ml). Az Ureaplasma urealyticum esetében az inokulum kb. 10 színváltoztató egység/ml. Inkubációs idő 18-24 óra, míg a N. gonorrhoeae, Branhamella catarrhalis,

H. influenzáé, C. difficile, P, acnes és a B. fragilis esetében 48 óra. Valamennyi organizmust kb. 37 ’Con inkubáljuk, a Candida albicans kivételével (30 ’C). A M. gonorrhoeae-t és a H. influenzae-t 5% CO2-t tartalmazó atmoszférában inkubáljuk, az anaeróbokat pedig anaerob gázelegyben. Az alkalmazotttáptalajok:

- Iso-Sensitest leves (Oxoid) a Staphylococcusok, a Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vul35 garis,Klebsiellapneumoniae esetében;

- Todd-Hewitt leves (Difco) a többi Streptococcus esetében;

- GC alap-leves (Difco) + l%IsoVitalexBBL (:N. gonorrhoeae;

- agy-szív infúziós leves (Difco) + 1% C adalék (Difco) a H. influenzáé esetében;

- Müller-Hinton leves (BBL) a Branhamella catarrhalis esetében;

- AC táptalaj (Difco) a C. perfringens esetében;

- Wilkins-Chalgren agar (Oxoid) a többi anaerób esetében (T. D. Wilkins, S. Chalgren, Antimicrob. Ag. Chemother. 10,926,1976);

- Evans-Taylor-Robinson leves (Difco) adalékanyagokkal az U. urealyticum esetében;

- élesztő-nitrogén leves (Difco) a Candida albicans esetében.

Egyes mikroorganizmusok minimális gátló koncentrációját (MIC, pg/ml) a IV. táblázatban mutatjuk be.

Az alábbi táblázatokban a MIC5(£sMIC9O kezelt törzsek 50/-ának illetve 90%-ának gátlásához szükséges minimális koncentrációt jelentik.

-7HU203580Β

IV. Táblázat

Törzs	MlC(pgZml) GE 2270 antibiotikum A faktor
Staph.aureusTourL165 -	0,25
Staph. Aureus Tour L165 (10 ^öcfu/ml)	0,25
Staph. aureus Tour L165+30% bocine serum	0,25
Staph. epidermidis L147 ATCC 23338	0,13
Staph. haemolyticusL602	0,5
Staph. haemolyticusL602 (10^öcfu/ml)	J
Strep. pyogenes C203	0,25
Strep. pneumoniae UC41	0,13
Strep. faecalis ATCC 7080	0,13
Strep. mitisL796	0,13
Clostridium perfringensISS 30543	0,03
Clostridium dificile ATCC 9689	0,03
Propionibacterium acnes ATCC 6919	<0,004
Bacteroides fragilis ATCC 23745	2
Neisseria gonorrhoeae ISM 68/126	32
Branhamella catarrhalis ATCC 8176	1
Haemophilus influenzáé ATCC 19418	128
UreapiasmaurealyticumL 1479	32
Escherichia coli SKF12140	>128
Proteus vulgáris ATCC 8 81	>128
Pseudomonasaeruginosa ATCC 10145	>128
Klebsiella pneumoniae L142	>128
Candida albicans SKF 2270	>128
DSPSA GE 2270 antibiotikum aktivitását in vitro	Az V. táblázat ezeknek a kísérleteknek az ered-
klinikumban izolált enterococcusokkal kapcsolat-	ményeit mutatja be.
bán végzett kísérletekkel is igazoltuk.
V. Táblázat
A GE 2270 antibiotikum aktivitása Enterococcusokkal szemben
Fajta A törzsek MIC tartomány	pg/ml MIC50	MIC90
szama
Strep.faecalis 15+ 0,03-0,25 Strep.faecium 15+ 0,06-0,5	0,06	0,25
0,006	0,13

^eértve 4 vankomicin-rezisztens törzset ideértve 5 vankomicin-rezisztens törzset

Néhány in vitro vizsgálat eredményét — a klinikumban izolált koaguláz-negatív Staphylococcusszal szemben — a VI. táblázatban mutatjuk be.

VI. Táblázat

A GE 2270 antibiotikum aktivitása koaguláz-negatív Staphylococcusokkal szemben

	MIC(pg/ml)
Staph.epidermidis L408	0,5
„L423	0,25
„L410	0,5
„L393	0,5
„L425	0,25

	MIC^g/ml)
Staph.haemolyticus L353	0,25
„L602	1
„L383	0,5
„L626	0,5
„L382	1
„L620	1
„L381	0,5

A GE 2270 antibiotikum antirnikrobiális aktivitás-spektruma anaerobokat is magában foglal, amint ezt a VH. táblázatban bemutatott in vitro kísérleti eredmények mutatják.

