JPH0670078B2 - ポリペプチド抗生物質 - Google Patents

ポリペプチド抗生物質

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JPH0670078B2
JPH0670078B2 JP60247876A JP24787685A JPH0670078B2 JP H0670078 B2 JPH0670078 B2 JP H0670078B2 JP 60247876 A JP60247876 A JP 60247876A JP 24787685 A JP24787685 A JP 24787685A JP H0670078 B2 JPH0670078 B2 JP H0670078B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、抗生物質活性を有するポリペプチド（以下、
エピデルミンという）、この物質に抵抗性を示すスタフ
イロコツカス・エピデルミデイス(staphylococcus epid
ermidis)の新株を用いるその製造方法、この活性物質エ
ピデルミンを含有する抗生物質製剤、および感染疾患の
治療のためのこの活性物質の利用に関する。
スタフイロコツカス・エピデルミデイスの特定の株、す
なわちスタフイロコツカス・エピデルミデイスNCIB1153
6〔ナシヨナル・コレクシヨン・オブ・インダストリア
ル・バクテリア(National Collection of Industrial B
acteria)アバデイーン(Aberdeen)に寄託〕がグラム陽性
病原菌に対して広範な活性を有し、細菌細胞を溶解する
低分子量抗生物質ポリペプチドを産生することは、EP-A
-0,027,710号によつて知られている。
また、スタフイロコツカス・エピデルミデイスMF205
〔テイラー(S.M.Taylor)ほか：インターナシヨナル・ジ
ヤーナル・マス・スペクトロメトリー・アンド・イオン
・フイジクス(Int.J.Mass Spectrom.Ion Physics)、48
巻、161〜164、1983〕がグラム陽性菌に対して有効なオ
リゴペプチドを産生することも知られている。しかし、
この報告からは、この菌株が上述の株NCIB11536と同一
かどうかについては明らかでない。
本発明は、1984年10月26日に、ジヤーマン・コレクシヨ
ン・オブ・マイクロオーガニズムズ(German Collection
of Microorganisms)にDSM3095の番号で寄託され、上述
のNCIB 11536株と類縁のスタフイロコツカス・エピデル
ミデイスの抵抗性変異株が、改良製造方法および後処理
方法によれば、とくにグラム陽性菌に対して抗生物質作
用を有する類似のポリペプチド、エピデルミンを産生す
ること、またエピデルミンをスタフイロコツカス・エピ
デルミデイスNCIB11536およびMF205の産生物と比較する
と、とくにアミノ酸組成においてかなりの差を示すこと
を発見したことに基づくものである。
6N塩酸を用い（18時間、110℃）、エピデルミンを完全
加水分解したのち、イオン交換クロマトグラフイーによ
りアミノ酸の定量分析を行うと〔ビオトロニツク(Biotr
onik)LC6000E型装置を用い標準プログラムによる〕以下
のα‐アミノ酸組成が得られた。
Asp(1.00),Pro(0.95),Gly(2.09),Ala(2.03),Ile(2.03),
Tyr(0.30),Phe(2.02)、Lys(2.00)（第１図参照）。チオ
グリコール酸の添加により、完全加水分解物中のチロシ
ン含量は、ほぼ化学量論値の0.93に上昇する。
タンパク質アミノ酸のコンフイギユレーシヨンは、完全
加水分解物からペンタフルオロプロピオニルアミノ酸の
n-プロピルエステルのガスクロマトグラフイーによつて
決定した。分離はキラル固定相としてL-バリン‐tert-
ブチルアミド‐ポリシロキサン(Chirasil-Val)を用いて
行つた。コンフイギユレーシヨン既知のアミノ酸の試験
化合物と比較して、上記構成はL-コンフイギユレーシヨ
ンを有するものとして分類された（第２図参照）。
これらのタンパク質アミノ酸に加えて、以下の非タンパ
ク質アミノ酸が存在する：ランチオニン(２)、β‐メチ
ルランチオニン(１)およびα，β‐デヒドロアミノ酪酸
(１)。ランチオニンはメソコンフイギユレーシヨンを有
するが、β‐メチルランチオニンは2S,3S,6Rコンフイギ
ユレーシヨンを有する。エピデルミンはさらに、S-（2-
アミノビニル）‐D-システイン成分を含有する。
新規化合物、エピデルミンは、以下の特徴を有する。
（ｉ）外観；無色粉末 （ii）溶解性；水／氷酢酸またはメタノール／氷酢酸の
混合物にきわめて易溶、低級アルコールに可溶、クロロ
ホルム、アセトン、ジエチルエーテル、石油エーテルに
不溶 （iii）シリカゲル板上の発色反応：ニンヒドリン、塩
素/TDM〔TDM＝4,4′‐ビス‐（ジメチルアミノ）ジフエ
ニルメタン〕、オルシン／硫酸、アニスアルデヒド／硫
酸。紫外光254nmにおける水噴霧での非分解検出 （iv）薄層クロマトグラフイー〔既製のシリカゲル板60
F254（メルク）を使用〕、システムA;クロロホルム／メ
タノール/17％アンモニア(2/2/1)、RF＝0.73、システム
B;クロロホルム／メタノール/17％アンモニア(70/35/1
0)RF＝0.30、システムC;n-ブタノール／氷酢酸／水(4/1
/1)、RF＝0.05 （ｖ）HPLC;第７図参照 （vi）安定性;pH2〜７において安定。ただしそれ以上高
いpHでは活性の急激な低下が起こる （vii）分子量;2160付近（陰イオンなしで） （viii）紫外部吸収スペクトル；水溶液、267nmに長波
長側極大（第３図） （ix）赤外部吸収スペクトル；サンプルの臭化カリウム
錠のIRスペクトル（第４図） （ｘ）核磁器共鳴スペクトル；1H-NMRスペクトル（第５
図）、13C‐NMRスペクトル（第６図） エピデルミンの配列決定に適当なフラグメントはトリプ
シン分解によつて得られた。トリプシンとの反応によ
り、抗生物質活性は容易に失われる。肉眼的にはゼリー
様の白色沈殿がトリプシン分解により生じ、この沈殿は
遠心分離で除去できた。上澄液を凍結乾燥し、１％酢酸
中セフアデツクスG25〔フアルマシア(Pharmacia)製デキ
ストランゲル〕上ゲルクロマトグラフイーに付した。
ニンヒドリン、塩素/TDMおよび水で染色できる化学的に
均一な分画（以下P1分画と呼ぶ）は、エピデルミンのト
リプシン分解のＮ末端フラグメントであることがわかつ
た（下記参照）。
著しく疎水性のゼリー様沈殿は数種の化学成分からな
り、全分子のＣ末端フラグメントのトリプシン分解時に
生成したものである。沈殿をジメチルホルムアミドに溶
解し、ついでジメチルホルムアミドを溶出液として用い
セフアデツクスLH-20〔セフアデツクスG-25のヒドロキ
シプロピル化によつて得られるデキストランゲル、フア
ルマシア(Pharmacia)製〕上ゲルクロマトグラフイーに
