JPH06113826A - 新規なエピデルミン産生菌株 - Google Patents
新規なエピデルミン産生菌株Info
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- JPH06113826A JPH06113826A JP5173284A JP17328493A JPH06113826A JP H06113826 A JPH06113826 A JP H06113826A JP 5173284 A JP5173284 A JP 5173284A JP 17328493 A JP17328493 A JP 17328493A JP H06113826 A JPH06113826 A JP H06113826A
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- A61P31/04—Antibacterial agents
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- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 新規なエピデルミン産生菌株を提供する。
【構成】 エピデルミン抵抗性菌株、スタフィロコッカ
ス・エピデルミディスＤＳＭ３０９５。
ス・エピデルミディスＤＳＭ３０９５。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗生物質活性を有する
ポリペプチド（以下、エピデルミンという）に抵抗性を
示し、この抗生物質を産生するスタフィロコッカス・エ
ピデルミディス（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐ
ｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の新株に関するものである。
ポリペプチド（以下、エピデルミンという）に抵抗性を
示し、この抗生物質を産生するスタフィロコッカス・エ
ピデルミディス（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐ
ｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の新株に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】スタフィロコッカス・エピデルミディス
の特定の株、すなわちスタフィロコッカス・エピデルミ
ディスＮＣＩＢ１１５３６〔ナショナル・コレクション
・オブ・インダストリアル・バクテリア（Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ
ｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ）アバディーン（Ａｂｅｒｄｅｅ
ｎ）に寄託〕がグラム陽性病原菌に対して広範な活性を
有し、細菌細胞を溶解する低分子量抗生物質ポリペプチ
ドを産生することは、ＥＰ−Ａ−０，０２７，７１０号
によって知られている。
の特定の株、すなわちスタフィロコッカス・エピデルミ
ディスＮＣＩＢ１１５３６〔ナショナル・コレクション
・オブ・インダストリアル・バクテリア（Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ
ｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ）アバディーン（Ａｂｅｒｄｅｅ
ｎ）に寄託〕がグラム陽性病原菌に対して広範な活性を
有し、細菌細胞を溶解する低分子量抗生物質ポリペプチ
ドを産生することは、ＥＰ−Ａ−０，０２７，７１０号
によって知られている。
【０００３】また、スタフィロコッカス・エピデルミデ
ィスＭＦ２０５〔ティラー（Ｓ．Ｍ．Ｔａｙｌｏｒ）ほ
か：インターナショナル・ジャーナル・マス・スペクト
ロメトリー・アンド・イオン・フィジクス（Ｉｎｔ．
Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｉｏｎ Ｐｈｙｓｉ
ｃｓ）、４８巻、１６１〜１６４、１９８３〕がグラム
陽性菌に対して有効なオリゴペプチドを産生することも
知られている。しかし、この報告からは、この菌株が上
述の株ＮＣＩＢ１１５３６と同一かどうかについては明
らかでない。
ィスＭＦ２０５〔ティラー（Ｓ．Ｍ．Ｔａｙｌｏｒ）ほ
か：インターナショナル・ジャーナル・マス・スペクト
ロメトリー・アンド・イオン・フィジクス（Ｉｎｔ．
Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｉｏｎ Ｐｈｙｓｉ
ｃｓ）、４８巻、１６１〜１６４、１９８３〕がグラム
陽性菌に対して有効なオリゴペプチドを産生することも
知られている。しかし、この報告からは、この菌株が上
述の株ＮＣＩＢ１１５３６と同一かどうかについては明
らかでない。
【０００４】
【発明の開示】本発明は、１９８４年１０月２６日に、
ジャーマン・コレクション・オブ・マイクロオーガニズ
ム（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉ
ｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）にＤＳＭ３０９５の番号で
寄託され、上述のＮＣＩＢ１１５３６株と類縁のスタフ
ィロコッカス・エピデルミディスの抵抗性変異株が、改
良製造方法および後処理方法によって、特にグラム陽性
菌に対して抗生物質作用を有する類似のポリペプチド、
エピデルミンを産生すること、また産生されたエピデル
ミンをスタフィロコッカス・エピデルミディスＮＣＩＢ
１１５３６およびＭＦ２０５の産生物と比較すると、特
にアミノ酸組成においてかなりの差を示すことを発見し
たことにもとづくものである。
ジャーマン・コレクション・オブ・マイクロオーガニズ
ム（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉ
ｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）にＤＳＭ３０９５の番号で
寄託され、上述のＮＣＩＢ１１５３６株と類縁のスタフ
ィロコッカス・エピデルミディスの抵抗性変異株が、改
良製造方法および後処理方法によって、特にグラム陽性
菌に対して抗生物質作用を有する類似のポリペプチド、
エピデルミンを産生すること、また産生されたエピデル
ミンをスタフィロコッカス・エピデルミディスＮＣＩＢ
１１５３６およびＭＦ２０５の産生物と比較すると、特
にアミノ酸組成においてかなりの差を示すことを発見し
たことにもとづくものである。
【０００５】
【表１】
【０００６】６Ｎ塩酸を用い（１８時間、１１０℃）、
エピデルミンを完全加水分解したのち、イオン交換クロ
マトグラフィーによりアミノ酸の定量分析を行うと〔ビ
オトロニック（Ｂｉｏｔｒｏｎｉｋ）ＬＣ６０００Ｅ型
装置を用い標準プログラムによる〕以下のα−アミノ酸
組成が得られた：Ａｓｐ（１．００），Ｐｒｏ（０．９
５），Ｇｌｙ（２．０９），Ａｌａ（２．０３），Ｉｌ
ｅ（２．０３），Ｔｙｒ（０．３０），Ｐｈｅ（２．０
２），Ｌｙｓ（２．００）（図１参照）。チオグリコー
ル酸の添加により、完全加水分解物中のチロシン含量
は、ほぼ化学量論値の０．９３に上昇する。
エピデルミンを完全加水分解したのち、イオン交換クロ
マトグラフィーによりアミノ酸の定量分析を行うと〔ビ
オトロニック（Ｂｉｏｔｒｏｎｉｋ）ＬＣ６０００Ｅ型
装置を用い標準プログラムによる〕以下のα−アミノ酸
組成が得られた：Ａｓｐ（１．００），Ｐｒｏ（０．９
５），Ｇｌｙ（２．０９），Ａｌａ（２．０３），Ｉｌ
ｅ（２．０３），Ｔｙｒ（０．３０），Ｐｈｅ（２．０
２），Ｌｙｓ（２．００）（図１参照）。チオグリコー
ル酸の添加により、完全加水分解物中のチロシン含量
は、ほぼ化学量論値の０．９３に上昇する。
【０００７】タンパク質アミノ酸のコンフィギュレーシ
ョンは、完全加水分解物からのペンタフルオロプロピオ
ニルアミノ酸のｎ−プロピルエステルのガスクロマトグ
ラフィーによって決定した。分離はキラル固定相として
Ｌ−バリン−ｔｅｒｔ−ブチルアミド−ポリシロキサン
（Ｃｈｉｒａｓｉｌ−Ｖａｌ）を用いて行った。コンフ
ィギュレーション既知のアミノ酸の試験化合物と比較し
て、上記構成はＬ−コンフィギュレーションを有するも
のとして区別される。（図２参照）。
ョンは、完全加水分解物からのペンタフルオロプロピオ
ニルアミノ酸のｎ−プロピルエステルのガスクロマトグ
ラフィーによって決定した。分離はキラル固定相として
Ｌ−バリン−ｔｅｒｔ−ブチルアミド−ポリシロキサン
（Ｃｈｉｒａｓｉｌ−Ｖａｌ）を用いて行った。コンフ
ィギュレーション既知のアミノ酸の試験化合物と比較し
て、上記構成はＬ−コンフィギュレーションを有するも
のとして区別される。（図２参照）。
【０００８】これらのタンパク質アミノ酸に加えて、以
下の非タンパク質アミノ酸が存在する：ランチオニン
（２）、β−メチルランチオニン（１）およびα，β−
デヒドロアミノ酪酸（１）。ランチオニンはメソコンフ
ィギュレーションを有するが、β−メチルランチオニン
は２Ｓ，３Ｓ，６Ｒコンフィギュレーションを有する。
エピデルミンはさらに、Ｓ−（２−アミノビニル）−Ｄ
−システィン成分を含有する。
下の非タンパク質アミノ酸が存在する：ランチオニン
（２）、β−メチルランチオニン（１）およびα，β−
デヒドロアミノ酪酸（１）。ランチオニンはメソコンフ
ィギュレーションを有するが、β−メチルランチオニン
は２Ｓ，３Ｓ，６Ｒコンフィギュレーションを有する。
エピデルミンはさらに、Ｓ−（２−アミノビニル）−Ｄ
−システィン成分を含有する。
【０００９】本発明に係わり産生される新規エピデルミ
ンは、以下の特徴を有する： （ｉ）外観；無色粉末； （ｉｉ）溶解性；水／氷酢酸またはメタノール／氷酢酸
の混合物にきわめて易溶、低級アルコールに可溶、クロ
ロホルム、アセトン、ジエチルエーテル、石油エーテル
に不溶； （ｉｉｉ）シリカゲル板上の発色反応：ニンヒドリン、
塩素／ＴＤＭ〔ＴＤＭ＝４，４′−ビス−（ジメチルア
ミノ）ジフェニルメタン〕、オルシン／硫酸、アニスア
ルデヒド／硫酸。紫外光２５４ｎｍにおける水噴霧での
非分解検出；
ンは、以下の特徴を有する： （ｉ）外観；無色粉末； （ｉｉ）溶解性；水／氷酢酸またはメタノール／氷酢酸
の混合物にきわめて易溶、低級アルコールに可溶、クロ
ロホルム、アセトン、ジエチルエーテル、石油エーテル
に不溶； （ｉｉｉ）シリカゲル板上の発色反応：ニンヒドリン、
塩素／ＴＤＭ〔ＴＤＭ＝４，４′−ビス−（ジメチルア
ミノ）ジフェニルメタン〕、オルシン／硫酸、アニスア
ルデヒド／硫酸。紫外光２５４ｎｍにおける水噴霧での
非分解検出；
【００１０】（ｉｖ）薄層クロマトグラフイー〔既製の
シリカゲル板６０Ｆ254 （メルク）を使用〕、システム
Ａ；クロロホルム／メタノール／１７％アンモニア（２
／２／１）、ＲF ＝０．７３、システムＢ；クロロホル
ム／メタノール／１７％アンモニア（７０／３５／１
０）、ＲF ＝０．３０、システムＣ；ｎ−ブタノール／
氷酢酸／水（４／１／１）、ＲF ＝０．０５；
シリカゲル板６０Ｆ254 （メルク）を使用〕、システム
Ａ；クロロホルム／メタノール／１７％アンモニア（２
／２／１）、ＲF ＝０．７３、システムＢ；クロロホル
ム／メタノール／１７％アンモニア（７０／３５／１
０）、ＲF ＝０．３０、システムＣ；ｎ−ブタノール／
氷酢酸／水（４／１／１）、ＲF ＝０．０５；
【００１１】（ｖ）ＨＰＬＣ：図７参照 （ｖｉ）安定性：ｐＨ２〜７において安定。ただしそれ
以上高いｐＨでは活性の急激な低下が起こる； （ｖｉｉ）分子量：２１６０付近（陰イオンなしで）； （ｖｉｉｉ）紫外部吸収スペクトル：水溶液、２６７ｎ
ｍに長波長側極大（図３）； （ｉｘ）赤外部吸収スペクトル：サンプルの臭化カリウ
ム錠のＩＲスペクトル（図４）； （ｘ）核磁器共鳴スペクトル： 1Ｈ−ＮＭＲスペクトル
（図５）、13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（図６）。
以上高いｐＨでは活性の急激な低下が起こる； （ｖｉｉ）分子量：２１６０付近（陰イオンなしで）； （ｖｉｉｉ）紫外部吸収スペクトル：水溶液、２６７ｎ
