RU1838414C - Штамм бактерий РLаNовISроRа RoSea АТСС 53773 - продуцент фактора А антибиотика GE 2270, способ получени фактора А антибиотика GE 2270, фактор А антибиотика GE 2270 - Google Patents

Description

количеств противомикробных веществ. Среда , используема  дл  предварительного культивировани , может быть той же самой, что и дл  дальнейших ферментации, но могут быть также применены другие среды. Штамм, продуцирующий антибиотик GE 2270, может быть выращен при температурах между 20 и 40°С, предпочтительно между 24 и 35°С.

Во врем  ферментации получение антибиотика контролируют с помощью испытательного бульона или образцов экстракта мицели  дл  противомикробной активности , например, путем биологических проб или TLC или HPLC методик.

Организмы, чувствительные к антибиотику GE 2270, такие как Bacillus subtllls и S.aureus используют в качестве тестовых организмов. Биологическую пробу осуществл ют с помощью метода диффузии в агаре на агаровых пластинах. Максимум получени  противомикробной активности имеет место между вторым и п тым днем ферментации ..

Антибиотик GE 2270 получают культивированием штамма Planoblspora rosea АТСС 53773, продуцирующего антибиотик GE 2270, и наход т, в основном, в мицелии.

Термин антибиотик GE 2270 относитс  к комплексу антибиотика GE 2270, который выдел ют в конце процесса ферментации (см. пример 2), также как и к антибиотику GE 2270 фактор А, который  вл етс  его главным компонентом. Антибиотик активен в качестве агента, стимулирующего рост домашних животных и птиц.

Морфологические характеристики Pianobispora rosea ATCC 53773.

Pianobispora rosea ATCC 53773 растет хорошо на большинстве стандартных сред. Вегетативный мицелий образует длинные и нерегул рно разветвленные филамеиты (0,5-1,0 мкм), пронизывающие агар и образующие компактное новообразование на его поверхности. Мицелий остаетс  нефраг- ментированным, независимо от того, происходит ли рост в жидкой и/1и твердой среде. Его цвет колеблетс  от светлокораллового до красно-кораллового на большинстве испытуемых сред. Воздушный мицелий образован из длинных волнистых и тонких гифов с небольшими боковыми разветвлени ми и растет на воздухе, в основном, параллельно поверхности агара. Воздушный мицелий, когда он присутствует, имеет бело-красный цвет. Сорангии образуютс  по одиночке или группами вдоль гифов воздушного мицели  и имеют длину около 6,6-8;0 микрон и ширину 1,0-1,2 микрона. Они прии

соедин ютс  к гифу коротким спорангиеиос- цем (1,0-2,0 мкм в длину). Продольна  пара веретенообразных пр мых спор (от 3,0- 3,5x1.0 до 1.2 мкм) образуетс  в каждом спо- рангии, В споранги х споры отделены поперечной-перегородкой, После отделени  от оболочки спорангии споры станов тс  подвижными посредством perltrichous flagella.

Культуральные характеристики Pianobispora rosea АТСС 53733.

Дл  изучени  культургльных характеристик Pianobispora rosea ATCC 53733 культивируют на различных стандартных средах.

При необходимости делают цветовое определение.

Культуральные и физиологические характеристики и использование источников углерода представлены в таблицах I,II,III.

В табл. 1 даны значени , полученные после двух недель инкубировани  при 28°С.

Дл  этого теста примен ют среду № 8 и результаты оценивают после двухнедельного инкубировани  при 28-30°С.

Чувствительность к температуре. Оптимум температуры роста колеблетс  от 28°С до 37°С.

Не наблюдают роста гщи 15°С и 50°С. умеренный рост при 20°С.

Хемотаксономические характеристики. Анализ оболочки клетки:

Анализ аминокислот, присутствующих в . оболочке клетки, выполн ют по методу, описанному Becker и др. (Быстра  дифференциаци  между nocardia и Streptomyces путем бумажной хроматографии гидролизо- ванной полной клетки, Spll. Microbiol 12, 421-423, 1964).

Анализ гидролизованной полной клетки показывает присутствие мезо-диаминопи- мелиновой кислоты. .

При анализе препарата чистой оболочки клетки глицина не обнаружено.

l iЈPJHl Jl0.0Ј0JiQ§IP4.H.9Io... Анализ содержани  сахара в гидролизованной полной клетке провод т по методу Lechevalier M.P. (Идентификаци  клинически важных аэробных актиномицетов I.Lab.Cliri.Med. 71, 934-944, 1968), использу  целлюлозные листы дл  тонкослойной хроматографии, как описано Staneck S.L and G.D. Roberts (Упрощенный подход к идентификации аэробных актиномицетов путем тонкослойной хроматографии, Appi. Microbiol. 28, 226-231, 1974) со содержащей системой растворителей: этилацетат-пири- дин-вода (100:35:25 об./об.).

Полученные результаты показывают присутствие мадурозы (3-0-метил-О-галак- тоза) и отсутствие арабинозы и галактозы.

35

40

45

50

55

Идентификаци  штамма Planobispora rosea ATCC 53733.

Этот штамм относ т к роду Planobispora rosea и классифицируют как Planobispora rosQa вследствие следующих морфологических и химических характеристик:

а) Присутствие мезо- диаминопимели- новой кислоты и отсутствие глицина в оболочке клетки (оболочка клетки хемотип III)

в) присутствие мадурозы в гидролизате полной клетки (картина В полного клеточного сахара)

. с) образование на воздушном мицелии длинной и цилиндрической спорангии, содержащей пару подвижных спор

d) красный цвет вегетативного мицели 

Морфологические характеристики Planobispora rosea ATCC 53733, сообщенные оыше, не существенно отличаютс  от морфологических характеристик штамма Plariobispora rosea, который описан I.E. Thilman с сотр. о Актиномецетали The Lena Intern. Symp. on Tascon., September, 1968, ed, A. Prauser. Lena.

Он депонирован American Type Culture Collection и зарегистрирован под номером 23866. Дл  этого штамма не описано антибактериальной продукции.

Как упом нуто оыше.. антибиотик GE 2270 наход т обычно в мицелии продуцирующего штамма, хот  незначительное количество вещества наход т также в ферментационном бульоне.