付すと、化学的に均一な生成物（以下P2と呼ぶ）が得ら
れた。P2は水、塩素/TDMおよび紫外線下に検知できた。
P2はニンヒドリン反応陰性であつた。
フラグメントP1のアミノ酸分析結果は、Pro(１),Lan
(１)，β‐Me-Lan(１),Gly(１),Ala(２),Ile(２),Phe
(１),Lys(２)であつた。全分子のダンシル化によりＮ末
端アミノ酸はイソロイシンと決定されていること、フラ
グメントP2はイソロイシンを含まないことから、フラグ
メントP1は全分子のＮ末端分解物と考えられる。トリプ
シン分解によつたことから、フラグメントP1のＣ末端は
リジンであると考えられる。
P1の構造をさらに明瞭にするため、カルボキシペプチダ
ーゼＢ（ベーリンガーマンハイム）を用いて、Ｃ末端ア
ミノ酸のリジンを酵素的に除去した。生成したフラグメ
ントP12はセフアデツクスG-25上ゲルクロマトフラフイ
ー（１％酢酸）により純粋に単離することができた。P1
2は、次のアミノ酸:Pro(１),Lan(１)，β‐Me-Lan(１),
Gly(１),Ala(２),Ile(２),Phe(１),Lys(１)からなる。
チオエーテルアミノ酸、ランチオニンおよびβ‐メチル
ランチオニンの硫黄橋がエドマン(Edman)法による配列
解析の妨害になる。したがつて、P12をラネーニツケルW
2と反応させて、硫黄を含まないドデカペプチドを得
た。メソ‐LanはD-およびL-アラニンに、β‐メチルラ
ンチオニンはD-アミノ酪酸およびL-アラニンに変換され
た。このドデカペプチドの配列はエドマン分解およびFA
Bスペクトロメトリーにより、次のように明らかにされ
た。
Ile1-Ala2-Ala3-Lys4-Phe5-Ile6-Ala7-Abu8-Pro9-Gly10
-Ala11-Ala12 フラグメントP12内の硫黄橋の配置については様々の検
討を加えた結果、次の構造が明らかにされた。
トリプシン分解によつて得られたＣ末端フラグメントP2
は次の構成からなることが明らかにされた:Asn(１),Lan
(１),Gly(１),Phe(１),Tyr(１)，α‐ケト酪酸およびS-
（2-アミノビニル）‐D-システイン。
このα‐ケト酪酸は全分子配列中のリジン13に続くデヒ
ドロアミノ酪酸に由来する。遊離のアミノ基をもつデヒ
ドロアミノ酸は不安定で、とくにα‐ケト酸に変換され
やすく、トリプシン分解ではデヒドロアミノ酪酸のアミ
ノ基が除去される。
トリプシン分解フラグメントP2はＮ末端がα‐ケト酪酸
で遮閉されている（P2はニンヒドリン反応陰性であ
る）。完全加水分解およびアミノ酸分析で同定されたア
ミノ酸、ランチオニン、グリシン、フエニルアラニン、
チロシンおよびアスパラギン酸のほかに、P2には酸完全
加水分解で破壊される成分がさらに含まれている。これ
は、エピデルミン（第６図）およびフラグメントP2（第
８図）の13C‐核磁気共鳴スペクトルにおけるそのシグ
ナルから明らかにされた。
このアミノ酸の化学的性質についての情報はP2とラネー
ニツケルW2との反応における２個の主生成物から得られ
た。製造HPLCで単離された両生成物を完全加水分解する
と、この反応によつて生じたアミノ酸クロマトグラム中
にさらにD-アラニン基が示された。
この成分の構造は、もとの抗生物質の不均一水素添加に
よつて明らかにされた。４個の反応生成物H1,H2,H3およ
びH4を半製造HPLCで精製し、完全加水分解し、キラル固
定相上ガスクロマトグラフイーに付した（第15図）。第
２図のクロマトグラムに比し、H1およびH3にはさらに１
個のピークが認められ、これはマススペクトルによりS-
（2-アミノエチル）‐D-システインと同定された。エピ
デルミン中では、このアミノ酸は、酸不安定成分、S-
（2-アミノビニル）‐D-システインとして存在した。
Ｃ末端フラグメントP2のラネーニツケルW2処理によつて
生じた２個のペプチドP21およびP22はアミノ酸分析およ
びChirasil-val上ガスクロマトグラフイーによつて次の
ように特徴づけることができた。
さらに、両生成物ともＣ末端がエチルアミンで遮閉され
ていた。脱硫と水素添加によつてS-（2-アミノビニル）
‐D-システインは分解し、D-アラニンとエチルアミンを
生成した。
架橋のないヘプタペプチドP21の配列決定（部分加水分
解;0.1N塩酸、93℃、16時間）により、次の構造が明ら
かにされた。
H3C‐CH2‐CO-CO-Gly-D-Ala-L-Asn-D-Ala-L-Tyr-L-Ala-
NHET P22中に存在するメソランチオニンの架橋の配置は、部
分加水分解およびP21とP22の酵素フラグメントについて
の各種化学的検討によつて解明され、トリプシン分解に
由来するフラグメントP2の構造は次のように決定され
た。
P2フラグメントをＮ末端で遮閉している2-ケト酪酸を、
もとの抗生物質に存在するアミノ酸デヒドロブチリンに
よつて当モル置換し、トリプシン分解ペプチドP1とP2を
縮合させると、次式で示されるヘテロデチツク四環ペプ
チド、抗生物質エピデルミンが生成した。
リボソームで合成されたヘテロデチツク環状ドコサペプ
チド、抗生物質エピデルミンの構造： 各チオエーテルアミノ酸のＮ末端に近い方の半分はＤコ
ンフイギユレーシヨン（R,S表示法ではＳコンフイギユ
レーシヨンに相当）である。
本明細書に使用されているものとして、「Ｓ」、「Ｒ」
および「Ｚ」の表示はそれぞれ、不斉炭素原子の絶対コ
ンフィギュレーションおよびＣ＝Ｃ二重結合の立体異性
に係わるカーン−インゴールド−プレログ(Cahn-Ingold
-Prelog)命名法に基づくものであり、「Ｓ」または
「Ｒ」の記号を付けた炭素原子はそれぞれ、Ｓ−コンフ
ィギュレーションまたはＲ−コンフィギュレーションを
有することを意味し、そしてまたＺの記号を付けた二重
結合はＺ−コンフィギュレーションを有することを意味
するものとする。
本発明は、エピデルミンとして知られた均一な、したが
つて純粋な生成物、その製造、単離および精製方法に関
する。
その産生菌、スタフイロコツカス・エピデルミデイス(S
taphyrococcus epidermidis)DSM3095は、組成：肉汁２
〜４％、麦芽エキス１〜３％およびCaCO30.25〜１％も
しくはCa(OH)20.25〜0.5％（％はとくに指示のない限り
重量％である）の複合メジウム中37℃で有気的に培養さ
れる。最大抗生物質活性は18〜23時間後に達成される。
抗生物質を濃縮する試みは、たとえば、10lの発酵槽か
らの培養ろ液に対して行われ、各工程の効率はプレート
拡散試験によつてチエツクした。活性成分は培養ろ液に
ついてn-ブタノール抽出を行い、細胞および石灰を除去
することにより濃縮できた。しかしながら、n-ブタノー
ルによる抽出は、培養ろ液の自然の終pH8.0においての
み可能であつた。エーテル沈殿で脂質の夾雑物を分離す
ることでさらに精製できた。このためには、ブタノール
抽出液を蒸発させ、残留物をメタノールに溶解し、５倍
量の冷ジエチルエーテル中に攪拌下に注いだ。活性は完
全に沈殿中に残留した（第９図）。