-8HU 203580Β

VII. Táblázat

A GE 2270 aktivitása anaerobokkal szemben

MlC(pgZml) 5

	MJC(pg/ml)
„L1563	0,03
„L1565	0,008

Bacteroides fragilis L1236 „L1237 „L1226 „L1228 „L1010

Propionibacterium acensL1014 „L1560

10 1 2

0,004

0,004 15

AP. acnes-szel szembeni aktivitást olyan in vitro kísérlettel is megerősítettük, amely 11, a klinikumban izolált törzset foglal magában. Az eredményeket az alábbiakban mutatjuk be.

A GE 2270 antibiotikum aktivitása P. acnes ellen

A törzsek száma	MIC tartomány	liptai MIC 50	MIC90
11	0,004-0,008	0,008	0,008
Baktericid aktivitás	Enterococcus faecalis-	p és 10% Cremophor	EL-t (polietoxüezett ricinus-
szál szemben		olaj) tartalmaz.

Az idő/pusztulás görbéket 100 ml-es Erlenmeyer lombikokban, 10 ml Todd-Hewitt húslevessel veszszük fel. A tenyészeteket kevertetés nélkül 37 ’C-on inkubáljuk. A beoltást az Enterococcus faecalis 30 L149 törzs logaritmikus növekedési fázisban levő tenyészetével végezzük, 1,4x10' CFU/ml csíraszámmal.

A vonatkozási antibiotikum (8 mg/1 teikoplanin) óra alatt a fertőző baktériumok 99%-át pusztítja 35 el, míg a GE 2270 antibiotikum A faktor (0,13 mg/1) órán belül a baktériumok 99,8%-át és 48 órán belül 99,99%-át öli el ebben a dózisban vagy 24 órán belül 4 mg/1 koncentrációban.

Ez az aktivitás Enterococcus faecalis-szal szem- 40 ben kiterjed olyan törzsekre is, amelyek glikopeptid antibiotikumokra rezisztensek.

Aktivitás Gardnerella vaginalis-szal szemben

G. vaginalis klinikai izolátumot vizsgáltunk 45 Casman agaron, amely 50% nyúlvért és 0,15% lizált nyúlvért (inokulum kb. ÍO’CFU) tartalmaz. A GE 2270 antibiotikum A faktor MIC értéke a 2-4 mg/1 tartományba esik; a MIC 5 (érték 2 mg/1. Az inkubálást 48 órán át végezzük 37 ’C-on anaerob gázelegy- 50 ben.

Kísérletes vérmérgezés egérben

A találmány szerinti vegyület antimikrobiális aktivitását egérben előidézett kísérletes vérmérge- 55 zés esetében is megerősítettük.

CDI egérből álló csoportokat (Charles River, átlagtömeg 18-22 g, mindkét nem) intraperitoneálisan Staph. Aureus ATCC 19636-tal fertőzünk meg. Azantibakteriális vizsgálathoz szükséges ada- 60 got (10 ^ösejt/egér) 0,5 ml, 5% bakteriológiai minőségű mucint tartalmazó oldatban (Difco) szuszpendáltuk. A vizsgálandó vegyületet intravénásán adagoljuk, egyszer, közvetlenül a fertőzést követően, sterü vizes oldatban, amely 5% dimetü-formamidot 65

Az ED5 (írtéket a 7. napon határozzuk meg az egyes dózisokhoz tartozó túlélő állatok %-os menynyisége alapján, Spearman és Kaerber módszerével (Statistical Methods in Biological Assay, 524-530, Charles Griffin and Co, Ltd. London (1952)/. Értéke 1,13 mg/kg.

Kísérleti szívbelhártyagyulladás patkányban A szívbelhártyagyulladást hímnemű CD patkányokban (Charles River) idézzük elő, amelyek tömege kb. 200 g. Az aorta-billentyűn keresztül egy polietilén katétert (PP. 25 Portex) vezetünk be a bal kamrába, a jobboldali artéria carotis-on át, és ezt kötéssel enyhén rögzítjük. A katéter megfelelő elhelyezkedését nyomásátvivővel ellátott regisztráló műszerrel (Hewlett Packard 7782A) ellenőrizzük. Két nap elteltével a patkányokat i.v. injekcióval egy S. aureus L1524 tenyészetből származó, 10⁴CFU-t tartalmazó 0,5 ml NaCl-oldattal fertőzzük meg. A kezelést 16 órával a fertőzést követően kezdjük és 5 napon át folytatjuk, a propilénglikol:Cremopher EL:5%-os glükóz 10:20:7 arányú elegyben oldott GE2270 antibiotikum A faktor i.v., 20 mg/kg dózisban naponta kétszer visszük be. A túlélő patkányokat a kezelés megkezdésétől számított 6. napon öljük le és kiemeljük az állatok szívét. A kezelés befejezését megelőzően elpusztult állatokat boncolásnak vetjük alá és szívüket kiemeljük. Az egyes szíveket lemérjük és homogenizáljuk; a homogenizátumokat sorozat-hígításnak vetjük alá és a baktériumterhelés meghatározására Todd-Hewitt agaron szélesztjük. Vérnek a teljes szív homogenizátumokban való jelenléte nem befolyásolja az eredményeket, mivel a bér baktérium-titere mindig legalább ezerszer kisebb, mint a szívé. Az adatokat statisztikusan elemezzük a Scheffe-f. többszörös összehasonlítási próbával (Scheffe, H.: The analysis of variants, John WUey and Sons, New york, 1959). A statisztikus elemzésből kizárjuk azokat az állatokat, amelyek a