Предпочтительна  методика дл  выделени  антимикробного вещества изобретени  из мицели  включает экстрагирование фильтрованного или центрифугированного мицели  органическим растворителем, смешивающимс  с водой, концентрирование экстрактов и выделение сырого антимикробного вещества осаждением, необ зательно добавлением осаждающего растворител , экстракцией водного остатка органическим растворителем, не смешива- ющимс св.одой;или адсорбционной хрома- тографией с последующим элюированием желаемого продукта из адсорбционной матрицы .

Предпочтительна  методика дл  выделени  антимикробного вещества данного изобретени  из ферментационного бульона . включает экстракцию органическим растворителем , несмешивающимс  с водой, с последующимосаждением из концентрированных экстрактов возможно добавлением осаждающего агента или дальнейшей экстракцией водного остатка их с органическим растворителем, несмешивающимс  с водой. Напротив, ферментационный бульон может контактировать с

адсорбционной матрицей с последующим элюированием пол рной элюирующей смесью. Это хроматографическа  методика может также прин тьс  к концентрирован- 5 ному экстракту, полученному из ферментационного бульона вместо самого бульона.

Примерами органических растворителей , смешивающихс  с водой, которые могут быть использованы при экстракции

0 антимикробного вещества изобретени  из мицелиевой массы,  вл ютс : низшие алка- нолы, например (Ci-Сз) алканолы, такие как метанол, этанол и пропанол, фенил (Ci-Сз) алканолы,такие как бензиновый спирт, ни5 зшие кетоны, например, (Сз-С-0 кетоны, такие как ацетон и этилметилметон, циклические эфиры, такие какдиоксан и тет- рагидрофуран, гликоли и их продукты частичной эгерифи кации, как

0 этиленгликоль, пропиленгликоль и этиленг- ликоль монометиловый эфир, низшие амиды , такие как диметилформамид и диэтилформамид.

Примерами органических растворите5 лей, месмешйвающихс  с водой, которые могут быть использованы в экстракции антимикробного вещества изобретени  из ферментационного бульона  вл ютс  обычные углеводородные растворители, которые

0 могут быть линейными, разветвленными или циклическими, такими как гексан или циклогексан, галогенированные углеводороды , такие как хлороформ, четыреххлори- стый углерод, дихлорэтан, фторбромзтан,

5 дибромэтан,трихлопропан,хлортрифторок- тан, и тому подобное: ароматические углеводороды , такие как бензол, толуол, ксилол, и тому подобное; эфиры из по крайней мере четырех атомов углерода, такие

0 как этилацетат, пропилацетат, этилбутират и тому подобное} алканолы из, по крайней мере; четырех атомов углерода, которые могут быть линейными, разветвленными или циклическими, такие как бутанол, 15 пентанол, 2-пентанол, 3-пемтанол, 1-гекса- .. нол,2-гексанол, 3-гексанол, 3,3-диметил-1-бутанол, 4-метил-1 -пентанол . З-метил-1-пентанол, 2,2-диметил-З- пснтанол, 2,4-диметил-З -пентанол,

0 4,4-диметил-2-пентанол, 5-метил-2-гексанол , 1-гептанол, :2-гептанол, 5-метил-1гексанол ,2-этил-1-гексанол,

2-метил-З-гексанол, 1-октанол, 2-октанол,

циклопентанол, 2-циклопентилэтанол, 35 циклопентил-1-пропанол, циклогексанол, циклогепта ол, циклооктанол, 2,3-диметил- циклогексанол, 4-этил-циклогексанол, цик- лооктилметанол, 6-метил-5-гептен-2-ол, 1-нонанол, 2-конанол, 1-деканол, 2-деканол и 3-деканол, линейные и разветвленные ал«сильные зфиры и смеси их, такие как петро- лейный эфир, этиловый эфир, пропиловый эфир, бутилбвый эфир и т.д.; и смеси или функциональные производные их.

Как известно в данной области техники, фазовое разделение может быть улучшено путем высаливани .

Когда примен ют экстракцию, выдел ют водную фазу, содержащую значительное количество органического растворител , при этом может быть удобно азеотропно дистиллировать воду из нее, Обычно это требует добавлени  растворител , способного образовывать минимальные азеотроп- ные смеси с водой с последующим добавлением осаждающего агента, чтобы осадить желаемый продукт, если необходимо . Характерными образцами органических растворителей, способных образовывать минимальные азеотропные смеси,  вл ютс  н-бутанол, бензол, толуол, бутиловый эфир, четыреххлористый углерод, хлороформ , циклогексан, 2,5-диметил-фуран, гек- сан и м-ксилол, предпочтительным растворителем  вл етс  н-бутанол.

Примерами осаждающих агентов  вл ютс  петролейный эфир, низшие алкильные эфиры. такие как этиловый эфир, пропиловый эфир и бутиловый эфир, и низшие алкильные кетоны, такие как ацетон,

Примерами хроматографических систем , которые могут быть обычно использованы при выделении антимикробного вещества изобретени ,  вл ютс  полистирол или смешанные смолы полистирол-ди- винилбензол, такие как Amberlite ХАД 2 или ХАД 4 (Rohm and Haas), S 112 (Dow Chemistry Co.) и Diaion HP 20 (Mitsubishi); акриловые смолы, такие как ХАД 7 или ХАД 8 (Rohm and Haas); полиамиды, такие как поликапролак- тамы, найлоны и сшитые поливинилпирро- лидоны, обычно имеющие объем пор (мл/г) в пределах между 1 и 5, площадь поверхности (м /г) в пределах между 1 и 100, кажуща с  плотность (г/мл) в пределах между 0,15 и 0,50, средний диаметр пор (ангстремы) в пределах между 300 и 300Qи распределение частиц по размеру, где по крайней мере 40 процентов частиц по размеру меньше, чем 300 микрометров, такие как Полиамид-СС 6, Полиамид - SC 6, Полиамид-СС 6,6. Полиамид-СС 6АС и Полиамид-SC 6АС (Macherey Nagel and Co., West Germany), поливинил- пирролидонова  смола PVP-CL (Aldrich Chemic. GmbH and Co., KS - West Germany), полиамидна  смола РА 400) M.WocIm AG, West Germany); и углерод.

В случае полистирольной или акриловой смолы предпочтительным элюентом   в- л етс  с месь пол рных растворителей.