他のとくに適当な濃縮方法は、遠心分離培養ろ液の、ア
ンバーライト(Amberlite)XAD-8またはアクリル酸エステ
ルベースの類似ポリマー(Serva)への吸着である。エピ
デルミンは、単純な吸着のみでなく、樹脂中の遊離アク
リル酸基の陽イオン交換活性によつても付着する。これ
は、活性成分が樹脂から、メタノール／濃塩酸(99:1)で
の溶出によつてはじめて放出できる事実から確認され
る。強酸性の溶出液はアンモニアで中和してから、真空
中で濃縮する。アンバーライトXAD-8への吸着によつて
処理したのちは、次にメタノール／エーテルからの再沈
殿は不必要である。
エピデルミンの吸着による単離は、微生物の培養中に培
養培地から直接実施することもできる。
安定性試験とクロマトグラフイーによる検討は、凍結乾
燥したブタノール抽出物について行つた。この抽出物を
種々のpHの水溶液とインキユベートしたところ、活性は
pH10以上では急速に低下したが、この抗生物質はpH2〜
７の範囲で安定である。
ブタノール抽出液を蒸発させた残留物の薄層クロマトグ
ラフイーでは、各種のスプレー試薬で染色される複数個
の化合物が認められた。平行して行つたバイオオートグ
ラムにより、新規活性物質の性質について重要な情報が
得られた。酸性および全中性システムで、この抗生物質
は、シリカゲル60の薄層クロマトグラフイにおいてベー
スラインに止まつたが、アルカリ性溶出液でのクロマト
グラフイーでは0.3〜0.75のRf値を与えた。アルカリ性
システムでバイオオートグラフイーと薄層クロマトグラ
フイーを組み合わせると、ニンヒドリンで染色できる化
合物との相関を示した。
これらの予備試験の結果、この抗生物質は強塩基性ペプ
チドであり、カラムから酸性または中性システムでは溶
出できないので、シリカゲル60上でのカラムクロマトグ
ラフイーではさらに精製することはできないことがわか
つた。
脂質を含まないアンバーライトXAD溶出液またはブタノ
ール抽出物をセフアデツクスLH-20上クロマトグラフイ
ーに付し、メタノール／酢酸(95:5)で溶出すると、多数
の小ペプチド、アミノ酸および塩が抗生物質のメジウム
から分離された（第９図）。
クレーグ(Craig)によつて開発された操作に従つた以後
の多段向流分配には、培養ろ液からの抗生物質の抽出時
に得られた経験を役立てることができた。最初の、n-ブ
タノール／酢酸エチル/0.1N酢酸(3:1:3)システムによる
液‐液分配では、抗生物質はベースライン上に残つた。
2-ブタノール/0.05N酢酸アンモニア(1:1)の中性システ
ムでの第２のクレーグ分配で、抗生物質は装置の中点に
あつた。酢酸アンモニウムは高真空下の凍結乾燥により
再び除去できた。
凍結乾燥後、エピデルミンは粉末として得られ、これは
使用したすべての薄層システムにおいて均一であつた。
ヨーロッパ特許出願第0,027,710号の操作では、精製
は、凍結／融解抽出、抽出剤の蒸発、限外ろ過、硫酸ア
ンモニウムによる沈殿、セフアデツクスG-50,G-25もし
くはG-15上またはバイオゲル(Biogel)P2上イオン交換ク
ロマトグラフイーおよびゲルろ過によつて行われるのに
対し、本発明の精製法では、アンバーラインXAD-8への
遠心分離培養ろ液の吸着、ついでセフアデツクスLH-20
上ゲルクロマトグラフイー、ついでクレーグによる２重
向流分配によつて均一、純粋な生成物が得られる。すな
わち、上記ヨーロッパ特許出願と本発明の単離、精製方
法は、全く異なつている。
上記EP-A-0,027,710号による既知方法との他の相違は、
複合栄養液の選択にある。公知の栄養溶液、脳心臓灌流
液(37gBHI/l)では抗生物質の収量はきわめて低いが、２
〜４％肉汁、１〜３％糖もしくは糖アルコール、たとえ
ば麦芽エキス、マルトース、ガラクトース、ラクトー
ス、マニトール、グルコースもしくはグリセロール、お
よび0.25〜１％炭酸カルシウムもしくは0.25〜0.5％水
酸化カルシウムからなる本発明の栄養溶液ではきわめて
良好な結果が得られた。最良の生産は以下の組成の栄養
液によつて達成された。すなわち３％肉汁、２％麦芽エ
キスおよび0.37％水酸化カルシウムである。すべての炭
素源のうち、麦芽エキスについでマルトースがもつとも
よい産生を示した。グルコースは他の炭素源との組合せ
としてのみ使用すべきである。ラクトースとマルトース
またはガラクトースとマルトースの組合せも良好な結果
を与えた。他の慣用の炭素源はすべて全く産生をみない
か、収率はきわめて低かつた。全20種のアミノ酸を各2g
/lの濃度とした塩素源も肉エキスと同じ結果を与えた。
カサミノ酸(Difco)は、トリプトフアン(１〜2mm)とビタ
ミンを添加した場合には窒素源として適している。適当
なビタミンとしては（カツコ内は好ましい濃度）、ビオ
チン(0.006mg/l)、ニコチン酸(2.3mg/l)、チアミン(1.0
mg/l)、ピリドキシン塩酸塩(12.0mg/l)、パントテン酸
カルシウム(1.2mg/l)がある。
発酵は34〜37℃の温度で、良好な通気下に実施する。最
良の産生パターンは発酵前のpHが6.0〜7.0のときに得ら
れる。２価の陽イオンの炭酸塩または水酸化物、たとえ
ば炭酸カルシウムまたは水酸化カルシウムの非存在下に
は産生は起こらない。炭酸カルシウムの添加後、たとえ
ばpH値は特徴的なパターンを示し、酸性域に低下し、こ
の場合、産生は起こらない。ついでpH値をわずかにアル
カリの範囲まで上昇させてやると、産生が始める。炭酸
カルシウムの代わりに炭酸マグネシウムを使用すること
もできるが、炭酸カルシウムよりも水酸化カルシウムの
方が好結果を与える。50mMの水酸化カルシウムで、25mM
の炭酸カルシウムの場合に比べて、産生は増加する。炭
素源（糖）が菌株によつて利用されると、生成した有機
酸は２価の陽イオンとコンプレツクを形成し、同時にメ
ジウムを緩衝化する。
第10図は、結果を生菌数と、ミクロカツカス・ルテウス
(Micrococcus luteus)ATCC9341に対する阻止面積をmmで
表示した抗生物質の産生について示した曲線で、本発明
のメジウムと前記ヨーロッパ特許における脳心臓灌流メ
ジウム(Difco)とを比較したものである。
最大生産の瞬間における活性の増大を検量線を用いたプ
レート拡散試験で測定した結果は次のとおりであつた。
脳心臓灌流栄養液における活性を100％とした。
ａ）脳心臓灌流アガール 100％ ｂ）３％肉エキス、２％麦芽エキス、 25mM炭酸カルシウム 200％ ｃ）３％肉エキス、２％麦芽エキス、 50mM水酸化カルシウム 320％ これらのデータは絶対産生量とは一致しない。しかしな
がら、プレート拡散試験で得られた値の比較では、既知
の操作と比較し、本発明の操作を用いた場合、有意な収
率の増加が明らかに示されている。
エピデルミンの産生に用いられる菌株は、シユライフア
ーほか(Schleifer ＆ Kloos)により、次のように特徴づ
けされている〔インターナシヨナル・ジヤナール・フオ
ア・システマトロジー・オブ・バクテリア(Int.J.Syst.