ｍに長波長側極大（図３）； （ｉｘ）赤外部吸収スペクトル：サンプルの臭化カリウ
ム錠のＩＲスペクトル（図４）； （ｘ）核磁器共鳴スペクトル： 1Ｈ−ＮＭＲスペクトル
（図５）、13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（図６）。
【００１２】エピデルミンの配列決定に適当なフラグメ
ントはトリプシン分解によって得た。トリプシンとの反
応により、抗生物質活性は容易に失われる。肉眼的には
ゼリー様の白色沈殿がトリプシン分解により生じ、この
沈殿は遠心分離により除去できた。上澄液を凍結乾燥
し、１％酢酸中セファデックスＧ２５〔ファルマシア
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製デキストランゲル〕上ゲルク
ロマトグラフィーに付した。ニンヒドリン、塩素／ＴＤ
Ｍおよび水で染色できる化学的に均一な分画（以下Ｐ１
分画と呼ぶ）は、エピデルミンのトリプシン分解のＮ末
端フラグメントであることがわかった（下記参照）。
ントはトリプシン分解によって得た。トリプシンとの反
応により、抗生物質活性は容易に失われる。肉眼的には
ゼリー様の白色沈殿がトリプシン分解により生じ、この
沈殿は遠心分離により除去できた。上澄液を凍結乾燥
し、１％酢酸中セファデックスＧ２５〔ファルマシア
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製デキストランゲル〕上ゲルク
ロマトグラフィーに付した。ニンヒドリン、塩素／ＴＤ
Ｍおよび水で染色できる化学的に均一な分画（以下Ｐ１
分画と呼ぶ）は、エピデルミンのトリプシン分解のＮ末
端フラグメントであることがわかった（下記参照）。
【００１３】著しく疎水性のゼリー様沈殿は数種の化学
成分からなり、全分子のＣ末端フラグメントのトリプシ
ン分解時に生成したものである。この沈殿をジチメルホ
ルムアミドに溶解し、次いでジメチルホルムアミドを溶
出液として用いるセファデックスＬＨ−２０〔セファデ
ックスＧ−２５のヒドロキシプロピル化によって得られ
るデキストランゲル、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）製〕上ゲルクロマトグラフィーに付すと、化学的に
均一な生成物（以下Ｐ２と呼ぶ）が得られた。Ｐ２は
水、塩素／ＴＤＭおよび紫外線下に検知できた。Ｐ２は
ニンヒドリン反応陰性であった。
成分からなり、全分子のＣ末端フラグメントのトリプシ
ン分解時に生成したものである。この沈殿をジチメルホ
ルムアミドに溶解し、次いでジメチルホルムアミドを溶
出液として用いるセファデックスＬＨ−２０〔セファデ
ックスＧ−２５のヒドロキシプロピル化によって得られ
るデキストランゲル、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）製〕上ゲルクロマトグラフィーに付すと、化学的に
均一な生成物（以下Ｐ２と呼ぶ）が得られた。Ｐ２は
水、塩素／ＴＤＭおよび紫外線下に検知できた。Ｐ２は
ニンヒドリン反応陰性であった。
【００１４】フラグメントＰ１のアミノ酸分析結果は、
Ｐｒｏ（１），Ｌａｎ（１），β−Ｍｅ−Ｌａｎ
（１），Ｇｌｙ（１），Ａｌａ（２），Ｉｌｅ（２），
Ｐｈｅ（１），Ｌｙｓ（２）であった。全分子のダンシ
ル化によりＮ末端アミノ酸はイソロイシンと決定されて
いること、およびまたフラグメントＰ２はイソロイシン
を含まないことから、フラグメントＰ１は全分子のＮ末
端分解物と考えられる。トリプシン分解によったことか
ら、フラグメントＰ１のＣ末端アミノ酸はリジンである
と考えられる。
Ｐｒｏ（１），Ｌａｎ（１），β−Ｍｅ−Ｌａｎ
（１），Ｇｌｙ（１），Ａｌａ（２），Ｉｌｅ（２），
Ｐｈｅ（１），Ｌｙｓ（２）であった。全分子のダンシ
ル化によりＮ末端アミノ酸はイソロイシンと決定されて
いること、およびまたフラグメントＰ２はイソロイシン
を含まないことから、フラグメントＰ１は全分子のＮ末
端分解物と考えられる。トリプシン分解によったことか
ら、フラグメントＰ１のＣ末端アミノ酸はリジンである
と考えられる。
【００１５】Ｐ１の構造をさらに明瞭にするため、カル
ボキシペプチダーゼＢ（ベーリンガーマンハイム）を用
いて、Ｃ末端アミノ酸のリジンを、酵素により除去し
た。生成したフラグメントＰ１２はセファデックスＧ−
２５上ゲルクロマトグラフィー（１％酢酸）により純粋
に単離することができた。Ｐ１２は、次のアミノ酸：Ｐ
ｒｏ（１），Ｌａｎ（１），β−Ｍｅ−Ｌａｎ（１），
Ｇｌｙ（１），Ａｌａ（２），Ｉｌｅ（２），Ｐｈｅ
（１），Ｌｙｓ（１）からなる。
ボキシペプチダーゼＢ（ベーリンガーマンハイム）を用
いて、Ｃ末端アミノ酸のリジンを、酵素により除去し
た。生成したフラグメントＰ１２はセファデックスＧ−
２５上ゲルクロマトグラフィー（１％酢酸）により純粋
に単離することができた。Ｐ１２は、次のアミノ酸：Ｐ
ｒｏ（１），Ｌａｎ（１），β−Ｍｅ−Ｌａｎ（１），
Ｇｌｙ（１），Ａｌａ（２），Ｉｌｅ（２），Ｐｈｅ
（１），Ｌｙｓ（１）からなる。
【００１６】チオエーテルアミノ酸、ランチオニンおよ
びβ−メチルランチオニンの硫黄橋がエドマン（Ｅｄｍ
ａｎ）法による配列解析の妨害になる。したがって、Ｐ
１２をラネ−ニッケルＷ２と反応させて、硫黄を含まな
いドデカペプチドを得た。メソ−ＬａｎはＤ−およびＬ
−アラニンに、β−メチルランチオニンはＤ−アミノ酪
酸およびＬ−アラニンに変換された。このドデカペプチ
ドの配列はエドマン分解およびＦＡＢスペクトロメトリ
ーにより、下記のとおりであることが明らかにされた： Ｉｌｅ1 −Ａｌａ2 −Ａｌａ3 −Ｌｙｓ4 −Ｐｈｅ5 −
Ｉｌｅ6 −Ａｌａ7 −Ａｂｕ8 −Ｐｒｏ9 −Ｇｌｙ10−
Ａｌａ11−Ａｌａ12
びβ−メチルランチオニンの硫黄橋がエドマン（Ｅｄｍ
ａｎ）法による配列解析の妨害になる。したがって、Ｐ
１２をラネ−ニッケルＷ２と反応させて、硫黄を含まな
いドデカペプチドを得た。メソ−ＬａｎはＤ−およびＬ
−アラニンに、β−メチルランチオニンはＤ−アミノ酪
酸およびＬ−アラニンに変換された。このドデカペプチ
ドの配列はエドマン分解およびＦＡＢスペクトロメトリ
ーにより、下記のとおりであることが明らかにされた： Ｉｌｅ1 −Ａｌａ2 −Ａｌａ3 −Ｌｙｓ4 −Ｐｈｅ5 −
Ｉｌｅ6 −Ａｌａ7 −Ａｂｕ8 −Ｐｒｏ9 −Ｇｌｙ10−
Ａｌａ11−Ａｌａ12
【００１７】フラグメントＰ１２内の硫黄橋の配置につ
いては様々な検討を加えた結果、次の構造が明らかにさ
れた：
いては様々な検討を加えた結果、次の構造が明らかにさ
れた：
【化１】
【００１８】トリプシン分解によって得られたＣ末端フ
ラグメントＰ２は次の構成からなることが明らかにされ
た：Ａｓｎ（１），Ｌａｎ（１），Ｇｌｙ（１），Ｐｈ
ｅ（１），Ｔｙｒ（１），α−ケト酪酸およびＳ−（２
−アミノビニル）−Ｄ−システィン。このα−ケト酪酸
は全分子配列中のリジン13に続くデヒドロアミノ酪酸に
由来する。遊離のアミノ基をもつデヒドロアミノ酸は不
安定で、特にα−ケト酸に変換され易く、トリプシン分
解ではデヒドロアミノ酪酸のアミノ基が除去される。
ラグメントＰ２は次の構成からなることが明らかにされ
た：Ａｓｎ（１），Ｌａｎ（１），Ｇｌｙ（１），Ｐｈ
ｅ（１），Ｔｙｒ（１），α−ケト酪酸およびＳ−（２
−アミノビニル）−Ｄ−システィン。このα−ケト酪酸
は全分子配列中のリジン13に続くデヒドロアミノ酪酸に
由来する。遊離のアミノ基をもつデヒドロアミノ酸は不
安定で、特にα−ケト酸に変換され易く、トリプシン分
解ではデヒドロアミノ酪酸のアミノ基が除去される。
【００１９】トリプシン分解フラグメントＰ２はＮ末端
がα−ケト酪酸で遮閉されている（Ｐ２はニンヒドリン
反応陰性である）。完全加水分解およびアミノ酸分析で
同定されたアミノ酸、ランチオニン、グリシン、フェニ
ルアラニン、チロシンおよびアスパラギン酸のほかに、
Ｐ２には酸完全加水分解で破壊される成分がさらに含ま
れている。これは、エピデルミン（図６）およびフラグ
メントＰ２（図８）の 13Ｃ−核磁気共鳴スペクトルにお
けるそのシグナルから明らかにされた。
がα−ケト酪酸で遮閉されている（Ｐ２はニンヒドリン
反応陰性である）。完全加水分解およびアミノ酸分析で
同定されたアミノ酸、ランチオニン、グリシン、フェニ
ルアラニン、チロシンおよびアスパラギン酸のほかに、
Ｐ２には酸完全加水分解で破壊される成分がさらに含ま
れている。これは、エピデルミン（図６）およびフラグ
メントＰ２（図８）の 13Ｃ−核磁気共鳴スペクトルにお
けるそのシグナルから明らかにされた。
【００２０】このアミノ酸の化学的性質についての情報
はＰ２とラネーニッケルＷ２との反応における２個の主
生成物から得た。製造ＨＰＬＣで単離された両生成物を
完全加水分解すると、この反応によって生じたアミノ酸
クロマトグラム中にさらにＤ−アラニン基が示された。
はＰ２とラネーニッケルＷ２との反応における２個の主
生成物から得た。製造ＨＰＬＣで単離された両生成物を
完全加水分解すると、この反応によって生じたアミノ酸
クロマトグラム中にさらにＤ−アラニン基が示された。
【００２１】この成分の構造は、もとの抗生物質の不均
一水素添加によって明らかにされた。４個の反応生成物
Ｈ１，Ｈ２，Ｈ３およびＨ４を半製造ＨＰＬＣで精製
し、完全加水分解し、キラル固定相上ガスクロマトグラ
フィーに付した（図１５）。図２のクロマトグラムに比
し、Ｈ１およびＨ３にはさらに１個のピークが認めら
れ、これはマススペクトルによりＳ−（２−アミノエチ
ル）−Ｄ−システィンと同定された。エピデルミン中で
は、このアミノ酸は、酸不安定成分、Ｓ−（２−アミノ
ビニル）−Ｄ−システィンとして存在した。
一水素添加によって明らかにされた。４個の反応生成物
Ｈ１，Ｈ２，Ｈ３およびＨ４を半製造ＨＰＬＣで精製
し、完全加水分解し、キラル固定相上ガスクロマトグラ
フィーに付した（図１５）。図２のクロマトグラムに比
し、Ｈ１およびＨ３にはさらに１個のピークが認めら
れ、これはマススペクトルによりＳ−（２−アミノエチ
ル）−Ｄ−システィンと同定された。エピデルミン中で
は、このアミノ酸は、酸不安定成分、Ｓ−（２−アミノ
ビニル）−Ｄ−システィンとして存在した。
【００２２】Ｃ末端フラグメントＰ２のラネーニッケル
Ｗ２処理によって生じた２個のペプチドＰ２１およびＰ
２２はアミノ酸分析およびＣｈｉｒａｓｉｌ−ｖａｌ上
ガスクロマトグラフィーによって次のように特徴づける
ことができた：
Ｗ２処理によって生じた２個のペプチドＰ２１およびＰ
２２はアミノ酸分析およびＣｈｉｒａｓｉｌ−ｖａｌ上
ガスクロマトグラフィーによって次のように特徴づける
ことができた：
【表２】
【００２３】さらに、両生成物ともＣ末端はエチルアミ
ンで遮閉されていた。脱硫と水素添加によってＳ−（２
−アミノビニル）−Ｄ−システィンは分解し、Ｄ−アラ
ニンとエチルアミンが生成された。架橋のないヘプタペ
プチドＰ２１の配列決定（部分加水分解；０．１Ｎ塩
酸、９３℃、１６時間）により、次の構造が明らかにさ
れた： Ｈ3 Ｃ−ＣＨ2 −ＣＯ−ＣＯ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ａｌａ−Ｌ
−Ｐｈｅ−Ｌ−Ａｓｎ−Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｔｙｒ−Ｌ−
Ａｌａ−ＮＨＥｔ
ンで遮閉されていた。脱硫と水素添加によってＳ−（２
−アミノビニル）−Ｄ−システィンは分解し、Ｄ−アラ
ニンとエチルアミンが生成された。架橋のないヘプタペ
プチドＰ２１の配列決定（部分加水分解；０．１Ｎ塩
酸、９３℃、１６時間）により、次の構造が明らかにさ
れた： Ｈ3 Ｃ−ＣＨ2 −ＣＯ−ＣＯ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ａｌａ−Ｌ
−Ｐｈｅ−Ｌ−Ａｓｎ−Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｔｙｒ−Ｌ−
Ａｌａ−ＮＨＥｔ
【００２４】Ｐ２２中に存在するメソランチオニンの架
橋の配置は、部分加水分解およびＰ２１とＰ２２の酵素
フラグメントについての各種化学的検討によって解明さ
れ、トリプシン分解に由来するフラグメントＰ２の構造
は次のように決定された：
橋の配置は、部分加水分解およびＰ２１とＰ２２の酵素
フラグメントについての各種化学的検討によって解明さ
れ、トリプシン分解に由来するフラグメントＰ２の構造