растворителей смешивающихс  с водой, таких как сообщено выше; в случае полиамидной смолы элюентом  вл етс  предпочтительно водна  смесь смешиваю- щегос  с водой растворители, такого как растворитель, упом нутый выше, и то врем  как дл  углерода предпочтительным элюентом  вл етс  низший кетон, такой как ацетон или низший спирт, такой как метанол. Дальнейша  очистка неочищенного образца антибиотика GE 2270 может быть выполнена по любой их известных методик, но предпочтительно проводить посредством хроматографических методик. Также удобно может быть применена так называема  стерическа  эксклюзивна  хроматографическа  методика с хорошими результатами по очистке, В частности, сшитые декстраны с контролируемым размером пор, в которых большинство гидроксильных групп алкилировано, например, Сефадекс 1H20-(Pharmacia Fine Chemicats, Ab), обычно примен ют в этой технике.

Как обычно в этой области техники, пол- учение, также как стадии выделени  и очистки , могут контролироватьс  целым р дом аналитических методик, включа  биологические пробы, такие как пробы на бумажном диске или агарова  диффузи , на чувстви- тельные микроорганизмы или методики тонкослойной хроматографии (TLC) или HPCI, которые могут включать ультрафильтрацию или стадию микробного задержани .

Предпочтительна  методика HPLC представлена обращенно-фазовой HPLC, с . использованием колонки с пористым и сферическими частицами силинизированного силикагел , например, силикагель, функци- онализированн.ый С-18 алкильными группа- ми, имеющий одинаковый диаметр (такой как 5 микрометров Ultrasphere ODS Altex Beckman Co.) пред-колонка которой  вл етс  силикагелем, функцмонализированным С-18 алкильными группами (такой как RP 18 Brownlee Labs) и элюент которой  вл етс  линейной градиентной смесью пол рного смешивающегос  с водой растворител , таким , как один из растворителей, описанных выше, в водном буферном растворе. Пред- почтительно этот раствор довод т до р) 5- 7. Наиболее предпочтительный элюент представл ет собой линейный градиент от 45 до 70% элюентаАвэлюентеВ, в котором элюент В  вл етс  смесью ацетонитрил- 5 водный буфер, рН 5-7,10:90 и элюент А  вл етс  смесью ацетонитрил/водный буфер, рН 5-7. 70:30.

Физико-химические характеристики антибиотика GE 2270 фактор А

а) Ультрафиолетовый спектр (УФ) поглощени , который представл ет на рисунке 1 с сопутствующими по снени ми, демонстрирует следующие максимумы поглощени :

Е 1 % Л мбда

1см макс (нм) 0.1MHCI- 245 (плечо)

310 0.1МКОН- 245 (плечо)

313 Фосфатный буфер - 245 (плечо) рН7,4 314 Метанол 244 (плечо) 265 З Ю

б) инфракрасный спектр (ИК) поглощени  в нуйоловой пасте, который представлен на рисунке 2 с сопутствующими по снени ми, демонстрирует следующие максимумы поглощени  (см ): 3700-3060, 3060-2660 (нуйол); 1650; 1590-1490; 1490- 1420(нуйол); 1375 (нуйол); 1310; 1245; 1210; 1165; 1090; 1060; 1020; 970; 930; 840; 810; 750; 720 (нуйол); 700.

Главные функциональные полосы ИК поглощени  этого спектра могут быть прописаны так:

V, (см )Отнесение 3600-3100 vNH. vOH 1650 - амид l() 1545 гетероциклическ

и

1525, 1495амид II (i- NH . 1250, 1205 ароматическа  5СН 870 гетероциклическа 

YCH 745, 700ароматическа  YCH

в) 1Н-ЯМР спектр, который представлен на рисунке 3, демонстрирует следующие группы сигналов (в ппм) при 500 мгц, запи- сайные в ДМСО-de (гексадейтеродиметил- сульфоксид), использу  ТМС в качестве внутреннего стандарта (0,00 ппм); число протонов дл  каждого сигнала сообщено в круглых скобках:

9,02 (1); 8,68 (1); 8,70 (1); 8,57 (1); 8,50 (1); 8,43 (1); 8,37 (1); 8,26 (1). 8,25 (1); 7,4-7,20 (9); 6,96(2); 6,02(1); 5,30-5,18(3); 5,01(1); 4,97(2); 4,80 (1); 4,56 (1); 4,30 (1); 4.26 (1); 3.98 (1); 3,81 (1); 3,79 (1); 3,38 (3); 2,72 (1); 2,58 (3); 2,48 (3); 2,16(1); 2,13(1); 1,96(2); 1,88(1); 1,34(1). 0,87 .(3); 0.84(3);

г) С-ЯМР спектр, который представлен на Рисунке 4 с сопутствующими по снени ми , демонстрирует следующие группы сиг- налов (ппм) при 125 мгц в DMCO-de с ТМС в качестве внутреннего стандарта (0,00 ппм), О означает четвертичные углеродные атомы или С 0-группы,

5

10

Q

5

Q  

5

0 5

0

5

173,69,0; 171.10; Q; 169,83,0; 169,51,0; 168,45, О; 168,26, О; 167,84, О; 165.68, О; 164,75, О: 161,40, О; 161,23 Q; 160,46, О; 160,29, Q; 159,35, Q; 153,52. Q; 150,31, Q; 150,11, Q; 149,41, Q; 146,93 О; 144,73, О; 143,75, Q; 142,10 О; 141,78, О; 141,33, СН; 140,97, Q; 139.53, Q; 128,68. СН; 127,99, 2 fCHj, 127,67, Q; 127,67, СН; 126,88. СН; 126,76, 123,17, СН.; 118,65, СН; 116,42, СН; 73,81, СН; 69,41, СН2; 67.97, СН; 67,36, СН2; 60,12 СН; 58,63. СНз; 58.24, СН; 55,41, СН; 48,15, СН; 47,03, СН2; 41,19, СН2; 37,60, СН2; 34,06, СН; 29.76, СН2; 25,85, СНз; 24.28, СН2; 18.49, СНз; 17,98, СН3; 11,99, СНз;

д) врем  удерживани  (Rt) 14,9 мин при анализе с помощью обращенно-фазовой HPL С при следующих услови х:

колонка: Ultrasphere (обращенна  фаза силаниэированный силикагель, 5 микрометров (Altex) Beckman (4,6 мм (в.д.)х 250 Мм.