-9HU 203580Β

18 fertőzést követő 40 órán belül pusztultak el. Ennek a juk be.

kísérletnek az eredményeit a következőkben mutatni GE 2270 antibiotikum A faktor aktivitása patkányok Staphylococcus-ok által kiváltott szívbelhártya gyulladásában

Fertőző ₊₊ Terápia organizmus^

Napi dózis dózis mg/kg alk.mód

A patkányok száma

LoglCFU/g szív (átlag ±SD) +++

S. aureus	—		11	9,48 ± 0,33
L1524	vivőanyag	i.v.	13	9,61 ±0,31
	GE2270 A faktor	2x20 mg/kg i.v.	12	4,89 ± 1,29⁺

pkisebb, mint 0,001 a kontrollokkal szemben (kezeletlen vagy a vivőanyaggal kezelt kontroll)

AGE 2270 antibiotikum A faktor MIC értéke a S. aureus L1524-re: 0,25 pg/ml

A szív bakteriális terhelése a kísérlet megkezdésekor: 7,36 ± 0,32 (átlag ± a lóg 1 (TFU/g szív SD értéke 5 állat esetében

Akut toxicitás

Az egerekkel végzett akut toxicitási vizsgálatok arramutatnak, hogy a GE 2270 antibiotikum Afaktor LD50értéke 100 mg/kg-nál (i.v.) magasabb és 500 mg/kg-nál (i.p.) magasabb ennek az állatfajtának az eesetében.

Tulajdonságai alapján a találmány szerinti vegyület aktív komponensként használható emberek vagy állatok kezelésére szolgáló gyógyszerek előállításához.

Pontosabban a GE 2270 antibiotikum A faktor olyan antimikrobiális anyag, amely főként Gram pozitív baktériumok és Gram pozitív és Gram negatív aeróbok ellen aktív. Úgy tűnik, hogy nagyon aktív a Staphylococcus által előidézett szívbelhártyagyulladás esetében is. Nem mutat keresztrezisztenciát a meticilinnel, valamint az aminoglikozid vagy a glikopeptid antibiotikumokkal.

A találmány szerinti antibiotikum fő terápiás indikációs területe tehát olyan fertőzések kezelése, amelyeket az antibiotikumokra érzékeny mikroorganizmusok jelenléte vált ki.

A „kezelés” kifejezést a megelőzésre, gyógyításra és kezelésre egyaránt vonatkoztatjuk.

A kezelésben különösen az embergyógyászat veendő számításba. Kezelést kaphat az erre rászoruló állat is, ideértve a főemlősöket és más emlősöket (ló, szarvasmarha, sertés, juh, baromfi és általában a háziállatok).

A találmány szerinti vegyületek önmagukban, gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyagokkal, valamint más antimikrobiális szerekkel (penicillinek, cefalosporinok, aminoglikozidok és glikopeptidek) együtt vihetők be. A kombinált terápia tehát az aktív vegyületek egymásutáni, egyidejű vagy külön-külön történő bevitelét foglalja magában, oly módon, hogy az elsőként bevitt anyag terápiás hatása még nem teljesen szűnik meg, amikor a következőt adagoljuk.

Kitüntetett az a gyógyszer-kikészítési mód, amelynek segítségével helyi alkalmazásra (sértetlen vagy sérült bőrön vagy nyálkahártyán (megfelelő készítményt állítunk elő. Ilyen készítmény ek pl. a porok, kenőcsök, krémek és rázókeverékek. Ezek30 ben a készítményekben a gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyagokat alkalmazzuk, amilyenek pl. a következő segédanyagok:

abszorbens kenőcs-alapanyagok (pl. vízmentes lanolin, hidrofil vazelin);

olajos kenőcs-alapanyagok (pl. cetil-észterek, viasz, olajsav, olívaolaj, parafin, spermaceti, keményítő-glicerit);

emulziós kenőcs-alapanyagok (pl. cetil-alkohol, gliceril-monosztearát, lanolin, sztearinsav), vízoldható kenőcs-alapanyagok (pl, glikol-éterek és származékaik, így a polietilén-glikolok, polioxi(l,2-etán-diil)-alfa-hidro-omega-hidroxi-oktade kanoát, poliszorbátok, és a polietilén-glikol-monosztearátok).