Bact.)25巻、50〜61、1975〕。
（ｉ） グラム染色：陽性 （ii） 細胞サイズ：直径0.5〜0.8μｍ （iii） コロニーのサイズ：直径約1mm （iv） コロニーの外観：平坦、光沢あり、中央がわ
ずかに盛り上がる （ｖ） コロニーの色：灰色がかつた白色 （vi） 培養液中の細胞：通常、単独または２個の群
をなす。大きなクランプをなすことは稀 （vii） 溶血：血液スライド上に培養液を広げると
強い溶血を示す （viii） 無気的生育：無気的条件下にもこの株は生
育する （ix） リゾチーム感受性:2mg/mlまではリゾチーム
に対し細胞は抵抗する （ｘ） ライソスタフイン感受性:20μg/mlでもライ
ソスタフインに対し細胞は感受性を示す （xi） エピデルミン抵抗性:1mg/mlまで認められる （xii） その他の抵抗性：液体培養においてこの株
はストレプトマイシン（1mg/mlまで）、スペクチノマイ
シン（0.5mg/mlまで）に対し著しい抵抗性を示す （xiii） 食塩含量の増大：食塩含量15重量％までは
なお良好な生育を示す。
コロニーまたは塗布した培養液は著しい粘着性を示す。
各種炭素源の利用性と酸の形成および他の酵素反応はア
ピ‐スタフ・システム〔Api-Staph System〕，バイオメ
リユー(Biomerieux)，ニユルテインゲン(Ｎrtingen)
を用いて決定した。このシステムは、クルースほか(Klo
os ＆ Schleifer)の分類にあてはめることが可能な20種
の生化学反応の組合せに基づくものである〔ジヤーナル
・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー(J.Clin.Mi
crobiol.)第１巻、82〜88、1975〕。
スタフイロコツカス・エピデルミデイスDSM3095の菌株
を、斜面チユーブ上、以下の組成のメジウムに接種し
た。
ペプトン 10g リン酸‐水素ナトリウム2g
肉エキス 8g グルコース 10g（別個にオートクレーブ処理） 食塩 3g pH 7.2 ついで一夜37℃でインキユベートし、−20℃に凍結し
た。長期に保存すると活性の消失をみるので各試験混合
物用に新鮮なチユーブを解凍した。
以下に抗生物質のさらに詳細な製造方法を述べる。
発酵は適当な振盪フラスコ中で行い、大量の物質を製造
するには容量200l以上のフアーメンターを使用する。
フラスコ試験には、側口のある500mlのエルレンマイヤ
ーフラスコを用いた。フラスコに栄養液100mlを加え、1
21℃で20分間、オートクレーブ処理した。接種には４時
間目の１％予備培養液を使用した。接種は37℃で、140r
pmで回転させた振盪器中で行つた。
10lのスケールでの発酵には、有効容量10lのフアーメン
ター〔ニユー・ブルンスウイツク・サイエンテイフイツ
ク(New Brunswick Scien-tific)社（米国）製のMF-14
型〕に9.9lの栄養溶液を加え、134℃で30分間、オート
クレーブ処理した。冷却後、４時間目の予備培養液100m
lで栄養溶液を接種し、37℃、0.6vvm、240rpmの速度の
ブレード攪拌器を用いて発酵を行つた。滅菌ポリオール
をくり返し添加して比較的強い発泡をおさえる。
25lスケールの発酵には、25lのフアーメンター〔再循環
システム付きブラウン／メルスンゲン(Braun/Melsunge
n)製b25型〕に栄養溶液25lを満たし、ポリオール3mlを
加えて、そのまま121℃で30分間滅菌した。接種には４
時間目の予備培養液300mlを用いた。発酵は37℃、0.6vv
m、100rpmで実施した。
肉エキス30g、麦芽エキス20gおよび炭酸カルシウム5gを
１中に含む栄養溶液中、10lのスケールで実施した発
酵過程を第11図に示す。供給炭素源の利用と酸の形成を
伴う強力な生育が、pH値の低下として検知できる。アル
カリ化の開始とともに、抗生物質が培養ろ液中に検出で
きる。産生は12〜18時間後にピークに達する。
発酵過程のモニターには、発酵開始後の種々の時間に滅
菌条件下にサンプルを採取し、次の各項目について評価
した。
ａ）pH値：実験室用pHメーター〔ニツク(Knick)pHmVメ
ーター）で測定 ｂ）生育過程：生存細菌数の増加を観察して生育をモニ
ターできる。この目的には、培養液0.5mlを滅菌条件下
に採取し、食塩水で希釈し、この希釈液0.1mlをスライ
ド上に塗布した（メジウム:1あたり、ペプトン10g、
肉エキス8g、食塩3g、リン酸‐水素ナトリウム2g、グル
コース10g）。37℃で18時間インキユベートしたのちに
は各コロニーを数えることができた。
ｃ）抗生物質濃度：サンプルをエペンドルフ遠心分離機
3200で２分間遠心分離し、その上澄液20μｌについてプ
レート拡散試験を実施した。同時に、既知濃度で検量曲
線をプロツトした。
最大産生に到達したのち、培養液を連続遠心分離〔ロー
エル・ウント・ゼエーネ、ルーシユトルフ／ロツト(Loh
er ＆ Shne,Ruhstorf/Rott)、LA71b-4型〕によつて13
80rpmで分離した。細胞の至適分離のためには、流速を
きわめて低く保つ必要があつた。活性成分の最初の濃縮
は、以下の例１に記載するように、前述のアンバーライ
トXAD-8への吸着によつて行つた。
例１ 培養ろ液80lを約8lのアンバーライトXAD-8上に注いだ。
通過液には活性は全く検出されなかつた。ついで水で洗
浄したが、この場合も活性は溶出しなかつた。続いてメ
タノール13lで洗浄した。洗浄液には活性は検出されな
かつた。溶出はメタノール／塩酸99:1を用いて行い、以
下の分画を得た。
分画1: 0.8l 活性 分画2: 4.5l 主な活性分画 分画3: 2l 活性 分画4: 2l 活性なし 分画5: １ 活性なし 各分画について薄層クロマトグラフイーを行い、エピデ
ルミン含量を調べ、ついで活性分画を合して、ロータリ
ーエバポレーターで蒸発乾固させた(81.2g)。残留物を
メタノール／酢酸(95/5)400mlに取り、遠心分離して不
溶成分を除き、50mlのセフアデツクスLH-50（カラム100
×5cm）を用い、バツチ法でゲルクロマトグラフイを行
つた（溶出液：メタノール／酢酸95/5）。陽性分画を合
し、蒸発濃縮した(14.8g)。
クレーグによる多段分配には、ラボルテツク(Labortec,
Basle)の装置を使用した。最初の分離は50mlの装置で、
n-ブタノール／酢酸エチル/0.1M酢酸(3/1/3)のシステム