は次のように決定された：
【化２】
【００２５】Ｐ２フラグメントをＮ末端で遮閉している
２−ケト酪酸を、もとの抗生物質に存在するアミノ酸デ
ヒドロブチリンによって当モル置換し、トリプシン分解
ペプチドＰ１とＰ２とを縮合させると、次式で示される
ヘテロデチック四環ペプチド、抗生物質エピデルミンが
生成した：
２−ケト酪酸を、もとの抗生物質に存在するアミノ酸デ
ヒドロブチリンによって当モル置換し、トリプシン分解
ペプチドＰ１とＰ２とを縮合させると、次式で示される
ヘテロデチック四環ペプチド、抗生物質エピデルミンが
生成した：
【００２６】リボソームで合成されたヘテロデチック環
状ドコサペプチド、抗生物質エピデルミンの構造：
状ドコサペプチド、抗生物質エピデルミンの構造：
【化３】
【００２７】各チオエーテルアミノ酸のＮ末端に近い方
の半分はＤ−配置（Ｒ，Ｓ表示法ではＳ−配置に相当す
る）である。本明細書に使用されているものとして、
「Ｓ」、「Ｒ」および「Ｚ」の表示はそれぞれ、不斉炭
素原子の絶対コンフィギュレーションおよびＣ＝Ｃ二重
結合の立体異性に係わるカーン−インゴールド−プレロ
グ（Ｃａｈｎ−Ｉｎｇｏｌｄ−Ｐｒｅｌｏｇ）命令法に
基づくものであり、「Ｓ」または「Ｒ」の記号を付けた
炭素原子はそれぞれ、Ｓ−コンフィギュレーションまた
はＲ−コンフィギュレーションを有することを意味し、
そしてまたＺの記号を付けた二重結合はＺ−コンフィギ
ュレーションを有することを意味するものとする。
の半分はＤ−配置（Ｒ，Ｓ表示法ではＳ−配置に相当す
る）である。本明細書に使用されているものとして、
「Ｓ」、「Ｒ」および「Ｚ」の表示はそれぞれ、不斉炭
素原子の絶対コンフィギュレーションおよびＣ＝Ｃ二重
結合の立体異性に係わるカーン−インゴールド−プレロ
グ（Ｃａｈｎ−Ｉｎｇｏｌｄ−Ｐｒｅｌｏｇ）命令法に
基づくものであり、「Ｓ」または「Ｒ」の記号を付けた
炭素原子はそれぞれ、Ｓ−コンフィギュレーションまた
はＲ−コンフィギュレーションを有することを意味し、
そしてまたＺの記号を付けた二重結合はＺ−コンフィギ
ュレーションを有することを意味するものとする。
【００２８】本発明は、エピデルミンとして知られる抗
生物質の産生菌株に関する。この産生菌株、スタフィロ
コッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）ＤＳＭ３０９５は、
肉汁２〜４％、麦芽エキス１〜３％およびＣａＣＯ
3 ０．２５〜１％もしくはＣａ（ＯＨ）2 ０．２５〜
０．５％（％はとくに指示のない限り重量％である）の
組成を有する混合メジウム中において、３７℃で有気的
に培養される。最大抗生物質活性は１８〜２３時間後に
達成される。
生物質の産生菌株に関する。この産生菌株、スタフィロ
コッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）ＤＳＭ３０９５は、
肉汁２〜４％、麦芽エキス１〜３％およびＣａＣＯ
3 ０．２５〜１％もしくはＣａ（ＯＨ）2 ０．２５〜
０．５％（％はとくに指示のない限り重量％である）の
組成を有する混合メジウム中において、３７℃で有気的
に培養される。最大抗生物質活性は１８〜２３時間後に
達成される。
【００２９】抗生物質を濃縮する手段は、たとえば、１
０リットルの発酵槽からの培養ろ液に対して行われ、各
工程の効率はプレート拡散試験によってチェックした。
活性成分は培養ろ液についてｎ−ブタノール抽出を行
い、細胞および石灰を除去することにより濃縮できた。
しかしながら、ｎ−ブタノールによる抽出は、培養ろ液
の自然の最終ｐＨ８．０においてのみ可能であった。エ
ーテル沈殿により脂質夾雑物を分離することによってさ
らに精製できた。このためには、ブタノール抽出液を蒸
発させ、残留物をメタノールに溶解し、５倍量の冷ジエ
チルエーテル中に攪拌下に注いだ。活性は完全に沈殿中
に残留していた（図９）。
０リットルの発酵槽からの培養ろ液に対して行われ、各
工程の効率はプレート拡散試験によってチェックした。
活性成分は培養ろ液についてｎ−ブタノール抽出を行
い、細胞および石灰を除去することにより濃縮できた。
しかしながら、ｎ−ブタノールによる抽出は、培養ろ液
の自然の最終ｐＨ８．０においてのみ可能であった。エ
ーテル沈殿により脂質夾雑物を分離することによってさ
らに精製できた。このためには、ブタノール抽出液を蒸
発させ、残留物をメタノールに溶解し、５倍量の冷ジエ
チルエーテル中に攪拌下に注いだ。活性は完全に沈殿中
に残留していた（図９）。
【００３０】他の特に適当な濃縮方法は、遠心分離した
培養ろ液の、アンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）Ｘ
ＡＤ−８またはアクリル酸エステルベースの類似ポリマ
ー（Ｓｅｒｖａ）への吸着である。エピデルミンは、単
純な吸着のみでなく、樹脂中の遊離アクリル酸基の陽イ
オン交換活性によっても付着する。これは、活性成分が
樹脂から、メタノール／濃塩酸（９９：１）での溶出に
よって初めて放出できる事実から確認される。強酸性の
溶出液はアンモニアで中和してから、減圧の下に濃縮す
る。アンバーライトＸＡＤ−８への吸着によって処理し
たのちは、引き続くメタノール／エーテルからの再沈殿
は不必要である。
培養ろ液の、アンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）Ｘ
ＡＤ−８またはアクリル酸エステルベースの類似ポリマ
ー（Ｓｅｒｖａ）への吸着である。エピデルミンは、単
純な吸着のみでなく、樹脂中の遊離アクリル酸基の陽イ
オン交換活性によっても付着する。これは、活性成分が
樹脂から、メタノール／濃塩酸（９９：１）での溶出に
よって初めて放出できる事実から確認される。強酸性の
溶出液はアンモニアで中和してから、減圧の下に濃縮す
る。アンバーライトＸＡＤ−８への吸着によって処理し
たのちは、引き続くメタノール／エーテルからの再沈殿
は不必要である。
【００３１】エピデルミンの吸着による単離は、微生物
の培養中に培養培地から直接実施することもできる。安
定性試験およびクロマトグラフィーによる検討を、凍結
乾燥したブタノール抽出物について行った。この抽出物
を種々のｐＨの水溶液とインキュベートしたところ、活
性はｐＨ１０以上では急速に低下したが、この抗生物質
はｐＨ２〜７の範囲で安定である。
の培養中に培養培地から直接実施することもできる。安
定性試験およびクロマトグラフィーによる検討を、凍結
乾燥したブタノール抽出物について行った。この抽出物
を種々のｐＨの水溶液とインキュベートしたところ、活
性はｐＨ１０以上では急速に低下したが、この抗生物質
はｐＨ２〜７の範囲で安定である。
【００３２】ブタノール抽出液を蒸発させた残留物の薄
層クロマトグラフィーでは、各種のスプレー試薬で染色
される複数個の化合物が認められた。平行して行ったバ
イオオートグラムにより、新規活性物質の性質について
重要な情報が得られた。酸性および全中性システムで、
この抗生物質は、シリカゲル６０の薄層クロマトグラフ
ィにおいてベースラインに止まったが、アルカリ性溶出
液でのクロマトグラフィーでは０．３〜０．７５のＲf
値を与えた。アルカリ性システムでバイオオートグラフ
ィーと薄層クロマトグラフィーを組み合わせると、ニン
ヒドリンで染色できる化合物との相関を示した。
層クロマトグラフィーでは、各種のスプレー試薬で染色
される複数個の化合物が認められた。平行して行ったバ
イオオートグラムにより、新規活性物質の性質について
重要な情報が得られた。酸性および全中性システムで、
この抗生物質は、シリカゲル６０の薄層クロマトグラフ
ィにおいてベースラインに止まったが、アルカリ性溶出
液でのクロマトグラフィーでは０．３〜０．７５のＲf
値を与えた。アルカリ性システムでバイオオートグラフ
ィーと薄層クロマトグラフィーを組み合わせると、ニン
ヒドリンで染色できる化合物との相関を示した。
【００３３】これらの予備試験の結果から、この抗生物
質は強塩基性ペプチドであり、カラムから酸性または中
性システムでは溶出できないので、シリカゲル６０上で
のカラムクロマトグラフィーではさらに精製することは
できないことがわかった。脂質を含まないアンバーライ
トＸＡＤ溶出液またはブタノール抽出物をセファデック
スＬＨ−２０上クロマトグラフィーに付し、メタノール
／酢酸（９５：５）で溶出すると、多数の小ペプチド、
アミノ酸および塩が抗生物質のメジウムから分離された
（図９）。
質は強塩基性ペプチドであり、カラムから酸性または中
性システムでは溶出できないので、シリカゲル６０上で
のカラムクロマトグラフィーではさらに精製することは
できないことがわかった。脂質を含まないアンバーライ
トＸＡＤ溶出液またはブタノール抽出物をセファデック
スＬＨ−２０上クロマトグラフィーに付し、メタノール
／酢酸（９５：５）で溶出すると、多数の小ペプチド、
アミノ酸および塩が抗生物質のメジウムから分離された
（図９）。
【００３４】クレーグ（Ｃｒａｉｇ）によって開発され
た操作に従った以後の多段向流分配には、培養ろ液から
の抗生物質の抽出時に得られた経験を役立てることがで
きた。最初の、ｎ−ブタノール／酢酸エチル／０．１Ｎ
酢酸（３：１：３）システムによる液−液分配では、抗
生物質はベースライン上に残った。２−ブタノール／
０．０５Ｎ酢酸アンモニア（１：１）の中性システムで
の第２のクレーグ分配で、抗生物質は装置の中点にあっ
た。酢酸アンモニウムは高減圧下の凍結乾燥により再び
除去できた。凍結乾燥後、エピデルミンは粉末として得
られ、これは使用したすべての薄層システムにおいて均
一であった。
た操作に従った以後の多段向流分配には、培養ろ液から
の抗生物質の抽出時に得られた経験を役立てることがで
きた。最初の、ｎ−ブタノール／酢酸エチル／０．１Ｎ
酢酸（３：１：３）システムによる液−液分配では、抗
生物質はベースライン上に残った。２−ブタノール／
０．０５Ｎ酢酸アンモニア（１：１）の中性システムで
の第２のクレーグ分配で、抗生物質は装置の中点にあっ
た。酢酸アンモニウムは高減圧下の凍結乾燥により再び
除去できた。凍結乾燥後、エピデルミンは粉末として得
られ、これは使用したすべての薄層システムにおいて均
一であった。
【００３５】ヨーロッパ特許出願第０，０２７，７１０
号の操作では、精製は、凍結／融解抽出、抽出剤の蒸
発、限外ろ過、硫酸アンモニウムによる沈殿、セファデ
ックスＧ−５０，Ｇ−２５もしくはＧ−１５上またはバ
イオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ）Ｐ２上イオン交換クロマトグ
ラフィーおよびゲルろ過によって行われるのに対し、本
発明に係る精製方法では、アンバーライトＸＡＤ−８へ
の遠心分離培養ろ液の吸着、ついでセファデックスＬＨ
−２０上ゲルクロマトグラフィー、ついでクレーグによ
る２重向流分配によって均一、純粋な生成物が得られ
る。すなわち、上記ヨーロッパ特許出願と本発明に係る
単離、精製方法とは、全く異なっている。
号の操作では、精製は、凍結／融解抽出、抽出剤の蒸
発、限外ろ過、硫酸アンモニウムによる沈殿、セファデ
ックスＧ−５０，Ｇ−２５もしくはＧ−１５上またはバ
イオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ）Ｐ２上イオン交換クロマトグ
ラフィーおよびゲルろ過によって行われるのに対し、本
発明に係る精製方法では、アンバーライトＸＡＤ−８へ
の遠心分離培養ろ液の吸着、ついでセファデックスＬＨ
−２０上ゲルクロマトグラフィー、ついでクレーグによ
る２重向流分配によって均一、純粋な生成物が得られ
る。すなわち、上記ヨーロッパ特許出願と本発明に係る
単離、精製方法とは、全く異なっている。
【００３６】上記ＥＰ−Ａ−０，０２７，７１０号によ
る既知方法とのその他の相違点は、複合栄養液の選択に
ある。公知の栄養溶液、脳心臓用灌流液（３７ｇ ＢＨ
Ｉ／ｌ）では抗生物質の収量はきわめて低いが、２〜４
％肉汁、１〜３％糖もしくは糖アルコール、たとえば麦
芽エキス、マルトース、ガラクトース、ラクトース、マ
ニトール、グルコースもしくはグリセロール、および
０．２５〜１％炭酸カルシウムもしくは０．２５〜０．
５％水酸化カルシウムからなる本発明で使用される栄養
溶液ではきわめて良好な結果が得られた。
る既知方法とのその他の相違点は、複合栄養液の選択に
ある。公知の栄養溶液、脳心臓用灌流液（３７ｇ ＢＨ