пред-колонка: Brownlee Labs RP18 (ок- тадецилсилаи силикагель, 5 микрометров), элюент А: ацетонитрил: 18 мм фосфат натри  70:30(об./об.) доведенный до рН 7,0. элюент В: ацетонитрил: 18 мм фосфат натри  10:90 (об./об.), доведен до рН 7,0

режим элюировзни : линейный градиент элюента А в элюенте В от 45%-до 70% за 20 мин

скорость потока: 1,8 мл/мин У.Ф. детектор: 254 нм внутренний стандарт: хлорамфеникол (,7 мин)

е) элементный анализ, после того, как образец предварительно высушен при около 140°С в инертной атмосфере, указывает следующий состав: углерод, водород, азот, сера,

ж) Rf значение 0,37 в следующей хрома- тографической системе:

дихлорметан:метанол 9:1 (об./об.), использу  пластины силикагел  (силикагель 60 F254, MerckCo)

визуализаци : УФ сиет при 254 нм, желтое п тно с парами иода или биоавтографи , использу  В. Subtllis ATCC 6633 -на минимальной среде Дэвиса; внутренний стандарт; хлорамфеникол (Rf 0,56)

з) FAB-MS анализ, показывающий наинизшую массу изотопа протонированного молекул рного иона при м/з 1290,3+0,1 дальтон. Все другие пики свыше 800 м/з единиц (не счита  пиков изотопов) в спектре были менее, чем 20% от молекул рного иона, на основании анализа с помощью двойного фокусирующего масс-спектрометра Kratos MS-50 при следующих экспериментальных услови х: бомбардировка быстрыми атомами Хе при б кв: глицеринева  матрица; режим положительной ионизации ,

и) аминокислотный анализ сол нокислого гидролизата, показывающий присутствие следующих природных аминокислот: глицин, (1)-пролин и (и)-серин, при следующих экспериментальных услови х;

образец гидролизуют при 105°С в течение 20 часов в присутствии 6 NHCI, содержащей 1% фенола, и затем получают производные в две стадии следующим образом:

1) образование н-пропиловых эфиров карбоновой кислоты функционализацией с 2 NHCI в безводном пропаноле (90°С, 1 час), и последующа  сушка в атмосфере азота;

2) конверси  свободных аминогрупп в амидные с пентафторпропионовым ангидридом (безводным дихлорметаном, 1/9 (об/об) при комнатной температуре в течение 1 часа с последующей сушкой в атмосфере азота,

функционализированный остаток, полученный таким образом, раствор ют в дих- лорметане и анализируют GG-MS, использу  НР5985В систему при следующих услови х:колонка: капилл рна  колонка из плавленного кварца, покрыта  хиральным.н-пропионшН-валин т-бутила- мид полисилоксаном (25 м х 0,2 мм в.д.; C.G.C. ANA LYTIC); температурна  программа 80°С в течение 4 часов, затем 4°С/мин

к) ионизационные исследовани 

никаких поддающихс  ионизации функций не определено титрованием с 0,1 NHCI и 0,1 NaOH в метилцеллозоль/вода; слабо основную функцию вы вл ют титрованием с 0,1 NHCIO4 в неводной среде (уксусна  кислота),

л) Удельное вращение

альфа о20 +140,8; абсолютный этанол, при концентрации около 5 г/л.

Антимикробна  активность соединений изобретени  может быть продемонстрирована серией стандартных тестов In vitro MIG дл  Clostridium difficile, Propionlbacterlum acnes, и Bacteroldes fragllls путем агарового разбавлени  (инокул ты 1ft4 (FU). MIC дл  других организмов определ ют разбавлением микробульона (инокула 104 до 105 CFU/мл). Инокул ты дл  Ureaplasma urealytlcum были приблизительно 104 цветовых изменений единиц/мл. Времена инкубации составл ли 18-24 часов, кроме N.gonorrhoeae Branhamella catarrhalis, M.lnfluenzae, I.difficile, P.acnes и B.fragllls (48 ч). Все организмы инкубируют при около 37°С кроме Candida alblcans (30°C). N. gonorrhoeae и M.lnfluenzae инкубируют в 5%, С02 атмосфере, анеэробируют в смеси анаэробных газов. Использованные среды: Sso. Sensltest бульон (ОХо Id) (Staphylococcl, Streptococcus faecalis, Streptococcus faeclum Escherlchla coll, Pseudomonas

aerugtnosa. Proteus fulgares, Klebsiella pneumonia }; Todd. Hewltt бульон (Difco) (другие стрептококки); GC основани  бульон (Difco) +1 % Sso fitalex BBL (N. gonorrhocal); бульон из насто  мозгов и сердца (Difco)

+1% добавка С (Difco) (M.influenzae), Mueller. Hlnton бульон (BBL) (Branhamella catarrhalis); AC среда (Difco); (C.pevfringens); Wilklns. Chalgren агар (Oxold) (другие анаэробы) Evans and Taylor

Robinson бульон (Difco), с добавками, дл  U.urealytlcum; дрожжевой азотный бульон (Difco) (Candida alficans).

Минимальные ингибиторные концентрации (MIG, микрограмм/мл) дл  некоторых

микроорганизмов сообщены ниже в табл. 4.

Активность антибиотика ОБ 2270 также подтверждаетс  в экспериментах in vitro no отношению к клиническим изол там enterococci.

В табл. 5 сообщаютс  результаты этих экспериментов.

Результаты, относ щиес  к некоторым In vitro тестам по отношению к клинически- изолированным коагулазо-негативным Spaphylococci сообщены ниже в табл. 6.

Противомикробный спектр активности антибиотика GE 2270 включает также анаэробы , как показано согласно результатам in v tro эксперимента, сообщенным в табл. 7 ниже.

Активность по отношению к P. acnes подтверждают в in vitro эксперименте, включающем II клинических-изолированных штаммов, результаты которого приведены в табл.8.,„ . Бактерицидна  активность по отношению к Enterococcus faecalis.

Кривые врем -гибель получают в 10 мл Todd-He Witt бульона в 100 мл скл нках Эрлеймейера, выдержанных при 37°С без перемешивани . Логарифмически растущую культуру Enterococcus faecalis штамма 1 149 инокулируют при 1,4хЮ7 CFU/мл. Указанный антибиотик/тейхопланин, 8. мг/л убивает 99% инфицирующих бактерий за 48 часов; в то врем  как антибиотик GE 2270 фактор А/О,12 мл/л) убивает 99,8% бактерий за 2 часа и 99,99% за 48 часов при этой дозе или за 24 часа при 4 мг/л.