Ezek a készítmények más ismert adalékanyagokat is tartalmazhatnak, így tartósítószereket. Előállításuk a szakember számára ismert eljárásokkal történik, amelyek kézikönyvekben leírva megtalálhatók (1. pl· Remington’s Pharmaceutical Sciences,

17^tEd.,1985,MackPubl.Co.)

A találmány szerinti vegyületek a szakember számára ismert eljárásokkal (amelyek kézikönyvekben pl. az előbbiekben említett leírva találhatók) olyan készítmények alakjában is kikészíthetők, amelyek parenterális bevitelre alkalmasak.

Egy találmány szerinti vegyületet injekció alakjában a következő komponensek hozzáadásával készíthetünk ki:

- oldódást elősegítő szer, pl. propilén-glikol vagy dimetil-acetamid és

- egy felületaktív anyag, pl. polioxietilén-szorbitán-inonooleát vagy poli-etoxilezett ricinusolaj steril vízben.

Egy parenterális bevitelre szolgáló jellegzetes készítmény összetétele pl. a következő:

-10HU 203580Β mg GE 2270 antibiotikum Afaktor/ml készítmény (a végleges alakban)

10-20% felületaktív anyag, amely lehet egy polioxietilén-szorbitán-zsírsav-észter, egy polioxietilén-ricinusolaj-származék és

0-20%, előnyösen 10-20% oldódást elősegítő szer, mint propilén-glikol, dimetü-acetamid, dimetil-formamid, terc-butü-N-hidroxi-karbamát, 1,21,3- vagy 1,4-butándiol, etil-oleát, tetrahidro-furfuril-polietüén-glikol 200, dimetil-izoszorbid, benzü-alkoholstb.

Kitüntetett oldódást elősegítő szer a propilénglikol.

A polioxietüén-szorbitán-zsírsav-észterek a kereskedelemben hozzáférhetők; ezek közül egyeseket a Tween kereskedelmi néven hoznak forgalomba. Ugyancsak ismertek a „poliszorbátok” szabad néven is. Példák ezekre a poliszorbát 20,21,40,60, 61,65,80,81 és 85. A találmány szerinti vegyületek kikészítése során kitüntetetten használható a poliszorbát 80, a poli(oxi-l,2-etán-diil)-származékok közé tartozó szorbitán-mono-9-okta-dekanoát.

A polioxietílén-ricinusolajak és a polioxietÜénhidrogénezett ricinusolajak a kereskedelemben ugyancsak hozzáférhetők Egyeseket közülük a Cremophor védjeggyel hoznak forgalomba. Az üyen vegyületekre példák a következők:

- Cremophor EL (polietoxilezettricinusolaj),

- cremoppher RH 40 (polietoxüezett hidrogénezett ricinusolaj),

- Cremophor RH 60 (PEG 60 hidrogénezett ricinusolaj vagy

- Cremophor EL-719 (polioxietilezett növényi olaj).

Egy injekciós készítmény pH-ja előnyösen a 7 ± 0,5 tartományba kell, hogy essék. Szükség esetén ajánlatos lehet a pH egy megfelelő pufferrel való beállítása. Puff erek készítéséhez előnyösen a 1RIS (trihidroxi-metil-amino-metán) vagy foszfátok használhatók fel.

Egy parenterális bevitelre szolgáló készítmény kitüntetett módon a következő segédanyagokat foglalja magában: Cremophor EL (polioxi-35 ricinusolaj, USP/NF) - 20%; propilén-glikol, 5-20%, előnyösen 10-20%.

Ezeket a készítményeket általában úgy állítjuk elő, hogy az aktív komponenst a szerves oldószerben oldjuk, majd hozzáadjuk, és ezzel együtt állni hagyjuk, a felületaktív anyagot, végül steril pro inj. vízzel a kívánt térfogatra hígítjuk

Más, a szakember által ismert adalékanyagok így tartósítószerek vagy stabilizálószerek ugyancsak adagolhatok

Egy parenterális készítmény összetétele pl. a kö-

vetkező:
2270 antibiotikum A faktor	10 mg
PEG 40 ricinusolaj
(Cremophor EL)	0,2 ml
propilén-glikol	0,2 ml
metü-parahidroxi-benzoát	0,5 mg
propil-parahidroxi-benzoát	0,05 mg
víz pro inj., q.s.	lml-re

Égy másik megoldás szerint az aktív komponens liofüizált por alakjában készíthető ki és ebből az oldat a felhasználást megelőzően állítható újra elő.

Ha egy liofilizált anyagot egy olyan keverékből kiindulva állítunk elő, amely az aktív komponenst és egy felületaktív anyagot (pl. polietüén-glikol 60 hidrogénezett ricinusolaj), ezt előnyösen egyedül a vizes közeggel vihetjük újra oldatba, szerves oldószer hozzáadása nélkül.