Ｉ／ｌ）では抗生物質の収量はきわめて低いが、２〜４
％肉汁、１〜３％糖もしくは糖アルコール、たとえば麦
芽エキス、マルトース、ガラクトース、ラクトース、マ
ニトール、グルコースもしくはグリセロール、および
０．２５〜１％炭酸カルシウムもしくは０．２５〜０．
５％水酸化カルシウムからなる本発明で使用される栄養
溶液ではきわめて良好な結果が得られた。
【００３７】最良の生産は以下の組成の栄養液によって
達成された。すなわち３％肉汁、２％麦芽エキスおよび
０．３７％水酸化カルシウムである。すべての炭素源の
うち、麦芽エキスについでマルトースがもっともよい産
生を示した。グルコースは他の炭素源との組合せとして
のみ使用すべきである。ラクトースとマルトースまたは
ガラクトースとマルトースの組合せも良好な結果を与え
た。
達成された。すなわち３％肉汁、２％麦芽エキスおよび
０．３７％水酸化カルシウムである。すべての炭素源の
うち、麦芽エキスについでマルトースがもっともよい産
生を示した。グルコースは他の炭素源との組合せとして
のみ使用すべきである。ラクトースとマルトースまたは
ガラクトースとマルトースの組合せも良好な結果を与え
た。
【００３８】他の慣用の炭素源はいずれも、全く産生を
みないか、または収率はきわめて低かった。全２０種の
アミノ酸を各２ｇ／ｌの濃度とした窒素源も肉エキスと
同じ結果を与えた。カサミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）は、トリ
プトファン（１〜２ｍｍ）とビタミンを添加した場合に
は窒素源として適している。適当なビタミンとしては
（カッコ内は好ましい濃度）、ビオチン（０．００６ｍ
ｇ／ｌ）、ニコチン酸（２．３ｍｇ／ｌ）、チアミン
（１．０ｍｇ／ｌ）、ピリドキシン塩酸塩（１２．０ｍ
ｇ／ｌ）、パントテン酸カルシウム（１．２ｍｇ／ｌ）
がある。
みないか、または収率はきわめて低かった。全２０種の
アミノ酸を各２ｇ／ｌの濃度とした窒素源も肉エキスと
同じ結果を与えた。カサミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）は、トリ
プトファン（１〜２ｍｍ）とビタミンを添加した場合に
は窒素源として適している。適当なビタミンとしては
（カッコ内は好ましい濃度）、ビオチン（０．００６ｍ
ｇ／ｌ）、ニコチン酸（２．３ｍｇ／ｌ）、チアミン
（１．０ｍｇ／ｌ）、ピリドキシン塩酸塩（１２．０ｍ
ｇ／ｌ）、パントテン酸カルシウム（１．２ｍｇ／ｌ）
がある。
【００３９】発酵は３４〜３７℃の温度で、充分の通気
下に実施する。最良の産生パターンは発酵前のｐＨが
６．０〜７．０のときに得られる。２価の陽イオンの炭
酸塩または水酸化物、たとえば炭酸カルシウムまたは水
酸化カルシウムの非存在下には産生は起こらない。炭酸
カルシウムの添加後、たとえばｐＨ値は特徴的なパター
ンを示し、酸性域に低下し、この場合、産生は起こらな
い。ついでｐＨ値をわずかにアルカリの範囲まで上昇さ
せてやると、産生が始まる。炭酸カルシウムの代わりに
炭酸マグネシウムを使用することもできるが、炭酸カル
シウムよりも水酸化カルシウムの方が好結果を与える。
５０ｍＭの水酸化カルシウムにより、２５ｍＭの炭酸カ
ルシウムの場合に比べて、産生は増加する。炭素源
（糖）が菌株によって利用されると、生成した有機酸は
２価の陽イオンとコンプレックを形成し、同時にメジウ
ムを緩衝化する。
下に実施する。最良の産生パターンは発酵前のｐＨが
６．０〜７．０のときに得られる。２価の陽イオンの炭
酸塩または水酸化物、たとえば炭酸カルシウムまたは水
酸化カルシウムの非存在下には産生は起こらない。炭酸
カルシウムの添加後、たとえばｐＨ値は特徴的なパター
ンを示し、酸性域に低下し、この場合、産生は起こらな
い。ついでｐＨ値をわずかにアルカリの範囲まで上昇さ
せてやると、産生が始まる。炭酸カルシウムの代わりに
炭酸マグネシウムを使用することもできるが、炭酸カル
シウムよりも水酸化カルシウムの方が好結果を与える。
５０ｍＭの水酸化カルシウムにより、２５ｍＭの炭酸カ
ルシウムの場合に比べて、産生は増加する。炭素源
（糖）が菌株によって利用されると、生成した有機酸は
２価の陽イオンとコンプレックを形成し、同時にメジウ
ムを緩衝化する。
【００４０】図１０は、結果を生菌数と、ミクロカッカ
ス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕ
ｓ）ＡＴＣＣ９３４１に対する阻止面積をｍｍで表示し
た抗生物質の産生について示した曲線であり、本発明に
係るメジウムと前記ヨーロッパ特許における脳心臓灌流
メジウム（Ｄｉｆｃｏ）とを比較したものである。
ス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕ
ｓ）ＡＴＣＣ９３４１に対する阻止面積をｍｍで表示し
た抗生物質の産生について示した曲線であり、本発明に
係るメジウムと前記ヨーロッパ特許における脳心臓灌流
メジウム（Ｄｉｆｃｏ）とを比較したものである。
【００４１】最大生産の瞬間における活性の増大を検量
線を用いたプレート拡散試験で測定した結果は次のとお
りであった（脳心臓灌流栄養液における活性を１００％
とした）： ａ）脳心臓灌流アガール １００％ ｂ）３％肉エキス、２％麦芽エキス、２５ｍＭ炭酸カルシウム ２００％ ｃ）３％肉エキス、２％麦芽エキス、５０ｍＭ水酸化カルシウム ３２０％ これらのデータは絶対産生量とは一致しない。しかしな
がら、プレート拡散試験で得られた数値との比較では、
既知の操作と比較し、本発明に係る操作を用いた場合の
有意な収率の増加が明らかに示されている。
線を用いたプレート拡散試験で測定した結果は次のとお
りであった（脳心臓灌流栄養液における活性を１００％
とした）： ａ）脳心臓灌流アガール １００％ ｂ）３％肉エキス、２％麦芽エキス、２５ｍＭ炭酸カルシウム ２００％ ｃ）３％肉エキス、２％麦芽エキス、５０ｍＭ水酸化カルシウム ３２０％ これらのデータは絶対産生量とは一致しない。しかしな
がら、プレート拡散試験で得られた数値との比較では、
既知の操作と比較し、本発明に係る操作を用いた場合の
有意な収率の増加が明らかに示されている。
【００４２】エピデルミンの産生に用いられる本発明の
菌株は、シュライファーほか（Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ ＆
Ｋｌｏｏｓ）により、次のように特徴づけされている
〔インターナショナル・ジャーナル・フォア・システマ
トロジー・オブ・バクテリア（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．
Ｂａｃｔ．）２５巻、５０〜６１、１９７５〕： （ｉ）グラム染色：陽性 （ｉｉ）細胞サイズ：直径０．５〜０．８μｍ （ｉｉｉ）コロニーのサイズ：直径約１ｍｍ （ｉｖ）コロニーの外観：平坦、光沢あり、中央がわず
かに盛り上がる
菌株は、シュライファーほか（Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ ＆
Ｋｌｏｏｓ）により、次のように特徴づけされている
〔インターナショナル・ジャーナル・フォア・システマ
トロジー・オブ・バクテリア（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．
Ｂａｃｔ．）２５巻、５０〜６１、１９７５〕： （ｉ）グラム染色：陽性 （ｉｉ）細胞サイズ：直径０．５〜０．８μｍ （ｉｉｉ）コロニーのサイズ：直径約１ｍｍ （ｉｖ）コロニーの外観：平坦、光沢あり、中央がわず
かに盛り上がる
【００４３】（ｖ）コロニーの色：灰色がかった白色 （ｖｉ）培養液中の細胞：通常、単独または２個の群を
なす。大きなクランプをなすことは稀 （ｖｉｉ）溶血：血液スライド上に培養液を広げると強
い溶血を示す （ｖｉｉｉ）無気的成育：無気的条件下にもこの株は成
育する （ｉｘ）リゾチーム感受性：２ｍｇ／ｍｌまではリゾチ
ームに対し細胞は抵抗する （ｘ）ライソスタフィン感受性：２０μｇ／ｍｌでもラ
イソスタフィンに対し細胞は感受性を示す
なす。大きなクランプをなすことは稀 （ｖｉｉ）溶血：血液スライド上に培養液を広げると強
い溶血を示す （ｖｉｉｉ）無気的成育：無気的条件下にもこの株は成
育する （ｉｘ）リゾチーム感受性：２ｍｇ／ｍｌまではリゾチ
ームに対し細胞は抵抗する （ｘ）ライソスタフィン感受性：２０μｇ／ｍｌでもラ
イソスタフィンに対し細胞は感受性を示す
【００４４】（ｘｉ）エピデルミン抵抗性：１ｍｇ／ｍ
ｌまで認められる （ｘｉｉ）その他の抵抗性：液体培養においてこの株は
ストレプトマイシン（１ｍｇ／ｍｌまで）、スペクチノ
マイシン（０．５ｍｇ／ｍｌまで）に対し著しい抵抗性
を示す （ｘｉｉｉ）食塩含量の増大：食塩含量１５重量％まで
はなお良好な生育を示す。 コロニーまたは塗布した培養液は著しい粘着性を示す。
ｌまで認められる （ｘｉｉ）その他の抵抗性：液体培養においてこの株は
ストレプトマイシン（１ｍｇ／ｍｌまで）、スペクチノ
マイシン（０．５ｍｇ／ｍｌまで）に対し著しい抵抗性
を示す （ｘｉｉｉ）食塩含量の増大：食塩含量１５重量％まで
はなお良好な生育を示す。 コロニーまたは塗布した培養液は著しい粘着性を示す。
【００４５】各種炭素源の利用性と酸の形成および他の
酵素反応はアピ−スタフ・システム〔Ａｐｉ−Ｓｔａｐ
ｈ Ｓｙｓｔｅｍ〕，バイオメリュー（Ｂｉｏｍｅｒｉ
ｅｕｘ），ニュルティンゲン（Ｎｕｒｔｉｎｇｅｎ）を
用いて決定した。このシステムは、クルースほか（Ｋｌ
ｏｏｓ ＆ Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ）の分類にあてはめる
ことが可能な２０種の生化学反応の組合せに基づくもの
である〔ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイ
オロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）第１
巻、８２〜８８、１９７５〕。
酵素反応はアピ−スタフ・システム〔Ａｐｉ−Ｓｔａｐ
ｈ Ｓｙｓｔｅｍ〕，バイオメリュー（Ｂｉｏｍｅｒｉ
ｅｕｘ），ニュルティンゲン（Ｎｕｒｔｉｎｇｅｎ）を
用いて決定した。このシステムは、クルースほか（Ｋｌ
ｏｏｓ ＆ Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ）の分類にあてはめる
ことが可能な２０種の生化学反応の組合せに基づくもの
である〔ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイ
オロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）第１
巻、８２〜８８、１９７５〕。
【００４６】
【表３】
【００４７】スタフィロコッカス・エピデルミディスＤ
ＳＭ３０９５菌株を、斜面チューブ上、以下の組成のメ
ジウムに接種した： ペプトン １０ｇ リン酸−水素ナトリウム ２ｇ 肉エキス ８ｇ グルコース １０ｇ（別個にオートク
レーブ処理） 食塩 ３ｇ ｐＨ ７．２ ついで一夜３７℃でインキュベートし、−２０℃に凍結
した。長期に保存すると活性の消失をみるので各試験混
合物用に新鮮なチューブを解凍した。
ＳＭ３０９５菌株を、斜面チューブ上、以下の組成のメ
ジウムに接種した： ペプトン １０ｇ リン酸−水素ナトリウム ２ｇ 肉エキス ８ｇ グルコース １０ｇ（別個にオートク
レーブ処理） 食塩 ３ｇ ｐＨ ７．２ ついで一夜３７℃でインキュベートし、−２０℃に凍結
した。長期に保存すると活性の消失をみるので各試験混
合物用に新鮮なチューブを解凍した。
【００４８】以下に本発明に係る抗生物質のさらに詳細
な製造方法を述べる。発酵は適当な振盪フラスコ中で行
い、大量の物質を製造するには容量２００リットル
（ｌ）以上のファーメンターを使用する。フラスコ試験
には、側口のある５００ｍｌのエルレンマイヤーフラス
コを用いた。フラスコに栄養液１００ｍｌを加え、１２
１℃で２０分間、オートクレーブ処理した。接種には４
時間目の１％予備培養液を使用した。接種は３７℃で、
１４０ｒｐｍで回転させた振盪器中で行った。
な製造方法を述べる。発酵は適当な振盪フラスコ中で行
い、大量の物質を製造するには容量２００リットル
（ｌ）以上のファーメンターを使用する。フラスコ試験
には、側口のある５００ｍｌのエルレンマイヤーフラス