を用いて行つた。サンプル(5g)を下相(100ml)に溶解
し、以下の条件で分離した。
段数 160 各段の振動移動 70 振動の強度 45 分離時間 20分 最終精製には、得られた粗生成物(4.2g)を2gのバツチ
で、2-ブタノール/0.05N酢酸アンモニウムシステムの下
相(50ml)に溶解し、エレメント440の10ml装置で精製し
た。
段数 440 各段の振動移動 50 振動の強度 50 分離時間 10分 エピデルミンを含むエレメントを合し、蒸発濃縮し、水
に取り、高真空下に数回凍結乾燥した。抗生物質(2.6g)
は実施したすべての試験において均一であつた。
エピデルミンの製造および単離過程での生物学的特徴の
検査、すなわち活性スペクトルの記録および産生、後処
理、濃縮のモニターにはプレート拡散試験を用いた。試
験は、グライナー(Greiner,Nrtingen)製のペトリ皿、
径6mmのろ過デイスク〔マシエリー・ウントナーゲル(Ma
cherey ＆ Nagel,Dren)〕を用い、ツエナーほか(Ｚ
hner ＆ Maas)のバイオロジー・オブ・アンテイバイオ
テイツクス(Biology of Antibiotics,Springer Verlag,
Berlin-Heidelberg-New York,1972)の記載に従つて実施
した。ろ過デイスクを適当な試験液20μｌで湿らせ、室
温においてガラススライド上で乾燥させ、試験プレート
上に置いた。試験プレートを37℃でインキユベートし、
生育阻止を約16時間後に評価した。ルーチンの試験細菌
としては、操作上の問題が少ないので、ストレプトコツ
カス・パイロジエンズ(Streptococcus pyrogenes)ATCC8
668と、ミクロコツカス・ルテウス(Micrococcus luteu
s)ATCC9341を用いた。
ストレプトコツカス・パイロジエンズATCC8668の試験プ
レート：試験プレートの調製前に、試験細菌を血液プレ
ート上にムチンと新たに接種する必要がある〔メジウ
ム:pH7.4アガール500ml、ムチン溶液（10重量％）160m
l、グルコース溶液（50重量％）3.5mlおよびヒツジ血液
70ml〕。15〜18時間、37℃でインキユベートしたのち、
食塩懸濁液(E5780.5)を調製し、この懸濁液1mlを栄養ベ
ース〔メジウム：ペプトン10g、肉エキス8g、食塩3g、N
a2HPO42g、グルコース10g（いずれも１あたり）、pH
7.2〕100ml中にピペツトで加えた。10mlのバツチをもつ
プレートは４℃に数日間保存できた。
ミクロコツカス・ルテウスATCC9341の試験プレート：一
夜培養液（メジウム:1あたり、ペプトン10g、肉エキ
ス8g、食塩3g、Na2HPO42g、グルコース10g、pH7.2）を5
78nmの吸光度が1.0になるように希釈した。アガール100
mlにこの懸濁液0.25mlを接種し、バツチ10mlをスライド
上に注いだ。試験プレートは４℃で数日間保存できた。
活性スペクトル用試験プレート： 細菌の試験プレート： α）好気性細菌 一夜培養液を関連試験メジウム中で生育させ、プレート
はミクロコツカス・ルテウスATCC9341の場合と同様にし
て調製した。
β）嫌気性細菌 クロストリジウム・パストウリアナムATCC6103およびプ
ロピオニバクテリウム・アクネDSM1897の予備培養液
を、酸素を除くために栄養溶液を綿栓まで満たした試験
管内で生育させた。この培養液3mlでアガール100mlを接
種し、そのバツチ10mlをプレート上に注いだ。無気ポツ
ト(BBL-Gas Pak100、Becton,Dickinson GmbH,Heidelber
g)中至適温度でインキユベーシヨンを行つた。
イースト様菌の試験プレート： 振盪培養器中、関連試験メジウムで18〜20時間、細胞を
生育させた。トーマの計数チヤンバーで計数したのち、
アガール1mlあたりの細胞数が106個になるように試験プ
レートに接種した。
菌およびストレプトマイセスの試験プレート： 試験微生物は斜面チユーブ上（メジウム:1あたり、酵
母エキス4g、麦芽エキス10g、グルコース4g）、相当温
度で胞子形成を生じるまで生育させた。胞子を3mlの食
塩ツイーン80（食塩水100mlにツイーン80を１滴添加）
に浮遊させ、試験プレート中に注いだ。
エピデルミンはきわめて優れた抗生物質活性を有する
が、とくにグラム陽性菌の系列に対して有効である。エ
ピデルミンの抗生物質活性は、ナイシン（nisin:ナイシ
ンについてはとくにDE-A-2,000,818号またはGB-B-1,18
2,156号参照）と比較して試験した。一部の臨床に関連
する重要な細菌についてはフシド酸も比較に含めた。有
効性はプレート拡散試験により最小阻止濃度を求めて決
定した。
ａ）プレート拡散試験 プレート拡散試験では、エピデルミンおよびナイシンに
対する各種微生物の感受性を調べた。第２表は、この両
抗生物質がグラム陽性菌にほぼ、もつぱら作用すること
を示している。ナイシンは40,000単位の活性のものを使
用した。
ｂ）最小阻止濃度 臨床的に関連ある細菌についての最小阻止濃度(μg/ml)
を、以下のメジウム中マイクロタイタープレートで試験
した。
蒸留水1,000ml中、乳酸ナトリウム5ml、Na2SO45g、、KH
2PO40.5g、MgCl20.1g、NH4Cl5g、グルコース10g、パン
トテン酸カルシウム50μｇ、チアミン50μｇ、葉酸0.25
μｇ、ナイアシン50μｇ、p-アミノ安息香酸25μｇ、ピ
キドキシン塩酸塩50μｇ、リボフラビン25μｇ。
第３表には、エピデルミン、ナイシンおよびフシド酸の
最小阻止濃度(μg/ml)を比較試験によつて示す。この場
合用いたナイシンの活性は2500単位であつた。
第２表に挙げたメジウムは以下に記載するとおりであ
る。メジウムはpHを調整したのち、121℃で20分間、オ
ートクレーブ処理した。
以下の数値はすべて水１中の値である。化学的に定義
されたメジウムの場合は脱イオン水を用いた。
（２） グルコース‐アガールメジウム ペプトン 10g 肉エキス 8g NaCl 3g Na2HPO4 2g グルコース 10g（別個にオートクレーブ処理 アガール 20g pH7.2 （３） 酵母‐麦芽メジウム 酵母エキス 4g 麦芽エキス 10g グルコース 4g アガール 20g pH7.3 （４） 細菌用オキソイドメジウム 肉エキス 10g ペプトン 10g NaCl 5g アガール 20g pH7.2 （５） 栄養肉汁(Difco) 8g アガール 20g pH7.2 （６） 細菌用最小培地〔ヒユツター(Ｈtter)ほ