Эта активность по отношению к Enterococcus faecalis распростран етс  также на штаммы, которые резистентны к гликопептидным антибиотикам.

Активность по отношению к Gardnerella vaglnalls 13 клинических изол тов vaglnalls испытывают на Gasman агаре с 5% кроличьей крови и 0.15% лизированной крови кролика (инокул т приблизительно 104 CPU). MIC антибиотика GE 2270 фактора А была в области 2-4 мг/л, MICso 2 мг/л. Инкубацию провод т в течение 48 часов при 37-С в анаэробной газовой смеси.

Эксперимент л ы г1 ис /1ышей.

Противомикробна  активность соединений изобретени  подтверждаетс  также в экспериментальном ее сепсисе у мышей.

Группы из 8 мышей CDI обоих полов (Charles River, средний вес 18-22 г)инфици- руют внутрибрюшинно Staphybcoccus aureus ATCC 19636. Бактерицидное введение веществ 10 клеток/мышь) осуществл ют в виде суспензии в 0,5 мл 5% микробиологического муцина (Difco). Тесто- вое соединение примен ют внутривенно один раз немедленно после инфекции в стерильном водном растворе, содержащем 5% диметилформамида и 10% CremophorR EL) полиэтоксилиробанное касторовое масло).

EDso рассчитывают на седьмой день от процента оставшихс  в живых животных при каждой дозе по методу Spearman and Raerber ее значение составл ет 1,13 мг/кг.

Экспериментальный эндокардит у крыс

андокардйт БьГ/Гвызван у особей мужского пола CD крыс (Charles ),вес щих около 200 г. Полиэтиленовый катетер (PP.25 Partex) ввод т через клапан аорты в левый желудочек через правую сонную артерию и закрепл ют шелковой лигатурой. Правильное положение катетера контролируют, использу  усилитель записи (Hewlett Packard модель 7782А) с датчиком давлени . Через два дн  крыс инфицируют путем инъекции 0,5 мл раствора соли, содержащего ЮА CFU aures 1 1524. Лечение провод т в течение 5 дней, начина  с 16 час. После инфицирова- ни . Антибиотик GE 2270 фактор А, солюби- лизированный в пропиленгликоле: CremophorEI:5% глюкоза -(10:20:70, ввод т I, v. 20 мг/кг дважды в день. Оставшихс  в живых крыс убивают на шестой день после лечени  и их сердца удал ют. Каждое животное , умершее до конца терапии, вскрывают и его сердце удал ют. Каждое сердце взвешивают и гомогенизируют, гомогенаты по- следовательно разбавл ют и помещают на Todd-Hewitt агар, чтобы определить бактериальную нагрузку. Присутствие крови в полных сердечных гомогенатах не вли ет на результаты, так как бактериальные титры в крови были всегда, по крайней мере, в 1000 раз ниже, чем сердечные нагрузки. Данные статистически проанализируют посредством Scheffe s сложного сравнительного теста . Тех крыс, которые умерли в течение 40 часов после заражени , исключают из статистического анализа. Результаты этого эксперимента привод тс  в табл. 9.

Остра  токсичность.

Тесты на острую токсичность, выполненные на мышах, показывают, что LDso дл  антибиотика GE 2270 фактор А выше, чем 100 мг/кг i.v. и выше, чем 500 мг/кг l.p. y того же вида животных.

Ввиду его свойств, соединение изобретени  может быть использовано как активный ингредиент при приготовлении лекарственных препаратов дл  лечени  человека или животного.

В частности, антибиотик GE 2270 фактор А  вл етс  противомикробным агентом, главным образом, активным по отношению к грамположительным бактери м и грамо- положительным также как и грамотрица- тельным анаэробам. По-видимому, он также  вл етс  очень активным в стафилококковом эндокардите без какой-либо кросс-ре- зистентности с метисиллинсм, аминогликозидами или гликопептидными антибиотиками. .

Главное терапевтическое показание антибактериального вещества изобретени  заключаетс  таким образом в лечении инфекций , относ щихс  к присутствию микроорганизма , чувствительного к нему.

Как полагают, термин лечение включает в себ  также профилактику, терапию и лечение.

Пациент, получающий этот курс лечени ,  вл етс  любым нуждающимс  в нем животным, включа  приматов, в частности, людей, и других млекопитающих, таких как лошади, крупный рогатый скот, свинь  и овца , домашн   птица и домашние животные вообще.

Соединение изобретени  может примен тьс  как таковое или как добавка с фармацевтически приемлемыми носител ми и может также примен тьс  в соединении с другими противомикробными агентами, такие как пенициллины,цефалоспорины,ами- ногликозиды и гликопептиды. Объединенна  терапи , таким образом, включает последовательное, одновременное и раздельное введение активного соединени  путем, при котором терапевтические эффекты от первого приема еще полностью не исчезают.

На фиг. Т представлен УФ спектр антибиотика GE 2270 фактор А/Соответствие между символами примененными растворител ми  вл етс  следующим:

-- относитс  к образцу в СНзОН

О относитс  к образцу в 0,1 NHCI в относитс  к образцу о фосфатном буфере рН 7,4

относитс  к образцу в 0,1 N КОН На фиг. 2 представлен ИК-спектр поглощени  антибиотика GE 2270 фактор А в нуй- оловой пасте.

На фиг. 3 представлен Н-ЯМР антибиотика GE 2270 фактор А, измеренный при 500 мгц в DMCO-de

На фиг. 4 представлен С-ЯМР антибиотика GE 2270 фактор А при 125 мгц в DMCO-de

П р и м е р 1. Получение антибиотика GE 2270.

Культуру Planoblspora rosea ATCC 53773 выращивают на агаровой питательной среде из овс ной муки в течение двух недель при 28-30°С и затем используют дл  инокул ции 500 мл скл нки, содержащие 100 мл засевной среды следующего состава;

Крахмал20 г/л Полипептон 5 г/л Дрожжевой экстракт 3 г/л М сной экстракт 2 г/л Соева  мука 2 г/л Карбонат кальци  1 г/л Дистиллированна  ,. вода g.S 100мл (доведенна  до рН 7,0 перед стерилизацией ).