コを用いた。フラスコに栄養液１００ｍｌを加え、１２
１℃で２０分間、オートクレーブ処理した。接種には４
時間目の１％予備培養液を使用した。接種は３７℃で、
１４０ｒｐｍで回転させた振盪器中で行った。
【００４９】１０リットルのスケールでの発酵には、有
効容量１０リットルのファーメンター〔ニュー・ブルン
スウイック・サイエンティフイック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎ
ｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社（米国）製のＭ
Ｆ−１４型〕に９．９リットルの栄養溶液を加え、１３
４℃で３０分間、オートクレーブ処理した。冷却後、４
時間目の予備培養液１００ｍｌで栄養溶液を接種し、３
７℃、０．６ｖｖｍ、２４０ｒｐｍの速度のブレード攪
拌器を用いて発酵を行った。滅菌ポリオールをくり返し
添加して比較的強い発泡をおさえる。
効容量１０リットルのファーメンター〔ニュー・ブルン
スウイック・サイエンティフイック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎ
ｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社（米国）製のＭ
Ｆ−１４型〕に９．９リットルの栄養溶液を加え、１３
４℃で３０分間、オートクレーブ処理した。冷却後、４
時間目の予備培養液１００ｍｌで栄養溶液を接種し、３
７℃、０．６ｖｖｍ、２４０ｒｐｍの速度のブレード攪
拌器を用いて発酵を行った。滅菌ポリオールをくり返し
添加して比較的強い発泡をおさえる。
【００５０】２５リットルスケールの発酵には、２５リ
ットルのファーメンター〔再循環システム付きブラウン
／メルスンゲン（Ｂｒａｕｎ／Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ）製
ｂ２５型〕に栄養溶液２５リットルを満たし、ポリオー
ル３ｍｌを加えて、そのまま１２１℃で３０分間滅菌し
た。接種には４時間目の予備培養液３００ｍｌを用い
た。発酵は３７℃、０．６ｖｖｍ、１０００ｒｐｍで実
施した。肉エキス３０ｇ、麦芽エキス２０ｇおよび炭酸
カルシウム５ｇを１リットル中に含む栄養溶液中、１０
リットルのスケールで実施した発酵過程を図１１に示
す。供給炭素源の利用と酸の形成を伴う強力な生育が、
ｐＨ値の低下として検知できる。アルカリ化の開始とと
もに、抗生物質が培養ろ液中に検出できる。産生は１２
〜１８時間後にピークに達する。
ットルのファーメンター〔再循環システム付きブラウン
／メルスンゲン（Ｂｒａｕｎ／Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ）製
ｂ２５型〕に栄養溶液２５リットルを満たし、ポリオー
ル３ｍｌを加えて、そのまま１２１℃で３０分間滅菌し
た。接種には４時間目の予備培養液３００ｍｌを用い
た。発酵は３７℃、０．６ｖｖｍ、１０００ｒｐｍで実
施した。肉エキス３０ｇ、麦芽エキス２０ｇおよび炭酸
カルシウム５ｇを１リットル中に含む栄養溶液中、１０
リットルのスケールで実施した発酵過程を図１１に示
す。供給炭素源の利用と酸の形成を伴う強力な生育が、
ｐＨ値の低下として検知できる。アルカリ化の開始とと
もに、抗生物質が培養ろ液中に検出できる。産生は１２
〜１８時間後にピークに達する。
【００５１】発酵過程のモニターには、発酵開始後の種
々の時間に滅菌条件下にサンプルを採取し、次の各項目
について評価した： ａ）ｐＨ値：実験室用ｐＨメーター〔ニック（Ｋｎｉｃ
ｋ）ｐＨ ｍＶメーター）で測定 ｂ）生育過程：生存細菌数の増加を観察して生育をモニ
ターできる。この目的には、培養液０．５ｍｌを滅菌条
件下に採取し、食塩水で稀釈し、この希釈液０．１ｍｌ
をスライド上に塗布した（メジウム：１リットルあた
り、ペプトン１０ｇ、肉エキス８ｇ、食塩３ｇ、リン酸
−水素ナトリウム２ｇ、グルコース１０ｇ）。３７℃で
１８時間インキュベートしたのちには各コロニーを数え
ることができた。
々の時間に滅菌条件下にサンプルを採取し、次の各項目
について評価した： ａ）ｐＨ値：実験室用ｐＨメーター〔ニック（Ｋｎｉｃ
ｋ）ｐＨ ｍＶメーター）で測定 ｂ）生育過程：生存細菌数の増加を観察して生育をモニ
ターできる。この目的には、培養液０．５ｍｌを滅菌条
件下に採取し、食塩水で稀釈し、この希釈液０．１ｍｌ
をスライド上に塗布した（メジウム：１リットルあた
り、ペプトン１０ｇ、肉エキス８ｇ、食塩３ｇ、リン酸
−水素ナトリウム２ｇ、グルコース１０ｇ）。３７℃で
１８時間インキュベートしたのちには各コロニーを数え
ることができた。
【００５２】ｃ）抗生物質濃度：サンプルをエペンドル
フ遠心分離機３２００で２分間遠心分離し、その上澄液
２０μｌについてプレート拡散試験を実施した。同時
に、既知濃度で検量曲線をプロットした。 最大産生に到達したのち、培養液を連続遠心分離〔ロー
エル・ウント・ゼェーネ、ルーシュトルフ／ロット（Ｌ
ｏｈｅｒ ＆ Ｓｏｈｎｅ，Ｒｕｈｓｔｏｒｆ／Ｒｏｔ
ｔ）、ＬＡ７１ｂ−４型〕によって１３８０ｒｐｍで分
離した。細胞の至適分離のためには、流速をきわめて低
く保つ必要があった。活性成分の最初の濃縮は、以下の
例１に記載するように、前述のアンバーライトＸＡＤ−
８への吸着によって行った。
フ遠心分離機３２００で２分間遠心分離し、その上澄液
２０μｌについてプレート拡散試験を実施した。同時
に、既知濃度で検量曲線をプロットした。 最大産生に到達したのち、培養液を連続遠心分離〔ロー
エル・ウント・ゼェーネ、ルーシュトルフ／ロット（Ｌ
ｏｈｅｒ ＆ Ｓｏｈｎｅ，Ｒｕｈｓｔｏｒｆ／Ｒｏｔ
ｔ）、ＬＡ７１ｂ−４型〕によって１３８０ｒｐｍで分
離した。細胞の至適分離のためには、流速をきわめて低
く保つ必要があった。活性成分の最初の濃縮は、以下の
例１に記載するように、前述のアンバーライトＸＡＤ−
８への吸着によって行った。
【００５３】
【実施例】例 １ 培養ろ液８０リットルを約８リットルのアンバーライト
ＸＡＤ−８上に注いだ。通過液には活性は全く検出され
なかった。ついで水で洗浄したが、この場合も活性は溶
出されなかった。続いてメタノール１３リットルで洗浄
した。洗浄液には活性は検出されなかった。溶出はメタ
ノール／塩酸９９：１を用いて行い、以下の分画を得
た： 分画１：０．８リットル 活性 分画２：４．５リットル 主な活性分画 分画３： ２リットル 活性 分画４： ２リットル 活性なし 分画５： １リットル 活性なし
ＸＡＤ−８上に注いだ。通過液には活性は全く検出され
なかった。ついで水で洗浄したが、この場合も活性は溶
出されなかった。続いてメタノール１３リットルで洗浄
した。洗浄液には活性は検出されなかった。溶出はメタ
ノール／塩酸９９：１を用いて行い、以下の分画を得
た： 分画１：０．８リットル 活性 分画２：４．５リットル 主な活性分画 分画３： ２リットル 活性 分画４： ２リットル 活性なし 分画５： １リットル 活性なし
【００５４】上記各分画について薄層クロマトグラフィ
ーを行い、エピデルミン含量を調べ、ついで活性分画を
合せて、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固させた
（８１．２ｇ）。残留物をメタノール／酢酸（９５／
５）４００ｍｌに取り、遠心分離して不溶成分を除き、
５０ｍｌのセファデックスＬＨ−５０（カラム１００×
５ｃｍ）を用い、バッチ法でゲルクロマトグラフィを行
った（溶出液：メタノール／酢酸９５／５）。陽性分画
を合し、蒸発濃縮した（１４．８ｇ）。
ーを行い、エピデルミン含量を調べ、ついで活性分画を
合せて、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固させた
（８１．２ｇ）。残留物をメタノール／酢酸（９５／
５）４００ｍｌに取り、遠心分離して不溶成分を除き、
５０ｍｌのセファデックスＬＨ−５０（カラム１００×
５ｃｍ）を用い、バッチ法でゲルクロマトグラフィを行
った（溶出液：メタノール／酢酸９５／５）。陽性分画
を合し、蒸発濃縮した（１４．８ｇ）。
【００５５】クレーグによる多段分配には、ラボルテッ
ク（Ｌａｂｏｒｔｅｃ，Ｂａｓｌｅ）の装置を使用し
た。最初の分離は５０ｍｌの装置で、ｎ−ブタノール／
酢酸エチル／０．１Ｍ酢酸（３／１／３）の分配系を用
いて行った。サンプル（５ｇ）を下相（１００ｍｌ）に
溶解し、以下の条件で分離した： 段数 １６０ 各段の振動移動 ７０ 振動の強度 ４５ 分離時間 ２０分
ク（Ｌａｂｏｒｔｅｃ，Ｂａｓｌｅ）の装置を使用し
た。最初の分離は５０ｍｌの装置で、ｎ−ブタノール／
酢酸エチル／０．１Ｍ酢酸（３／１／３）の分配系を用
いて行った。サンプル（５ｇ）を下相（１００ｍｌ）に
溶解し、以下の条件で分離した： 段数 １６０ 各段の振動移動 ７０ 振動の強度 ４５ 分離時間 ２０分
【００５６】最終精製には、得られた粗生成物（４．２
ｇ）を２ｇのバッチで、２−ブタノール／０．０５Ｎ酢
酸アンモニウムシステムの下相（５０ｍｌ）に溶解し、
エレメント４４０の１０ｍｌ装置で精製した： 段数 ４４０ 各段の振動移動 ５０ 振動の強度 ５０ 分離時間 １０分 エピデルミンを含むエレメントを合し、蒸発濃縮し、水
に取り、高真空下に数回凍結乾燥した。抗生物質（２．
６ｇ）は実施したすべての試験において均一であった。
ｇ）を２ｇのバッチで、２−ブタノール／０．０５Ｎ酢
酸アンモニウムシステムの下相（５０ｍｌ）に溶解し、
エレメント４４０の１０ｍｌ装置で精製した： 段数 ４４０ 各段の振動移動 ５０ 振動の強度 ５０ 分離時間 １０分 エピデルミンを含むエレメントを合し、蒸発濃縮し、水
に取り、高真空下に数回凍結乾燥した。抗生物質（２．
６ｇ）は実施したすべての試験において均一であった。
【００５７】エピデルミンの製造および単離過程での生
物学的特徴の検査、すなわち活性スペクトルの記録およ
び産生、後処理、濃縮のモニターにはプレート拡散試験
を用いた。試験は、グライナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｎｕ
ｒｔｉｎｇｅｎ）製のペトリ皿、径６ｍｍのろ過ディス
ク〔マシェリー・ウントナーゲル（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆
Ｎａｇｅｌ，Ｄｕｒｅｎ）〕を用い、ツェナーほか
（Ｚａｈｎｅｒ ＆ Ｍａｓｓ）のバイオロジー・オブ
・アンティバイオティックス（Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ Ａ
ｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａ
ｇ，Ｂｅｒｌｉｎ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ−Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ，１９７２）の記載に従って実施した。
物学的特徴の検査、すなわち活性スペクトルの記録およ
び産生、後処理、濃縮のモニターにはプレート拡散試験
を用いた。試験は、グライナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｎｕ
ｒｔｉｎｇｅｎ）製のペトリ皿、径６ｍｍのろ過ディス
ク〔マシェリー・ウントナーゲル（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆
Ｎａｇｅｌ，Ｄｕｒｅｎ）〕を用い、ツェナーほか
（Ｚａｈｎｅｒ ＆ Ｍａｓｓ）のバイオロジー・オブ
・アンティバイオティックス（Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ Ａ
ｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａ
ｇ，Ｂｅｒｌｉｎ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ−Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ，１９７２）の記載に従って実施した。
【００５８】ろ過ディスクを適当な試験液２０μｌで湿
らせ、室温においてガラススライド上で乾燥させ、試験
プレート上に置いた。試験プレートを３７℃でインキュ