か、1966〕 D-グルコース 8g 酒石酸二アンモニウム 4g NaCl 5g K2HPO4 2g MgSO4・7H2O 1g CaCl2 0.2g MnSO4・H2O 0.01g フエリオキサミンB 0.02g アガール 20g pH7.2 （７） クロストリジウム・パストウリアナム用メジ
ウム 肉エキス 3g 酵母エキス 3g 麦芽エキス 3g ペプトン 20g D-グルコース 5g アスコルビン酸 0.2g アガール 20g pH7.0 （８） プロピオニバクテリウム・アクネ用ブリユーア
ー(Brewer)チオグリコレートメジウム チオグリコレ-トメジウム 40.5g アガール 20g pH7.2 エピデルミンは耐容性に優れ、局所的に用いた場合、毒
性作用は認められない。
主たる利点は、抵抗性変異株、スタフイロコツカス・エ
ピデルミデイスDSM3095がエピデルミンに抵抗性で、そ
れを産生することである。菌株NCIBは、それが産生する
低分子抗生物質に対してこのような抵抗性を示さない。
新規クローンDSM3095は次のようにして得られた。
適応は側口を有する100mlのエルレンマイヤーフラスコ
中、10mlの栄養溶液（脳心臓灌流液）で実施した。出発
培養液を0.5mlの12時間培養液で接種した。高濃度のエ
ピデルミンを含むフラスコには、前回のよく生育した培
養液0.5mlを種として用いた。生育は578nmにおいて光学
的に評価した。培養液中エピデルミン濃度1.0mg/mlでも
なお良好な生育を示した培養液を食塩水で希釈し、エピ
デルミン0.5mg/mlを注いでおいたスライド上に塗布し
た。比較のために、文献公知の菌株NCIB11536の12時間
培養液を希釈しないでプレート上に塗布した。37℃に24
時間インキユベートしたのち、10-6に希釈した適応培養
液に94個のコロニーが観察された。希釈しないで0.15mg
/ml含有プレート上に塗布した対照菌株からは、48時間
インキユベートしたのちも、生育は認められなかつた。
抵抗性コロニーを選択し、メジウム２のプレート上にグ
リツドパターンに塗布した。径5mmのフラグメントを取
つて産生の予備試験とマイクロコツカス・ルテウスATCC
9341に対する活性試験を行つたのち、産生クローンを液
体メジウム中で試験した。
抵抗性菌株と文献公知菌株の比較： ａ）プレート拡散試験における最小阻止濃度： ２種の菌株を含む試験プレート上で得られた最小阻止濃
度を第４表に示す。
ｂ）生育および産生： 栄養溶液（３％肉エキス、２％麦芽エキス、0.37％水酸
化カルシウム）中で２種の菌株の生育と産生パターンを
比較した（第12図参照）。
生育パターン：生菌数の測定 産生パターン：プレート拡散試験におけるミクロコツカ
ス・ルテウスATCC9341に対する活性 抵抗性菌株によつてより良好な産生が認められる。
ｃ）各種生育相におけるエピデルミンに対する感受性： 産生菌株の抗生物質による固有の阻害と、選ばれたクロ
ーンの抵抗性の試験をバイオホトメーター（自動循環装
置付のエペンドルフ製ホトメーター）を用いて実施し
た。
これらの試験は、たとえば、次のように実施した。
スタフイロコツカス・エピデルミデイスNCIB11536また
は選ばれた抵抗性菌株DMS3095の12時間培養液0.5mlのバ
ツチを新鮮なメジウム上に接種した。
これらの培養液を578nmの吸光度が0.043になるまで生育
させ（層厚1mmの皿）、ついでバイオホトメーターのキ
ユーベツト（層厚2cm）に7.5mlを加えた。
細胞懸濁液の密度がバイオホトメーターの透過率90％に
なるように調整した。インキユベーシヨンは最大通気下
に37℃で実施した。各生育相にエピデルミンを水溶液と
して添加した。
いずれの菌株も、対数期の初期と中期に、各種濃度のエ
ピデルミンを添加した。結果を第13図および第14図に示
す。
これまでに試験した濃度では、抵抗性菌株には溶菌は認
められなかつた。
本発明の抗生物質エピデルミンは、それが単離された培
養液と同様、殺菌効果を示し、細胞を溶解させる。
その殺菌活性とグラム陽性細菌に対する広いスペクトル
の活性から、本発明のポリペプチド抗生物質エピデルミ
ンは、グラム陽性細菌によつて生じる感染症の治療にと
くに有用である。エピデルミンは、湿疹、膿痂疹、蜂巣
炎およびとくに痙瘡のような皮膚感染症の治療に有用で
ある。プロピオニバクテリウム・アクネズの一部の重要
な菌株に対する著しく高い有効性は、すでに第２表およ
び第３表に示した。エピデルミンはヒトの皮膚に生棲す
る微生物によつて正常に産生されるものということがで
き、他の慣用の抗生物質に比べ、皮膚の保護により効果
的である。
本発明の抗生物質を慣用の賦形剤および担体とともに含
有する医薬組成物は、経口的に、非経口的に、経腸的に
または局所的に適用できる。これらの組成物は、とくに
局所用剤型の場合、溶液剤、乳化剤、ゲル、ローシヨ
ン、軟膏、クリームまたは粉末として提供される。
以下の実施例はこれらの医薬用剤型の製造方法を例示す
るものである。
例２ チンク剤 100g中含量： エピデルミン 1.0g エタノール（94.5容量％） 56.0g 1,2-プロピレングリコール 40.0g 脱イオン水 3.0g 製法： エピデルミンをエタノール、1,2-プロピレングリコール
および水の混合物に溶解し、この溶液を無菌的にろ過す
る。
例３ ローシヨン 100g中の含量 エピデルミン 1.00g 1,2-プロピレングリコール 7.00g アルキルジメチルベンジルアン モニウムクロリド（ベンザルコンＡ ） 0.15g ソルビタンモノパルミテート （スパン40 ） 0.40g ソルビマクロゴールパルミテート （ツイーン40 ） 1.20g デシルオレエート （セチオールＶ ） 2.40g セチルおよびステアリル アルコール混合物（ラネツテＯ ） 1.60g セチルパルミテート 0.80g 脱イオン水 全量100gとする 製法： 上記量のアルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリ
ド、ソルビタンモノパルミテート、ソルビマクロゴール
パルミテート、デシルオレエート、セチルおよびステア
リルアルコールならびにセチルパルミテートを水75ml中
に攪拌下に混合し、ついでエピデルミンの1,2-プロピレ
ングリコール溶液のろ過液と残部の水を攪拌に加え、均
一にする。