Kívánt esetben adagolhatunk egy általánosan alkalmazott liofilizálást elősegítő anyagot, a liofilizált anyag por alakban való előállítására.

Előnyösen valamennyi említett készítményt i.v. bevitel segítségével alkalmazunk olyan fertőzések kezelésére, amelyeket egy, a találmány szerinti antibiotikumra érzékeny mikroorganizmus vált ki.

A pszeudomembrán-kolitisz vagy más olyan betegség kezelésére, amely annak tulajdonítható, hogy anaerobok vannak jelen a gyomor-bélrendszerben, a találmány szerinti vegyülelből egy hatásos dózis orálisan vihető be egy megfelelő gyógyszerkészítmény alakjában, amilyen egy kapszula, tabletta vagy egy vizes szuszpenzió.

Az aktív komponens dózisa számos tényezőtől függ, amilyen pl. a beteg típusa, kora és állapota; a specifikus aktív komponens és a bevitelre megválasztott készítmény; a bevitel ütemezése stb.

A hatékony antimikrobiális adagolás általában egység-dózis alakjában történik.

Általában előnyben részesítjük az ismételt alkalmazást (beadagolást), pl. napi 2-6 alkalommal. Egy hatékony dózis általában a 0,5-50 mg/testtömegkg/nap tartományba eshet.

Egy kitüntetett, helyileg alkalmazható készítmény egy olyan kenőcs, amely 1-10% találmány szerinti vegyületet tartalmaz.

A gyógyszert előíró orvos mindentől függetlenül képes arra, hogy az optimális adagolást egy adott beteg esetében és egy konkrét helyzetben meghatározza.

Gyógyszerként az ember- és az állat-gyógyászat területén való alkalmazás mellett a találmány szerinti vegyületek felhasználhatók az állati növekedés elősegítésére.

Ebből a célból egy találmány szerinti vegyületet orálisan, egy megfelelő takarmányban visszük be. Azt a pontos koncentrációt alkalmazzuk, amelyre szükség van ahhoz, hogy az aktív komponens a növekedést elősegítő, hatásos mennyiségben álljon rendelkezésre, normál mennyiségű takarmány elfogyasztása mellett.

A találmány szerinti vegyületnek az állati takarmányhoz való hozzáadását előnyösen úgy végezzük, hogy megfelelő takarmány-premixet készítünk, amely az aktív vegyületet hatásos mennyiségben tartalmazza és a premixet bevisszük a teljes takarmányba.

Egy másik megoldás szerint egy átmeneti koncentrátum vágj' takarmány-adalék — amely az aktív komponenst tartalmazza — keverhető hozzá a takarmányhoz Az Uyen takarmány-premixekés teljes takarmányok előállítási módját és bevitelét kézikönyvekben leírva találhatjuk meg (pl. Applied animál Nutrition, 1969, W. H. Freedman and Co., San Francisco, Amerikai Egyesült Államok; vagy „Livestock Feeds and Feeding O and B books, Corvallis, Oregon, Amerikai Egyesült Államok, 1977).

-11HU 203580Β

A rajzok rövid ismertetése

Az l.ábra a GE antibiotikum A faktor UV spektrumát mutatja be, A jelzésekés az alkalmazott oldószerek között az összefüggés a következő;

CH2DH kör 0.1NHC1

Négyzet 7,4 pH-jú foszfát puffer háromszög Ο,ΙΝΚΟΗ

A 2. ábra a GE 2270 antibiotikum A faktor IR abszorpciós spektrumát (nujol mullpólyában) mutatja be. _η

A 3. ábra a GE 2270 antibiotikum A faktor ΉNMR spektrumát mutatja be, 500 MHz-en DMSOdbban felvéve.

A 4. ábra a GE 2270 antibiotikum A faktor¹CNMR. spektrumát mutatja be, 125 MHz-en, DMSO-d 6-ban.

A következő példák részletesebben szemléltetik a találmányt. Nem kívánjuk azonban igényünket a példákra korlátozni.

1. példa

A GE 2270 antibiotikum előállítása

Planobispora rosea ATCC 53773-at zabliszt ferdeagar lemezen 2 héten át 28-30 ’C-on tenyésztünk, majd 1-1 kémcsövet 500 ml-es lombikok beoltására használunk fel, amelyek 100-100 ml, a következő összetételű inokulum-táptalajt tartalmaznak:

Keményítő 20 g/1 polipepton 5f/l élesztőkivonat 3 g/1 szarvasmarha-kivonat 2 g/1 szójaliszt 2 g/1 kalcium-karbonát 1 g/1 desztillált víz, q.s. 100 ml

Sterilizálás előtt pH 7,0-ra beállítva.