Скл нку инкубируют на роторном встр - хивателе (200 об./мин) при 28-30°С в течение 92 часов. Полученную культуру затем используют дл  инокул ции в контейнерном ферментаторе, содержащем 4 литра той же самой среды и культуру инкубируют при 28- 30°С в течение 48 часов при перемешивании (около 900 об/мин) и аэрации (около одного стандартного литра воздуха на объем на Минуту ).

Полученный бульон перенос т в фер- ментатор, содержащий 50 л следующей продуцирующей среды:

Крахмал 20 г/л Пептон 2,5 г/л Гидролизованный казеин 2,5 г/л Дрожжевой экстракт 3 г/л М сной экстракт , 2 г/л Соева  мука 2 г/л Карбонат кальци  1 г/л Дистиллированна  вода g.s. (доведенна  до рН 7,0 перед стерилизацией ) и инкубируют в течение около 72 часор при28-30°С.

Противомикробную продукцию контролируют с помощью испытани  агаровой пробы на бумажном диске, использу  B.subtilis ATCC 6633, выращенном на минимальной среде Davis. Зоны ингибировани  оценивают после инкубировани  в течение ночи при 35°С.

П р и м е р 2. Выделение антибиотика GE2270,

Ферментированную массу (50 л), полученную выше, собирают и подвергают фильтрации в присутствии фильтрующего средства (Clarcell).

Антибиотик GE 2270 находитс , глав- 5 ным образом, в мицелии, даже если некоторое количество его может быть выделено также из фильтратов,

а) Фильтрат довод т до около рН 7,0 и экстрагируют этилацетатом (50 л). Органи- 0 ческую фазу отдел ют центрифугированием и концентрируют до небольшого объема при пониженном давлении. Полученный масл нистый остаток затем обрабатывают петролейным эфиром, чтобы осадить неочи- 5 щенкый антибиотик GE 2270, который собирают путем фильтрации и сушат. 415 мг неочищенного комплекса антибиотика GE 2270 получают.

в) Мицелий экстрагируют дважды 20 л 0 метанола и объединенные экстракты концентрируют при пониженном давлении, получа  водный остаток, который дважды экстрагируют этилацетатом. Неочищенный антибиотик G Е 2270 (606 г) осаждают добав- 5 лением петролейного эфира из концентрированной органической фазы.

П р и м е р 3. Очистка антибиотика GE 2270 фактор А.

Сырец, полученный из.мицели  соглас- 0 но методике, описанной выше (Зг), раствор ют в-тетрагидрофуране и концентрируют при пониженном давлении в присутствии силикагел  (230-400 меш). Полученный твердый остаток собирают и нанос т на хро- 5 матографическую колонку, содержащую 300 г силикагел  (230-400 меш), приготовленного в метиленхлориде (CH2CI2). Колонку про вл ют сначала метиленхлоридом (2 л) и затем последовательно 1,5 л смесей мети- 0 ленхлорида и метанола в следующих соотношени х; 98,2, 96/4, 94/6, 92/8, 90/10 .и 88/12 (об./об.).

фракции собирают, анализируют методами TLC, HPLC или микробиологически по 5 отношению к B.subtilis объедин ют согласно содержанию в них антибиотика.

Объединенные фракции, содержащие чистый антибиотик GE 2270 фактор A (HPLC врем  удерживани  14,9 мин.см. Физико- химические данные, пункт Е, выше) концентрируют при пониженном давлении, получа  масл нистый остаток, который солюби- лизируют тетрагидрофураном. Из этого раствора антибиотик GE 2270 фактор А (600 Mr) осаждают путем добавлени  петролей- його эфира.

П р и м е р 4. Другой урожай антибиотика GE 2270 фактор А получают из других фракций, выделенных с помощью выше описанной хроматаграфической системы, но которые содержат его в неочищенной форме (HPLC). Также эти фракции объедин ют, Концентрируют и обрабатывают, чтобы получить твердое вещество, как описано выше. Этот .неочищенный препарат антибиотика СЕ 2270 фактор А очищают методом HPLC согласно следующей методике:

Часть этого осадка (6 мг) раствор ют в смеси ацетонитрил: вода, 1:1 (об./об.) и ввод т в HPLC хроматографическую систему, Снабженную колонкой с силанизированным силикагелем (Lichrosorb RP 18,7 микрометров , 250x10 мм., Merck Darmstadt.

Провод т элюирование смесью раствора А и В с линейным градиентом концентраций от 50% до 85% А и В, в течение 20 мин при скорости потока около 4 мл в мин, Раствор А представл ет собой смесь ацетонит- рила и 18 мм буфера фосфата натри  70/30 {об./об.), доведенную до рН 6, ото врем  как раствор В представл ет собой смесь ацето- нитрилз и 18 мм фосфатного буфера, 10/90 (об./об.), доверенную до рН G.

Колонку присоедин ют к Perkin Elmer LC 85 УФ детектор при 330 нм. Фракции I последовательных хроматографических опытов, имеющие однородное содержание, объедин ют и концентрируют при пониженном давлении, чтобы удалить ацетонитрил, получал, таким образом, выделенные остаточные растворы, содержащие антибиотик GE 2270 фактор А. Эти растворы экстрагируют дважды равным объемом этилацетата м противомикробный продукт получают осаждением из концентрированной органической фазы путем добавлени  петролейного эфира. После выделени  фильтрацией и высушивани  получают 27 мг антибиотика GE 2270 фактор А.

Формула.изобретени 

1. Штамм бактерий Pianobispora rosea АТСС 53773 - продуцент фактора А антибиотика GE 2270.

2. Способ получени  фактора А антибиотика GE 2270, заключающийс  в том, что культивируют штамм бактерий Pianobispora rosea ATCC 53773 в услови х глубинного погружени  и аэрации в присутствии усваиваемых источников углерода, азота и минеральных солей при 24 - 35°С до оптимального накоплени  целевого продукта с последующим его выделением путем экстракции мицели  и фильтрата культуральноп жидкости .