ベートし、生育阻止を約１６時間後に評価した。ルーチ
ンの試験細菌としては、操作上の問題が少ないので、ス
トレプトコッカス・パイロジェンズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ８６６８
と、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｌｕｔｅｕｓ）ＡＴＣＣ９３４１を用いた。
らせ、室温においてガラススライド上で乾燥させ、試験
プレート上に置いた。試験プレートを３７℃でインキュ
ベートし、生育阻止を約１６時間後に評価した。ルーチ
ンの試験細菌としては、操作上の問題が少ないので、ス
トレプトコッカス・パイロジェンズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ８６６８
と、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｌｕｔｅｕｓ）ＡＴＣＣ９３４１を用いた。
【００５９】ストレプトコッカス・パイロジェンズＡＴ
ＣＣ８６６８の試験プレート：試験プレートの調製前
に、試験細菌を血液プレート上にムチンとともに新たに
接種する必要がある〔メジウム：ｐＨ７．４アガール５
００ｍｌ、ムチン溶液（１０重量％）１６０ｍｌ、グル
コース溶液（５０重量％）３．５ｍｌおよびヒツジ血液
７０ｍｌ〕。１５〜１８時間、３７℃でインキュベート
したのち、食塩懸濁液（Ｅ578 ０．５）を調製し、この
懸濁液１ｍｌを栄養ベース〔メジウム：ペプトン１０
ｇ、肉エキス８ｇ、食塩３ｇ、Ｎａ2 ＨＰＯ4 ２ｇ、グ
ルコース１０ｇ（いずれも１リットルあたり）、ｐＨ
７．２〕１００ｍｌ中にピペットで加えた。１０ｍｌの
バッチをもつプレートは４℃に数日間保存できた。
ＣＣ８６６８の試験プレート：試験プレートの調製前
に、試験細菌を血液プレート上にムチンとともに新たに
接種する必要がある〔メジウム：ｐＨ７．４アガール５
００ｍｌ、ムチン溶液（１０重量％）１６０ｍｌ、グル
コース溶液（５０重量％）３．５ｍｌおよびヒツジ血液
７０ｍｌ〕。１５〜１８時間、３７℃でインキュベート
したのち、食塩懸濁液（Ｅ578 ０．５）を調製し、この
懸濁液１ｍｌを栄養ベース〔メジウム：ペプトン１０
ｇ、肉エキス８ｇ、食塩３ｇ、Ｎａ2 ＨＰＯ4 ２ｇ、グ
ルコース１０ｇ（いずれも１リットルあたり）、ｐＨ
７．２〕１００ｍｌ中にピペットで加えた。１０ｍｌの
バッチをもつプレートは４℃に数日間保存できた。
【００６０】ミクロコッカス・ルテウスＡＴＣＣ９３４
１の試験プレート：一夜培養液（メジウム：１リットル
あたり、ペプトン１０ｇ、肉エキス８ｇ、食塩３ｇ、Ｎ
ａ2ＨＰＯ4 ２ｇ、グルコース１０ｇ、ｐＨ７．２）を
５７８ｎｍの吸光度が１．０になるように希釈した。ア
ガール１００ｍｌにこの懸濁液０．２５ｍｌを接種し、
バッチ１０ｍｌをスライド上に注いだ。試験プレートは
４℃で数日間保存できた。
１の試験プレート：一夜培養液（メジウム：１リットル
あたり、ペプトン１０ｇ、肉エキス８ｇ、食塩３ｇ、Ｎ
ａ2ＨＰＯ4 ２ｇ、グルコース１０ｇ、ｐＨ７．２）を
５７８ｎｍの吸光度が１．０になるように希釈した。ア
ガール１００ｍｌにこの懸濁液０．２５ｍｌを接種し、
バッチ１０ｍｌをスライド上に注いだ。試験プレートは
４℃で数日間保存できた。
【００６１】活性スペクトル用試験プレート： 細菌の試験プレート： α）好気性細菌 一夜培養液を関連試験メジウム中で成育させ、プレート
はミクロコッカス・ルテウスＡＴＣＣ９３４１の場合と
同様にして調製した。 β）嫌気性細菌 クロストリジウム・パストウリアナムＡＴＣＣ６１０３
およびプロピオニバクテリウム・アクネＤＳＭ１８９７
の予備培養液を、酸素を除くために栄養溶液を綿栓まで
満たした試験管内で成育させた。この培養液３ｍｌでア
ガール１００ｍｌを接種し、そのバッチ１０ｍｌをプレ
ート上に注いだ。無気ポット（ＢＢＬ−Ｇａｓ Ｐａｋ
１００、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｇｍｂ
Ｈ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）中至適温度でインキュベー
ションを行った。
はミクロコッカス・ルテウスＡＴＣＣ９３４１の場合と
同様にして調製した。 β）嫌気性細菌 クロストリジウム・パストウリアナムＡＴＣＣ６１０３
およびプロピオニバクテリウム・アクネＤＳＭ１８９７
の予備培養液を、酸素を除くために栄養溶液を綿栓まで
満たした試験管内で成育させた。この培養液３ｍｌでア
ガール１００ｍｌを接種し、そのバッチ１０ｍｌをプレ
ート上に注いだ。無気ポット（ＢＢＬ−Ｇａｓ Ｐａｋ
１００、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｇｍｂ
Ｈ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）中至適温度でインキュベー
ションを行った。
【００６２】イースト様菌の試験プレート：振盪培養液
中、関連試験メジウムで１８〜２０時間、細胞を成育さ
せた。トーマの計数チャンバーで計数下のち、アガール
１ｍｌあたりの細胞数が１０6 個になるように試験プレ
ートに接種した。 菌およびストレプトマイセスの試験プレート：試験微生
物は斜面チューブ上（メジウム：１リットルあたり、酵
母エキス４ｇ、麦芽エキス１０ｇ、グルコース４ｇ）、
相当温度で胞子形成を生じるまで成育させた。胞子を３
ｍｌの食塩ツィーン８０（食塩水１００ｍｌにツィーン
８０を１滴添加したもの）に浮遊させ、試験プレート中
に注いだ。
中、関連試験メジウムで１８〜２０時間、細胞を成育さ
せた。トーマの計数チャンバーで計数下のち、アガール
１ｍｌあたりの細胞数が１０6 個になるように試験プレ
ートに接種した。 菌およびストレプトマイセスの試験プレート：試験微生
物は斜面チューブ上（メジウム：１リットルあたり、酵
母エキス４ｇ、麦芽エキス１０ｇ、グルコース４ｇ）、
相当温度で胞子形成を生じるまで成育させた。胞子を３
ｍｌの食塩ツィーン８０（食塩水１００ｍｌにツィーン
８０を１滴添加したもの）に浮遊させ、試験プレート中
に注いだ。
【００６３】エピデルミンはきわめて優れた抗生物質活
性を有するが、特にグラム陽性菌の系列に対して有効で
ある。エピデルミンの抗生物質活性は、ナイシン（ｎｉ
ｓｉｎ：ナイシンについては、特にＤＥ−Ａ−２，００
０，８１８号またはＧＢ−Ｂ−１，１８２，１５６号参
照）と比較して試験した。一部の臨床に関連する重要な
細菌についてはフシド酸も比較に含めた。有効性はプレ
ート拡散試験により最小阻止濃度を求めて決定した。
性を有するが、特にグラム陽性菌の系列に対して有効で
ある。エピデルミンの抗生物質活性は、ナイシン（ｎｉ
ｓｉｎ：ナイシンについては、特にＤＥ−Ａ−２，００
０，８１８号またはＧＢ−Ｂ−１，１８２，１５６号参
照）と比較して試験した。一部の臨床に関連する重要な
細菌についてはフシド酸も比較に含めた。有効性はプレ
ート拡散試験により最小阻止濃度を求めて決定した。
【００６４】ａ）プレート拡散試験 プレート拡散試験では、エピデルミンおよびナイシンに
対する各種微生物の感受性を調べた。第２表は、この両
抗生物質がグラム陽性菌にほぼ、もっぱら作用すること
を示している。ナイシンは４０，０００単位の活性のも
のを使用した。この表において、（−）は活性のないこ
とを示し、そして Ｓｐ：痕跡
対する各種微生物の感受性を調べた。第２表は、この両
抗生物質がグラム陽性菌にほぼ、もっぱら作用すること
を示している。ナイシンは４０，０００単位の活性のも
のを使用した。この表において、（−）は活性のないこ
とを示し、そして Ｓｐ：痕跡
【００６５】
【表４】
【００６６】
【表５】
【００６７】ｂ）最小阻止濃度 臨床的に関連ある細菌についての最小阻止濃度（μｇ／
ｍｌ）を、以下のメジウム中マイクロタイタープレート
で試験した：蒸留水１，０００ｍｌ中、乳酸ナトリウム
５ｍｌ、Ｎａ2 ＳＯ4 ５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｍ
ｇＣｌ2 ０．１ｇ、ＮＨ4 Ｃｌ ５ｇ、グルコース１０
ｇ、パントテン酸カルシウム５０μｇ、チアミン５０μ
ｇ、葉酸０．２５μｇ、ナイアシン５０μｇ、ｐ−アミ
ノ安息香酸２５μｇ、ピキドキシン塩酸塩５０μｇ、リ
ボフラビン２５μｇ。第３表には、エピデルミン、ナイ
シンおよびフシド酸の最小阻止濃度（μｇ／ｍｌ）を比
較して示す。この場合用いたナイシンの活性は２５００
単位であった。
ｍｌ）を、以下のメジウム中マイクロタイタープレート
で試験した：蒸留水１，０００ｍｌ中、乳酸ナトリウム
５ｍｌ、Ｎａ2 ＳＯ4 ５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｍ
ｇＣｌ2 ０．１ｇ、ＮＨ4 Ｃｌ ５ｇ、グルコース１０
ｇ、パントテン酸カルシウム５０μｇ、チアミン５０μ
ｇ、葉酸０．２５μｇ、ナイアシン５０μｇ、ｐ−アミ
ノ安息香酸２５μｇ、ピキドキシン塩酸塩５０μｇ、リ
ボフラビン２５μｇ。第３表には、エピデルミン、ナイ
シンおよびフシド酸の最小阻止濃度（μｇ／ｍｌ）を比
較して示す。この場合用いたナイシンの活性は２５００
単位であった。
【００６８】
【表６】
【００６９】第２表に挙げたメジウムは以下に記載する
とおりのものである。メジウムはｐＨを調整したのち、
１２１℃で２０分間、オートクレーブ処理した。以下の
数値はすべて水１リットル中の数値である。化学的に定
義されたメジウムの場合は脱イオン水を用いた。 （２）グルコース−アガールメジウム ペプトン １０ｇ 肉エキス ８ｇ ＮａＣｌ ３ｇ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ２ｇ グルコース １０ｇ（別個にオートク
レーブ処理） アガール ２０ｇ ｐＨ ７．２
とおりのものである。メジウムはｐＨを調整したのち、
１２１℃で２０分間、オートクレーブ処理した。以下の
数値はすべて水１リットル中の数値である。化学的に定
義されたメジウムの場合は脱イオン水を用いた。 （２）グルコース−アガールメジウム ペプトン １０ｇ 肉エキス ８ｇ ＮａＣｌ ３ｇ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ２ｇ グルコース １０ｇ（別個にオートク
レーブ処理） アガール ２０ｇ ｐＨ ７．２
【００７０】（３）酵母−麦芽メジウム 酵母エキス ４ｇ 麦芽エキス １０ｇ グルコース ４ｇ アガール ２０ｇ ｐＨ ７．３ （４）細菌用オキソイドメジウム 肉エキス １０ｇ ペプトン １０ｇ ＮａＣｌ ５ｇ アガール ２０ｇ ｐＨ ７．２
【００７１】 （５）栄養肉汁（Ｄｉｆｃｏ） ８ｇ アガール ２０ｇ ｐＨ ７．２ （６）細菌用最小培地〔ヒュッターほか、１９６６〕 Ｄ−グルコース ８ｇ 酒石酸二アンモニウム ４ｇ ＮａＣｌ ５ｇ Ｋ2 ＨＰＯ4 ２ｇ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ １ｇ ＣａＣｌ2 ０．２ｇ ＭｎＳＯ4 ・Ｈ2 Ｏ ０．０１ｇ フェリオキサミンＢ ０．０２ｇ アガール ２０ｇ ｐＨ ７．２
【００７２】 （７）クロストリジウム・パストウリアナム用メジウム 肉エキス ３ｇ 酵母エキス ３ｇ 麦芽エキス ３ｇ ペプトン ２０ｇ Ｄ−グルコース ５ｇ アスコルビン酸 ０．２ｇ アガール ２０ｇ ｐＨ ７．０ （８）プロピオニバクテリウム・アクネ用ブリューアー
（Ｂｒｅｗｅｒ）チオグリコレートメジウム チオグリコレートメジウム ４０．５ｇ アガール ２０ｇ ｐＨ ７．２
（Ｂｒｅｗｅｒ）チオグリコレートメジウム チオグリコレートメジウム ４０．５ｇ アガール ２０ｇ ｐＨ ７．２
【００７３】エピデルミンは耐容性に優れ、局所的に用
いた場合、毒性作用は認められない。主たる利点は、抵
抗性変異株、スタフィロコッカス・エピデルミディスＤ
ＳＭ３０９５がエピデルミンに抵抗性で、それを産生す
ることである。菌株ＮＣＩＢは、それが産生する低分子
抗生物質に対してこのような抵抗性を示さない。
いた場合、毒性作用は認められない。主たる利点は、抵
抗性変異株、スタフィロコッカス・エピデルミディスＤ
ＳＭ３０９５がエピデルミンに抵抗性で、それを産生す
ることである。菌株ＮＣＩＢは、それが産生する低分子