A lombikot forgó rázógépen (200 ford/perc) ínkubáljuk, 28-30 ’C-on, 92 órán át. A kapott tenyészetet ekkor egy üvegfermentor beoltására használjuk fel, amely 4 liter, az előbbi összetételű táptalajt tartalmaz, és a tenyészetet 48 órán át 28-30 ’Ck-on inkubáljuk, kevertetés közben (kb. 900 ford.T/perc) és levegőztetés mellett (kb. 1 standard liter levegő/térfogat/perc).

A kapott fermentlevet átvisszük egy fermentor-

ba, amely 501, a következő összetételű termelő táptalajt tartalmaz:
keményítő	20g/l
pepton	2,5 g/1
hidrolizált kazein	2,5 g/1
élesztőkivonat	3g/l
szarvasmarha-kivonat	2gd
szójaliszt	2g/l
kalcium-karbonát	lg/1
desztillált víz q.s.

Sterilizálás előtt pH 7,0-ra beállítva., és a tenyészetet kb. 72 órán át 28-30 ’C-on inkubáljuk

Az antibiotikum-termelést papírkorongos vizsgálattal követjük, B. subtilis ATCC 6633 alkalmazásával, minimális Davis-f. táptalajon. A gátlási zónákat egy éjjelen át 35 ’C-on végzett inkubálás után értékeljük ki.

2. példa

A GE 2270 antibiotikum kinyerése

Az előbbiek szerint előállított fermentlevet (501) elkülönítjük és szűrési segédanyag (Clarcell) jelenlétében szűrjük.

A GE 2270 antibiotikum főként a micéliumban fordul elő, bár bizonyos mennyiségben megtalálható a szűrletben is és kinyerhető ebből.

a) A szűrlet kb. pH 7,0-ra állítjuk be és 501 etilacetáttal extraháljuk A szerves fázist centrifugálással elkülönítjük, és csökkentett nyomáson kis térfogatra töményítjük be. A kapott olajos maradékot ezután petroléterrel kezeljük így kicsapjuk a nyers GE 2270 antibiotikumot, amelyet szűréssel összegyűjtünk és szárítunk 515 mg nyers GE 2270 antibiotikum komplexet kapunk.

b) A micéliumot kétszer extraháljuk 20-201 metanollal és az egyesített kivonatokat csökkentett nyomáson bepároljuk. Vizes maradékot kapunk, amelyet kétszer extrahálunk etil-acetáttal. A nyers GE 2270 antibiotikumot (6,06 g) petroléter hozzáadásával csapjuk ki a betöményített szerves fázisból.

5. példa

A GE 2270 antibiotikum tisztítása és az A faktor kinyerése

Az előbbiekben leírt eljárással a micéliumból kapott nyers anyagot (3 g) tetrahidrofuránban oldjuk és csökkentett nyomáson (0,068-0,047 mm-es szita-lyukbőségű) szilikagél jelenlétében betöményítjük. A kapott sziláid maradékot összegyűjtjük és felvisszük egy kromatográfiás oszlopra, amely 300 g (0,068-0,047 mm-es szita-lyukböségű) szilikagélt tartalmaz, metilén-kloridban. Az oszlopot először 2 1 metilén-kloriddal eluáljuk, majd egymás után .1,5-1,51 metüénklorid:metanol eleggyel, amelynek összetétele a következő: 98:2,; 96:4; 94:6; 92:8; 90:10 és 88:12 (térf/térf.).

A rakciókat összegyűjtjük, TLC-vel, HPLC-vel vagy mikrobiológiai módszerrel (B. subtilis felhasználásával) elemezzük, és a frakciókat antibiotikumtartalmuk szerint egyesítjük.

Az egyesített frakciókat, amelyek a tiszta GE 2270 antibiotikum A faktort tartalmazzák (HPLC retenciós idő 14,9 perc, 1. az előbbi e) pont szerinti fizikokémiai adatokat) csökkentett nyomáson betöményítjük. így egy olajos maradékot kapunk, amelyet tetrahidrofuránban oldunk. Ebből az oldatból petroléter hozzáadásával 600 mg GE 2270 antibiotikum A faktort csapunk ki, melynek fizikai kémiai állandói megegyeznek az előzőekben megadottakkal.

4. példa

További mennyiségű GE 2270 antibiotikum A faktort kapunk a többi frakcióból, amelyet az előbbiekben leírt kromatográfiás eljárással különítettünk el, de amelyek az antibiotikumot szennyezett alakban (HPLC) tartalmazzák. Ezeket a frakciókat is összeöntjük, betöményítjük és a fenti módon kezeljük, szilárd anyag előállítására. Ezt a nyers GE 2270 antibiotikum A faktor készítményt HPLC-vel tisztítjuk, a következő eljárás szerint:

E csapadék egy részét (6 mg (1:1) térf/térf.) ace12

-12HU 203580Β tonitril:víz elegyben oldjuk és az oldatot felvisszük egy HPLC kromatográfiás rendszerre, amely egy szüanizált szüikagél oszlopot (Lichrosorb RP 18,7 μιη, 250 x 10 mm, Merck, Darmstadt) tartalmaz.