3. Фактор А антибиотика GE 2270, имеющий следующие характеристики: а) ультрафиолетовый спектр поглощени , который демонстрирует следующий максимум.погло0 щенм :

1%

5

Е1с 0,1 М НС

0,.1 М КОН

Фосфатный буфер рН7,4

/Uiatcc, им

245 (плечо)

310

245 (плечо)

313

Метанол

245 (ппбчгй 314 244 (плзчп) 265 310

б) инфракрасный спектр поглощени  п

иуйолоаой посте, который демонстрирует

следующие максимумы поглощени ., ():

3700-3060, 3060-2650 (нупол): 16130, 1ПУП1490 , 1490-1420 (нуйол); 1375 (нуйсл): 13 10,

1245, 1210; 1165; 1090; 10GO; 1020; 970: 930;

840; 810:750; 720 (пупол); 700;

Главные функциональные полосы поглощени  этого спектра могут бить отнесены как:

V, см Отнесение 3600-3100 Nil, ЮН 1650 амид l(vOO) 1545 гетероциклическа 

vOC и vON 1525, 1495амид I (5NH)

1250, 1205

870

ароматическа  ОСИ гетероциклическа  YCH 745,700ароматическа  YCH

в) Н-ЛМР спектр, который демонстрирует следующие группы смгналоп (в ррт) при 500 мГЧ-;, записанные в DMCQ-de (гексэ- дейтеродиметилсульфо.ксид). использу - ТМС в качестве внутреннего стандарта (0,00 ррт); число протонов дл  каждого сигнала дано в круглых скобках:

9,02 (1); 0,68 (1); 8,70 (1); 8,57 (1); 8,50 (1);

8,43 (1); 8,37 (1); 8,26 (); 8,25 (1); 7,4-7,20 (9);

6,96 (2), 6,02 (1); 6,30-6,18 (3); 5,10(1): 4,97(2);

4,80(1); 4,56(1); 4,30(П: 4,26 (I); 3,98(1): 3,01

(1); 3.79 (1); 3,38 (3); 2.72 (1); 2,50 (3): 2.48 СП;

2,16(1); 2,13(1); 1.98(2); 1,88(1); 1.34(1);ОД)7

(3); 0,84(3):

г) С-МР спектр, демонстрирующий следующие группы сигналов (ррт) при 125 мГц в DMCO-decTMC n качестве внутреннего стандарта (0,00 ppm), Q - четвертичные углеродные атомы или -группы:

173,69, Q; 171,10. Q; 169,830; 169,51, Q; 168,45, Q; 168,26 Q; 167,84, Q; 165,68, Q; 164,75, Q; 161,40, Q; 161.23. Q; 160,46, Q; 160,29, Q; 159,35, Q; 153,42, Q; 150,31. Q: 150,11, Q; 149,41, Q; 146,93, Q; 144,73, Q; 143,75, Q; 142,10, Q; 141,78. Q; 141,33, CH; 140,97, Q; 139,53, Q; 128.68. CH; 127,99, 2 rCHj; 127,67, Q; 127,67, CH; 126,88, CH; 126,76, С CCHJ; 123,17, CH; 118,66, CH: 116,42, CH; 73,81, CH; 69,41, CH2; 67,97, CH; 67,36. CH2; 60,12, CH; 58,63, СНз; 58,24, CH; 55,41, CH; 48.15 CH; 47.03, CH2; 41,19, CH2; 37,60, CH2:34,06, CH; 29,76, CH2; 25,85, CH3; 24,28, CH2; 18,49, CH3; 17,98, СНз; 11,99, СНз;

д) врем  удерживани  (Rt) 14,9 мин при анализе с помощью обращенно-фазовой HPL С при следующих услови х: колонка: Uitrasphere PDS (обращенна  фаза силани- зированный силикагель; 5 микрометров) Altex (Beckman) 4,6 мм (в.д) х 250 мм;

предколонка: Brownlee Labs RP 18 (ок- тадесилсилан силикагель; 5 микрометров);

элюент А: ацетонитрил: 18 ммоль фос- фат натри  70:30 (об./об.), доведенный до рН 7,0

элюент В: ацетонитрил: 18 ммоль фосфат натри  10:90 (об./об.), доведенный до рН 7,0;

режим элюировани : линейный градиент элюента А в элюенте В от 45 до 70% за 20 мин;

скорость потока: 1,8 мл/мин;

УФ-детектор: 254 нм;

внутренний стандарт: Хлорамфеникол (Rt 3,7 мин.)

е) элементный анализ, после того, как

образец предварительно высушен при

140°С а инертной атмосфере, указывают

следующий состав: углерод, водород, азот,

сера;

ж) Rt - 0,37 в хроматографи.ческой системе: дихлорметан: метанол, 9:1 (об./об.), использу  пластины силикагел  (силикагель 60F254, Merck Co.); Визуализаци ; УФ-свет при 254 нм, желтое п тно с парами иода или биоавтографи , использу  B.subtills ATCC 6633 на минимальной среде Дэвиса: внут- . ренний стандарт: хлорамфеникол (Rf 0,56);

з) FAB-MS анализ, показывающий наинизшую массу изотопа протонированного молекул рного иона при м/з (1290,3+0,1) дальтон, все другие пики свыше 800 м/з

единиц (не счита  пиков изотопа) в спектре были менеечем 20% от молекул рного иона, на основании анализа с помощью двойного фокусирующего масс-спектрометра Kratos MS-50 при следующих экспериментальных

услови х; бомбардировка быстрыми атомами Хе при 6 кВ; глицеринова  матрица; режим положительной ионизации;

и) аминокислотный анализ сол нокис- лотного гидролизата, пбказывающий присутствие следующих- природных аминокислот: глицин (1 }-пролин и (1)-серин, при следующих экспериментальных услови х: образец гидролизуют при 105°С в течение 20 ч в присутствии 6N HCI, содержащей

1% фенола, и затем получают производные в две стадии следующим образом: образование н-пропиловых эфиров карбоновой кислоты обработкой 2 н. HCI в безводном пропаноле(90°С, 1 ч), и последующа  сушка

в атмосфере азота; конверси  свободных аминогрупп в амидные с пентафторпропио- новым ангидридом (безводным дихлормета- ном, 1/9 (о б./о б.) при комнатной температуре в течение 1 ч с последующей

сушкой в атмосфере азота; функционэлизи- рованный остаток,.полученный таким образом , раствор ют в дихлорметане и анализируют CG-MS, использу  НР5985В систему при следующих услови х: колонка:

капилллрна   колонка из плавленного кварца , покрыта  хиральным н-пропионил-Ь-ва- лин т-бутиламид полисилоксаном (25 м х 0,2 мм в.д.; C.G.C. ANAL YTIC); температурна  программа 80°С в течение 4 ч, затем

4°С/мин

к) ионизационные исследовани ; никакие ионизируемые функций не определ ют титрованием с 0,1 н. HCI и 0,1 и. NaOH в смеси метилцешюзольв/вода; слабоосновную функцию вы вл ют титрованием 0,1 NaHCICM в неводной среде (уксусна  кислота);

л) удельное вращение;

альфа о20 +140,8°С; абсолютный эта- нол, при концентрации около 5 г/л.