例４ ゲル 100g中含量 エピデルミン 1.0g ラウリルアルコールのポリエチレン グリコールエーテル（ブリツジ35 ） 1.0g 1,2-プロピレングリコール 5.0g アクリル酸ポリマー （カルボポール934 ） 1.2g p-ヒドキシ安息香酸メチル 1.6g p-ヒドロキシ安息香酸プロピル 0.4g 香料 適量 水酸化ナトリウム溶液 pH6.5になるまで 脱イオン水 全量100gとする 製法： 特定量の賦形剤を水75ml中に攪拌下に加える。エピデル
ミンを1,2-プロピレングリコールと残部の水の混合物に
溶解し、この溶液を再び攪拌下に加える。得られたゲル
をもう一度ホモジナイズする。
【図面の簡単な説明】
第１図はエピデルミンの酸完全加水分解物のアミノ酸ク
ロマトグラムである（ニンヒドリン発色、λ＝570nm） 第２図はエピデルミンの酸完全加水分解物のN-ペンタフ
ルオロプロピオニル‐アミノ酸n-プロピルエステルのCh
irasil-Val上ガスクロマトグラムである（温度プログラ
ム、３分間、85℃の等温、ついで１分間４℃ずつ200℃
まで上昇、キヤリアーガス：H2,0.92バール） 第３図：エピデルミン水溶液の紫外部スペクトル、pH3
(ｃ＝0.15mg/ml) 第４図：エピデルミンの赤外吸収スペクトル、KBr錠 第５図：エピデルミンの1H‐NRスペクトル(20mg/0.5mlD
7‐ジメチルホルムアミド、400.16MHz) 第６図：エピデルミンの13C‐NRスペクトル（40mg/0.5m
l、12C，2H‐ジメチルホルムアミド、100.6MHz、45360
パルス） 第７図：エピデルミンのμBondapak C18 HPLCクロマト
グラム（300×3.9mm、移動相:A＝アセトニトリル/0.01M
KH2PO4、10/90;B＝アセトニトリル/0.01M KH2PO4、70/
30、30分で10％Ｂ→100％Ｂ直線勾配、流速2ml/分） 第８図：フラグメントP2の13C‐NRスペクトル（12mg/0.
5ml、12C，2H‐ジメチルホルムアミド、100.6MHz、3830
0パルス） 第９図：エピデルミンの単離 第10図：生菌数（実線）とミクロコツカス・ルテウスに
対する活性（点線）のジメウムによる比較 ▲ 脳心臓灌流液 ○ ３％肉エキス‐２％麦芽エキス‐0.25％ CaCO3 ● ３％肉エキス‐２％麦芽エキス‐0.37％ Ca(OH)2 第11図:10lスケールでの発酵過程 ● pH曲線 ▲ 生菌数 ○ ストレプトコツカス・パイロジエンズATCC 8668に対する活性 第12図：文献公知の菌株と抵抗性クローンDSM3095の生
菌数（実線）およびミクロコツカス・ルテウスATCC9341
に対する活性（点線） ○ 文献公知の菌株 ▲ 抵抗性クローン 第13図：各種生育相におけるスタフイロコツカス・エピ
デルミデイスNCIB11536へのエピデルミンの添加 曲線1;正常な生育パターン 曲線2;対数期の初期にエピデルミン10μg/mlを添加、溶
菌を生じている 曲線3;対数期の中期にエピデルミン10μg/mlを添加、同
様に溶菌を生じている 曲線4;対数期の中期にエピデルミン2.5μg/mlを添加、
生育遅延 第14図：抵抗性クローンDSM3095の各種生育相における
エピデルミンの添加 曲線1;正常な生育パターン、NCIB11536の場合に同じ 曲線2;対数期の初期にエピデルミン120μg/mlを添加、
生育にわずかな遅延のみ 曲線3;対数期の中期に360μg/mlのエピデルミン添加、
生育にわずかな遅延をみるのみ 第15図:H1の完全加水分解物のN-ペンタフルオロプロピ
オニルアミノ酸N-プロピルエステルのChirasil-Val上ガ
スクロマトグラム（温度プログラム;3分間80℃に等温保
持、ついで１分間４℃で200℃に上昇させる、キヤリヤ
ーガス：H2）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:45） (72)発明者 ギユンサー ユング ドイツ連邦共和国テユビンゲン，オブ デ ル グラフエンハルデ ５ (72)発明者 ヘルマン アルガイエル ドイツ連邦共和国ビベラツハ，ケレスライ ン 105 (72)発明者 ウルスラ スクナイダー ドイツ連邦共和国ルテシヤイム，シヤウマ ンストラーセ ３

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】アミノ酸組成がAsn(１),Pro(１),Gly(２),
    Ala(２),Ile(２),Phe(２),Lys(２),Lan(２)，β‐Me-La
    n(１),Dhb(１),Tyr(１),S-（２−アミノビニル）−Ｄ−
    システイン(１)からなり；一次構造が で表され；そして各チオエーテルアミノ酸のＮ末端に近
    い半分がＤコンフィギュレーションであることを特徴と
    する、エピデルミンとして知られる抗生物質活性ポリペ
    プチド。
  2. 【請求項２】アミノ酸組成がAsn(１),Pro(１),Gly(２),
    Ala(２),Ile(２),Phe(２),Lys(２),Lan(２)，β‐Me-La
    n(１),Dhb(１),Tyr(１),S−（２−アミノビニル）−Ｄ
    −システイン(１)からなり；一次構造が で表され；そして各チオエーテルアミノ酸のＮ末端に近
    い半分がＤコンフィギュレーションであることを特徴と
    するエピデルミンとして知られる抗生物質活性ポリペプ
    チドの製造方法であって、 スタフィロコッカス・エピデルミディス (Staphylococcus epidermidis)DSM3095を、肉汁のよう
    な窒素源２〜４％、炭素源として糖または糖アルコール
    １〜３％ならびにアルカリ土類金属の炭酸塩0.25〜１％
    および／または水酸化物0.25〜0.5％を含む混合栄養溶
    液中、34〜37℃で好気的に生育させ；細胞および無機塩
    を除去した後に生成した活性物質を単離するために、培
    養液を、pH8においてｎ−ブタノールで抽出し、ブタノ
    ール抽出液を蒸発させ、残留物をメタノールに溶解し、
    エーテル沈殿によってこの溶液から脂質夾雑物を除去す
    るか、あるいは、培養液をアクリレートまたはポリスチ
    レンをベースとしたポリマーにより処理し、この樹脂を
    メタノール／濃塩酸(99:1)で処理して吸着したエピデル
    ミンを放出させ、この溶液をアンモニアで中和して減圧
    下に蒸発濃縮し；かくして得られた単離物質をゲルクロ