抗生物質に対してこのような抵抗性を示さない。
【００７４】新規クローンＤＳＭ３０９５は次のように
して得られた。適応は側口を有する１００ｍｌのエルレ
ンマイヤーフラスコ中、１０ｍｌの栄養溶液（脳心臓用
灌流液）で実施した。出発培養液を０．５ｍｌの１２時
間培養液で接種した。高濃度のエピデルミンを含むフラ
スコには、前回のよく生育した培養液０．５ｍｌを種と
して用いた。生育は５７８ｎｍにおいて光学的に評価し
た。培養液中エピデルミン濃度１．０ｍｇ／ｍｌでもな
お良好な生育を示した培養液を食塩水で希釈し、エピデ
ルミン０．５ｍｇ／ｍｌを注いでおいたスライド上に塗
布した。
して得られた。適応は側口を有する１００ｍｌのエルレ
ンマイヤーフラスコ中、１０ｍｌの栄養溶液（脳心臓用
灌流液）で実施した。出発培養液を０．５ｍｌの１２時
間培養液で接種した。高濃度のエピデルミンを含むフラ
スコには、前回のよく生育した培養液０．５ｍｌを種と
して用いた。生育は５７８ｎｍにおいて光学的に評価し
た。培養液中エピデルミン濃度１．０ｍｇ／ｍｌでもな
お良好な生育を示した培養液を食塩水で希釈し、エピデ
ルミン０．５ｍｇ／ｍｌを注いでおいたスライド上に塗
布した。
【００７５】比較のために、文献公知の菌株ＮＣＩＢ１
１５３６の１２時間培養液を希釈しないでプレート上に
塗布した。３７℃に２４時間インキュベートしたのち、
１０ -6に希釈した適応培養液に９４個のコロニーが観察
された。希釈しないで０．１５ｍｇ／ｍｌ含有プレート
上に塗布した対照菌株からは、４８時間インキュベート
したのちも、生育は認められなかった。抵抗性コロニー
を選択し、メジウム２のプレート上にグリッドパターン
に塗布した。径５ｍｍのフラグメントを取って産生の予
備試験とマイクロコッカス・ルテウスＡＴＣＣ９３４１
に対する活性試験を行ったのち、産生クローンを液体メ
ジウム中で試験した。
１５３６の１２時間培養液を希釈しないでプレート上に
塗布した。３７℃に２４時間インキュベートしたのち、
１０ -6に希釈した適応培養液に９４個のコロニーが観察
された。希釈しないで０．１５ｍｇ／ｍｌ含有プレート
上に塗布した対照菌株からは、４８時間インキュベート
したのちも、生育は認められなかった。抵抗性コロニー
を選択し、メジウム２のプレート上にグリッドパターン
に塗布した。径５ｍｍのフラグメントを取って産生の予
備試験とマイクロコッカス・ルテウスＡＴＣＣ９３４１
に対する活性試験を行ったのち、産生クローンを液体メ
ジウム中で試験した。
【００７６】抵抗性菌株と文献公知菌株との比較： ａ）プレート拡散試験における最小阻止濃度：２種の菌
株を含む試験プレート上で得られた最小阻止濃度を第４
表に示す。
株を含む試験プレート上で得られた最小阻止濃度を第４
表に示す。
【表７】
【００７７】ｂ）生育および産生：栄養溶液（３％肉エ
キス、２％麦芽エキス、０．３７％水酸化カルシウム）
中で２種の菌株の生育と産生パターンを比較した（図１
２参照）： 生育パターン：生菌数の測定 産生パターン：プレート拡散試験におけるミクロコッカ
ス・ルテウスＡＴＣＣ９３４１に対する活性 抵抗性菌株によってより良好な産生が認められる。
キス、２％麦芽エキス、０．３７％水酸化カルシウム）
中で２種の菌株の生育と産生パターンを比較した（図１
２参照）： 生育パターン：生菌数の測定 産生パターン：プレート拡散試験におけるミクロコッカ
ス・ルテウスＡＴＣＣ９３４１に対する活性 抵抗性菌株によってより良好な産生が認められる。
【００７８】ｃ）各種生育相におけるエピデルミンに対
する感受性：産生菌株の抗生物質による固有の阻害と、
選ばれたクローンの抵抗性の試験をバイオホトメーター
（自動循環装置付のエペンドルフ製ホトメーター）を用
いて実施した。これらの試験は、たとえば、次のように
実施した。スタフィロコッカス・エピデルミディスＮＣ
ＩＢ１１５３６または選ばれた抵抗性菌株ＤＭＳ３０９
５の１２時間培養液０．５ｍｌのバッチを新鮮なメジウ
ム上に接種した。
する感受性：産生菌株の抗生物質による固有の阻害と、
選ばれたクローンの抵抗性の試験をバイオホトメーター
（自動循環装置付のエペンドルフ製ホトメーター）を用
いて実施した。これらの試験は、たとえば、次のように
実施した。スタフィロコッカス・エピデルミディスＮＣ
ＩＢ１１５３６または選ばれた抵抗性菌株ＤＭＳ３０９
５の１２時間培養液０．５ｍｌのバッチを新鮮なメジウ
ム上に接種した。
【００７９】これらの培養液を５７８ｎｍの吸光度が
０．０４３になるまで生育させ（層厚１ｃｍの皿）、つ
いでバイオホトメーターのキューベット（層厚２ｃｍ）
に７．５ｍｌを加えた。細胞懸濁液の密度がバイオホト
メーターの透過率９０％になるように調整した。インキ
ュベーションは最大通気下に３７℃で実施した。各生育
相にエピデルミンを水溶液として添加した。いずれの菌
株も、対数期の初期と中期に、各種濃度のエピデルミン
を添加した。結果を図１３および図１４に示す。これま
でに試験した濃度では、抵抗性菌株には溶菌は認められ
なかった。
０．０４３になるまで生育させ（層厚１ｃｍの皿）、つ
いでバイオホトメーターのキューベット（層厚２ｃｍ）
に７．５ｍｌを加えた。細胞懸濁液の密度がバイオホト
メーターの透過率９０％になるように調整した。インキ
ュベーションは最大通気下に３７℃で実施した。各生育
相にエピデルミンを水溶液として添加した。いずれの菌
株も、対数期の初期と中期に、各種濃度のエピデルミン
を添加した。結果を図１３および図１４に示す。これま
でに試験した濃度では、抵抗性菌株には溶菌は認められ
なかった。
【００８０】本発明に係る抗生物質エピデルミンは、そ
れが単離された培養液と同様、殺菌効果を示し、細胞を
溶解させる。その殺菌活性とグラム陽性細菌に対する広
いスペクトルの活性から、本発明に係るポリペプチド抗
生物質エピデルミンは、グラム陽性細菌によって生じる
感染症の治療にとくに有用である。エピデルミンは、湿
疹、膿痂疹、蜂巣炎およびとくに座瘡のような皮膚感染
症の治療に有用である。プロピオニバクテリウム・アク
ネズの一部の重要な菌株に対する著しく高い有効性は、
すでに第２表および第３表に示した。エピデルミンはヒ
トの皮膚に生棲する微生物によって正常に産生されるも
のということができ、他の慣用の抗生物質に比べ、皮膚
の保護により効果的である。
れが単離された培養液と同様、殺菌効果を示し、細胞を
溶解させる。その殺菌活性とグラム陽性細菌に対する広
いスペクトルの活性から、本発明に係るポリペプチド抗
生物質エピデルミンは、グラム陽性細菌によって生じる
感染症の治療にとくに有用である。エピデルミンは、湿
疹、膿痂疹、蜂巣炎およびとくに座瘡のような皮膚感染
症の治療に有用である。プロピオニバクテリウム・アク
ネズの一部の重要な菌株に対する著しく高い有効性は、
すでに第２表および第３表に示した。エピデルミンはヒ
トの皮膚に生棲する微生物によって正常に産生されるも
のということができ、他の慣用の抗生物質に比べ、皮膚
の保護により効果的である。
【００８１】本発明に係る抗生物質を慣用の賦形剤およ
び担体とともに含有する医薬組成物は、経口的に、非経
口的に、経腸的にまたは局所的に適用できる。これらの
組成物は、特に局所用剤型の場合、溶液剤、乳化剤、ゲ
ル、ローション、軟膏、クリームまたは粉末として提供
される。
び担体とともに含有する医薬組成物は、経口的に、非経
口的に、経腸的にまたは局所的に適用できる。これらの
組成物は、特に局所用剤型の場合、溶液剤、乳化剤、ゲ
ル、ローション、軟膏、クリームまたは粉末として提供
される。
【００８２】以下の例はこれらの医薬用剤型の製造方法
を例示するものである。例 ２ チンク剤 １００ｇ中含量： エピデルミン １．０ｇ エタノール（９４．５容量％） ５６．０ｇ １，２−プロピレングリコール ４０．０ｇ 脱イオン水 ３．０ｇ 製法：エピデルミンをエタノール、１，２−プロピレン
グリコールおよび水の混合物に溶解し、この溶液を無菌
的にろ過する。
を例示するものである。例 ２ チンク剤 １００ｇ中含量： エピデルミン １．０ｇ エタノール（９４．５容量％） ５６．０ｇ １，２−プロピレングリコール ４０．０ｇ 脱イオン水 ３．０ｇ 製法：エピデルミンをエタノール、１，２−プロピレン
グリコールおよび水の混合物に溶解し、この溶液を無菌
的にろ過する。
【００８３】例 ３ ローション １００ｇ中の含量 エピデルミン １．００ｇ １，２−プロピレングリコール ７．００ｇ アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド 〔ベンザルコンＡ（登録商標）〕 ０．１５ｇ ソルビタンモノパルミテート 〔スパン４０（登録商標）〕 ０．４０ｇ ソルビマクロゴールパルミテート 〔ツィーン４０（登録商標）〕 １．２０ｇ デシルオレエート 〔セチオールＶ（登録商標）〕 ２．４０ｇ セチルおよびステアリル アルコール混合物〔ラネッテＯ（登録商標）〕 １．６０ｇ セチルパルミテート ０．８０ｇ 脱イオン水 全量１００ｇとする
【００８４】製法：上記量のアルキルジメチルベンジル
アンモニウムクロリド、ソルビタンモノパルミテート、
ソルビマクロゴールパルミテート、デシルオレエート、
セチルおよびステアリルアルコールならびにセチルパル
ミテートを水７５ｍｌ中に攪拌下に混合し、ついでエピ
デルミンの１，２−プロピレングリコール溶液のろ過液
と残部の水を攪拌に加え、均一にする。
アンモニウムクロリド、ソルビタンモノパルミテート、
ソルビマクロゴールパルミテート、デシルオレエート、
セチルおよびステアリルアルコールならびにセチルパル
ミテートを水７５ｍｌ中に攪拌下に混合し、ついでエピ
デルミンの１，２−プロピレングリコール溶液のろ過液
と残部の水を攪拌に加え、均一にする。
【００８５】例 ４ ゲル １００ｇ中含量 エピデルミン １．０ｇ ラウリルアルコールのポリエチレン グリコールエーテル〔ブリッジ３５（登録商標）〕 １．０ｇ １，２−プロピレングリコール ５．０ｇ アクリル酸ポリマー 〔カルボポール９３４（登録商標）〕 １．２ｇ ｐ−ヒドキシ安息香酸メチル １．６ｇ ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル ０．４ｇ 香 料 適 量 水酸化ナトリウム溶液 ｐＨ６．５になるまで 脱イオン水 全量１００ｇとする
【００８６】製法：特定量の賦形剤を水７５ｍｌ中に攪
拌下に加える。エピデルミンを１，２−プロピレングリ
コールと残部の水の混合物に溶解し、この溶液を再び攪
拌下に加える。得られたゲルをもう一度ホモジナイズす
る。
拌下に加える。エピデルミンを１，２−プロピレングリ
コールと残部の水の混合物に溶解し、この溶液を再び攪
拌下に加える。得られたゲルをもう一度ホモジナイズす
る。
【図１】エピデルミンの酸完全加水分解物のアミノ酸ク
ロマトグラム（ニンヒドリン発色、λ＝５７０ｎｍ）。
ロマトグラム（ニンヒドリン発色、λ＝５７０ｎｍ）。
【図２】エピデルミンの酸完全加水分解物のＮ−ペンタ
フルオロプロピオニル−アミノ酸ｎ−プロピルエステル
のＣｈｉｒａｓｉｌ−Ｖａｌ上ガスクロマトグラム（温
度プログラム、３分間、８５℃の等温、ついで１分間４
℃ずつ２００℃まで上昇、キャリアーガス：Ｈ2 ，０．
９２バール）
フルオロプロピオニル−アミノ酸ｎ−プロピルエステル
のＣｈｉｒａｓｉｌ−Ｖａｌ上ガスクロマトグラム（温
度プログラム、３分間、８５℃の等温、ついで１分間４
℃ずつ２００℃まで上昇、キャリアーガス：Ｈ2 ，０．
９２バール）
【図３】エピデルミン水溶液の紫外部スペクトル〔ｐＨ
３（Ｃ＝０．１５ｍｇ／ｍｌ）〕
３（Ｃ＝０．１５ｍｇ／ｍｌ）〕
【図４】エピデルミンの赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ
錠）
錠）
【図５】エピデルミンの 1Ｈ−ＮＲスペクトル（２０ｍ
ｇ／０．５ｍｌ Ｄ7 −ジメチルホルムアミド、４０
０．１６ＭＨｚ）
ｇ／０．５ｍｌ Ｄ7 −ジメチルホルムアミド、４０
０．１６ＭＨｚ）
【図６】エピデルミンの13Ｃ−ＮＲスペクトル（４０ｍ
ｇ／０．５ｍｌ、12Ｃ， 2Ｈ−ジメチルホルムアミド、
１００．６ＭＨｚ、４５３６０パルス）
ｇ／０．５ｍｌ、12Ｃ， 2Ｈ−ジメチルホルムアミド、
１００．６ＭＨｚ、４５３６０パルス）
【図７】エピデルミンのμ Ｂｏｎｄａｐａｋ Ｃ18
ＨＰＬＣクロマトグラム（３００×３．９ｍｍ、移動
相：Ａ＝アセトニトリル／０．０１Ｍ ＫＨ2 ＰＯ4 、
１０／９０；Ｂ＝アセトニトリル／０．０１Ｍ ＫＨ2