Az eluálást egy olyan elegy lineáris gradiensével végezzük, amely 50-85% A oldatot tartalmaz B oldatban, 20 perc alatt, kb. 4 ml/perc áramlási sebesség mellett. Az A oldat acetonitril és 18 mM 6 pH-jú nátrium-foszfát puffer 70:30 (térf/térf.) elegye, míg a B oldat acetonitrü és 18 mM 6 pH-jú foszfát puffer 10:90 (térf/térf.) elegye.

Az oszlopot hozzákapcsoljuk egy 330 nm-en mérő Perkin Elmer LC 85UV detektorhoz. Összeöntjük 11 egymásutáni kromatográfiás futtatás homogén tartalmú frakcióit és az oldatokat csökkentett nyomáson betöményítjük, az acetonitrü eltávolítására. így maradék oldatokat kapunk, amelyek különböző mennyiségű GE 2270 antibiotikum A faktort tartalmaznak. Ezeket az oldatokat kétszer extraháljuk azonos térfogatú etüacetáttal és az antibiotikumot a tömény szerves fázisból petroléter hozzáadásával való kicsapással kapjuk meg. Szűréssel való kinyerés és szárítás után 27 mg GE 2270 antibiotikum A faktort kapunk, melynek fizikai kémiai állandói azonosak a fentiekben megadottakkal.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás GE 2270 antibiotikum A faktor előállítására, amely a következő jellemző tulajdonságokat mutatja be:

A) az 1. ábrán látható UV abszopciós spektrum, amely a következő abszorpciós maximumokat mutatja:

E TcnLambdamaínm) 0.1MHC1 245 (váll, 310

0.1MKOH 245 (váll) 313

7,4 pH-jú 245 (váll) 314 foszfát puffer metanol 265 244 (váll) 310

B) A 2. ábrán látható IR abszorpciós spektrum nujol pólyában, amely a következő abszorpciós maximumokat mutatja (cm y 3700-3060; 30602660 (nujol); 1650; 1590-1490; 1490-1420 (nujol); 1375 (nujol); 1310; 1245; 1210; 1165; 1090; 1060; 1020; 970; 930; 840; 810; 750; 720; 700.

E spektrumban a főbb funkcionális IR abszorpciós sávok a kővetkezőképpen minősíthetők: v, cm eredet

3600-3100 vNH.vOH

1650 Iamid(vC-O)

1545 heterociklus vC-C és vC-N

1525,1495 Hamid(öNH)

1250,1205 aromás 6CH

870 heterociklus yCH

745,700 . aromás yCH

C) A 3. ábrán látható rl-NMR spektrum a következő jel-csoportokat (ppm-ben) mutatja 500 MHz-en, DMSO-d 6-ban felvéve: (DMSO- hexadeutero-dimetü-szulfoxid), belső standardként (0,00 ppm) TMS (tetrametil-szüánt) használva. Zárójelben az egyes jelekhez tartozó protonok számát tüntetjük fel:

9,02 (1), 8,68 (1), 8,70 (1), 8,57 (1), 8,50 (1), 8,43 (1), 8,37 (1), 8,26 (1), 8,25 (1), 7,4-7,20 (9), 6,96 (2), 6,03 (1), 5,30-5,18 (3), 5,01 (1), 4,97 (2), 4,80 (1), 4,56 (1),4,30 (1), 4.26 (1). 3,98 (1). 3,81 (1), 3,79 (1), 3,38 (3), 2,72 (1), 2,58 (3), 2,48 (3), 2,16 (1), 2,13 (1), 1,96 (2), 1,88 (1), 1,34 (1VL87 (3), 0,84 (3).

D) A 4. ábrán látható ^x C-NMR spektrum a következő jel-csoportokat mutatja (ppm-ben) 125 MHz-en, DMSO-dbban, belső standardként (0,00 ppm) TMS alkalmazásával. Q jelentése kvatemer szénatom vagy C-0 csoport: 173,69, Q; 171,10, Q; 169,83, Q; 169,51, Q; 168,45, Q; 168,26, Q; 167,84, Q; 165,68, Q; 164,75, Q; 161,40, Q; 161,23, Q; 160,46, Q; 160,29, Q; 159,35, Q; 153,42, Q; 150,31, Q; 150,11, Q; 149,41, Q; 146,93, Q, 144,73, Q; 143,75, Q, 142,10, Q; 141,78, Q; 141,33, CH; 140,97, Q; 139,53, Q; 128,68, CH; 127,99, 2(CH); 127,67, Q; 127,67, CH; 126,88, CH; 126,76, 2(CH); 123,17,CH; 118,66,CH; 116,42, CH; 73,81, CH; 69,41, CH2 67,97, CH; 67,36, CH2 60,12, CH; 58,63, CH3 58,24, CH; 55,41, CH; 48,15, CH; 47,03, CH2 41,19, CH2 37,60, CH2 34,06, CH; 29,76, CH2 25,85, CH3 24,28, CH2 18,49, CH3 17,98 CH311.99, CH3