    マトグラフィー〔セファデックスLH−20、メタノール／
    酢酸(95:5)〕に付して他の低分子量ペプチド、アミノ酸
    および塩を除去し；次いでクレーグ(Craig)による多重
    向流分配に付し、最初の液−液分配はｎ−ブタノール／
    酢酸エチル/0.1N酢酸(3:1:3)のシステムを用いて行い
    （エピデルミンはベースライン上に残る）、第二の分配
    は２−ブタノール/0.05N酢酸アンモニウム(1:1)中性シ
    ステムを用い、この溶出液から凍結乾燥によって純粋な
    エピデルミンを無色の粉末として単離することを特徴と
    する抗生物質エピデルミンの製造方法。
  3. 【請求項３】窒素源として、２〜４重量％の肉汁、全20
    種のアミノ酸の混合物（アミノ酸濃度2g/l）、または２
    〜４％のカサミノ酸（トリプトファンの存在下）；炭素
    源として１〜３重量％の麦芽エキス、マルトース、ガラ
    クトース、ラクトース、マニトール、グルコース、グリ
    セロール、またはラクトースとマルトースもしくはガラ
    クトースとマルトースの配合物；および0.25〜１重量％
    の炭酸カルシウムまたは0.25〜0.5重量％の水酸化カル
    シウムを発酵メジウムに導入し、さらに所望によりビオ
    チン、ニコチン酸、チアミン、ピリドキシン塩酸塩およ
    びパントテン酸カルシウムのようなビタミンを加え、発
    酵前にpH値を6.0〜7.0に調整し、製造過程は連続サンプ
    リングでモニターする、特許請求の範囲第２項に記載の
    方法。
  4. 【請求項４】スタフィロコッカス・エピデルミディス (Staphylococcus epidermidis)DSM3095を、肉汁のよう
    な窒素源２〜４％、炭素源として糖または糖アルコール
    １〜３％ならびにアルカリ土類金属の炭酸塩0.25〜１％
    および／または水酸化物0.25〜0.5％を含む混合栄養溶
    液中、34〜37℃で好気的に生育させ；細胞および無機塩
    を除去した後に生成した活性物質を単離するために、培
    養液を、pH8においてｎ−ブタノールで抽出し、ブタノ
    ール抽出液を蒸発させ、残留物をメタノールに溶解し、
    エーテル沈殿によってこの溶液から脂質夾雑物を除去す
    るか、あるいは、培養液をアクリレートまたはポリスチ
    レンをベースとしたポリマーで処理し、この樹脂をメタ
    ノール／濃塩酸(99:1)で処理して吸着したエピデルミン
    を放出させ、この溶液をアンモニアで中和して減圧下に
    蒸発濃縮し；かくして得られた単離物質をゲルクロマト
    グラフィー〔セファデックスLH-20、メタノール／酢酸
    (95:5)〕に付して他の低分子量ペプチド、アミノ酸およ
    び塩を除去し；次いでクレーグ(Craig)による多重向流
    分配に付し、最初の液−液分配はｎ−ブタノール／酢酸
    エチル/0.1N酢酸(3:1:3)のシステムを用いて行い（エピ
    デルミンはベースライン上に残る）、第二の分配は２−
    ブタノール/0.05N酢酸アンモニウム(1:1)中性システム
    を用い、この溶出液から凍結乾燥によって純粋なエピデ
    ルミンを無色の粉末として単離することを特徴とする方
    法で得られた抗生物質エピデルミン。
  5. 【請求項５】活性成分として、アミノ酸組成がAsn(１),
    Pro(１),Gly(２),Ala(２),Ile(２),Phe(２),Lys(２),La
    n(２)，β‐Me-Lan(１),Dhb(１),Tyr(１),S−（２−ア
    ミノビニル）−Ｄ−システイン(１)からなり；一次構造
    が で表され；そして各チオエーテルアミノ酸のＮ末端に近
    い半分がＤコンフィギュレーションであることを特徴と
    する抗生物質エピデルミンを、慣用の担体および／また
    は賦形剤とともに含有する抗菌性医薬組成物。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0637384B2 (ja) * 1985-09-21 1994-05-18 株式会社資生堂 皮膚化粧料
EP0350810B1 (de) * 1988-07-15 1993-09-29 Dr. Karl Thomae GmbH Verfahren zur Gewinnung, Isolierung und Reinigung von Epidermin
DE3938140A1 (de) * 1989-11-16 1991-08-08 Beiersdorf Ag Desodorierende kosmetische mittel
EP0659068B1 (en) * 1992-09-10 1996-12-04 Sara Lee/DE N.V. Mouth-care products with anti-bacterial activity
AU689494B2 (en) * 1993-08-20 1998-04-02 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Method for the prevention and treatment of bovine mastitis
WO1995030751A1 (en) * 1994-05-07 1995-11-16 Ciba-Geigy Ag Lanthionine-containing antimicrobial compound
WO1996031192A1 (de) * 1995-04-07 1996-10-10 Kuyus-Stiftung Kosmetische zusammensetzung zur behandlung von cellulite
SE9602496D0 (sv) 1996-06-20 1996-06-20 Bengt Guss Method and means for producing a fibrinogen binding protein and its use in biotechnology
JP2006176406A (ja) * 2003-03-11 2006-07-06 Asahi Kasei Pharma Kk ペプチド系抗生物質
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