Таблица 1

Культуральные характеристики штамма Planoblspora rosea ATCC 53773

Питательные среды

Овс ный агар 6%

ISP 2 (дрожжевой

кстракт, солодовый

агар)

ISP3

/ISP4

P 5 (глицерин, аспа- рагин, агар)

SP б (пептон, дрожевой экстракт железо , агар) SP 7 (тирозин, агар)

Hichey и Fresner s агар

zapek, глюкоза, агар

люкоза, аспарагино- вый агар

Усиленный рост с однородной поверхностью , кораллово-красный (2-Н-10), обильна  продукци  светлокрасного воздушного мицели  (1-А-9).

Усиленный рост с морщинистой поверхностью (2-Е-9), след светлого воздушного мицели 

Умеренный рост с однородной поверхностью, светлокрасный (2-Е-8), след красновато-белого воздушного мицели  Умеренный рост с однородной поверхностью , кораллово-красный (2-Е-10) Умеренный рост с однородной и плоской поверхностью, свет окрасный (2-А-9), обильна  продукци  белого воздушного мицели  Умеренный рост, слегка сморщенный, светлокоралловый (I-A-10)

Умеренный рост с однородной и тонкой поверхностью , светлокрасный (1-А-9), обильное образование светло-красного (I-C-9)

воздушного мицели 

Усиленный рост с толстой и морщинистой поверхностью свет окораллокрасный (I-A- 10), умеренна  продукци  светлокрасного

воздушного мицели 

Очень скудный рост с однородной и поверхностью, умеренна  продукци  светлокрасного воздушного мицели  Умеренный рост с однородной и тонкой поверхностью, бесцветный, воздушный ми- целий отсутствует.

Морфологические характеристики

Питательный агар

Benett s агар алат кальци , агар

безжиренное молоко , агар

Яичный альбумин, агар

екстроза, триптоза,

агар Картофельный агар

Хороший рост с однородной поверхностью, светлооранжепый с краснвоатой окраской

(9-А-7)

Умеренный рост со слабо сморщенной поверхностью , светложелтый-красный (10-А-6) Бедный рост с однородной и плоской поверхностью , бесцветный Умеренный рост с однородной поверхностью, кораллово-красный (2-Г-9) Бедный рост с однородной и тонкой поверхностью , бесцветный до светло-красного

(2-А-8) Нет роста

Хороший рост с однородной поверхностью,

светлооранжевый с красноватой окраской

(9-А-7)

Примечание. Буква и числа относ тс  к цвету, определенному согласно MaerzА. и PaulM. Ren, 1950. ADlctionaryof Color, 2-nd Edition Me Graw-HIII Book Company Inc. New York.

Таблица.2 Физиологические характеристики Planobispora rosea ATCC 53733

Тесты

Гидролиз крахмала Образование сульфидов водорода б Тирозинова  реакци 

Гидролиз казеина

Переваривание малата кальци 

Разжижение желатина

Коагул ци  молока

Пептонизаци  молока

Восстановление нитрата

Утилизаци  карбогидрата

Продолжение табл. 1

Результаты

положительный отрицательный

положительный слабо положительный

отрицательный слабо положительный отрицательный отрицательный положительный

Таблица 3

Фруктоза

Галактоза

Глюкоза

Рамноза

Лактоза

Цукроза

Мальтоза

Рафиноза

Целлюлоза

Маннит

Салицин

Инозит

Целлобиоза

Примечание: + - умеренный рост +/- - редкий рост - нет роста

Штамм

Staph. aureus Tour L 165

Staph. aureus Tour L 165(106 мл)

taph. aureus Tour L 165 + 30% бычьей сыворотки

Staph. epidermidls L147 ATCC 12228

Staph. haemolytlcus L 602 Staph. haemolyticus L 602 (106 мл)

Strep, pyogenes C203 Strep, pneumonlae UC41 Strep, faecalis ATCC 7080

Strep, mitis L 796 Clostrldium perfringens TSS 30543 с

Clostridium difficile ATCC 9689

Propionibacterium acnes ATCC 6919

Bacteroides fragilis ATCC 23745

Heisseria gonorrholae Is 68/126

Branhamella catarrhalls ATCC 8176

Haemophilus influenzae ATCC 19418

Ureaplasma urealyticum L 1479

Escherichia coli SRF 12140

Proteus vulgaris ATCC 881

Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145

Rleblella pneumonlae L 142

Candida albicans SRF 2270

Продолжение табл. 3

+/+

+

Таблица 4

M.I.C. (микрограмм/мл)

Антибиотик GE 2270 Фактор А

.0,25 0.25 0,25 0.13 0,51

0,25 0.13 0.13 0.13 0.03 0,03

0.004

2

32 1

128

32

128 128 128 128 128

Таблица 5 . Активность антибиотика GE 2270 по отношению к энтерококкам

Т а б леи ц а 6

Активность антибиотика GE 2270 по отношению к коагулазо-негативным

Staphylococci

Активность GE 2270 по отношению к анаэробам

Таблица 7

,Та бл и ц а 8 Активность антибиотика GE 2270 по отношению к P. aches

Активность антибиотика GE 2270 фактор А в стаффилококко- эндокардите у крыс

Хр 0,001 в сравнение с контрольными (лечеными или неле чеными с наполнителем)

) Бактериальна  нагрузка на сердце в начале терапии 7, (значение +SD log 10 /g сердце дл  5 животных)

MIC антибиотика GE 2270 фактор А дл  S. aureus L 1524 0,25 микрограмм/мл.

80604020

фиг.I

Таблица 9

- сн он

0.1N IIC1

phosphate buffer pll 7.4 0.1 Ы КОИ

4000

30002500 2000 18OO 1600 MOO

. Фиг. 2

lOCfo 80O60O

а ,

s

IV

f-Г

fiscal

ч

- а 1

-35

з

Js

ИЗ

3

-ъЗ