ＰＯ4 、７０／３０、３０分で１０％Ｂ→１００％Ｂ直
線勾配、流速２ｍｌ／分）
ＨＰＬＣクロマトグラム（３００×３．９ｍｍ、移動
相：Ａ＝アセトニトリル／０．０１Ｍ ＫＨ2 ＰＯ4 、
１０／９０；Ｂ＝アセトニトリル／０．０１Ｍ ＫＨ2
ＰＯ4 、７０／３０、３０分で１０％Ｂ→１００％Ｂ直
線勾配、流速２ｍｌ／分）
【図８】フラグメントＰ２の13Ｃ−ＮＲスペクトル（１
２ｍｇ／０．５ｍｌ、12Ｃ， 2Ｈ−ジメチルホルムアミ
ド、１００．６ＭＨｚ、３８３００パルス）
２ｍｇ／０．５ｍｌ、12Ｃ， 2Ｈ−ジメチルホルムアミ
ド、１００．６ＭＨｚ、３８３００パルス）
【図９】エピデルミンの単離を示すフローシート。
【図１０】生菌数（実線）とミクロコッカス・ルテウス
に対する活性（点線）のメジウムによる比較を示すグラ
フ。 ▲ 脳心臓用灌流液 〇 ３％肉エキス−２％麦芽エキス−０．２５％ Ｃａ
ＣＯ3 ● ３％肉エキス−２％麦芽エキス−０．３７％ Ｃａ
（ＯＨ）2
に対する活性（点線）のメジウムによる比較を示すグラ
フ。 ▲ 脳心臓用灌流液 〇 ３％肉エキス−２％麦芽エキス−０．２５％ Ｃａ
ＣＯ3 ● ３％肉エキス−２％麦芽エキス−０．３７％ Ｃａ
（ＯＨ）2
【図１１】１０リットルスケールでの発酵過程を示すグ
ラフ。 ● ｐＨ曲線 ▲ 生菌数 〇 ストレプトコッカス・パイロジェンズＡＴＣＣ８６
６８に対する活性
ラフ。 ● ｐＨ曲線 ▲ 生菌数 〇 ストレプトコッカス・パイロジェンズＡＴＣＣ８６
６８に対する活性
【図１２】文献公知の菌株と抵抗性クローンＤＳＭ３０
９５の生菌数（実線）およびミクロコッカス・ルテウス
ＡＴＣＣ９３４１に対する活性（点線）を示すグラフ。 〇 文献公知の菌株 ▲ 抵抗性クローン
９５の生菌数（実線）およびミクロコッカス・ルテウス
ＡＴＣＣ９３４１に対する活性（点線）を示すグラフ。 〇 文献公知の菌株 ▲ 抵抗性クローン
【図１３】各種生育相におけるスタフィロコッカス・エ
ピデルミディスＮＣＩＢ１１５３６へのエピデルミンの
添加に係るグラフ； １；正常な生育パターン ２；対数期の初期にエピデルミン１０μｇ／ｍｌを添
加、溶菌を生じている ３；対数期の中期にエピデルミン１０μｇ／ｍｌを添
加、同様に溶菌を生じている ４；対数期の中期にエピデルミン２．５μｇ／ｍｌを添
加、生育遅延
ピデルミディスＮＣＩＢ１１５３６へのエピデルミンの
添加に係るグラフ； １；正常な生育パターン ２；対数期の初期にエピデルミン１０μｇ／ｍｌを添
加、溶菌を生じている ３；対数期の中期にエピデルミン１０μｇ／ｍｌを添
加、同様に溶菌を生じている ４；対数期の中期にエピデルミン２．５μｇ／ｍｌを添
加、生育遅延
【図１４】抵抗性クローンＤＳＭ３０９５の各種生育相
におけるエピデルミンの添加に係るグラフ； １；正常な生育パターン、ＮＣＩＳ１１５３６の場合に
同じ ２；対数期の初期にエピデルミン１２０μｇ／ｍｌを添
加、生育にわずかな遅延のみ ３；対数期の中期に３６０μｇ／ｍｌのエピデルミン添
加、生育にわずかな遅延をみるのみ
におけるエピデルミンの添加に係るグラフ； １；正常な生育パターン、ＮＣＩＳ１１５３６の場合に
同じ ２；対数期の初期にエピデルミン１２０μｇ／ｍｌを添
加、生育にわずかな遅延のみ ３；対数期の中期に３６０μｇ／ｍｌのエピデルミン添
加、生育にわずかな遅延をみるのみ
【図１５】Ｈ１の完全加水分解物のＮ−ペンタフルオロ
プロピオニルアミノ酸Ｎ−プロピルエステルのＣｈｉｒ
ａｓｉｌ−Ｖａｌ上ガスクロマトグラム（温度プログラ
ム；３分間８０℃に等温保持、ついで１分間４℃で２０
０℃に上昇させる、キャリヤーガス：Ｈ2 ）
プロピオニルアミノ酸Ｎ−プロピルエステルのＣｈｉｒ
ａｓｉｌ−Ｖａｌ上ガスクロマトグラム（温度プログラ
ム；３分間８０℃に等温保持、ついで１分間４℃で２０
０℃に上昇させる、キャリヤーガス：Ｈ2 ）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 7/08 8318−4Ｈ 7/10 ＺＮＡ 8318−4Ｈ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:45） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:45） Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者 ギユンサー ユング ドイツ連邦共和国テユビンゲン，オブ デ ル グラフエンハルデ ５ (72)発明者 ヘルマン アルガイエル ドイツ連邦共和国ビベラツハ，ケレスライ ン 105 (72)発明者 ウルスラ スクナイダー ドイツ連邦共和国ルテシヤイム，シヤウマ ンストラーセ ３
Claims (2)
- 【請求項１】 エピデルミン抵抗性の新規なエピデルミ
ン産生株、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓ
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉ
ｓ）ＤＳＭ３０９５。 - 【請求項２】 以下の特徴： （ｉ）グラム染色：陽性、 （ｉｉ）細胞サイズ：直径０．５〜０．８μｍ、 （ｉｉｉ）コロニーのサイズ：直径約１ｍｍ、 （ｉｖ）コロニーの外観：平坦、光沢あり、中央がわず
かに盛り上る、 （ｖ）コロニーの色：灰色がかった白色、 （ｖｉ）培養中の細胞：通常、単独または２個の群をな
す。大きなクランプをなすことは稀、 （ｖｉｉ）溶血：血液スライド上に培養液を広げると強
い溶血を示す、 （ｖｉｉｉ）無気的生育：無気的条件下にもこの株は生
育する、 （ｉｘ）リゾチーム感受性：２ｍｇ／ｍｌまではリゾチ
ームに対し細胞は抵抗する、 （ｘ）ライソスタフィン感受性：２０μｇ／ｍｌでもラ
イソスタフィンに対し細胞は感受性を示す、 （ｘｉ）エピデルミン抵抗性：１ｍｇ／ｍｌまで認めら
れる、 （ｘｉｉ）その他の抵抗性：液体培養においてこの株は
ストレプトマイシン（１ｍｇ／ｍｌまで）、スペクチノ
マイシン（０．５ｍｇ／ｍｌまで）に対し著しい抵抗性
を示す、 （ｘｉｉｉ）食塩含量の増大：食塩含量１５重量％まで
はなお良好な生育を示す、そして （ｘｉｖ）コロニーまたは塗布した培養液は粘着性を示
す、を有するスタフィロコッカス・エピデルミディス
（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄ
ｉｓ）ＤＳＭ３０９５。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19843440423 DE3440423A1 (de) | 1984-11-06 | 1984-11-06 | Antibiotisches polypeptid, verfahren zu seiner herstellung, dieses polypeptid erzeugender stamm von staphylococcus epidermidis, dieses polypeptid enthaltende zubereitungsformen und seine verwendung zur bekaempfung infektioeser erkrankungen |
| DE34404236 | 1985-07-01 | ||
| DE35234784 | 1985-07-01 | ||
| DE19853523478 DE3523478A1 (de) | 1985-07-01 | 1985-07-01 | Antibiotisches polypeptid, verfahren zu seiner herstellung, dieses polypeptid erzeugender stamm vom staphylococcus epidermidis, dieses polypeptid enthaltende zubereitungsformen und seine verwendung zur bekaempfung infektioeser erkrankungen |
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|---|---|---|---|
| JP60247876A Division JPH0670078B2 (ja) | 1984-11-06 | 1985-11-05 | ポリペプチド抗生物質 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06113826A true JPH06113826A (ja) | 1994-04-26 |
| JPH0732704B2 JPH0732704B2 (ja) | 1995-04-12 |
Family
ID=25826263
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60247876A Expired - Lifetime JPH0670078B2 (ja) | 1984-11-06 | 1985-11-05 | ポリペプチド抗生物質 |
| JP5173284A Expired - Lifetime JPH0732704B2 (ja) | 1984-11-06 | 1993-07-13 | 新規なエピデルミン産生菌株 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60247876A Expired - Lifetime JPH0670078B2 (ja) | 1984-11-06 | 1985-11-05 | ポリペプチド抗生物質 |
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| JPH0637384B2 (ja) * | 1985-09-21 | 1994-05-18 | 株式会社資生堂 | 皮膚化粧料 |
| ES2059645T3 (es) * | 1988-07-15 | 1994-11-16 | Thomae Gmbh Dr K | Procedimiento para la obtencion, el aislamiento y la purificacion de epidermina. |
| DE3938140A1 (de) * | 1989-11-16 | 1991-08-08 | Beiersdorf Ag | Desodorierende kosmetische mittel |
| AU5158093A (en) * | 1992-09-10 | 1994-03-29 | Sara Lee/De N.V. | Mouth-care products with anti-bacterial activity |
| ATE201995T1 (de) * | 1993-08-20 | 2001-06-15 | Novartis Ag | Verfahren zur prävention und behandlung der rindermastitis |
| JPH09512711A (ja) * | 1994-05-07 | 1997-12-22 | チバ−ガイギー アクチェンゲゼルシャフト | ランチオニン含有抗菌化合物 |
| AU5098396A (en) * | 1995-04-07 | 1996-10-23 | Kuyus-Stiftung | Cosmetic composition for treating cellulite |
| SE9602496D0 (sv) | 1996-06-20 | 1996-06-20 | Bengt Guss | Method and means for producing a fibrinogen binding protein and its use in biotechnology |
| JP2006176406A (ja) * | 2003-03-11 | 2006-07-06 | Asahi Kasei Pharma Kk | ペプチド系抗生物質 |
| KR20230078378A (ko) * | 2021-11-26 | 2023-06-02 | 코스맥스 주식회사 | 에피더미디박테리움 케라티니 추출물이 함침된 다공성 실리카 및 그의 피부상태 개선 용도 |
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