E) Retenciós idő (Rtt 14,9 perc, fordított fázisú HPLC-vel a következő körülmények között végezve a vizsgálatot:

oszlop: Ultrasphere ODS (fordított fázisú szilanizált szüikagél; 5 jxm; Altex, Beckman); 4,6 mm (belső átmérő) x 250 mm;

első-oszlop: Brownlee Labs RP 18 (oktadecil-szilán szüikagél, 5 pun);

A eluálószer: acetonitril: 18 mM—pH 7,0-ra beállított —nátrium-foszfát 70:30 (térf/térf.),

B eluálószer: acetonitrü: pH 7,0-ra beállított 18 mM nátrium-foszfát puffer 10:90 (térf/térf.),;

az eluálás módja: az A eluálószer lineáris gradiense a B eluálószerben, 45-70% között, 20 perc alatt;

áramlási sebesség: 1,8 ml/perc;

UV detektor: 254 nm;

belső standard: kloramfenikol (Rfe 3,7 perc).

F) elemanalízis- a minta előzetes, kb. 140 °C-on közömbös atomszférában való szárítása után — a következő összetevőkre mutat: C, Η, N, S.

G) 0,37 Rf érték a következő kromatográfiás rendszerben:

- diklór-metán:metanol 9:1 (térf/térf.);

- szilikagél lemezek (szüikagél 60F254Merck Co.);

- kimutatás: 254 nm-es UV fény; jód-gőz hatására sárga folt vagy bioautográfia, B. subtüis ATCC 6633 alkalmazásával, Davis-f. minimál-táptalajon,

- belső standard: kloramfenikol (Rfl),56).

H) FAB-MS elemzés: a protonált molekula ion a legkisebb tömegű izotópot m/z 2390,3 ± 1 daltonnái mutatja. 800 m/z tömeg-egység fölött minden csúcs (eltekintve az izotóp csúcsoktól) a spektrumban a molekula-ion 21%-ánál kisebb mennyiségű. Az elemzést Kratos Ms-50 kettős fókuszáló tömegspektrométerrel végezzük, a következő kísérleti körülmények között: Xe gyors atom bombázás 6 Kv mellett;

glicerin mátrix; pozitív ionizációs mód.

-13HU203580Β

I) A sósavas hidrolizátum aminosav-elemzése a következő természetes aminosavak jelenlétére mutat: glicin, L-prolin és L-szerin. A kísérleti körülmények a következők:

A mintát 105 °C-on 20 órán át 6N HCl-ben hidrolizáljuk (amely HC1 1% fenolt tartalmaz), majd két lépésben származékot képzünk, a következő módon:

a) n-propil-észter képzése a karbonsav-funkció igénybevételével, 2M HCl-lel, vízmentes propanolban (90 ’C, 1 j, majd szárítás nitrogén alatt;

b) a szabad amino-csoportok amiddá való átalakítása 1:9 (térf ./térf.) pentafluor-propionsav-anhidrid: vízmentes diklór-metán eleggyel, szobahőmérsékleten, 1 órán át, majd szárítás nitrogén atmoszférában.

Az így kapott származékot diklór-metánban oldjuk és GC-MS technikával elemezzük HP 5985B rendszer alkalmazásával, a következő körülmények között:

- oszlop: királis n-propionil-L-valin-terc-butilamid-polisziloxánnal bevont ömlesztett szilikagél kapilláris oszlop (25 m x 0,2 mm belső átmérő; C. G. C.ANALYTIC)

- hőmérsékleti program: 80 ’C 4 percen át, majd 4’C/perc

L) Ionizációs vizsgálatok

0,lN HCl-lel és 0,lN NaOH-dal metil-celloszolv/víz közegben titrálva nem mutatható ki ionizálható funkció; 0,lN HClO4-gyel való titrálással nemvizes közegben (ecetsav) egy gyenge bázisos funkció mutatható ki.

M) Fajlagos forgatás [a]²D= +140,8, absz. etanolban, kb. 5 g/1 koncentrációban, azzal jellemezve, hogy Planobispora rosea ATCC 53773 törzset vagy enek GE 2270 antibiotikum A faktort termelő mutánsát vagy variánsát süllyesztett fermentációs körülmények között tenyésztjük asszimilálható szénés nitrogén-forrás és szervetlen sók jelenlétében, a termelt antibiotikumot a tenyészetből kinyerjük és kívánt esetben valamely ismert módon tisztítjuk.
2. Eljárás antibiotikus hatású gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, az 1. igénypont szerinti eljárással előállított vegyületet gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyagokkal és adott esetben egyéb adalékanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé feldolgozzuk.